KR20080039903A - 인간 지방 유도된 세포의 면역표현형 및 면역원성 - Google Patents

Abstract

본 발명은 낮은 수준의 면역원성을 나타내는 분리된 지방 조직 유도된 스트로마 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 본 발명은, 숙주 거부 및/또는 숙주 대 이식물 질환을 감소 또는 억제하기에 유효한 양의 지방 조직 유도된 스트로마 세포를 수용자에게 투여하여 이식 관련 면역 반응을 감소시키기 위한 방법 및 조성물을 포함한다.

Description

인간 지방 유도된 세포의 면역표현형 및 면역원성{THE IMMUNOPHENOTYPE AND IMMUNOGENICITY OF HUMAN ADIPOSE DERIVED CELLS}

재생의학의 발달 분야는, 손상된 조직 및 기관을 보수하기 위한 신규한 치료제로서 생물질, 성장인자 및 세포를 조합하고자 한다. 이러한 특수 분야의 성장에 따라, 조직 공학적 적용에 부합하기 위한 인간 성인 줄기 세포의 신뢰성 있고 안전하며 효과적인 공급원에 대한 필요가 존재한다. 조절 목적으로, 이들 세포는 정량화 가능한 순도 척도로서 정의되어야만 한다. 임상 수준의 실제적 목적에서, 이들 세포는 케어 시점에서 필요시 즉각 사용 가능한 "시약 선반으로부터" 사용 가능한 제품이어야 한다. 상업적 관점에서는, 자가 유래 (autologous)에 반대되는 동종 (allogeneic)의 성인 줄기 세포를 이식을 위해 사용할 수 있는 능력은 제품 개발상 심대한 긍정적 효과를 가져올 것이다. 이러한 상황하에서, 한 공여자에게서 유래한 세포의 단일 로트 (lot)가 여러 환자에게 이식 가능하며, 이에 따라 품질 관리 및 품질 확신 모두에 대한 비용을 절감할 수 있다.

줄기 세포는 또한 성인 생물체의 조직에 존재한다. 성인 줄기 세포로 가장 잘 특정화된 것은 골수 및 말초 혈액에서 분리된 조혈 선조 세포이다. 치료하지 않는 경우, 치사량으로 방사선 조사된 마우스는 죽게 되는데, 이는 그 순환 혈액 세포를 재충전하지 못했기 때문이다; 그러나, 동계 (syngeneic) 공여자 동물 의 골수 세포 이식은 숙주 동물을 회생시킬 수 있다. 공여 세포가 순환 혈액 세포의 재충전을 담당한 것이다. 따라서 미분화 조혈 줄기 세포가 숙주 동물의 상이한 혈액 세포 주를 재생 가능함을 나타내기 위한 연구가 실시되었다. 이들 연구는, 암 및 선천성 대사 이상에 대해 널리 수용된 치료 방식으로서 골수 이식의 기초를 제공하였다.

최근까지 골수 기원의 조혈 줄기 세포 (HSC)는 다능분화 및 자가 재생 가능한 "성인" 줄기 세포로 인정된 유일한 것이었다. 이제, 여러 조직 부위에서의 줄기 세포의 존재를 지지하는 증거가 축적되고 있다. 이는, 다능 성인 선조 세포 (MAPC), 골수로부터의 중간엽 줄기 세포 (MSC), 피부 줄기 세포, 귀 MSC, 중추 신경계의 신경 줄기 세포, 간 및 췌장 줄기 세포, 및 골격 근육의 줄기 세포를 포함한다. 지방 유도된 줄기 세포 (ASC)는, 몇몇 유용한 특징을 나타낸다. 백색 지방 조직으로부터 유도된 성인 줄기 세포는, 지방세포, 섬유아세포, 상피, 조혈 지지체, 간세포, 신경, 근육성, 및 골아세포 주 경로를 따라 시험관 내에서 분화 가능하다 (Gimble 등, 2003 Curr. Top. Dcv. Biol. 58:13760; Halvorsen 등, 2001 Metabolism 50:407-13; Flalvorsen 등, 2001 Tissue Eng. 7:729-41; Hicok 등, 2004 Tissue Eng. 10:371-80; Erickson 등, 2002 Biochem. Biophys. Res. Commun. 290:763-9; Safford 등, 2004 Exp. Neurol. 187:319-28; Safford 등, 2002 Biochem. Biophys. Res. Commun. 294:371-9; Zuk 등, 2001 Tissue Eng. 7:211-28; Zuk 등, 2002 Mol. Biol. Cell. 13:4279-95; Mizuno 등, 2003 J. Nippon Med. Sch. 70:300-6; Seo 등, 2005 Biochem. Biophys. Res. Commun. 328:258-64). 지방 조직은, 접근가능하고, 풍부하고 재충전가능한 것으로서, 각 개인에서 성인 줄기 세포의 잠재적 저장고를 제공한다. 이러한 발견은, 독립적으로 연구중인 여러 그룹의 연구로부터 알 수 있다. 그러나, 상이한 실험실에서의 세포 제제는 동일하지 않다. 이들 독립적 그룹들은, 저민 지방 조직을 콜라게나제로 소화시키고 이어서 원심분리하는 방법에 의해 그들의 세포를 분리하기 시작하는 것으로 여겨진다. 초기의 세포 펠릿은 "스트로마 혈관 분획 (SVF)"으로 확인된다. 일부 그룹들은, 최소한으로 가공된 세포 군집에 대해서만 그 주의를 집중한다. 다른 그룹들은, 다중 계대를 위한 SVF 세포의 플라스틱 (plastic) 부착성 하부군을 확대시키며; 이들은 ASC로 확인된 세포들이다.

포유류 면역 체계는, 감염제에 대해 개인을 보호하고 종양 성장을 막는 중요한 역할을 수행한다. 그러나, 동일한 면역 체계에 의해, 관련없는 공여자의 세포, 조직 및 기관 이식편의 거부와 같은 원치않는 효과가 발생할 수 있다. 면역 체계는, 이식된 조직과 같은 유익한 침입자와 유해한 침입자를 구분하지 못하면서, 면역 체계는 이식된 조직 또는 기관을 거부한다. 이식된 기관의 거부는, 공여자의 동종항원 또는 이종항원을 인식하는 숙주 내에 존재하는 동종반응성 T 세포에 의해 보통 매개 된다.

세포, 조직 및 기관을 유전적으로 상이한 개인 간에 이식하는 것은, 이식물 거부의 위험을 필연적으로 야기한다. 세포 거의 전부는, 주요 조직적합성 복합체의 생성물인 MHC 클래스 I 분자를 발현한다.

나아가, 감염성 사이토카인에 노출시 여러 타입의 세포들은 MHC 클래스 II 분자들을 발현하도록 유도될 수 있다. 추가의 면역원성 분자로, 여성 수용자에게 의해 인지되는 Y 염색체 항원과 같은 비주요 조직적합성 항원에서 유도된 것을 포함한다. 동종이식물의 거부는 주로 CD4 및 CD8 하부군 모두의 T 세포에 의해 매개 된다 (Rosenberg 등, 1992 Annu. Rev. Immunol. 10:333). 동종반응성 CD4+ T 세포는, 동종항원에 대항한 세포용해성 CD8 반응을 악화시키는 사이토카인을 생성한다. 이들 하부군 내에서, 이들이 생성하는 사이토카인에 의해 특징지워지는, 세포 하부군이 항원 자극 이후 발달한다. Th1 세포는, IL-2 및 IFN-γ를 생성하며, 주로 동종이식물 거부에 관계한다 (Mossmann 등, 1989 Annu. Rev. Immunol. 7:145). Th2 세포는, IL-4 및 IFN-10를 생성하며, IL-10을 통해 Th1 반응을 억제조절 (down-regulate) 가능하다 (Fiorentino 등, 1989 J. Exp. Med. 170:208 1). 실제로, 원치 않는 Th1 반응을 Th2 경로로 우회시키기 위해 많은 노력이 기울여져 왔다. 환자에서의 원치 않는 동종 반응성 T 세포 반응 (동종이식물 거부, 이식물 대 숙주 질환)은, 프레드니손, 아자티오프린 및 시클로스포린 A와 같은 면역억제 약물로 보통 치료된다. 불행하게도, 이들 약물은 환자 일생동안 보통 유지되어야 하며 일반화된 면역억제를 포함하는 다수의 위험한 부작용을 가진다. 범 면역억제보다 훨씬 우수한 접근법은, 공여자 세포 동종항원에 대항한 특이적 또는 국소화 억제를 유도하여, 나머지 면역 체계를 건드리지 않는 것이다.

동종 줄기 세포의 이식을 가능하게 하는 동종항원에 대항한 면역 내성 (tolerance)을 유도할 수 있는 여러 방법이 존재하는 것으로 여겨진다. 불행하게도 이들 접근법 다수는, 설치류 동물 모델에서는 잘 작동하나 비인간 영장류 또는 인간에게 적용시 성공적이지 못했다. 유사하게, 수용자와 유전적으로 동일한 배아 줄기 세포의 클론을 생성하기 위한 핵 전달 방법의 사용은 고급 종에 있어 문제가 되고 있고, 다만 인간에 대해 제한적인 성공이 최근 보고 되었다 (Hwang 등, 2004, Science 303:1669). 줄기 세포의 다른 타입의 조작에 대해 상기 기술이 어떻게 적용될지, 그리고 조작 및 확대에 필요한 시간이 그 유용성을 제거시킬 지의 여부가 불분명하다.

줄기 세포는 낮은 수준의 면역원성을 나타내는 것으로 보고되었는데, 이는, 이들의 분화의 미성숙 상태 및 면역 조절성 특성 때문일 것이다.

래트 배아 유사 줄기 세포주는 낮은 수준의 MHC 클래스 I 항원을 발현하고 MHC 클래스 II 분자 및 CD8O(B7-1)/86(B7-2) 공자극성 분자 발현에 대해서는 음성이다 (Fandrich 등, 2002 Nat. Med. 8:17 1). 이들 세포는, 문맥 정맥으로 주입시 면역적격 동종 수용자 래트의 간에 이식화된다. 이식화는, 공자극성 분자의 부재와, 줄기 세포주에 의한 FasL의 발현에 기인한 것이다. 활성화된 T 세포는, Fas 수용체를 발현하여, 줄기 세포주에 의해 세포자멸사에 대하여 이들이 취약하도록 만든다. 이들 특성이 다른 배아 줄기 세포에 의해 공유되는지의 여부는, 이식된 태아 및 배야 줄기 세포 유도된 조직이 종종 수용자의 면역 체계에 의해 거부되기 때문에 현재 미공지이다 (Bradley 등, 2002 Nat. Rev. 2:859; Kaufman 등, 2000 E-biomed 1:11). 설치류에서 유도된 신경 줄기 세포는, 낮은 수준 또 는 무시할만한 수준의 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 항원을 발현하나 (McLaren 등, 2001 J. Neuroimmunol 112:35), 이들 세포는 면역억제약물을 사용하지 않는 한 동종 수용자에게 이식 이후 보통 거부된다 (Mason 등, 1986 Neuroscience 19:685; Sloan 등, 1991 Trends Neurosci. 14:341; Wood 등, 1996 Neuroscience 70:775). IFN 패밀리의 감염성 사이토카인에 노출된 이후, 세포막 상에 MHC 분자가 상향 조절된 (Up-regulated) 이후 거부가 발생할 수 있다 (McLaren 등, 2001 J. Neuroimmunol 112:35).

기관 이식의 주요 목적은, 수용자가 이식물 거부 면역 반응을 일으키는 것을 유도하지 않으면서, 기타 외래 항원에 대한 수용자의 면역적격을 보존한 채로 공여자 기관을 영구 이식화하는 것이다. 보통, 숙주 거부 반응을 방지하기 위해, 비특이적 면역억제제로 시클로스포린, 메토트릭세이트, 스테로이드 및 FK506이 사용된다. 이들 시약은, 매일 기준으로 투여되어야 하며, 투여 중단시 이식물 거부가 보통 일어난다. 그러나, 비특이적 면역억제제 사용의 주요 문제점은, 이들이 면역 반응의 모든 면을 억제하도록 작용함으로써, 수용자의 감염 및 암을 포함한 기타 질환에 대한 취약성을 심대하게 증가시킨다는 점이다. 나아가, 면역억제제의 사용에도 불구하고, 인간 기관 이식에 있어서 이식물 거부는 사망 및 질병률의 주요 원인으로 여전히 존재한다. 모든 인간 이식은, 영구적 이식물 수용이 없다면 10년 이내에 실패한다. 심장 이식의 50%만이 5년을 생존하며, 신장 이식의 20%만이 10년을 생존한다 (Opelz 등, 1981 Lancet 1:1223).

성공적 이식은, 면역 효과자 세포에 의해 매개되는 이식에 대한 숙주의 원치 않는 면역 반응을 방지 및/또는 감소시켜, 공여자 조직의 숙주 거부를 피하도록 하는 것에 의존한다고 현재 믿어진다. 또한 성공적 이식에 유리한 것은, 이식물 대 숙주 질환으로 알려진, 수용자 조직에 대한 공여자 조직에 의한 원치않는 면역 반응을 감소 또는 제거하는 방법이다. 따라서, 유전적으로 상이한 개인들 간에 세포, 조직 및 기관의 이식과 관련된 원치 않는 면역 반응을 억제 또는 이와 다르게는 방지할 수 있는 방법이 오랫동안 필요하였다. 본 발명은 이러한 필요를 충족시킨다.

발명의 간단한 요약

본 발명은, 비면역원성 특성을 나타내는 분리된 지방 조직 유도된 성인 스트로마 (ADAS) 세포에 관한 것이며, 여기에서 세포는 적어도 제 2 계대까지 계대된 것으로, 나아가 세포는 인간 다중약물 수송체 (ABCG2) 및 알데하이드 탈수소효소 (ALDH)로 이루어진 군에서 선택되는 줄기 세포 관련 특성을 발현하는 것이다.

본 발명의 한 면에서 ADAS 세포는 적어도 제 16 계대까지 계대된 것이다.

다른 면에서, ADAS 세포 내로 외인성 유전 물질을 도입한 것이다.

또 다른 면에서, ADAS 세포는 인간에서 유도된다.

다른 면에서 ADAS 세포는 그 수용자에게 동종인 것이다. 추가의 다른 면에서, ADAS 세포는 그 수용자에게 이종인 것이다.

본 발명은 또한, 이식편 수용자 내에서 동종항원에 대항한 효과자 세포의 면역 반응을 감소시키는 이식 환자의 치료 방법에 관한 것으로, 이식편 수용자에게 비면역원성 특성을 나타내는 ADAS 세포를 동종항원에 대항한 효과자 세포의 면역 반응을 감소시키기에 유효한 양으로 투여하는 것이며, 여기에서 ADAS 세포는 적어도 2 계대까지 계대된 것이며, 나아가 ADAS 세포는 인간 다중약물 수송체 (ABCG2) 및 알데하이드 탈수소효소 (ALDH)로 이루어진 군에서 선택되는 줄기 세포 관련 특성을 발현하는 것으로서, 이에 따라 이식편 환자 내에서 효과자 세포가 동종항원에 대하여 감소된 면역 반응을 가지게 되는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

한 면에서, 효과자 세포는 T 세포이다. 다른 면에서 T 세포는 공여자로부터, 동종항원은 수용자로부터 유래한다. 또 다른 면에서 T 세포는 수용자로부터, 동종항원은 공여자로부터 유래한다.

다른 면에서, T 세포는 이식편 내에 존재한다.

또 다른 면에서, 효과자 세포는 수용자에게 ADAS 세포를 투여하기 이전에 활성화된 T 세포이고, 나아가 면역 반응은 공여자로부터의 T 세포의 재활성화인 것이다.

추가의 면에서, ADAS 세포는 이식편 수용자의 이식 거부를 치료하기 위해 이식 수용자에게 투여된다.

다른 면에서 ADAS 세포는 포유류 유래의 것이다. 바람직하게, 포유류는 인간이다.

추가의 면에서, 면역억제제를, ADAS 세포와 조합하여 수용자에게 투여한다.

한 면에서, ADAS 세포는, 이식 이전에 수용자에게 투여된다. 다른 면에서 ADAS 세포는 이식과 동시에 수용자에게 투여된다. 또 다른 면에서, ADAS 세포는 이식의 일부로 투여된다. 다른 면에서 ADAS 세포는 이식편의 이식에 이어 수용자에게 투여된다.

한 면에서, ADAS 세포는 수용자에게 정맥내 투여된다.

다른 면에서, 효과자 세포는 공여자 이식편의 수용자의 세포이다.

또 따른 면에서 ADAS 세포는 유전적으로 변형된 것이다.

본 발명은 또한, 동종항원에 대항한 효과자 세포에 의한 면역 반응을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 이는, 비면역원성 특성을 나타내는 ADAS 세포를 동종항원에 대항한 효과자 세포의 면역 반응을 감소시키기에 유효한 양으로 효과자 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 것으로서, 여기에서 ADAS 세포는 적어도 2 계대까지 계대된 것이며, 나아가 ADAS 세포는 인간 다중약물 수송체 (ABCG2) 및 알데하이드 탈수소효소 (ALDH)로 이루어진 군에서 선택되는 줄기 세포 관련 특성을 발현하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게, 효과자 세포는 T 세포이다.

본 발명은 또한, 지방 조직으로부터 유도된 세포군으로부터 ADAS 세포를 분리하는 방법에 관한 것이며, 이는, ABCG2에 특이적인 항체를 제공하고; 항체-지방 조직 유도된 스트로마 세포 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 항체와 지방 유도된 세포군을 접촉시키고; 그리고 지방 유도된 세포군으로부터 항체-지방 조직 유도된 스트로마 세포 복합체를 실질적으로 분리하여; 지방 조직 유도된 스트로마 세포를 분리하는 것을 특징으로 한다.

한 면에서, 항체는 물리적 지지체에 컨쥬게이션된다.

다른 면에서, 물리적 지지체는, 마이크로비드, 자기 비드, 팬닝 표면, 밀도 원심분리를 위한 조밀한 입자, 흡착 컬럼 및 흡착 막으로 이루어지는 군에서 선택 된다.

또 다른 면에서, 물리적 지지체는 스트렙타비딘 비드 및 비오틴 비드로 이루어지는 군에서 선택된다.

한 면에서, 상기 항체-지방조직 유도된 스트로마 세포 복합체는, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS) 및 자기 활성화된 세포 분류 (MACS)로 이루어지는 군에서 선택되는 방법을 사용하여, 지방 유도된 세포군으로부터 실질적으로 분리된다.

본 발명은 또한, 지방 유도된 세포군으로부터의 지방 조직 유도된 스트로마 세포를 풍부하게(enriching) 하는 방법에 관한 것이며, 이는, ABCG2에 특이적인 항체를 제공하고; 항체-지방 조직 유도된 스트로마 세포 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 항체와 지방 유도된 세포군을 접촉시키고; 그리고 지방 유도된 세포군으로부터 항체-지방 조직 유도된 스트로마 세포 복합체를 실질적으로 분리하고; 따라서 지방 조직 유도된 스트로마 세포를 분리하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 지방 조직으로부터 유도된 세포군으로부터 ALDH에 대해 양성인 ADAS 세포를 동정하는 방법에 관한 것으로, 이는, 세포군에 대해서 ALDH에 특이적인 절단가능한 기질을 제공하는 것을 포함하며, 여기에서 기질은 ALDH+ 세포 내에 존재시 절단되는 것이며 또한 절단된 기질은 형광을 방출함으로써 ALDH+ADAS 세포를 동정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 예시를 위하여, 본 발명의 특정 구현을 도면에 개시한다. 그러나, 본 발명이 도면에 개시된 구현의 정확한 배열 및 기구에 한정되는 것은 아니 다.

도 1A 내지 도 1D를 포함하는 도 1은, 지방 조직에서 유도된 세포의 군락 형성 단위 어세이 (CFU)를 나타내는 일련의 이미지들이다. 상기 이미지들은, 하기 군락들의 대표적 염색 프로필을 나타낸다: (도 1A) 톨루이딘 블루⁺ CFU-F; (도 1B) 알칼린 포스파타제⁺ CFU-ALP; (도 1C) 오일 레드 O⁺ CFU-Ad; 및 (도 ID) 알리자린 레드⁺ CFU-Ob.

도 2는, 지방 유도된 세포의 플로우 사이토메트리 히스토그램을 나타내는 그래프이다. 대표 공여자로부터의 선택된 조혈성, 줄기 세포 및 스트로마 세포 마커의 플로우 사이토메트리 히스토그램을 스트로마 혈관 분획 (SVF) 및 계대 2 (P2) 단계에 대해 나타내었다. 양성 염색 세포의 백분율을 각 패널의 우측 상단에 나타내었다. 청색선은 양성 염색 세포를, 적색선은 이소타입 매칭된 모노클로날 항체 대조군을 나타낸다.

도 3A 및 도 3B를 포함하는 도 3은, 정제 및 계대의 함수에 따른 지방 유도된 세포의 면역표현형의 상대적 변화를 나타내는 일련의 챠트이다. 양성 염색 세포의 백분율을 분리 단계 및 계대 번호에 따라 나타낸다. 도 3A는, 스트로마 세포 관련 마커 CD166, CD73, CD44, 및 CD29 를 나타낸다. 도 3B는 줄기 세포 관련 마커인 인간 다중약물 수송체 (ABCG2) 및 CD34를 나타낸다 (계대 번호의 순서는 도 3B에 대해 도 3A에서는 역순임).

도 4는, 정제 및 계대의 함수에 따른 지방 유도된 세포의 알데하이드 탈수소 효소 염색을 나타낸다.

도 5는, 지방 유도된 세포의 플로우 사이토메트리 히스토그램을 나타내는 그래프이다. 대표 공여자로부터의 선택된 조혈성 마커의 플로우 사이토메트리 히스토그램을 스트로마 혈관 분획 (SVF) 및 계대 2 (P2) 단계에 대해 나타내었다. 양성 염색 세포의 백분율을 각 패널의 우측 상단에 나타내었다. 청색선은 양성 염색 세포를, 적색선은 이소타입 매칭된 모노클로날 항체 대조군을 나타낸다.

도 6은, 정제 및 계대 함수에 따른 지방 유도된 세포의 혼합 림프구 반응 (MLR) 으로 평가한 지방 유도된 세포의 면역원성을 나타내는 그래프이다. 도 5는 단일 공여자로부터의 대표적 MLR을 나타낸다. 자극 세포의 부재하, 자가유래 조사된 (irradiated) PBMC (음성 대조군) 존재하, 동종 조사된 PBMC (양성 대조군) 존재하, 및 지방 유도된 세포 (SVF, PO-P4) 존재하에서, T 세포 증식을 측정하였다. 자극 세포는 웰당 5,000, 10,000, 또는 20,000의 밀도로 존재하였다.

도 7은, 인간 SVF 세포 및 ADAS 세포를 포함하는 인간 지방 유도된 세포의, 2방향 혼합 림프구 반응에서의 면역 억제 효과를 나타내는 챠트이다.

도 8은, MLR로 측정한 골수 스트로마 세포 (BMSC) 및 ADAS 세포 간의 면역 억제 효과를 비교하는 챠트이다. ADAS 및 BMSC 군 간의 차이는 크지 않았다 (p > O.05, Student's t-test).

본 발명은, 지방 조직 유도된 성인 스트로마 (ADAS) 세포가 신규한 면역표현형 및 면역 특성을 소지한다는 발견에 관련된다. ADAS 세포의 신규한 특성은, 세포 및/또는 유전자 치료에서 이들 세포를 사용하고, 분리 및 배양하는 방법을 제공한다. 본 발명은, ADAS 세포를 분리하고 배양하며, 그리고 또한 숙주 또는 이식물에 의한 면역 거부 가능성을 감소시키는, 수용자에게 ADAS 세포를 이식하는 방법 및 조성물을 포함한다.

본 발명은, 수용자의 고유 면역 체계에 의한 이식편에 대한 면역 반응을 감소 및/또는 제거함에 의해, 일례로 생물적합성 격자 또는 공여자 조직, 기관 또는 세포인 이식편의 이식에 유용하다. 하기에 충분히 설명하듯이, ADAS 세포는, 이식편의 동종이식 거부를 억제 및/또는 방지하는 역할을 수행한다.

또한, 본원에 개시되 내용은, ADAS 세포가, 일례로 생물적합성 격자 또는 공여자 조직, 세포 또는 기관인 공여자 이식편에 의한 이식물 대 숙주 질환으로 알려진 수용자 조직에 대항한 원치 않는 면역 반응의 억제 및/또는 방지에 유용함을 나타낸다.

따라서, 본 발명은, 이식의 숙주 거부를 감소 또는 억제하기에 유효한 양의 ADAS 세포로 수용자를 치료함으로써, 수용자 내의 이식편에 대한 면역 반응을 감소 및/또는 제거하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 또한, 수용자에 대항한 공여자 이식편에 의한 부작용성 반응을 억제 또는 감소시키기 위하여 ADAS 세포로 이식 수용자 및/또는 공여자 이식편을 처리함으로써, 이식물 대 숙주 질환인, 숙주에 대항한 외부 이식편에 의한 숙주 내 면역 반응을 감소 및/또는 제거하기 위한 방법 및 조성물이 본 발명에 포함된다.

정의

본원에 사용된 하기 각 용어들은 본 단원에 관련된 의미를 가진다.

본원에 사용된 "a" 및 "an"의 관사들은, 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과를 (즉, 적어도 하나) 일컫는다. 일례로, '한 성분"은, 한 개의 성분 또는 한 개 초과의 성분을 의미한다.

"약"의 용어는, 당업자에 의해 이해되는 것으로, 사용된 내용에 따라 어느 정도 가변이다.

"지방 조직 유도된 세포(adipose tissue-derived cell)"의 용어는, 지방 조직으로부터 기원한 세포를 의미한다. 지방 조직으로부터 분리한 초기 세포군은, 비제한적으로 스트로마 혈관 분획 (SVF) 세포를 포함하는 불균질한 세포군이다.

본원에 사용된 "지방 유도된 스트로마 세포", "지방 조직 유도된 스트로마 세포", "지방 조직 유도된 성인 스트로마 (ADAS) 세포" 또는 "지방 유도된 줄기 세포 ASC)"의 용어는, 상호 교환적으로 사용되며, 비제한적으로 지방세포, 골아세포, 연골세포, 근육 및 신경/교세포주와 같은 각종 상이한 세포 타입에 대한 유사 줄기 세포 전구체로 작용 가능하고, 지방 조직으로부터 기원한 스트로마 세포를 가리킨다. 본 내용에서, ADAS 세포는 비제한적으로 ABCG2 및 ALDH의 발현을 포함하는 신규한 면역표현형 특성을 소지하는 유사 줄기 세포의 실질적으로 균질한 군집을 포함한다. 또한, 본 발명의 ADAS 세포는 T 세포 증식의 유도에 대해 면역원성이지 않다. ADAS 세포는, 표준의 배양 기법 또는 기타 본원에 공지된 방법으로 지방 조직의 기타 성분으로부터 분리 가능한 지방 조직으로부터 유도된 하부군 군집을 구성한다. 추가로 ADAS 세포는, 본원에 개시된 세포 표면 마커를 사용하여 세포 혼합물로부터 분리가능하다.

본원에 사용된 "후기 계대된 (late passaged) 지방 조직 유도된 스트로마 세포"의 용어는, 초기 계대된 세포에 비해 면역원성 특성을 적게 나타내는 세포를 가리킨다. 지방 조직 유도된 스트로마 세포의 면역원성은, 계대의 수에 대응한다. 바람직하게 세포는 적어도 제 2 계대까지 계대되고, 더 바람직하게 세포는 적어도 제 3 계대까지 계대되고, 가장 바람직하게 세포는 적어도 제 4 계대까지 계대되는 것이다.

"지방”은, 임의 지방 조직을 가리킨다. 지방 조직은 갈색 또는 백색 지방 조직일 수 있다. 바람직하게 지방은, 피하 백색 지방 조직이다. 그러한 세포는 1차 세포 배양 또는 불사화 세포주를 포함 가능하다. 지방 조직은 지방 조직을 가지는 임의의 생물체로부터 유래할 수 있다. 바람직하게, 지방 조직은 포유류, 가장 바람직하게 지방 조직은 인간이다. 인간 지방 조직의 간편한 공급원은 지방 흡입 수술로부터이다. 그러나 지방 조직의 공급원 또는 지방 조직의 분리 방법은 본 발명에 있어 절대적인 것이 아니다.

"동종 (allogeneic)"은, 동일 종의 상이한 동물에서 유래한 이식물을 일컫는다.

본원에 정의된 바와 같이 “동종 지방 유래된 성인 스트로마 세포"는, 수용자와 동일한 종의 상이한 개인으로부터 수득한 것이다.

"동종항원"은, 수용자에 의해 발현되는 항원과 상이한 항원이다.

본원에 사용된 "자가 유래"의 용어는, 동일한 개인에서 유래한 임의의 물질로, 상기 개인에게 이후 재도입되는 것을 의미한다.

"이종 (xenogeneic)"은, 상이한 종의 동물로부터 유도된 이식물을 의미한다.

본원에 사용된 "생물적합성 격자"의 용어는, 조직 발달에 도움이 되는 3차원 구조로의 형성을 촉진하는 기질을 이르는 것을 의미한다. 따라서 일례로, 세포외 매트릭스 물질, 합성 중합체, 사이토카인, 성장 인자 등을 포함하는 것과 같은 생물적합성 격자 상에 세포를 배양 또는 시딩 (seeding) 가능하다. 격자는, 조직 타입의 발달 촉진을 위해 목적 형상으로 성형 가능하다. 또한, 적어도 세포 배양의 초기 단계에서, 배지 및/또는 기질에 적절한 조직 타입 및 구조의 발달을 촉진하는 인자들을 보충한다 (일례로, 성장 인자, 사이토카인, 세포외 매트릭스 물질 등).

"공여자 항원”은, 수용자에게 이식될 공여자 조직에 의해 발현되는 항원을 가리킨다.

본원에서 사용한 “분화 배지”는, 첨가제를 함유 또는 첨가제를 함유하지 않으며, 배지 중에서 인큐베이션시에 완전 분화되지 않은 줄기 세포, 지방 유도된 성인 스트로마 세포 또는 기타 다른 선조 세포가, 분화된 세포의 일부 또는 모든 특성을 가지는 세포로 발달하게 하는 세포 성장 배지를 가리킨다.

본원에 사용된 "효과자 세포(effector cell)"는, 항원에 대항하여 면역반응을 매개하는 세포를 가리킨다. 수용자에게 이식편이 도입되는 경우, 효과자 세포는 공여자 이식편 내에 존재하는 항원에 대항하여 면역 반응을 일으키는 수용자 고유의 세포일 수 있다. 다른 경우에서, 효과자 세포는, 이식편의 일부일 수 있고, 이식편을 수용자에게 도입하는 것은, 이식편 내에 존재하는 효과자 세포가 이식편의 수용자에 대항한 면역 반응을 야기하게 한다.

본원에서 사용된 “확대성(Expandability; 또는 팽창성)”은, 세포의 증식 용량, 일례로, 개수의 확대 또는 세포 군집의 경우 군집 배가 (doubling)로 진행하는 것을 가리킨다.

"이식물 (graft)"은, 세포, 조직, 장기 또는 기타 이식을 위한 임의의 생물적합성 격자를 일컫는다.

“성장 인자”는, 비제한적으로 하기를 포함하는 특정 인자를 의미한다; 피코그램/ml 내지 밀리그램/ml 수준 농도의 성장 호르몬, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 대식세포 컬러니 자극 인자, c-kit 리간드/줄기 세포 인자, 골프로테게린 리간드, 인슐린, 유사 인슐린 성장 인자, 상피 성장 인자 (EGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 신경 성장 인자, 섬모 신경영양 인자, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 및 골 형성 단백질.

본원에 사용한 “성장 배지”의 용어는, 세포 성장을 촉진하는 배양 배지를 의미하는 것이다. 성장 배지는 보통 동물 혈청을 포함한다. 일부 예에서 성장 배지는 동물 혈청을 포함하지 않을 수 있다.

본원에 사용한 세포의 "면역표현형"은, 세포의 표면 단백질 프로필로서의 세포의 표현형을 가리킨다.

"분리된 세포"는, 조직 또는 포유류에서 분리된 세포를 천연적으로 수반하는 기타 성분 및/또는 세포로부터 분리된 세포를 의미한다.

본원에 사용된 “다분화능” 또는 “다분화능성”의 용어는, 중추 신경계의 줄기 세포가 한 종류 이상의 세포로 분화 가능한 능력을 가리키는 것이다.

본원에 사용된 "조절"의 용어는, 증가, 감소 등의 생물적 상태의 임의의 변화를 가리키는 의미이다.

본원에 사용된 "비면역원성"의 용어는, ADAS 세포가 MLR 내에서 T 세포 증식을 유도하지 않는다는 발견을 의미하는 것이다. 그러나, 비면역원성이 MLR 내에서의 T 세포 증식에 제한되는 것은 아니며, 오히려 ADAS 세포가 생체내 T 세포 증식을 유도하지 않는다는 것에 또한 적용되어야 한다.

본원에 사용된 “증식”의 용어는, 유사 형태, 특히 세포의 재생 또는 증가를 가리키는 것이다. 즉, 증식은, 많은 수의 세포의 생산을 포괄하며, 다른 방법 중에서, 세포 내로 혼입되는 ³H-티미딘을 측정함 등에 의해 세포의 개수를 간단히 계수하여 측정 가능하다.

본원에 사용된 "세포 주기의 또는 주기로의 진행"의 용어는, 세포가 체세포 분열 및/또는 감수분열을 준비 및/또는 진입하는 과정을 의미하는 것이다. 세포 주기로의 진행은, G1 상, S 상, G2 상 및 M 상으로의 진행을 포함한다.

“전구 세포", "선조 세포", 및 "줄기 세포"의 용어들은, 당업계 및 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 다능성 또는 계통-비결정된 선조세포를 가리키며, 이는 잠정적으로 비제한적인 횟수의 체세포 분열 가능한 것으로, 이에 따라 그 자신을 재생 또는 목적 세포 타입으로 분화하게 되는 자손세포를 생산하는 것이다. 다능성 줄기 세포와 달리, 계통 결정된 선조 세포는, 상호간 표현형이 상이한 각종 세포 타입을 발생하지 못하는 것으로 보통 간주된다. 대신 선조 세포는, 하나 또는 가능하게는 두 개의 계통 결정된 세포 타입으로 발전한다.

“스트로마 세포 배지”로 본원에 사용된 용어는, ADAS 세포 배양에 유용한 배지를 가리킨다. 스트로마 세포 배지의 예는, DMEM/F 12 Ham's, 10% 소 태아 혈청, 100U 페니실린/100㎍ 스트렙토마이신/0.25㎍ 펀지온을 포함하는 배지이다. 보통, 스트로마 세포 배지는, 기본 배지, 혈청 및 항생제/항진균제를 포함한다. 그러나 ADAS 세포는 항생제/항진균제가 없고 하나 이상의 성장 인자가 보충된 스트로마 세포 배지로도 배양 가능하다. 바람직하게, 성장 인자는 인간 상피 성장 인자 (hEGF)이다. hEGF의 바람직한 농도는 약 1-50ng/ml, 더 바람직하게는 약 5ng/ml 농도이다. 바람직한 기본 배지는 DMEM/F12 (1:1)이다. 바람직한 혈청은 소 태아 혈청 (FBS)이나, 말 혈청 또는 인간 혈청을 포함하여 다른 혈청을 사용 가능하다. 바람직하게, 상기 배지에 최대 20%의 FBS를 가하여 스트로마 세포의 성장을 유지한다. 그러나 FBS 중에 스트로마 세포 성장에 필요한 성장 인자, 사이토카인, 및 호르몬이 확인되고, 성장 배지 중에 이들이 적절한 농도로 제공된다면, 규정된 배지를 사용할 수도 있다. 나아가 배양 배지에는 또한 추가의 성분을 첨가할 수 있음이 인지된다. 비제한적인 그러한 성분은, 항생제, 항진균제, 알부민, 성장 인자, 아미노산 및 기타 세포 배양을 위하여 당업계에 공지된 성분들을 포함한다. 배지에 첨가 가능한 비제한적인 항생제는, 페니실린 및 스트렙토마이신이다. 배양 배지 중의 페니실린 농도는 약 10 - 약 200 유닛/ml 이다. 배양 배지 중의 스트렙토마이신 농도는 약 10 - 약 200 ㎍/ml 이다. 그러나 본 발명은 스트로마 세포 배양을 위해 임의의 한 배지에 제한되지 않는다는 점을 이해하여야한다. 오히려, 조직 배양 중에 스트로마 세포를 유지할 수 있는 임의의 배지가 사용 가능하다.

본원에 사용된 "실질적으로 정제된" 세포는, 다른 세포 타입을 본질적으로 갖지 않는 세포이다. 따라서, 실질적으로 정제된 세포는, 천연 발생 상태에서는 보통 함께하는 기타 세포 타입으로부터 정제된 세포를 의미한다.

"이식편(transplant)"은, 이식될 생물적합성 격자 또는 공여자 조직, 기관 또는 세포를 가리킨다. 비제한적인 이식물의 예는, 조직, 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 피부 세포, 골수 및, 심장, 췌장, 신장, 폐 및 간과 같은 고형 기관을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "치료적으로 유효한 양"은, 세포가 투여되는 대상에게 유익한 효과를 제공하기에 충분한 ADAS 세포의 양을 의미한다.

본원에 사용된 어구 내의 "효과자 세포에 대한 동종항원에 대항한 수용자 내의 효과자 세포의 면역 반응을 감소하기 위해 이식 수용자를 치료함"의 용어는, 일례로 수용자에게 ADAS 세포를 투여하는 임의의 방법에 의해, ADAS 세포로 치료하지 않았고 나머지는 동일한 동물에서 내재적 면역 반응과 비교하여, 수용자 내에서의 동종 항원에 대항한 내재적 면역 반응을 감소시킨다는 의미이다. 내재적 면역 반응의 감소는, 본원 기재의 방법 또는 동물에서 내재적 면역 반응을 평가하는 임의의 다른 방법으로 평가 가능하다.

본원에 사용된 "내재적"은, 생물, 세포 또는 시스템 내부로부터의 또는 거기에서 생성되는 임의의 물질을 가리킨다.

"외래"는, 생물, 세포 또는 시스템 외부로부터 도입되는 또는 거기에서 생성되는 임의의 물질을 가리킨다.

"인코딩하는 (encoding)"은, 일례로 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 중의 뉴클레오티드의 특정 서열의 본질적 성질로서, 뉴클레오티드의 규정된 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는, 이에서 비롯되는 생물적 성질 및 규정된 아미노산 서열을 가지는, 생물 과정상 다른 중합체 및 고분자의 합성에서 주형으로 작용하는 것이다. 따라서 유전자에 해당하는 mRNA의 전사 및 번역이, 세포 내에서 또는 다른 생물 시스템에서 단백질을 생성하면, 유전자는 단백질을 인코딩하는 것이다. mRNA 서열과 동일하고 보통 서열 목록으로 제공되는 뉴클레오티드 서열인 코딩 (coding) 가닥 및, 유전자 또는 cDNA의 전사 주형으로 사용되는 비코딩 (non-coding) 가닥 모두, 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 생성물을 인코딩하는 것으로 언급 가능하다.

달리 특정되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은, 상호의 퇴화형 (degenerate version)이면서 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함 가능하다.

"단리된 핵산"은, 일례로, 천연에서 발생하는 게놈 내의 단편에 인접한 서열인, 일례로, 단편에 보통 인접한 서열들로부터 제거된 DNA 단편인, 천연 발생 상태에서 가장자리에 놓인 (flanking) 서열들로부터 분리한 핵산 조각 또는 단편을 가리킨다. 상기 용어는 또한, 세포 내에서 천연으로 수반되는 일례로 RNA 또는 DNA인 핵산 또는 단백질과 천연에서 수반되는 기타 성분들로부터 실질적으로 정제한 핵산에 적용된다. 상기 용어는 따라서, 일례로, 벡터, 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스 또는 진핵 또는 원핵의 게놈 DNA에 혼입된 재조합 DNA, 또는 다른 서열과 독립적으로 별도의 분자로 존재하는 것 (일례로, PCR 또는 제한 효소 분해에 의해 생성되는 게놈 또는 cDNA 단편 또는 cDNA)을 포함한다. 이는 또한, 추가의 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.

본 발명의 내용에서 통상 발생하는 핵산 염기에 대한 하기의 약어를 사용한다. "A"는 아데노신, "C"는 시토신, "T"는 티미딘", "G"는 구아노신을 의미하고 "U"는 우리딘을 의미한다.

본원에 사용된 "전사 조절하" 또는 "작동적으로 연결된"의 어구는, RNA 폴리머라제 개시 및 폴리뉴클레오티드의 발현 조절을 위해 프로모터가 폴리뉴클레오티드에 대해 올바른 위치 및 방향에 존재함을 의미한다.

본원에 사용된 "프로모터/조절 서열"의 용어는, 프로모터/조절 서열에 작동적으로 연결된 유전자 생성물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 경우에서, 상기 서열은 중심 프로모터 서열이고 다른 경우에서는 상기 서열은 유전자 생성물의 발현을 위해 필요한 기타 조절 서열 및 인핸서 서열을 포함 가능하다. 프로모터/조절 서열은, 일례로 조직 특이적 방식으로 유전자 생성물을 발현하는 것일 수 있다.

"구성적" 프로모터는, 유전자 생성물을 인코딩하거나 특정화하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결시, 세포의 대부분 또는 전체적 생리 조건하에서 세포 내에서 유전자 생성물의 생성을 도모하는 뉴클레오티드 서열이다.

"유도가능" 프로모터는, 유전자 생성물을 인코딩하거나 특정화하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결시, 프로모터에 해당하는 유도자가 세포 내에 존재하는 경우에만, 세포 내에서 유전자 생성물의 실질적 생성을 도모하는 뉴클레오티드 서열이다.

"조직 특이적" 프로모터는, 유전자 생성물을 인코딩하거나 특정화하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결시, 세포가, 프로모터에 해당하는 조직 타입의 세포인 경우에만 세포 내에서 유전자 생성물의 실질적 생성을 도모하는 뉴클레오티드 서열이다.

"벡터"는, 세포 내부에 단리된 핵산을 전달하기 위하여 사용되며, 단리된 핵산을 포함하는 물질의 조성물이다. 각종 벡터가 당업계에 공지이고, 비제한적으로는 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친성 화합물 관련 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함한다. 따라서 "벡터"라는 용어는 자발적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는, 일례로, 폴리라이신 화합물, 리포좀 등과 같이 세포 내로의 핵산 전달을 촉진하는 비플라스미드 및 비바이러스성 화합물을 포함하는 것으로 또한 이해되어야 한다. 제한이 아닌 예로써의 바이러스성 벡터는, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함한다.

"발현 벡터"는, 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 가리킨다. 발현 벡터는, 발현에 충분한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주세포에 의해 제공되거나, 시험관내 발현시스템 내로 제공 가능하다. 발현 벡터는, 일례로 코스미드, 플라스미드 (일례로 그 자체 또는 리포좀에 포함된 것) 및 재조합 뉴클레오티드를 혼입하는 바이러스와 같이 당업계 공지의 모든 것을 포함한다.

설명

본 발명은 상이한 개인으로부터 수득한 T 세포 (동종 T 세포)와 지방 조직 유도된 성인 스트로마 세포 (ADAS)를 접촉시키면 동종 T 세포가 증식하지 않는다는 발견에 관련된다. 선행 기술의 도그마는, T 세포가 다른 세포 타입과 혼합될 때 T 세포 증식이 일어난다는 것을 제시한다. 혼합된 림프구 반응 (MLR)은 면역원성 (즉, MLR로 측정한, 세포가 T 세포 증식을 유도하는 활성) 평가를 위한 표준의 방법이다. 본원에 개시된 결과는, 한 개인으로부터 유도된 T 세포가 다른 개인으로부터 수득한 ADAS 세포에 비반응성임을 시사한다. 따라서, 본원의 기재내용을 바탕으로, ADAS 세포는 T 세포 반응을 도모하는 면역 시스템에 대해 면역원성이 아닌 것이다.

본 발명의 한 구현에서, ADAS 세포의 면역표현형 및 면역원성은, 계대의 수에 대응한다. 본 기재의 내용을 바탕으로, 초기 계대된 세포에 비해 더 나중에 계대된 세포는 면역원성이 약하다. 바람직하게, 세포는 2 계대 이상 계대된 것이다. 바람직하게, 세포는 3 계대 이상 계대된 것이다. 더 바람직하게, 세포는 4 계대 이상 계대된 것이다.

본 발명의 다른 구현에서, 세포는 분리후 배양 가능하며, 적당하다면, 치료적 사용 이전에 그 면역원성 및 면역표현형에 대해 어세이된다. 바람직하게, 세포는 5 계대 이상 계대 가능하다. 더 바람직하게, 세포는 10 계대 이상 계대 가능하다. 일례로 세포는 15 계대 이상, 바람직하게 16 계대 이상, 더 바람직하게 17 계대 이상, 더욱더 바람직하게 18 계대 이상, 바람직하게 19 계대 이상, 또는 20 계대 이상 그 다분화능을 잃지 않고 계대 가능하다. 본원에 기재된 내용을 바탕으로, 당업자는, 본 세포가 면역원성이 아니고 따라서 포유류 이식에 유리한 것임을 인지할 것이다.

상이한 개인에서 T 림프구에 대한 본 발명 ADAS 세포의 비면역원성 표현형에 추가하여, 본 기재 내용을 바탕으로 당업자는, 동종성 세포간, 일례로 한 개인의 T 세포 및 다른 개인의 말초성 혈액 단핵 세포 (PBMC) 간의 MLR을 ADAS 세포가 억제 가능함을 인지할 것이다. 한 면에서, ADAS 세포는 상이한 개인들에게서 각각 수득된 T 세포 및 PBMC 간의 MLR에서의 동종 T 세포 반응을 활발하게 감소시킬 수 있다.

또한, 본원의 다른 곳에서 자세히 설명되듯이, ADAS 세포의 면역표현형은 세포 배양에 사용되는 방법에 관련된다. 일례로, ADAS 세포의 면역표현형은, 비제한적으로, 분리 단계, 계대 수, 세포가 부착성 군집으로 배양되었는지의 여부 및 배양 시간 길이의 함수로 정의된다. 본 내용을 바탕으로, ADAS 세포는 세포 및/또는 유전자 치료 요법에 성공적으로 사용 가능하다. 즉, 본 발명 세포는 세포가 개인에게 이식될 때, 이식물의 숙주에 의해 면역거부되는 가능성을 감소시킨다. 또한, ADAS 세포는, 이식편의 숙주 거부를 억제하기 위한 치료제로 사용 가능하며, 이식 이후 이식물 대 숙주 질환을 방지 또 다르게는 억제하기 위한 치료제로 사용 가능하다. 따라서, 본 발명은 실험/치료 목적을 위해 유용한 ADAS 세포 생성 방법 및 조성물을 포함한다.

I. ADAS 의 분리 및 배양

본 발명 방법에 유용한 ADAS 세포는, 당업자 공지의 각종 방법으로 분리 가능하다. 일례로 미국 특허 6,153,432에 개시된 방법은, 그 전체가 본원의 참조로 편입된다. 바람직한 방법에서, ADAS 세포는 바람직하게 인간 대상인 포유류 대상으로부터 분리된다.

지방 유도된 세포의 면역표현형은 배양 기법 (즉 계대수)에 따라 점진적으로 변화한다. 플라스틱에 대한 부착성 및 인간 지방 유도된 세포의 후속 확대는, 상대적으로 균질한 세포 군집을 선택하는 것으로서, 미정제 스트로마 혈관 분획의 불균질성에 비해 "스트로마" 면역표현형을 발현하는 세포를 풍부하게 하는 것이다. ADAS 세포는 또한 비제한적으로 인간 다중약물 수송체 (ABCG2) 및 알데하이드 탈수소효소 (ALDH)를 포함하는 줄기 세포 관련 마커를 발현한다.

본 내용을 바탕으로, 지방 유도된 세포의 면역표현형은, ADAS 세포에 대한 독특한 확인자로 사용되도록 이용 가능하다. 즉, 본 발명 세포 상의 독특한 세포 표면 마커는, 지방 조직에서 유도된 세포의 혼합 군집으로부터 특정 세포의 하부 군집을 분리하는데 사용 가능하다. 당업자는, 세포 표면에 특이적인 항체를 물리적 지지체 (즉 스트렙타비딘 비드)에 컨쥬게이션(conjugation)하여 세포 표면 특이적 지방 유도된 세포의 분리 기회를 제공 가능함을 인지할 수 있다. 분리된 세포는 이후 본원 기재 방법 또는 통상의 방법을 사용하여 시험관내에서 배양 및 확대 가능하다.

본 발명 추가의 구현은, 지방 조직으로부터 유도된 세포의 하부군집을 고갈 또는 분리하는 방법을 포함한다. 본 발명은, 지방 조직에서 유도된 세포의 면역표현형이 계대 수의 함수임을 발견한 것에 관련된다. 따라서, ADAS 세포와 같은 특이적 세포 군집은, 세포 혼합 군집 내에서 ADAS 세포에 특이적으로 결합하는 항체와 인큐베이션하고, 비제한적으로 자기적 분리를 포함하는 후속 분리 단계에 의해 지방 조직으로부터 유도된 그러한 세포들의 혼합 군집으로부터 고갈 가능하다. ADAS 세포에 특이적으로 결합하는 항체의 비제한적인 예는, 항-ABCG2 항체를 포함한다. 자기적 분리의 과정은, 비제한적으로 Dynabeads® (Dynal Biotech, Brown Deer, WI)를 포함하는 자기 비드를 이용하여 수행된다. Dynabeads® 의 사용에 추가하여 MACS 분리 시약 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)은, 세포들의 혼합 군집으로부터 ADAS를 고갈시키기 위해 사용 가능하다. 분리 단계의 결과, 풍부화된 ADAS 세포 군집을 수득 가능하다. 바람직하게 ADAS 세포 군집은 정제된 세포 군집이다.

본 발명 세포의 면역표현형은, 플로우 사이토메트리 세포 분리기를 사용하여 특이적 지방 유도된 세포를 분리하기 위한 방법을 제공한다. 바람직하게, ADAS 세포는 본원에 기재된 방법으로 분리된다. 분리된 ADAS 세포는, 이후 시험관내에서 배양하여 치료 또는 실험 목적에 유용한 목적하는 수의 세포를 생성할 수 있다.

ADAS를 배양하기 위해, 세포 배양 내에서 섬유아세포를 지지할 수 있는 임의의 매질을 사용 가능하다. 섬유아세포 성장을 지지하는 배지 제형은 비제한적으로 다음을 포함한다; 최소 필요 배지 이글, ADC-1, LPM (무 소혈청 알부민), FlO (HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지(Fitton-Jackson 변형과 함께 또는 없이), 기본 배지 이글 (Earle 염 베이스 첨가와 함께인 BME), 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM-혈청 없음), 야만(Yamane), IMEM-20, 글래스고우 변형 이글 배지 (GMEM), Leibovitz L-15 배지, McCoy's 5A 배지, 배지 M199 (Earle 염 베이스와 함께인 M199E), 배지 M199 (Hank 염 베이스와 함께인 M199H), 최소 필요 배지 이글 (Earle 염 베이스와 함께인 MEM-E), 최소 필요 배지 이글 (Hank 염 베이스와 함께인 MEM-H) 및 최소 필요 배지 이글 (비필수 아미노산과 함께인 MEM-NAA) 등. ADAS 배양에 바람직한 배지는 DMEM, 더 바람직하게는 DMEM/F12 (1:1)이다.

본 발명 방법에 사용하기 유용한 추가의 비제한적인 배지의 예는, 적어도 1% -약 30%, 더 바람직하게는 약 5% - 15%, 가장 바람직하게는 약 10%의 농도로 소 또는 다른 종의 태아 혈청을 함유 가능하다. 닭 또는 다른 종의 배아 추출물은 약 1% - 30%, 바람직하게 약 5% - 15%, 가장 바람직하게는 약 10%의 농도로 존재 가능하다.

분리 이후, ADAS 세포는 배양기 내 스트로마 세포 배지 내에서 일정 시간 또는, 다른 배양기로 세포가 옮겨지기 전에 세포가 컨플루언시에 이를 때까지 배양된다. 초기 플레이팅 이후, 세포를 약 6일간 배양 유지하여 계대 0 (P0) 군집을 수득한다. 세포는 무제한 횟수로 계대 가능하며, 각 계대는 세포를 약 6-7 일간 배양함을 포함하고, 이 기간 동안 세포 배가 시간은 3-5일 범위일 수 있다. 배양기는, 시험관내 세포 배양을 위해 통상 사용되는 임의의 배양기일 수 있다. 바람직한 배양기는, 배양 플라스크이고 더 바람직한 배양기는 T-225 배양 플라스크이다.

ADAS 세포는, 항생제/항진균제의 부재하에 hEGF가 보충된 스트로마 세포 배지 내에서 일정 시간 또는, 세포가 일정 수준의 컨플루언시(confluency)에 이를 때까지 배양 가능하다. 바람직하게, 컨플루언시의 수준은, 70% 초과이다. 더 바람직하게, 컨플루언시의 수준은, 90% 초과이다. 상기 시간은 시험관내에서 세포 배양에 적당한 임의의 시간이다. 스트로마 세포 배지는, ADAS 세포 배양의 임의 시점에서 교체 가능하다. 바람직하게, 스트로마 세포 배지는 3-4일마다 교체한다. 이후 ADAS 세포를 배양기로부터 수확하여, ADAS 세포는 즉시 사용 또는 후일 사용을 위해 동결 보관된다. ADAS 세포는 트립신화, EDTA 처리, 또는 배양기로부터 세포를 수확하기 위해 사용되는 임의의 다른 방법으로 수확 가능하다.

본원에 개시된 ADAS 세포는 통상 방법에 따라 동결 보관 가능하다. 바람직하게, 액체 질소 증기상 내에 10% DMSO를 함유한 스트로마 세포 배지 중에 약 백만 내지 천만 개의 세포를 동결 보관한다. 동결 세포는 37℃ 배쓰 내에서 저어가면서 해동하고 새로운 성장 배지 내에 재현탁하여 통상대로 성장시킨다.

본 발명은 또한 ADAS 세포의 면역표현형이 계대 수의 함수라는 발견에 관련된다. ADAS 세포의 면역표현형 및 면역원성 특성이 배양 기법의 함수로 규정된다 (즉, 부착 특성, 계대 수, 배양 시간 길이). 본 내용은, 갓 분리한 스트로마 혈관 분획 (SVF) 세포 및 초기 계대 ADAS 세포가 PBMC를 자극하지만, 후기 계대된 ADAS 세포가 면역원성이 아님을 시사한다.

인간 SVF 세포 및 지방 조직에서 유도된 초기 계대 부착성 세포는, 동종 PBMC에 필적하는 투여량 의존적인 MLR 반응을 유도하는 것으로 관측되었다. 점진적 계대에 따라, ADAS 세포는, 계대 1에 의해 (P1) 자가유래 PBMC에 대해 관측되는 것에 필적하는 수준으로 감소된 MLR 반응을 유도한다. 상기 세포는, 무제한 횟수로 계대 가능하다. 실제로, 후기 계대된 ADAS 세포는 면역원성이지 않다. 일례로 세포는 적어도 P2까지 계대하고; 더 바람직하게는 세포는 적어도 P3 까지 계대하고; 더 바람직하게는 세포는 적어도 P4까지 계대한다. 후기 계대된 ADAS 세포의 관측된 면역원성 결핍 특성은, 세포/유전자 치료 요법을 위한 포유류에게 ADAS 세포를 투여함과 관련된 숙주 또는 이식물에 의한 면역 거부의 발생 가능성이 감소됨을 나타낸다.

본 내용에 따라, 또한, 알려진 자극 세포에 대한 PBMC의 증식성 반응을 억제하는 면역 억제 인자를 후기 계대된 세포가 발현 가능한 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명의 세포는, 이들이 도입되는 포유류 내에서 면역 억제 효과를 유도하기 위해 사용 가능하다. 일례로, 자극 세포로서 동종 PBMC의 존재하에 MLR에 첨가시, 후기 계대된 세포는 증식성 반응을 억제할 수 있다.

본 발명에 포괄된 것으로서, ADAS 세포는 인간으로부터의 지방 흡입 물질로부터 보통 분리된다. 본 발명의 세포를 인간 대상에게 이식하는 경우에 있어서, 자가유래 이식편을 제공하도록 동일 대상으로부터 ADAS 세포를 분리하는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명에서는 동종 이식편 또한 고려의 대상이다.

따라서, 본 발명의 다른 면에서, 투여된 ADAS 세포는 수용자에 대하여 동종성일 수 있다. 동종 ADAS 세포는, 수용자와 동일종의 상이한 개인인 공여자로부터 분리 가능하다. 분리 이후, 세포를 본원 개시의 방법으로 배양하여 동종 생성물을 제조한다. 본 발명은 또한 수용자에 대해 이종성인 ADAS 세포를 포함한다.

II . 이식편의 숙주 거부 억제 치료 요법

본 발명은, 숙주의 이식편 거부 억제 치료 요법으로서의 ADAS 세포의 사용 방법을 포함한다. 본 발명은, ADAS 세포가 동종 T 세포 증식을 자극하지 않는다는 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은, 외래 기관, 세포 또는 조직의 이식에 대응한 T 세포 증식을 억제하기 위해 ADAS 세포를 사용함을 포함한다. 본 발명은 또한, T 세포 증식에 대해 면역 반응을 감소시키기에 유효한 양으로 포유류에게 ADAS 세포를 투여하는 방법을 포함한다.

당업자는, 본원에 제공된 내용을 기초로, 포유류에게 이식 또는 상이한 개인으로부터 수득한 임의 타입의 기관, 세포 또는 조직에 대응하여 T 세포 증식을 억제하기 위해 ADAS 세포를 사용할 수 있음을 인지 가능하다. 일례로, 비제한적으로 신경 줄기 세포 (NSC), 간 세포, 심장 세포, 연골 세포, 신장 세포, 지방 세포 등을 포함하는 세포에 대한 T 세포 증식을 ADAS 세포를 사용하여 억제 가능하다.

본 발명은, 숙주의 이식편 거부를 감소 또는 억제하기에 유효한 양의 ADAS 세포를 이식편 수용자에게 투여하여 수용자 내에서의 이식편에 대한 면역 반응을 감소 및/또는 제거하는 방법을 포함한다. 임의의 특정 이론에 구애되기를 바라지 않으면서, 이식편 수용자에게 투여되는 ADAS 세포는 수용자 T 세포의 활성화 및 증식을 억제한다.

이식편은, 생물적합성 격자 또는 이식될 공여자 조직, 기관 또는 세포를 포함한다. 이식편의 예로 비제한적으로는, 줄기 세포, 피부 세포 또는 조직, 골수, 및 심장, 췌장, 신장, 간 및 폐와 같은 고형 기관을 포함한다. 바람직하게, 이식편은 인간 NSC 이다.

본원의 내용을 기초로, ADAS 세포는, 일례로 조직 공여자, 이식 수용자 또 다르게는 비관련 공급원 (완전 상이한 개체 또는 종)과 같은 임의의 공급원으로부터 수득 가능하다. ADAS 세포는 T 세포에 대해 자가 유래 (동일한 숙주로부터 수득) 또는 T 세포에 대해 동종일 수 있다. ADAS 세포가 동종인 경우, ADAS 세포는 T 세포가 반응하는 이식편에 대해 자가유래일 수 있거나 또는 ADAS 세포는 T 세포 공급원 및 세포가 반응하는 이식편의 공급원 모두에 대해 동종인 개체로부터 수득 가능하다. 또한, ADAS 세포는 T 세포에 대해 이종성일 수 있으며 (상이한 종의 동물로부터 수득), 일례로 래트 ADAS 세포를 인간 T 세포의 활성화 및 증식 억제를 위해 사용 가능하다.

추가의 구현에서, 본 발명에 사용되는 ADAS 세포는, 비제한적으로 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 기본 (gibbon), 소를 포함한 포유류 임의의 종의 지방 조직으로부터 분리 가능하다. 바람직하게 ADAS 세포는, 인간, 마우스 또는 래트로부터 분리된다. 더 바람직하게, ADAS 세포는 인간으로부터 분리된다.

본 발명의 다른 구현은, 이식편의 수용자에 대한 ADAS 세포 투여 경로를 포함한다. ADAS 세포는, 즉 이식할 생물적합성 격자, 또는 공여자 조직, 기관 또는 세포인 이식편의 제공에 적당한 경로로 투여 가능하다. ADAS 세포는, 전신, 즉 비경구, 정맥내 주사로 투여되거나 특정 조직 또는 기관에 대해 표적화 가능하다. ADAS 세포는 피하 임플랜트 또는 세포를 일례로 근육과 같은 연결 조직에 주사함으로써 투여 가능하다.

ADAS 세포는 약 0.01 내지 약 5 X 10⁶ 세포/ml의 농도로 적절한 희석제 내에 현탁 가능하다. 주사 용액을 위한 적절한 부형제는, ADAS 세포 및 수용자에게 생물 및 생리적으로 적합한 것으로, 완충화된 식염 용액 또는 기타 절절한 부형제와 같은 것이다. 투여용 조성물은, 적절한 소독 및 안정성에 따르는 표준 방법에 따라 제형화, 제조 및 저장 가능하다.

ADAS 세포의 투여량은, 광범위하게 가변이며, 각 특정 경우의 개인의 필요에 따라 조절 가능하다. 사용되는 세포의 개수는, 수용자의 체중 및 증상, 투여의 회수 및/또는 빈도, 및 기타 당업자에게 공지인 변수에 의존한다.

체중 100kg 당 약 10⁵ 내지 약 10¹³ 개의 ADAS 세포를 개인에게 투여 가능하다. 일부 구현에서는 100kg 체중 당 약 1.5 x 10⁶ 내지 약 1.5 x 10¹²개의 세포를 투여한다. 일부 구현에서는 100kg 체중 당 약 1 x 10⁹ 내지 약 5 x 10¹¹개의 세포를 투여한다. 다른 구현에서는 100kg 체중 당 약 4 x 10⁹ 내지 약 2 x 10¹¹개의 세포를 투여한다. 또 다른 구현에서는 100kg 체중 당 약 5 x 10⁸ 내지 약 1 x 10¹⁰개의 세포를 투여한다.

본 발명의 다른 구현에서, ADAS 세포는, 이식편의 숙주 거부를 제거 및/또는 감소시키기 위하여 이식편 이전 또는 동시에 수용자에게 투여된다. 임의의 특정 이론에 구애되기를 바라지 않으면서, ADAS 세포는 수용자의 T 세포에 의한 이식편에 대한 면역 반응을 감소, 억제 또는 제거하기에 유효한 양으로, 이식편의 이식 이전 또는 동시에 수용자에게 ADAS 세포를 투여함으로써 이식편에 대한 수용자 면역 체계 조절에 사용 가능한 것이다. ADAS 세포는, 이식편의 존재시에 T 세포 반응을 감소, 억제 또는 제거하도록 수용자의 T 세포에 영향을 끼친다. 따라서 이식의 이전 또는 동시에 수용자에게 ADAS 세포를 투여함으로써 이식편의 숙주 거부를, 피할 수 있거나 또는 그 중증도를 감소시킬 수 있다.

다른 구현에서, ADAS 세포는, 이식편의 투여 이후 이식편 수용자에게 투여 가능하다. 또한, 본 발명은, 이식편의 숙주 거부로 또한 알려진, 이식편에 대한 면역 반응을 감소, 억제 또는 제거하기에 유효한 양의 ADAS 세포를 환자에게 투여하여 이식편에 대한 면역 부작용을 겪는 환자를 치료하는 방법을 포함한다.

III . 이식후 이식물 대 숙주 질환을 억제하는 치료 요법

본 발명은, 이식후 이식물 대 숙주 질환을 억제하는 치료 요법으로 ADAS 세포를 사용하는 방법을 포함한다. 본 발명은, ADAS 세포가 동종 T 세포의 증식을 자극하지 않는다는 발견에 기초한다. ADAS 세포는 MLR 반응에서 T 세포의 증식을 억제하는 것으로 고려된다. 본 발명은 또한 T 세포 증식에 대한 면역 반응을 감소시키기에 유효한 양의 ADAS 세포를 포유류에게 투여하는 방법을 포함한다.

본 발명은 또한, 수용자에 대한 공여자 이식편에 의한 면역 반응 (즉, 이식물 대 숙주 질환)을 감소 및/또는 제거하기 위한 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은, 수용자에게 이식편을 이식하기 이전에 ADAS 세포와, 일례로 생물적합성 격자 또는 공여자 조직, 기관 또는 세포, 바람직하게는 신경 줄기 세포인 공여자 이식편을 접촉시키는 방법을 포함한다. ADAS 세포는, 수용자에 대항한 공여자 이식편에 의한 부작용성 반응을 완화, 억제 또는 감소시키는 작용을 한다.

본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, ADAS 세포는, 이식편의 수용자에 대항한 이식편에 의한 원치않는 면역 반응을 제거 또는 감소시키기 위한 용도로, 임의의 공급원, 일례로 조직 공여자, 이식 수용자 또는 기타 미관련 공급원 (완전 상이한 개인 또는 종)으로부터 수득 가능하다. 따라서, ADAS 세포는 조직 공여자, 이식편 수용자 또는 기타 미관련 공급원에 대해 자가유래, 동종 또는 이종일 수 있다.

본 발명의 한 구현에서, 이식편을 수용자에게 이식편을 이식하기 이전에 ADAS 세포에 노출시킨다. 이러한 경우, 임의의 동종 반응성 수용자 세포에 의해 야기되는 이식편에 대항한 면역 반응이, 이식편 내에 존재하는 ADAS 세포에 의해 억제된다. ADAS 세포는, 수용자에 대해 동종성일 수 있고, 공여자 또는 공여자 또는 수용자 이외의 공급원에서 유도된 것일 수 있다. 일부 구현에서, 수용자 자가 유래의 ADAS 세포를 사용하여 이식편에 대한 면역 반응을 억제 가능하다. 다른 경우에서, 수용자에 대해 이종성인 ADAS 세포, 일례로 마우스 또는 래트 ADAS 세포를 사용하여 이식편에 대한 면역 반응을 억제 가능하다. 그러나, 본 발명에서는 인간 ADAS 세포의 사용이 바람직하다.

수용자에게 이식편의 이식 이전에 ADAS 세포로 이식편을 처리하는 것에 추가하여, 공여자 이식편을, 이식편과 관련될 수 있는 T 세포 활성화를 위해 이식 이전에 수용자의 세포 또는 조직으로 "선조절" 또는 "선처리" 가능하다. 수용자의 세포 또는 조직으로 이식편 처리 이후, 세포 또는 조직을 이식편으로부터 제거 가능하다. 처리한 이식편은 이후 수용자의 세포 또는 조직의 처리에 의해 활성화된 T 세포의 활성 감소, 억제 또는 제거를 위해 ADAS 세포로 추가 접촉시킬 수 있다. ADAS 세포로 이식편을 처리한 이후, ADAS 세포는 수용자로의 이식 이전에 이식편으로부터 제거 가능하다. 그러나, 일부 ADAS 세포는 이식편에 부착되어 이식편과 함께 수용자에게 도입될 수 있다. 이러한 경우, 수용자에게 도입된 ADAS 세포는 이식편 관련한 임의의 세포에 의해 야기되는 수용자에 대항한 면역 반응을 억제 가능하다. 임의의 특정 이론에 구애되기를 바라지 않으면서, 수용자에게 이식편을 이식하기 이전에 ADAS 세포로 이식편을 처리하는 것은, 활성화 T 세포의 활성을 감소, 억제 또는 제거하는 작용을 하여 따라서, 수용자의 조직 및/또는 세포로부터의 연이은 항원성 자극에 대한 T 세포 재자극화를 방지하거나 또는 낮은 반응성을 유도한다. 당업자는, 본 내용을 바탕으로, 이식 이전에 이식편을 선조절 또는 선처리함으로써 이식물 대 숙주 반응을 감소 또는 제거 가능함을 인지할 것이다.

일례로, 골수 또는 말초 혈액 줄기 세포 (조혈성 줄기 세포) 이식의 면에 있어서, 이식물에 의한 숙주 공격은, 수용자에 대한 이식물의 면역원성을 감소시키기 위한 본원에 개시된 선처리 방법을 사용하여 공여자 골수를 선 조절함에 의해 감소, 억제 또는 제거 가능하다. 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 공여자 골수는, 임의의 공급원의 ADAS 세포, 바람직하게는 수용자 ADAS 세포로 수용자에게 공여자 골수 이식 이전에 시험관 내에서 선처리 가능하다. 바람직한 구현에서, 공여자 골수를 먼저 수용자 조직 또는 세포에 노출 시킨 이후 ADAS 세포로 처리한다. 임의의 특정 이론에 구애되기를 바라지 않으면서, 수용자 세포 또는 조직과 공여자 골수를 먼저 접촉시키면 공여자 골수 내의 T 세포가 활성화되는 것으로 여겨진다. ADAS 세포로 공여자 골수를 처리하면 연이은 항원 자극에 대한 T 세포의 재자극을 방지하거나 낮은 반응성을 유도함으로써, 수용자 상에서 공여자 골수에 의해 유도된 부작용을 감소, 억제 또는 제거 가능하다.

본 발명의 한 구현에서, 이식물 대 숙주 질환으로 고생하는 이식 환자를 ADAS 세포를 투여하여 치료함으로써, 이식물 대 숙주 질환으로부터의 그 중증도를 감소, 억제 또는 제거 가능하며, 여기에서 ADAS 세포는 이식물 대 숙주 질환을 감소 또는 제거하기에 유효한 양으로 투여된다.

본 발명의 상기 구현에서 바람직하게, 수용자의 ADAS 세포는 이식 이전에 수용자로부터 수득 가능하고, 진행중인 이식물 대 숙주 반응을 치료하기에 충분한 양의 ADAS 세포 저장량을 제공하기 위해 배양 내에서 확대 및/또는 저장 가능하다. 그러나, 본원의 다른 곳에 기재한 바와 같이, ADAS 세포는 임의의 공급원, 일례로 조직 공여자, 이식편 수용자 또는 기타 미관련 공급원 (완전 상이한 개인 또는 종)로부터 수득 가능하다.

IV . ADAS 세포 사용의 이점

본원에 제공된 내용을 바탕으로, 공여자 조직에 대한 숙주 거부 또는 이식물 대 숙주 질환 치료를 위해, 일례로 면역 억제 약물 치료 요법의 사용과 같은 현재 방식과 함께, 본 발명의 ADAS 세포를 사용 가능함이 인지된다. 이식시 면역 억제 약물과 함께 ADAS 세포를 사용하는 것의 이점은, 본 발명의 방법을 사용함으로써, 이식편 환자의 면역 반응 증증도를 완화하고, 사용된 면역 억제 약물 치료 요법의 양을 감소시킬 수 있고/있거나 면역 억제 약물 치료 요법 투여 빈도를 감소시킬 수 있다. 면역 억제 약물 치료 요법 사용 감소의 장점은, 면역 억제 약물 치료 요법과 관련된 원치 않는 부작용 및 일반적 면역 억제를 완화할 수 있다는 점이다. 한 구현에서, 본 발명의 세포는 면역 억제 약물 요법을 필요로하지 않으면서 사용된다.

또한, 본 발명의 세포는 공여자 조직의 숙주 거부 또는 이식물 대 숙주 질환의 치료를 위해 "1회 (one-time)" 치료 요법으로 수용자에게 투여가능하다. 이식편의 수용자에 대한 1회 ADAS 세포 투여는 만성적 면역 억제 약물 치료 요법에 대한 필요를 제거한다. 그러나, 필요시에는 ADAS 세포의 다중 투여 또한 사용 가능하다.

본원에 기재된 발명은 또한, 이식편 숙주 거부 및/또는 이식물 대 숙주 질환의 방지, 치료 또는 완화를 위해 예방적 또는 치료적 유효량의 ADAS 세포를 투여하여 이식편 거부 및/또는 이식물 대 숙주 질환을 방지 또는 치료하는 방법을 포함한다. 본원의 내용을 기초로 ADAS 세포의 "치료적 유효량"은 ADAS 세포를 투여하지 않았을 때의 활성화된 T 세포의 수에 비교하여, 활성화된 T 세포의 수를 억제 또는 감소시키는 세포의 양을 의미한다. 이식편의 숙주 거부 경우, ADAS 세포의 유효량은 ADAS 세포의 투여 이전에 수용자 내에서 활성화된 T 세포의 수에 비교하여 이식편의 수용자 내에서 활성화된 T 세포의 수를 억제 또는 감소시키는 양이다. 이식물 대 숙주 질환의 경우에 있어서, ADAS 세포의 유효량은, 이식편 내 존재하는 활성화된 T 세포의 수를 억제 또는 감소시키는 양이다.

ADAS 세포의 유효량은, ADAS 세포를 투여하기 이전에 이식편 또는 수용자 내에 존재하는 활성화된 T 세포의 수를, ADAS 세포 투여 이후 이식편 또는 수용자 내에 존재하는 활성화된 T 세포와 비교하여 결정 가능하다. ADAS 세포 투여와 관련된 이식편 자체 또는 이식편 수용자 내에 존재하는 활성화된 T 세포의 수의 감소, 또는 증가 없음은, 투여한 ADAS 세포의 수가 ADAS 세포의 치료적 유효량임을 시사하는 것이다.

유전적 변형

본 발명의 세포는, 치료 목적의 외래 단백질 또는 분자의 발현 또는, 수용자 내에서 이들의 융화 및/또는 분화 추적을 위한 방법에 사용 가능하다. 따라서, 본 발명은, ADAS 세포 내에서 외인성 DNA를 동시 발현하며 ADAS 세포로 외인성 DNA를 도입하는 방법 및 발현 벡터를 포함한다. 세포 내로 DNA를 도입하고 발현하는 방법은 당업자 공지이고, 일례로 Sambrook 등 (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), 및 Ausubel 등 (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)에 기재된 것을 포함한다.

분리된 핵산은, 수용자에게 일단 도입된 이후, ADAS 세포의 이동, 융화 및 생존을 추적하기 위해 사용되는 분자를 인코딩 가능하다. 세포 추적에 유용한 비제한적인 단백질은, 초록 형광 단백질 (GFP), 임의의 다른 형광 단백질 (일례로 증강된 초록, 초록색파랑, 노랑, 파랑 및 붉은 형광 단백질; Clontech, Palo Alto, CA), 또는 기타 태그(tag) 단백질 (즉, LacZ, FLAG-tag, Myc, His₆ 등)을 포함한다.

본 발명의 ADAS 세포의 이동, 융화 및/또는 분화를 추적하는 것은 벡터 또는 바이러스에 의해 발현되는 검출 가능한 분자의 사용에 국한되지 않는다. 세포의 이동, 융화 및/또는 분화는 또한, 포유류 내의 이식된 ADAS 세포의 위치결정을 촉진하는 일련의 프로브를 사용함으로써 평가 가능하다. ADAS 세포 이식편의 추적은, 비제한적으로 ABCG2, ALDH 등의, 본원의 다른 곳에 기재된 세포 특이적 마커에 대한 항체 또는 핵산 프로브를 사용하여 추가로 실행 가능하다.

"유전적 변형"이라는 용어는, 외인성 DNA의 의도적 도입에 의한 ADAS 세포의 유전형의 안정적 또는 일시적 변화를 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. DNA는 합성, 또는 천연 유도된 것일 수 있고, 유전자, 유전자 일부 또는 기타 유용한 DNA 서열을 포함 가능하다. 본원에 사용된 "유전적 변형" 이라는 용어는 천연 바이러스 활성, 천연 유전자 재조합 등을 통해 발생하는 것과 같은 천연 발생적 변형을 포함하는 것이 아니다.

외인성 DNA 는, 바이러스 벡터 (레트로바이러스, 변형 헤르페스 바이러스, 헤르페스 바이러스성, 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스, 렌트바이러스성, 등) 또는 직접적 DNA 형질감염 (지질감염, 인산칼슘 형질감염, DEAD-덱스트란, 전기천공 등)을 통해 ADAS 세포로 도입가능하다.

세포의 유전적 변형의 목적이 생물 활성 물질의 생성을 위한 경우, 물질은, 보통 주어진 질환 치료에 유용한 것이다. 일례로, 세포를 유전적으로 변형함으로써 이들이 특정 성장인자 생성물을 분비하도록 요망될 수 있다.

본 발명의 세포는, 세포 배양에 유익한, 영양인자, 성장 인자, 사이토카인 등과 같은 분자를 생성하도록, 세포 내로 외인성 유전 물질을 도입함으로써 유전적으로 변형 가능하다. 추가로, 그러한 분자를 생성하도록 세포를 유전적으로 변형함으로써, 세포는, 치료가 필요한 환자에게 이식시 환자에게 추가의 치료효과를 제공할 수 있다.

본원에 사용된 "성장 인자 생성물"이라는 용어는, 세포에 대해 성장, 증식, 분화 또는 영양 효과를 가지는 단백질, 펩티드, 마이토젠, 또는 기타 분자를 의미한다. 일례로, CNS 질환 치료에 유용한 성장 인자 생성물은, 비제한적으로 신경 성장 인자 (NGF), 뇌 유도 신경영양인자 (BDNF), 뉴로트로핀 (NT-3, NT-4/NT-5), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 앰피레귤린, FGF-1, FGF-2, EGF, TGFα, TGFβs, PDGF, IGFs, 및 IL-2, IL-12, IL-13의 인터루킨을 포함한다.

세포는 또한, 특정 성장 인자 수용체 (r)을 발현하도록 변형 가능하며, 비제한적으로 이는 다음을 포함한다: p75 저친화성 NGFr, CNTFr, 뉴로트로핀 수용체의 trk 패밀리 (trk, trkB, trkC), EGFr, FGFr, 및 앰피레귤린 수용체. 세포는, 다음과 같은 각종 신경전달물질 또는 그 수용체를 생성하도록 조작 가능하다; 세로토닌, L-도파, 도파민, 노르에피네프린, 에피네프린, 타키키닌, 물질(substance)-P, 엔돌핀, 엔케팔린, 히스타민, N-메틸 D-아스파르테이트, 글리신, 글루타메이트, GABA, ACh, 등. 유용한 신경전달물질 합성 유전자는 다음을 포함한다; TH, 도파-디카복실라제 (DDC), DBH, PNMT, GAD, 트립토판 히드록실라제, ChAT, 및 히스티딘 디카복실라제. CNS 질환의 치료에 유용한 것으로 입증될 수 있는 신경단백질을 인코딩하는 유전자는, 물질-P, 신경단백질-Y, 엔케팔린, 바소프레신, VIP, 글루카곤, 봄베신, 콜레사이스토키닌 (CCK), 소마토스타신, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 등을 포함한다.

본 발명의 세포는 또한, 사이토카인을 발현하도록 변형 가능하다. 사이토카인은, 바람직하게는, 그러나 비제한적으로 IL-12, TNFα, IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-7, IL-2, IL-6, IL-15, IL-21, 및 IL-23로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명에서, 이종성 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 구축물을 ADAS 세포 내로 도입한다. 즉, 세포를 유전적으로 변형하여, 그 발현이 개인 내에서 치료효과를 가지는 유전자를 도입하도록 한다. 본 발명의 일부 구현에서, 치료할 개인 또는 다른 개인 또는 비인간 동물의 ADAS 세포는, 유전적으로 변형하여 결함 유전자를 대체 및/또는 치료하는 개인 내에서 그 발현이 치료 효과를 가지는 유전자를 도입하도록 한다.

세포 내로 유전자 구축물이 형질감염되는 모든 경우에서 이종유래 (heterologous) 유전자는 세포 내 유전자의 발현을 달성하기 위해 필요한 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 그러한 조절 서열은, 보통 폴리아데닐화 신호 및 프로모터를 포함한다.

유전자 구축물은 바람직하게, 필수 조절 서열에 작동적으로 연결된 이종유래 단백질용 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터로 제공됨으로써, 벡터가 세포로 형질 감염시, 코딩 서열이 세포 내에서 발현 되도록 한다. 코딩 서열은, 세포 내 서열의 발현을 위해 필요한 조절 성분에 작동적으로 연결된다. 단백질 인코딩 뉴클레오티드 서열은 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 그 하이브리드 또는 mRNA 와 같은 RNA 분자일 수 있다.

유전자 구축물은, 기능적 세포질 분자 또는 기능적 에피좀 분자로서 세포 내에 계속 존재할 수 있고, 또는 세포의 염색체 DNA 내로 혼입되며, 조절 성분에 작동적으로 연결된 유익한 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 외인성 유전 물질은, 플라스미드 형태로서 별개의 유전 물질로 남게 되도록 세포 내에 도입 가능하다. 이와 다르게 염색체 내로의 혼입 가능한 선형 DNA를 세포 내로 도입 가능하다. 세포 내로 DNA 도입시, 염색체 내로의 DNA 혼입을 촉진하는 시약을 첨가 가능하다. 혼입 촉진에 유용한 DNA 서열을 또한 DNA 분자 내에 포함시킬 수 있다. 이와 다르게, RNA를 세포 내로 도입 가능하다.

유전자 발현을 위한 조절 성분은 다음을 포함한다: 프로모터, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 서열. 이들 성분들은 본 발명 세포 내에서 작동가능한 것이 바람직하다. 또한, 이들 성분은 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되어 뉴클레오티드 서열이 세포 안에서 발현되고 따라서 단백질이 생성되도록 하는 것이 바람직하다. 개시 코돈 및 종결 코돈은, 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부인 것으로 보통 여겨진다. 그러나, 이들 서열이 세포 내에서 기능성인 것이 바람직하다. 유사하게, 사용되는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호는 본 발명의 세포 내에서 기능성이어야만 한다. 본 발명 실시에 유용한 프로모터의 비제한적인 예는, 많은 세포 내에서 활성인 것으로 사이토메가로바이러스 프로모터, SV40 프로모터 및 레트로바이러스 프로모터를 포함한다. 본 발명 실시예 유용한 다른 프로모터의 비제한적인 예는, 조직 특이적 프로모터로, 즉 일부 조직에서는 기능성이나 다른 조직에서는 그렇지 않은 프로모터; 또한, 특이적 또는 일반 인핸서 서열의 존부에 관계없이 세포 내에서 정상적으로 발현되는 유전자의 프로모터를 포함한다. 일부 구현에서, 인핸서 서열의 존부에 관계없이 세포 내에서 유전자를 구성적으로 발현하는 프로모터를 사용한다. 인핸서 서열은, 적당하거나 필요한 경우의 구현에서 제공된다.

본 발명의 세포는, 당업자에게 공지인 기술을 사용하여 형질감염 가능하다. 표준 방법을 사용하여 세포 내로 외래 유전자를 도입하여, 상기 유전자로 인코딩되는 단백질이 세포 내에서 발현되도록 할 수 있다. 일부 구현에서, 세포를 인산칼슘 침전 형질감염, DEAD 덱스트란 형질감염, 전기 천공, 미세주사, 리포좀 매개 전달, 화학물질 매개 전달, 리간드 매개 전달 또는 재조합 바이러스 벡터 전달로 형질감염시킨다.

일부 구현에서, 재조합 아데노바이러스 벡터를 사용하여, 세포 내로 목적 서열을 가진 DNA를 도입한다. 일부 구현에서, 재조합 레트로바이러스 벡터를 사용하여 세포 내로 목적 서열을 가진 DNA를 도입한다. 일부구현에서, 표준 인산칼슘, DEAD 덱스트란 또는 리포좀 담체 매개 형질감염 기법을 사용하여 분화하는 세포 내로 목적 DNA를 도입한다. 표준 항생제 저항 선별 기법을 사용하여 형질감염된 세포를 동정 및 선별 가능하다. 일부 구현에서 DNA는 미세주사법으로 바로 세포 내로 도입한다. 유사하게, 공지의 전기 천공 또는 입자 충격 기법을 사용하여 외래 DNA를 세포 내로 도입 가능하다. 제 2의 유전자는 보통 공동 형질감염되거나 또는 치료적 유전자에 연결된다. 제 2의 유전자는 종종 선별가능한 항생제 저항성 유전자이다. 형질감염된 세포는, 선별가능한 유전자를 취하지 않는 세포를 사멸시키는 항생제 중에서 세포를 성장시켜 선별 가능하다. 2개의 유전자가 연결되어 있지 않으면서 공동 형질감염되는 대부분의 경우에서, 항생제 처리에서 생존한 세포는 그 안에 2개의 유전자 모두를 가지며 이들 모두를 발현한다.

본원에 기재된 방법은 당업자 공지의 다수의 방법 및 각종 변형 및 그 조합으로 실행 가능함을 이해하여야 한다. 또한, 세포 타입 간의 작용 또는 상호작용의 방식과 관련하여 본원에 기재된 임의의 이론은, 본 발명을 어느 방식으로도 제한하는 것이 아니라, 오히려 본 발명의 방법을 더 잘 이해시키기 위해 제시된 것임을 이해하여야 한다.

V. 이식

본 발명은, 비손상의 새로운 ADAS 세포를 도입함에 의해 일정 형태의 치료적 구제를 제공하는 질환 치료를 위한, 인간을 포함한 동물에게 ADAS 세포를 투여하는 방법을 포함한다.

당업자는, ADAS 세포를 수용자에게 이식하여, 주위 환경으로부터의 신호 및 지시를 수용함에 따라, 세포가 주변 세포 환경에 의해 지배되어 생체 내에서 성숙 세포로 추가로 분화 가능함을 용이하게 인지한다. 이와 다르게, ADAS 세포는 목적 세포 유형으로 시험관내에서 분화 가능하고, 분화된 세포를 이를 필요로 하는 동물에게 투여 가능하다.

본 발명은 또한, CNS, 피부, 간, 신장, 심장, 췌장 등을 포함하는, 신체의 질환 또는 외상을 치료하기 위한 기타 치료방법과 조합되어 ADAS 세포를 이식함을 포함한다. 따라서, ADAS 세포는 기타 세포와 공동 이식 가능하며 이들 모두는 환자에게 유익한 효과를 나타내도록 유전적 변형 및 비유전적으로 변형된 것이다. 따라서, 본원 개시 발명은 본원에 개시된 내용을 인지한 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 기타 치료 방법과 조합 사용 가능하다.

본 발명의 ADAS 세포는, 문헌에 개시된 바와 같은 당업계 공지의 기법을 사용하여 환자에게 또는 신체 내 임의의 다른 적절한 부위에 이식 가능하고, 상기 문헌들 각각은 본원에 참고로 편입된다 (U.S. 특허 제 5,082,670 및 5,618,531 호).

본 발명 세포의 이식은, 당업계 공지의 기술 및 본원 기재 또는 추후 개발될 기술에 의해 달성 가능하다. 본 발명은, 이식, 그래프팅, 주입 (infusing), 또는 세포를 포유류, 바람직하게는 인간에게 도입하는 기타 방법을 포함한다. 본원에 예시된 것은, 각종 포유류의 심혈관 조직에 세포를 이식하는 방법이나, 본 발명이 그러한 해부학적 부위 또는 그들 포유류에 제한되는 것은 아니다. 또한, 골 이식에 대한 방법은 당업계 공지이며, 문헌에 기재되어 있다 (일례로, U.S. 특허 제 4,678,470 호). 췌장 세포 이식은 다음 문헌에 기재되어 있고 (U.S. 특허 제 6,342,479 호), U.S. 특허 제 5,571,083 호는 신체 내 임의의 해부학적 부위로 세포를 이식하는 방법을 개시한다.

세포는 또한 공지의 캡슐화 기법에 따라 캡슐화되어 생물활성 분자를 전달하는데 사용 가능하며, 이는 마이크로캡슐화 (U.S. 특허 제 4,352,883; 4,353,888; 및 5,084,350호로, 본원에 참조로 편입됨), 또는 마크로캡슐화 (U.S. 특허 제 5,284,761; 5,158,881; 4,976,859; 및 4,968,733 호; 및 국제출원 공보 제WO 92/19195호; WO 95/05452 호로, 이들 모두는 본원에 참조로 편입됨)를 포함한다. 마크로캡슐화를 위해, 장치 내의 세포 개수는 가변이다; 바람직하게 각 장치는 10³-10⁹ 개의 세포, 바람직하게는 약 10⁵ 내지 10⁷ 개의 세포를 포함한다. 다수개의 마크로캡슐화 장치를 환자 내에 임플랜트 가능하다. 마크로캡슐화 및 세포의 임플랜트 방법은 당업계 공지로서 일례로 문헌에 기재되어 있다 (U.S. 특허 제 6,498,018 호).

ADAS 세포의 투여량은, 광범위하게 가변이며, 각 특정 경우마다 개인의 요구에 따라 조절 가능하다. 사용하는 세포의 개수는 수용자의 상태 및 체중, 투여의 횟수 및/또는 빈도 및 기타 당업자에게 공지인 변수에 의존한다.

환자에게 투여하는 ADAS 세포의 개수는, 일례로 지방 조직 가공 이후의 세포 수율에 관련될 수 있다. 세포 총 개수의 일부를 후일의 사용을 위해 유지 또는 동결 보관 가능하다. 또한, 전달되는 투여량은, 환자에 대한 세포 전달 경로에 의존한다. 본 발명의 한 구현에서, 환자에게 전달되는 세포의 개수는 약 5.5 x 10⁴ 세포일 것이 기대된다. 그러나, 이러한 수는 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 그 크기 수준을 조절 가능하다.

본 발명의 환자에 대한 세포 투여 방식은, 치료하는 질환 타입, 포유류의 나이, 세포의 분화 여부, 세포가 불균질 DNA를 그 안에 혼입하고 있는지의 여부, 등과 같은 각종 인자에 따라 변화하는 것이다. 세포는, 직접 주입에 의해 목적 부위에 도입하거나 또는 특정 질환 또는 질병으로 고생하는 환자에게 화합물을 투여하여 도입하는 당업계에서 사용하는 기타 임의의 방식으로 도입 가능하다.

ADAS 세포는, 각종의 다양한 방식으로 숙주에게 도입 가능하다. 바람직한 투여 방법은, 혈관내, 뇌내, 비경구, 복강내, 정맥내, 경막외, 척수내, 스템내 (intrastemal), 관절내, 활액내, 난포막내, 동맥내, 심장내 또는 근육내이다.

ADAS 세포는 또한, 목적 치료 효과를 증강, 제어 또는 기타 안내하는 첨가제와 함께 적용 가능하다. 일례로, 한 구현에서 세포는 항체 매개 양성 및/또는 음성 세포 선별을 사용하여 추가로 정제되어, 효능을 증가하고, 사멸율을 감소하고 또는 방법의 용이성을 촉진하기 위한 세포 군집을 풍부화시키기 위해 사용 가능하다. 유사하게, 세포는, 임플랜트 되는 세포를 지지 및/또는 그 운명을 안내함에 의한 생체내 조직 공학을 촉진하는 생물적합성 매트릭스와 함께 적용 가능하다.

환자에게 ADAS 세포 투여 이전에, 세포는, 플라스미드, 바이러스 또는 대체의 벡터 기법을 사용하여 관심 핵산으로, 안정적 또는 일시적으로 형질감염 또는 트랜스덕션될 수 있다. 세포는, 유전자 변형 이후 투여되어, 세포에 의해 제공되는 치료적 반응 (들)을 촉진하고자 하는 유전자 생성물을 발현하도록 할 수 있다.

질환, 치료 또는 증상 치료를 위해 ADAS 세포를 사용하는 것은, 면역 억제제의 필요 없이 수용자에게 ADAS 세포를 도입 가능하다는 점에서 추가의 이점을 제공한다. 세포의 성공적 이식은, 수용자에 의한 이식물 거부 면역 반응을 유도하지 않고 공여자 세포의 영구적 그래프트화를 요구하는 것으로 여겨진다. 보통, 숙주 거부 반응을 방지하기 위해, 비특이적 면역 억제제인 시클로스포린, 메토트릭세이트, 스테로이드 및 FK506 이 사용된다. 이들 시약은 매일 투여되며, 투여가 중단되면 이식물 거부가 보통 발생한다. 그러나, 비특이적 면역 억제제를 사용할 때 바람직하지 않은 결과는, 이들이 면역 반응 전 부분을 억제하도록 기능하여 (일반 면역 억제), 감염 및 기타 질환에 대한 수용자의 취약성을 크게 증가 시킨다는 점이다.

본 발명은, 면역 억제제의 필요 없이 수용자에게 ADAS 세포 또는 분화된 ADAS 세포를 도입함에 의해 질병, 질환 또는 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은, 동종 또는 이종의 ADAS 세포 또는 이와 다르게는 기타 수용자와는 유전적으로 구분되는 ADAS 세포를 수용자에게 투여하여, 수용자에게 유익함을 제공하는 것을 포함한다. 본 발명은, 세포를 수용자에게 투여시 면역 억제제 사용의 필요 없이 질병, 질환 또는 증상을 치료하기 위해 ADAS 세포 또는 분화된 ADAS 세포를 사용하는 방법을 제공한다. 따라서 면역 억제 치료 요법과 관련된 암 관련 증상을 포함하는, 감염 및 기타 질환을 일으키는 것에 대한, ADAS 세포 또는 분화된 ADAS 세포를 이식받은 환자의 취약성이 감소된다.

하기의 실시예들은 본 발명의 면들을 추가로 예시한다. 그러나 어느 경우에도 본원에 기재된 본 발명의 교시 또는 내용을 제한하는 것은 아니다.

본 발명은 하기의 실시예를 통해 이제 설명된다. 이들 실시예는 단지 예시 목적을 위한 것으로 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되지 않고 본원에 개시된 내용의 결과에 따라 명백한 모든 변형을 오히려 포함하는 것이다.

하기의 실시예들은, 인간 SVF 세포 및 ADAS 세포를 포함하는 인간 지방 유도된 세포의 면역 표현형을 각종 분리, 정제 및 확대 단계에서, 플로우 사이토메트리 기재 어세이를 사용하여 정의하고자 실시된 것이다. 추가로, 인간 SVF 세포 및 ADAS 세포를 포함하는 인간 지방 유도된 세포의 면역원성을, 혼합 림프구 반응으로 시험관내에서 시험하였다. 본원에 개시된 결과는 세포 및/또는 유전자 치료 요법을 위한 수단으로서 동종 ADAS의 이식이 가능함을 시사한다.

본원에 개시된 내용은, ADAS 세포의 분리 및 확대가 초기 SVF에 대하여 상대적으로 균질한 세포 군집을 선별함을 나타낸다. 시험관내 MLR 어세이는, 숙주 내로 동종 ADAS 세포를 이식 가능함을 나타내고, 케어 시점에서 임상의 및 환자에게 유용한 "시약 선반으로부터"인 제품으로서의 성인 줄기 세포의 임상적 용도에 대한 지지를 제공한다.

실시예 1: 인간 지방 유도된 세포의 면역표현형: 스트로마 및 줄기 세포 관련 마커에서의 일시적 변화

지방 조직은 조직 공학적 적용을 위한 다분화능 성인 줄기 세포의 풍부하고도 손쉬운 공급원을 나타낸다. 그러나 모든 실험실에서 동등한 분리 및 계대 단계의 세포를 사용하는 것은 아니다. 일부 연구자들이 조직 공학적 목적을 위해 갓 분리한 스트로마 혈관 분획 (SVF) 세포를 사용하는 사실에 비추어, 본원에 제공된 실험은, 부착성 및 계대의 함수로서의, 인간 SVF 세포 및 ADAS 세포를 포함하는 인간 지방 유도된 세포의 면역표현형을 비교하고자 실시되었다. 갓 분리한 인간 지방 조직 유도된 스트로마 혈관 분획 (SVF) 세포의 면역표현형을 연속으로 계대된 ADAS 세포와 비교하였다. 초기의 SVF는 군락 형성 단위 섬유아세포 (CFU-F)를 1:30의 빈도로 포함하였다. 군락 형성 단위 지방세포 (CFU-Ad) 및 -골모세포 (CFU-Ob)도 상당한 빈도로 SVF 내에 존재하였다 (각각 1:40 및 1:12). 플로우 사이토메트리 기준 ADAS 세포의 면역표현형은, 부착성 및 계대에 따라 점진적으로 변화하였다. 일례로 스트로마 세포 관련 마커 (CD13, CD29, CD44, CD63, CD73, CD9O, CD166)는 SVF에서 초기에는 낮았으나 연이은 계대에 따라 상당히 증가하였다. 줄기 세포 관련 마커 CD34 는 SVF 및/또는 초기 계대 ADAS 세포에서 피크 수준이었고, 배양 기간에 걸쳐 비록 감소한 수준이지만 계속 잔존하였다. 조혈성 줄기 세포의 동정 및 특정화를 위해 모두 사용되었던 알데하이드 탈수소효소 (ALDH) 및 다중약물 저항성 수송체 단백질 (ABCG2)는, 검출 가능한 수 준으로 SVF 및 ADAS 세포에 의해 발현됨이 관측되었다. 내피 세포 관련 마커 (CD31, CD144 또는 VE-카드헤린, VEGF 수용체 2, 본 윌데브란드 인자)는, SVF 상에서는 발현되었으나 연속 계대에 따라 현저히 변화하지는 않았다. 따라서, 플라스틱에 대한 부착성 및 소태아 혈청 보충된 배지 내에서의 인간 ADAS 세포의 연이은 확대는, 상대적으로 균질한 세포 군집을 선택하며, 미정제 스트로마 혈관 분획의 불균질성에 비해 "스트로마" 면역표현형을 나타내는 세포를 풍부화시키는 것이다.

본원에 기재된 실험에 사용한 물질 및 방법을 이제 설명하고자 한다.

ADAS 세포 분리 및 확대

피하 지방 조직 부위로부터의 지방흡입 (liposuction) 흡입물은, 지역 성형외과의 재건 성형을 받고 있는 남성 및 여성 대상으로부터 수득하였다. 조직을 인산 완충 식염수 (PBS)로 3-4회 세척하고 1% 소 혈청 및 0.1% 콜라게나제 타입 I으로 보충되고 37℃로 미리 가열한 동일 부피의 PBS에 현탁하였다. 조직을 60분간 연속 교반 하에 37℃의 교반 수조에 위치시키고, 실온에서 300-500 X g로 5분간 원심분리하였다. 상청액으로 성숙 지방세포를 포함한 것을 흡입하였다.

펠릿은 스트로마 혈관 분획으로 밝혀졌다 (SVF). SVF 부분을 동결 보관 배지 (10% 디메틸설폭사이드, 10% DMEM/F 12 Ham's, 80% 소태아 혈청)에 재현탁하고 에탄올 재킷화된 밀봉 용기 내에서 -80℃ 로 동결하고, 연이어 액체 질소 내에 보관하였다. SVF 부분을 본원에 기재된 군락 형성 단위 어세이에 사용하였다. 나머지 SVF 세포를 현탁하여, 확대 및 배양을 위한 표면 면적 1 cm² 당 0.156ml의 조직 소화물의 밀도로, 스트로마 배지 (DMEM/F 12 Ham's, 10 % 소 태아 혈청 (Hyclone, Logan, UT), 100 U 페니실린/100 μg 스트렙토마이신/0.25μg Fungizone) 내의 T225 플라스크 내에 즉각 플레이팅하였다. 1차 세포 배양의 초기 계대는 "계대 0"으로 칭하여졌다 (P0). 5% CO₂, 37℃에서의 처음 48시간 배양 이후, 배양물을 PBS 로 세척하고 75-90%의 컨플루언시에 이를 때까지 스트로마 배지 내에 보관하였다 (배양중 약 6일간). 세포를 트립신 (0.05%) 소화로 계대하여, 5,000 세포/cm²의 밀도로 플레이팅하였다 ("계대 1"). 세포 생존성 및 계대 시점의 수를 트립판 블루 배척 및 혈구계 세포 계수로 측정하였다. 75-90%의 밀도를 이룬 이후에 세포를 반복하여 계대 4 까지 계대하였다 (배양중 약 6일간).

지방 형성

1차 ADAS 세포의 컨플루언트한 배양물을, 스트로마 배지를 지방세포 유도 배지 (DMEM/F-12 으로 3% FBS, 33 μM 비오틴, 17 μM 판토테네이트, 1 μM 소 인슐린, 1 μM 덱사메타손, 0.25 mM 이소부틸메틸잔틴 (IBMX), 5 μM 로시글리타존 및 100 U 페니실린/100 μg 스트렙토마이신/0.25 g Fungizone 함유)로 대체함으로써 지방생성을 발생하도록 유도하였다. 3일 후, IBMX 및 로시글리타존 모두가 결핍된 것을 제외하고는 유도 배지와 동일한 지방세포 유지 배지로 배지를 변경하였다. 3일마다 90% 의 유지 배지를 교체하면서, 세포를 9일까지 배양 중에 유지 하였다. 배양물을 PBS로 세척하고, 포르말린 용액으로 고정하고, 지방 세포 분화를 오일 레드 O로 중성 지방을 염색하여 측정하였다.

골생성

1차 ADAS 세포의 컨플루언트한 배양을 스트로마 배지를 골생성 유도 배지 (DMEM/F-12 Ham's 로, 10% FBS, 10 mM β-글리세로포스페이트, 50 μg/ml 소듐 아스코르베이트 2-포스페이트, 및 100 U 페니실린/100 μg 스트렙토마이신/0.25 g Fungizone 함유)로 대체함으로써 골생성을 발생하도록 유도하였다. 3-4일마다 새로운 골생성 유도 배지를 배양에 대해 3주간 공급하였다. 배양을 0.9% NaCl로 세척하고, 70% 에탄올로 고정하고, 골생성 분화를 알리자린 레드로 인산칼슘을 염색하여 측정하였다.

군락 형성 단위 ( CFU ) 어세이

군락 형성 단위의 빈도를, 선조 세포의 개수가 프와송 분포를 따른다는 가정하에 제한 희석 어세이로 측정하였다 (Bellows 등, 1989 Dev. Biol. 133:8-13). 25ml의 지방흡입 조직 흡입물에 상당하는 SVF 부분을 제한 희석 어세이함으로써, CFU의 빈도를 측정하였다. SVF 펠릿을 1% BSA 보충된 20ml PBS 에 현탁하고 오토클레이브된 금속망을 통해 여과하여 거대 조직 단편을 제거하였다. 세포 현탁액의 400μl 부분을 2ml 원심분리 튜브로 옮겨, 실온에서 3000rpm으로 3분간 원심분리하고, 펠릿을 이후 적혈구 용해 완충액 400μl에 재현탁하였다 (Sigma, St. Louis, MO).

5분간의 용해 기간 이후, 20μl 부피의 용해물을 동 부피의 트립판 블루와 혼합하고, 유핵 세포의 개수를 혈구계 계수로 측정하였다. SVF 의 나머지 세포를, 실온에서 300 X g으로 5분간 원심분리하고, 결과의 펠릿을 최종 농도로서 1ml 당 2 X 10⁵의 세포로 스트로마 배지 내에 재현탁하였다.

웰당 100μl의 스트로마 배지로 4 개의 96 웰 플레이트를 준비하였다. SVF 세포 현탁액을 각 플레이트의 12 컬럼에 걸쳐 2 배로 연속 희석함으로써, 약 10⁴ 내지 4 개의 세포를 웰당 포함하는 컬럼이 되도록 하였다. 37℃, 5% CO₂ 에서 96 웰 플레이트를 9일간 인큐베이션하였다. 이때, 4 개 플레이트 중 하나에 대해 CFU-섬유아세포 (CFU-F) 어세이를 실시하였다. 플레이트를 PBS로 세척하고 포르말린으로 고정하고 포르말린 중 톨루이딘 블루 0.1 %로 20 분간 염색하고 물로 세척하여, 음성 웰의 개수 (즉, > 20 톨루이딘 블루⁺ 세포의 군락을 포함하지 않는 것)를 각 세포 농도에 따라 측정하였다. 상기 데이터를 사용하여 F₀ = e^-u 및 u = -ln F₀의 식에 따라 CFU-F의 개수를 측정하였다 (여기에서, F₀는 군락이 없는 웰 분율을, u는 웰당 전구체의 평균 개수를 나타낸다). 따라서, 군락이 없는 웰의 분율이 "0.37"이면, 웰당 전구체 세포의 평균 개수는 "1"이 된다.

두번째 플레이트로는, CFU-알칼린 포스파타제 (CFU- ALP) 어세이를 실시하였다. 플레이트를 PBS로 린스하고 100% 에탄올로 고정하고 36mM 소듐 메타보레이트, 0.46mM 5-브로모-4-클로로-3-인독실 포스페이트, 12mM 니트로블루 테트라졸륨 및 8.3mM 황산마그네슘 (pH 9.3)을 포함하는 용액 존재 하에 1시간 동안 인큐베이션하고, 20 ALP⁺ 세포 초과의 군락을 가지지 않는 웰의 개수를 각 세포 농도에 대해 측정하였다. 그 결과는 상기 식에 따라 CFU-ALP의 개수 측정에 사용되었다.

나머지 2개의 96웰 플레이트는, 본원에 기재된 바와 같이 지방생성 및 골생성이 일어나도록 각각 유도하였다. CFU-지방세포 (CFU-Ad)를 유도 이후 9일 동안 오일 레드 O 염색으로 측정하였다. CFU-골모세포 (CFU-O)는, 유도 이후 14일 초과하여 알리자린 레드 염색으로 측정하였다.

플로우 사이토메트리

SVF 세포 및 0 내지 4 계대의 배양 세포로부터의 세포에 대해 플로우 사이토메트리를 실시하였다. 3개의 일반 카테고리 (조혈, 스트로마 및 줄기 세포)에 해당하는 표현형 마커 및 알데하이드 탈수소효소 (ALDH) 활성에 대해 세포를 분석하였다 (Stem Cell Technologies, Seattle, WA). 세포를 컨쥬게이션 및 비컨쥬게이션된 마우스 모노클로날 모두를 사용하여 분석하였다. 간단히, 약 4-8 x 10⁶을 각 군에 대해 수득하였다. 1 x 10⁶의 세포를 ALDH 분석을 위해 제거하고 1-2 x 10⁶의 세포를 비컨쥬게이션된 모노클로날로 염색하기 위해 제거하였다. CELLQuest 획득 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용한 Becton Dickinson FACSCaIIber 플로우 사이토메터 상에서 항체 세트당 10,000 이벤트를 수득하고, ALDH 어세이에 대해 25,000 이벤트를 수득하였다. 데이터 분석을 Flow Jo 분석 소프트웨어 (Tree Star)를 사용하여 실시하였다.

컨쥬게이션된 모노클로날 항체

플로우 세척 완충액 (1 X DPBS, 0.5% BSA 및 0.1% 소듐 아자이드)으로 세포를 1회 세척하고 블라킹 완충액 (25μg/ml 마우스 IgG 함유 세척 완충액)에 재현탁하고, 얼음상에서 10분간 인큐베이션하였다. 100 μl의 세포 현탁액을 (약 5 x 10⁵ 개의 세포) 튜브당 분취하여 적절히 레벨링된 mAb를 3색 분석을 위해 가하였다 (FITC, PE 및 APC). 적절한 이소타입 대조군의 조합을 실시하여 모노클로날 이소타입 조합을 반영하도록 하였다. 하기 항원에 대항한 항체는 달리 언급하지 않는 한 BD-Pharmingen 에서 구입하고 공급자가 추천한 양으로 사용하였다: CD13 PE (#555394), CD29 FITC (Caltag #CD2901), CD31 FJTC (Caltag #MHCD3101), CD34 PE (#348057), CD44 FITC (Cell Sciences #852.601.010), CD49a PE (#559596), CD63 FITC (#557288), CD73 PE (#550257), CD9O FITC (#555595), CD105 PE (Caltag #MHCD1O5O4), CD144 (Chemicon # MAB1989), CD146 PE (#550315), CD166 PE (#559263), ABCG2 FITC (ChemIcon #MAB4155F), VEGFr2 (Chemicon #MAB 1667), 및 본 윌데브란드 인자 (Chemicon MAB3442). 모든 튜브는 얼음상에서 인큐베이션 하면서 30분간 빛을 피하도록 하였다. 세포를 세척 완충액으로 1회 세척하고 200μl의 1% 파라포름알데하이드로 고정하였다.

비컨쥬게이션된 모노클로날 항체

세포를 상기와 같이 세척하고 5% 염소 혈청을 함유한 세척 완충액에서 블라킹하고, 10분간 인큐베이션한 후 100μl 분취액으로 나누었다. 1차 항체 (CD144, 항-VEGFR2 [KDR] 및 항-본 윌데브란드 인자)를 가하고 (10μg/ml), 세포를 얼음상에서 30분간 인큐베이션하였다. 세포를 세척 완충액에서 1회 세척하고, 혈청이 없는 세포 완충액에 재현탁하였다. 염소 항-마우스 PE-컨쥬게이션된 2차 항체를, "2차 단독" 대조군뿐 아니라 1차 항체를 함유한 현탁액에 가하였다 (5μg/ml). 세포를 얼음상에서 인큐베이션하면서 15분간 빛을 피하도록 하였다. 세포를 이후 플로우 세척 완충액으로 세척하고 1% 파라포름알데하이드로 고정하였다.

이들 실험 결과를 이제 설명하고자 한다.

세포 수율

총 44명의 공여자로부터 수득한 피하 지방 조직 지방흡입물을 콜라게나제 소화 및 차등 원심분리로 처리하였다. 44명의 공여자들의 연령 (평균 ± S.D; 41 ± 10, 18-64의 범위로) 및 BMI (평균 ± S.D; 26.1 ± 4.8, 19.9 내지 39.2의 범위로), 및 성별 분포 (84% 여성 및 16% 남성)는 이전의 연구에 보고된 것에 상응한 것이다 (Aust 등, 2004 Cytotherapy 6:7-14; Sen 등, 2001 J. Cell. Biochem. 81:312-9). 지방조직 내의 선조 세포의 빈도 평가를 위해, 스트로마 혈관 분획 내에 존재하는 유핵화 세포 개수의 평균개수는 지방 흡입 조직 1ml 당 308,849인 것으로 밝혀졌다 (표 1A). 이들 계산을 토대로, 조직화학 염색 특징에 따른 특정 계통 표현형의 CFU 빈도를 측정하기 위한 제한 희석 어세이에 의해 96웰 플레이트 내에서 CFU 어세이를 확립하였다 (표 2). 배양 9일 후, 톨루이딘 블루 또는 알칼린 포스파타제에 대해 양성 염색된 세포를 함유한 웰의 개수를 사용하여 CFU-F 및 CFU-ALP 각각의 빈도를 측정하였다 (도 1). 이때, 동일한 플레이트가 지방생성 또는 골생성 되도록 유도하였다. 오일 레드 O 에 의한 중성 지방 염색 또는 알리자린 레드에 의한 인산칼슘에 대한 염색에 양성인 웰의 개수를 추가로 9일 또는 >14일 후 각각 측정하였다. 결과의 CFU 평균 빈도는 다음과 같았다: CFU-F, 1:30; CFU-ALP, 1:285; CFU-Ad, 1:40; 및; CFU-Ob, 1:12 (표 2).

표 1A: 지방흡입 조직 1ml 에 대한 세포 수율

표 2: 유핵화 SVF 세포 군집 내의 군락 형성 단위의 빈도

초기 플레이팅에 이어, 세포를 6일의 평균 기간동안 배양되도록 유지하여 (표 1B), 계대 0 (P0) 군집을 수득하였다. 트립신 소화로 수확 시에, 원래의 지방흡입 조직 1ml 당 평균 247,401 개의 부착성 P0 세포를 수득하였다 (표 1B). 이들 값은 이전의 연구에 상응하는 것이다 (Aust 등, 2004 Cytotherapy 6:7-14). 각각 6-7일의 4회의 연속 계대를 통해 세포를 계대하였다. 각 계대마다, 세포 배가 시간은 3.6-4.7일이었다 (표 1B).

표 1B: 평균 세포 배가 시간 및 계대 길이

면역표현형

정제 및 계대의 각 단계 이후 동결 보관된 세포에 대해 플로우 사이토메트리 분석을 실시하였다 (표 3); 대표적 플로우 히스토그램을 도 2에 개시하였다. 초기의 SVF 세포는 CD31, CD144 (VE-카드헤린), VEGF-수용체 2, 및 본 윌데브란드 인자를 포함하는 내피 세포 관련 마커 패널에 대해 양성인 세포의 하부세트를 포함하였다 (표 3 및 도 2). 이들 마커의 수준은 계대 4 (P4) 동안 크게 변하지 않았다.

표 3: 점진적 분리 단계 및 계대 1에서의 인간 지방 유도된 세포의 표현형 특정화

¹데이터는, 괄호내의 공여자 수로부터 수득한 평균 ± 표준 편차로 표시되었다.

²데이터는, n=4 의 공여자 평균을 나타낸다.

³데이터는, n=3 의 공여자 평균을 나타낸다.

* Student t-test 에 의한 SVF 세포에 대하여 <0.05 인 P 값,

** Student t-test 에 의한 SVF 에 대하여 <-0.01 인 P 값,

*** Student t-test 에 의한 SVF 에 대하여 <-0.001인 P 값.

초기 SVF 세포 군집의 하부세트만이 스트로마 세포 관련 마커를 발현하였다 (표 3 및 도 3). SVF 의 1% 미만이 활성화된 림프구 통상 부착 분자 (ALCAM, CD166)를 발현하였고, SVF 의 63%가 히알유로네이트 수용체 (CD44)를 발현하였고; CD29, CD73, CD9O, 및 CD105 의 수준은 이들 값에 대하여 중간 정도였다. 연속 계대에 따라서, 이들 마커 각각에 대해 양성 염색되는 세포의 백분율이 증가하여 계대 4 에서는 (P4), 69% (CD166) 내지 98% (CD44) 사이로 증가하였다.

초기 SVF 세포는 줄기 세포 관련 마커에 대하여 양성 염색되는 하부군을 포함하였다. 평균 60%의 SVF가 조혈 줄기 세포 관련 마커인 CD34, 시알로뮤신 및 L-셀렉틴 리간드를 발현하였다 (Shailubhai 등, 1997 Glycobiology 7:305-14). CD34⁺ 수준은 P0 군에 대응하는 정도로 유지되다가 연속 계대에서 현저히 감소하였다 (도 3). CD34⁺ 군의 크기는, 범 (pan)-조혈 마커인 CD45의 발현을 기준으로 볼 때, 각 계대에서 조혈 세포 군의 그것을 지속적으로 초과하였다. SVF 의 평균 31%가, 획스트 염료의 배출을 담당하며 조혈 줄기 세포의 주변 분산 군집의 동정을 위해 사용된 다중 약물 저항성 수송체인 ABCG2를 나타내었다 (Goodell 등, 1996 J. Exp. Med. 183:1797- 806). 이들 수준은 P0 및 P1 계대 동안 증가하다가 연이은 계대 동안 감소하는데, 이러한 변화는 SVF에 대해 통계적으로 유의미하지 않다.

알데하이드 탈수소효소 (ALDHbr) 효소의 높은 수준은 조혈 줄기 세포의 확인 및 분리를 위한 신규한 마커임이 입증되었다 (Storms 등, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:9118-23; Fallon 등, 2003 Br. J. Haematol. 122:99-108; Storms 등, 2005 Blood). 형광 기질을 이용한 플로우 사이토메트리 분석에 따르면, 지방 유도된 세포가 ALDHbr 하부군을 포함한다 (표 3 및 도 4). ALDH 수준이 SVF 세포에서 낮지만, ALDHbr의 백분율은 계대 P0 내지 P4 사이에 > 70%에 달하며, 평균 형광 강도는 114 내지 306 이다. ALDHbr ADAS 세포의 백분율은, P9 까지 배양 중에 세포를 유지한 경우 10%로 감소한다.

본원에 기재된 결과 및 다른 그룹의 결과는, 제 2 계대 혹은 그 이후 플라스틱 부착성 ADAS 세포의 면역표현형을 나타낸다 (Gronthos 등, 2001 J. Cell. Physiol. 189:54-63; Aust 등, 2004 Cytotherapy 6:7-14; Zuk 등, 2002 Mol. Biol. Cell. 13:4279-95). ADAS 세포는 골수 유도된 스트로마 세포 또는 MSC의 그것을 닮은 표면 단백질 프로필을 나타내며 (Pittenger 등, 1999 Science 284:143-7), ADAS 세포는 다중 계통 경로를 따라 분화 가능하다 (Gimble 등, 2003 Curr. Top. Dev. Biol. 58:137-60). 실제로, 인간 ADAS 세포의 링 클로닝 분석은 계대 4를 통해 확대된 >50%의 클론이 2개 이상의 계통 특이적 경로를 따라 분화 가능함을 나타낸다 (Gimble 등, 2003 Curr. Top. Dev. Biol. 58:137-60). 결과적으로, 지방조직은, 입수 가능하며, 충분하고 대체적인, 재생 가능한 의학적 적용이 가능한 성인 줄기 세포의 공급원을 제공한다. 51명의 성인 대상으로부터 분리한 골수 MSC를 사용한 연구에 따르면, CFU-F 의 빈도가 약 1:10,000 STRO-1⁺ 임을 나타내었 다 (Stenderup 등, 2001 J. Bone Miner. Res. 16:1120-9). 이들 연구자들은 STRO-1 항체로의 풍부화 단계를 사용하였으므로, 이들 값은 인간 지방 조직에 대해 현재 보고된 값에 비하여 적어도 3 자릿수 크기만큼 적은 것이다. 따라서, 지방 조직에서의 CFU-F 풍부함은, 골수의 그것보다 상당히 높은 것이다.

CFU-Ad 및 CFU-Ob의 지방 조직 내 빈도는, CFU-F의 그것과 유사하였다; 그러나, CFU-ALP의 발생은, 약 1자리의 정도 크기로 덜 빈번한 것이다. 알칼린 포스파타제 효소 활성은 골수 골모세포 선조체 및 Westin-Bainton 스트로마 세포의 특성 규명에 사용되어 왔다 (Friedenstein, 1968 Clin. Orthop. Relat. Res. 59:21-37; Westen 등, 1979 J. Exp. Med. 150:919-37). 본 연구는, 배양중 9일 이후 알칼리 포스파타제 활성을 측정하고, 알리자린 레드 염색은 추가의 14-21일 이후 실시하였다. 강한 알칼리 포스파타제 염색이 다중층 세포 층과 관련되어 있으므로 (도 1), CFU-ALP의 빈도는, 연장된 배양 기간 이후 측정된다면 CFU-F 및 CFU-Ob의 그것과 유사해질 것으로 여겨진다.

다수의 그룹들이, 시험관 내 및 생체내 적용 모두를 위한 지방 유도된 세포를 분리하기 시작했다; 그러나, 연구중인 세포 군집의 분리 및 특정화에 대한 실험실 간의 일치 정도는 아직 불분명하다. 최근의 연구는, 분리 초기 단계에서의 지방 조직 유도된 세포에 집중하고 있으며, 초기 계대 수에서의 SVF 또는 부착성 세포에 그 초점을 맞추고 있다. 이들 세포는 VEGF 수용체 마커로서 Flk-1, CD31, VE-카드헤린, 본 윌데브란드 인자 및, 기타 내피세포 계통 관련 마커를 나타내었다. 지방 유도된 SVF는 치명적으로 방사선 조사된 마우스의 골수를 재건하 기 위해 사용되어 왔다. SVF 군집은, 대식세포의 선조 세포 및, 잠정적으로는 기타 조혈 계통을 함유하는 것으로 보고되었다. 유사하게, 본 발명의 내용은 SVF 세포 군집이 CD11, CD14, CD45 및 기타 마커의 발현에 기초한 조혈 계통 세포를 포함하는 것임을 나타낸다. 그러나, 이들의 발현은 점진적 계대에 따라 손실되므로, 이들이 부착성 세포 군집을 설명하는 것이 아님을 시사한다.

"줄기 세포" 관련 마커 (CD34, ABCG2, ALDHbr)의 수준은, 배양의 초기 단계에서 그들의 피크 수준에 도달한다 (계대 0/1). 본원에 개시된 결과는, 미분화 및 지방세포 분화된 인간 ADAS 세포의 무작위 질량 분석 프로테옴 분석에 의해 미토콘드리아 ALDH의 존재를 나타낸다. ALDHbr인 ADAS 세포의 백분율은, 총 세포군의 1% 또는 그 미만인 미분화된 골수 내에서 측정된 ALDHbr 세포의 백분율을 크게 초과한다 (Storms 등, 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:9118-23; Fallon 등, 2003 Br. J. Haematol. 122:99-108). 다른 그룹들은, 다수의 이들 동일한 "줄기 세포" 관련 세포 (CD34 및 ABCG2)를 CD31과 조합하여 사용함으로써, 지방 유도된 세포 군 중의 내피 선조 세포를 규정 및 정의하였다 (Miranville 등, 2004 Circulation 110:349-55). 이러한 패널 내의 항원 또는 효소 마커의 하부세트를, 골수 세포의 조혈 줄기 세포를 규정 및 분리하기 위해 현재 사용된 것과 유사한 방식으로 지방 조직에서 유도된 줄기 세포를 규정하기 위해 배타적으로 사용할 수 있을지는 추후 검토될 사항이다.

분리의 초기 단계에서, 스트로마 혈관 분획 (SVF)의 세포는, "스트로마" 관련 마커 (CD13, CD29, CD44, CD73, CD9O, CD1O5, CD166)의 수준이 낮음을 나타낸 다. 후기 배양 단계에서 (계대 3/4), 세포는 일정한 고수준의 "스트로마" 마커를 갖는 보다 균질한 프로필을 가지게 된다. 전체적으로, 이러한 일시적 발현 패턴은, 인간 골수 유도된 MSC에 대해 보고된 바와 유사하다. 골수 MSC는 시험관내 배양 14일 동안에 걸쳐, 엔도글린 (CD105) 및 5'-엑토 뉴클레오티다제 (CD73)에 각각 해당되는 SH2 및 SH3로 확인된 마커의 표면 발현을 점진적으로 증가시킨다. 계대 4에서, "스트로마 마커" 중 4개가 (CD13, CD29, CD44, CD73, CD9O) ADAS 세포군 >90% 에서 지속적으로 발현되었다. CD10과 같은 추가의 "스트로마 마커" 또한 상기 군집의 균질성을 설명하는데 유용할 수 있다. 이러한 발견은, 분리 및 확대의 각종 단계에서의 지방 유도된 세포의 현재의 면역표현형 특정화와 일치한다.

본 실시예의 실험은, 부착 특성 및 면역표현형에 따른 인간 지방 조직으로부터 유도된 세포를 시험하고자 고안된 것이다. 초기 분리된 스트로마 혈관 분획 세포는 불균질한 것으로 관측되었다. 그러나, 30 개 세포 중 약 1개만이 실제로 부착하여 지방 유도된 줄기 세포로 명명된 세포의 후속 확대에 기여한다. 지방세포 및 골모세포 선조체의 스트로마 혈관 분획내 빈도는, 부착성 세포군의 그것에 상응하는 것이다. CFU-F, CFU-Ad 및 CFU-Ob 데이터 간의 그러한 밀접한 상관관계는, 인간 지방조직 내의 이중-잠재성 및 삼중-잠재성 클로날 세포의 존재를 시사하는 다른 결과와 일치한다 (Zuk 등, 2002 13:4279-95). 전통적 스트로마 세포 마커들 (CD13, CD29, CD44, CD73, CD9O, CD1O5, CD166)은, 초기 스트로마 혈관 분획 세포의 단지 0.8-54% 내에만 존재하는 것으로 관측되었다. 후기 계대에서, 스트로마 마커는 지방 유도된 줄기 세포군의 98% 까지 존재한다. 발현상의 이러한 일시적 변화는, 인간 골수 세포 MSC 에 대해 보고된 바와 유사한 것이다. 인간 ADAS 세포는, 또한 CD34, ABCG2 및 알데하이드 탈수소효소와 같은 줄기 세포 관련 마커를 발현한다. 따라서, 본원에 개시된 결과는, 분리 및 배양의 함수에 따라 지방 유도된 세포군 내에서 현저한 변화가 발생함을 나타내며, 재생 의학적 치료 요법을 위한 성인 줄기 세포의 공급원으로서의 인간 지방 조직의 잠재적 유용성에 관한 가능성을 제시하는 것이다.

실시예 2: 인간 지방 유도된 세포의 면역원성

재생성 의학 기법은, 치료 시점에 바로 이용 가능한 인간 성인 줄기 세포의 풍부한 공급원을 필요로 한다. 임의의 특정 이론에 구애되길 바라지 않으면서, 동종 줄기 세포가 상기 목적을 달성할 수 있는 것으로 여겨진다. 지방 조직은 인간 세포의 미개발 저장고를 나타내므로, 하기의 실험은, 계대된 ADAS 세포에 대하여 갓 분리한 인간 지방 조직 유도된 스트로마 혈관 분획 세포 (SVF5)의 면역원성 성질을 비교하기 위해 고안된 것이다. 본원에 개시된 결과는, 지방 유도된 세포 상의 조혈 관련 마커 (CD11a, CD14, CD45, CD86, HLA-DR)가 계대에 따라 감소함을 나타낸다.

또한, 혼합 림프구 반응 (MLR)에서, SVF 및 초기 계대 ADAS 세포가 동종 반응자 T 세포에 의한 증식을 자극하는 것으로 관측되었다. 반면, 계대 P1 너머로 계대된 ADAS 세포는 T 세포로부터의 반응 유도에 실패하였다. 또한, 후기 계대된 ADAS 세포는 MLR 반응을 억제하는 것으로 관측되었다. 따라서, 플라스틱에 대한 부착성 및 인간 지방 유도된 세포의 연이은 확대는, 면역표현형 및 면역원성에 따른 상대적으로 균질한 세포군을 선택하는 것이다. 이들 결과는, 이식에서 동종 인간 ADAS 세포를 사용하는 것의 가능성을 지지하는 것이다.

본원에 개시한 실험에 사용한 물질 및 방법을 하기에 개시한다.

BMSC 세포 분리 및 확대

골수 스트로마 (BMSC) 세포를 하기 실험에서 비제한적으로 SVF 및 ADAS 세포를 포함하는 지방 조직 유도된 세포로부터 관측된 결과에 대한 대조군으로서 사용하였다. 간략하게, 인간 골수를 Cambrex Bioscience (Walkersville, MD) 또는 AllCells, LLC (Berkeley, CA)로부터 구입하였다. 골수 흡입물은 헤파린으로 수합하여 1.073g/ml의 밀도 구배로 분획화하였고 (Lymphocyte Separation Medium [LSM], Cambrex Bio Sciences, Walkersville, MID), 경계면에서 수합된 단일핵 세포를 BMSC 확대를 지지하기 위한 능력에 따라 선별된 10% FBS (JRH Biosciences, Lenexa, KS)를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지-저 글루코스 (HyQ DME/Low Glucose, HyClone, Logan, UT) 내에 플레이팅하였다. 유핵화 세포를 T185-cm² 플라스크 당 30 x 10⁷ 개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 1차 배양 (P0)에서 12-17일 동안 3 또는 4일마다 배지를 교환하며 성장시켰다. 세포가 컨플루언트 하여지면, 배양을 0.05% 트립신 (GIBCO, Grand Island, NY)을 사용하여 부착성 세포를 제거하여 계대하고, P1 세포로서 T185-cm² 플라스크 당 1 x 10⁶ 개의 세포로 재플레이팅하였다. 이 시점부터, BMSC를 7일마다 계대하고, 3 또는 4일마다 1회 배지를 교환하였다. 마지막 수확 시, 플라스말라이트 (Baxter Health Care, Deerfield, IL) 내에 10% DMSO (Edwards Life Sciences, Irvine, CA) 및 5% 인간혈청 알부민 (JRH Biosciences)를 함유하는 동결 용액을 사용하여 동결 보관하였다. 확대된 BMSC (P2-P4)는, 조혈성 마커 (CD45, CD14, CD3, MHC 클래스 II 항원)에 대해 음성이며 스트로마 마커 (CD13, CD29, CD44, CD9O, CD105)에 양성인, 외관상 섬유아세포인 균질한 군집을 나타내었다. BMSC는, 골생성 및 지방생성 계통과 함께 이들이 분화하는 능력에서 보이듯이, P2 및 P4에서 다분화능인 것이었다.

플로우 사이토메트리

본원의 다른 곳에 기재한 바와 같이 플로우 사이토메트리를 실시하였다. 하기 항원에 대항한 항체 (카탈로그 #) 는, 달리 언급되지 않는 한 BD-Pharmingen 로부터 구입하였고, 공급자의 추천량에 따라 사용하였다: CD11a APC (#550852), CD14 APC (#555394), CD4O APC (#555591), CD45 FITC (#555482), CD54 APC (#559771) , CD8O FITC (Caltag #MHCD8001), CD86 PE (Caltag #MHCD86O1), HLA-ABC APC (#555555), HLA-DR APC (#559868).

혼합된 림프구 반응 ( MLR )

인간 림프구 군집

말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 루코페레즈된 (leukopheresed) 말초 혈액 세포 (AllCells, LLC)를 LSM 농도 구배상에서 원심 분리하여 제조하였다. 자기 입자를 사용한 음성 선별에 의해 PBMC의 부분으로부터 T 세포를 정제하였다. 간략하게, PBMC를 단구 (항-CD14; 클론 UCHM1), B 세포 (항-CD19; 클론 LT19), 천연 킬러 세포(항-CD56; 클론 ERIC-1) 및 MHC 클래스 II 항원 (항-MHC 클래스 II DR; 클론 HL-39)을 발현하는 세포에 결합하도록 선택된 모노클로날 항체 (mAbs, 모두 Serotec, Inc., Raleigh, NC로부터임)의 칵테일로 처리하였다. PBMC를 항마우스 IgG 항체 (Dynal Corp, Lake Success, NY)로 코팅된 자기 비드와 혼합하였다. 비드 결합된 세포를, 자석으로 제거하여, 정제된 T 세포를 남기도록 하였다 (항-CD3 mAb를 사용한 플로우 사이토메트리에 의해 >90% T 세포). PBMC 및 정제된 T 세포 모두를 분취하여 액체 질소 내에 동결 보관하였다.

면역원성 어세이

1방향 MLR 어세이를 사용하여 지방 유도된 세포군의 면역원성을 측정하였다. MLR은, 소듐 파이루베이트, 비필수 아미노산, 항생제/항진균제, 2-머캅토에탄올 (모두 GIBCO, Grand Island, NY 의 시약임)과 5% 인간 AB 혈청 (Pel-Freez Biologicals, Rogers, AK)이 보충된 이스코부의 변형된 둘베코 배지 (IMDM)을 사용하여 96 웰 마이크로타이터 플레이트에서 실시하였다. 2명의 상이한 공여자로부터 유도된 정제된 T 세포를 2 x 10⁵ 세포/공여자/웰로 플레이팅하였다. 상이한 공여자를 이용함으로써, 지방 유도된 시험 세포에 대해 적어도 하나의 T 세포군이 주요 미스매치 (mismatch)가 되는 가능성을 최대화하였다. 본 어세이에 사용된 자극자 세포는 자가유래 PBMC (기저선 반응), 동종 PBMC (양성 대조군 반응) 및 시험 지방 유도된 세포군을 포함한다. 자극자 세포는 각종 수로 (보통 5000-20,000 세포/웰)로 배양 웰에 첨가되기 이전에, 세슘 조사기로 전달되는 감마 방사선 5000rads로 방사선 조사하였다. 추가의 대조군 배양물은, 배지 단독 내에 플레이팅된 T 세포로 이루어졌다 (자극자 세포 없음). 각 처리에 대해 3중 배양을 실시하였다. 배양을 ₃H-티미딘 (1 μCi/웰, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)으로 16시간 펄스하면서 6일 동안 5% CO₂ 에서 37℃ 로 인큐베이션하고, 세포를 Skatron 96 웰 세포 수확기 (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, NY)를 사용하여 유리 섬유 필터 매트 상에 수확하였다. 필터상에 침착된 분열하는 T 세포 내로 혼입된 방사능을, 섬광 계수기를 사용하여 측정하였다 (Microbeta Trilux Scintillation and Luminescence Counter, Wallac Inc., Gaithersburg, MD).

세포 군의 면역원성 평가에는 3가지 기준을 사용하였다. 이들은 1) 자가유래 PBMC 에 의해 유도된 것과 비교하여 T 세포 증식성 반응 (CPM)에서의 통계적으로 유의한 차이 (p < 0.05, Student's t-test); 2) 자가유래 PBMC로 유도된 반응과 적어도 750 CPM의 차이; 및 3) 적어도 3.0의 자극 지수 (자가유래 PBMC에 의해 유도된 CPM으로, 테스트 군에 의해 유도된 CPM을 나눈 것). 테스트 군으로 상기의 모든 3가지 기준을 통과한 것을 면역원성인 것으로 고려하였다.

억제 어세이

2방향 MLR 어세이를 사용하여, 지방 유도된 세포군의 억제를 평가하였다. 간략하게, 2명의 상이한 공여자로부터의 PBMC를, 2 x 10⁵ 세포/공여자/웰로 96 웰 마이크로타이터 플레이트 내에서 완전 배양 배지 내에 혼합하였다. 지방 유도된 세포를 5,000, 10,000 및 20,000 세포/웰로 MLR에 가하였다. 대조군 MLR 배양물은, 지방 유도된 세포가 첨가되지 않거나, 또는 인간 지라 섬유아세포 (CRL-7433, American Type Culture Collection, Manassas, VA)가 ADAS 세포에 사용되는 수로 첨가되었다. 지라 섬유아세포는, 분석된 가장 약한 억제성 섬유아세포성 세포 타입으로 밝혀졌고, 본 실험에서, ADAS 세포에 의한 억제 계산을 위해 적절한 어세이내 투여량을 규정하기 위해 사용되었다; 즉, 대조군 MLR의 10% 초과의 억제를 매개하지 않는 지라 섬유아세포의 최고 투여량. 억제는 하기식을 이용하여 계산되었다: 억제 백분율 = (1 - [테스트 세포 + MLR cpm ÷ MLR cpm]) x 100. 대조군 및 테스트 배양간의 통계적 유의성은 Student's t- test를 사용하여 평가하였다.

실험 결과를 이제 설명하고자 한다.

면역 표현형

각 정제 단계 및 계대 이후 동결 보관된 세포에 대해 플로우 사이토메트리 분석을 실시하였다 (표 1, 도 5). 초기 SVF 및 P0 세포는, 단구로 보이는 세포 하부세트를 포함하는데, 이는 이들이 일반 백혈구 항원 CD45, 단구/대식세포 마커 CD11a 및 CD14를 포함하는 조혈 마커, MHC 클래스 II DR 조직적합성 항원 및 공동 자극 분자 CD86 패널에 대해 양성이기 때문이다. 상기한 마커 대부분의 발현 감소에 따라 P1에 이르면 상기 군집은 소멸한다. 상기 군집 내 단구의 존재가 중요한데, 이는 이들 세포가 면역원성으로서 거부 반응을 유도 가능하기 때문이다. 다른 조혈 관련 마커는, "스트로마 세포" 관련 마커와 유사한 경향을 나타내었다. CD40, CD54 (ICAM-1), 및 MHC 클래스 I ABC 조직적합성 항원의 표면 수준은, SVF 및 P3 ADAS 세포군 간에서 현저히 증가하였다 (표 4). 변화의 범위는, CD40에 대해서는 1.3% 내지 66%이고, HLA-ABC에 대해서는 67% 내지 92%로 가변이었다. 공동 자극 활성 관련 분자 (CD40, CD54, CD80)의 중간 내지 높은 수준과 연계된 클래스 I 항원 발현의 높은 수준은, 이들 세포가 혼합 림프구 반응에서 항원 제시 세포로서 기능할 수 있음을 제안한다. 이를 하기에서 검증하였다.

표 4: 분리 및 계대의 점진적 단계에서의 인간 지방 유도된 세포의 표현형 특정화¹

¹데이터는, 괄호 내에 표시한 공여자 인원으로부터 수득한 평균 ± 표준편차 로 나타내었다.

²데이터는, n=4 공여자의 평균을 나타낸다.

* Student t-test 에 의한 SVF 세포에 대하여 <0.05 인 P 값,

** Student t-test 에 의한 SVF 에 대하여 <0.01 인 P 값,

*** Student t-test 에 의한 SVF 에 대하여 <0.001인 P 값.

면역원성

1방향 MLR 어세이를 실시하여, 인간 SVF 세포 및 ADAS 세포를 포함하는 인간 지방 유도된 세포의 면역원성을 평가하였다. T 세포의 증식을, 방사선 조사된 자극자 세포 투여량을 증가시키면서 ₃H-티미딘의 혼합을 기초로 측정하였다. 자가유래 및 동종 PBMC는 각각 음성 및 양성의 자극자 세포 대조군으로서 사용되었다. 인간 SVF 세포가, 동종 PBMC의 그것에 필적하는 투여량 의존적인 MLR 반응을 유도하는 것으로 관측되었다 (도 6). 점진적 계대에 따라서, ADAS 세포는 P1 에서 자가유래 PBMC에서 관측된 것에 필적하는 수준인 감소된 반응을 유도하였다. 다수 공여자로부터의, 인간 SVF 세포 및 ADAS 세포를 포함하는 지방 유도된 세포 군집의 면역원성을 표 5에 개시하였다. 면역원성에 대한 양성 및 음성 지정은, 본원 다른 곳에 기재된 기준에 의거한 것으로서, 20,000 세포/웰 (공여자 902-917) 내지 30,000 세포/웰 (공여자 407-611) 범위의 각 실험 내에서의 최고 세포 투여량에 대해 표시하였다. T 세포군 모두 또는 하나에 대한 양성 반응에 기초하여, 하기의 군은 면역원성인 것이다: SVF 세포 (4/7 공여자), P0 세포 (7/9 공여자) 및 P1 세포 (4/7 공여자). 나머지 계대된 세포 군 (P2-P4)은, 한 공여자의 P2 세포를 제외하고는 MLR 어세이에서 T 세포 증식을 유도하지 않았다.

표 5: 상이한 2명의 공여자로부터 유도된 T 세포에 대한 MLR 어세이에서 평가된 지방 조직 유도된 세포군의 면역원성

+ = 면역원성 (방법에 개시된 3가지 기준 모두를 만족하였음).

- = 비면역원성 (방법에 개시된 3가지 기준 1가지 이상을 만족하지 못하였음).

ND = 실시하지 않음.

면역 억제:

임의의 특정 이론에 구애되기를 바라지 않으면서, 계대된 ADAS 세포가 T 세포 반응을 자극하지 못하는 불능성은, ADAS 세포에 의해 매개되는 활성의 면역 억 제 기작, 고유의 낮은 면역원성, 또는 이들 특성 모두의 조합에 기인할 수 있다. 지방 유도된 세포가 면역 억제성인지의 여부를 검증하기 위해, 이를 5000, 10,000 또는 20,000 세포/웰로 MLR 배양물에 첨가하였다. 대조군 MLR 배양물은, 세포 무첨가이거나 비억제성 인간 지라 섬유아세포를 본원의 다른 곳에 기재한 수로 첨가하여, 세포 번잡화에 따른 억제를 조절하고자 하였다. 도 7에 도시 되었듯이, 지라 섬유아세포는, 최고 투여량 (20,000 세포/웰)에서만 MLR 배양을 억제하였다. 유효한 (인공적 억제가 없는) 더 낮은 투여량 2개를 사용하면, SVF 군집을 제외하고 모든 ADAS 세포 계대에 의해 현저한 억제가 매개되었다. P0-P4 ADAS 세포에 의해 매개된 대조군 MLR 반응 (세포 무첨가)의 억제 백분율은, 33 - 63% 범위였다. 표 6에 4명의 공여자로부터의 결과를 요약하였다. 억제 백분율은, 가장 낮은 세포 투여량에서 검증되었는데 (5000 세포/웰), 이는 이들 실험 어느 것에서도 지라 섬유아세포의 상기 투여량에서 MLR 의 억제가 발생하지 않았기 때문이다. SVF 군에 의한 평균 억제는 최소한 (10%)인데 반하여, P0-P4 세포에 의한 억제는 평균 32.0 + 3.2%이었다. 이러한 억제 정도는, 이들 배양물 중의 낮은 ADAS 세포 백분율 (1.3%)을 고려할 때에 현저한 것이다. BMSC 가 ADAS 세포와 비교하여 유사한 표현형 특성 및 분화 잠재능을 가지고 있기 때문에, ADAS 세포의 억제 특성을 BMSC와 비교하여 보는 것이 흥미로웠다 (Gimble 등, 2003 Curr Top Dev Biol 58:137-60). 이들 세포 모두는 3300-10,000 세포/웰의 투여량으로 첨가시에 MLR을 억제하였다 (도 8). ADAS 세포에 의한 억제 크기는 BMSC 의 그것을 최대 13% 초과한 것이다.

표 6: 4명의 상이한 공여자로부터의 지방 유도된 세포군에 의한 MLR 배양물의 억제 백분율

* 열악한 생존성 때문에 (<50%) 평균에 그 값을 포함시키지 않음.

일시적 변화:

본원에 개시된 결과는, 혼합 림프구 반응에서, 동종 말초 혈액 단핵세포의 그것과 동등한 T 세포 증식 반응을 갓 분리한 SVF 세포가 유도 가능함을 나타낸다. 이러한 면역원성 반응은 초기 계대 (P0, P1) ADAS 세포에서 감소하여 후기 계대 ADAS 세포 (P2-P4)에서는 본질적으로 사라졌다. 동종반응성 의미에서의 세포군집의 면역원성은, 군집 내 항원 제시 세포 (APC)의 존재에 의해 주로 결정된다. 고전적 APC는, 조혈 세포로서, 보통 CD80 및 CD86과 같은 공동자극성 분자에 추가하여 MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자를 발현하는 수상 세포 또는 대식세포이다. 면역원성으로 밝혀진 지방 유도된 세포의 P0 및 SVF 군집이, 거의 단구로 여겨지는 세포(CD45, CD11a, CD14, CD86 및 MHC 클래스 II 항원들에 대해 양성)의 APC 하부군을 포함하는 반면, 단구를 포함하지 않는 P1-P4 군집이 일반적으로 면역원성이 아니라는 점은 주목할 만하다. 임의의 특정 이론에 구애되기를 바라지 않으면 서, ADAS 세포는 대안적으로 APC 자체로 행동하는 것으로 여겨지는데, 이는, 이들이 CD54, CD40, CD80 및 CD86를 포함하는 공동자극성 활성을 나타내는 다수의 세포 표면 분자 및 동종항원 (MHC 클래스 I 항원)을 발현하기 때문이다. 흥미롭게도, ADAS 세포는 이들 분자 대부분을 적어도 P4 까지는 발현하며, 이는 이들 단백질이, ADAS 세포에게 APC 기능을 부여하기에 충분하지 않거나 또는 활발한 면역 억제와 같은 기타 기작이 면역원성에 앞설 수 있음을 나타낸다. 본 연구에서, ADAS 세포는 MLR에서 T 세포를 현저히 억제함을 나타내었다. 이러한 성질은, P0-P4 세포에서는 뚜렷하나 (평균 32% 억제), SVF 군에서는 그렇지 못하다 (평균 10% 억제). 결과의 인공적 해석을 피하기 위해 (즉, 세포 번잡화에 따른 억제), MLR 중 반응세포 대 테스트 세포의 비율을 매우 높게 하여 (80:1) 억제 실험을 실시하였다. 상기 비율에서 대조군 지라 섬유아세포는 억제성이지 않았다. ADAS 세포에 의한 억제를 BMSC와 비교하였는데, 이는 이들 세포 타입 모두가 유사한 표현형 및 기능적 특성을 가지며, BMSC는 유사분열 촉진 자극 및 MLR 어세이의 T 세포 증식을 억제하는 그들의 활성에 의해 면역 억제성인 것으로 밝혀졌기 때문이다. 실제로, ADAS 세포 및 BMSC가 유사한 크기의 억제를 나타내는 것으로 관측되었다. 본원에 제시된 이들 결과는 문헌에 최근 보고된 것을 확인 및 연장하는 것이다 (Puissant 등, 2005 Br. J. Haematol. 129:118-29).

BMSC는 간세포 성장 인자 및 전환 성장 인자 베타를 포함하는 억제 분자, 프로스타글랜딘 및 인돌레아민 2,3-디옥시게나제를 정교화화는 것으로 보고되었다. BMSC 매개된 림프구 증식 억제를 설명하는 다수의 상이한 기작이 제안되어 왔다. 이들은, 사이클린 D2 발현의 억제에 의한 활성화된 T 세포 및 B 세포의 분열 정지, 조절성 T 세포 또는 APC의 유도, 및 수상 세포 및 세포독성 T 세포 성숙을 방해하는 것을 포함한다. 임의의 특정 이론에 구애되기를 바라지 않으면서, ADAS 세포 매개 억제는 BMSC의 그것과 유사한 기작을 가지는 것으로 여겨진다. 본원에 기재된 면역성 데이터는, 배양 확대된 지방 유도된 세포가 동종반응성 T 세포 증식을 자극하는 것이 아니라, 활발히 억제함을 나타내며, 이는, 이들 세포를 전통적 조직적합성 장벽을 넘어서 이식 가능함을 시사한다. BMSC는, 기대되는 시간 기간보다 더 길게 면역적격의 동종 및 이종 수용자 내에서 생존하는 것으로 보고되었다. SVF 군집의 면역원성 특성 때문에, 단구를 제거하는 이식물 조작에 의해 상기 군집의 면역원성을 감소시킬 수 있을지라도, SVF 세포의 이식은 자가 적용에만 제한되게 될 것으로 보인다. 그러나, 조직 수선 또는 대체를 위한 세포 공급원으로서의 동종 ADAS 세포의 용도는, 임상 실시를 위한 성인 줄기 세포의 즉각적 입수성 및, 이들의 제조의 실제적 및 상업적 측면 및 품질 신뢰 측면에서, 중요한 의미를 가진다.

본원에 개시된 결과는, 인간 지방 조직으로부터 유도된 세포의 특성이 시험관내 부착 및 확대의 함수로 변화함을 나타낸다. 콜라게나제 소화 및 차등 원심분리로 분리한 스트로마 혈관 분획 세포는, 전통적 조혈 마커에 대해 불균질한 것이었다. 이들 초기 세포의 8.1% - 17.6% 가 단구/대식세포 및, 범-조혈성 항원 CD11a, CD14, CD45, CD86 및 HLA-DR 을 발현하였다. 4회의 연속 계대 이후, 부착성 지방 유도된 줄기 세포의 1% 미만이 CD14, CD45, 또는 CD86 를 발현하였고, 한편 이들 세포의 3% 이하가 CD11a 또는 HLA-DR 를 발현하였다. 면역표현형에서의 이들 변화는, 혼합 림프구 반응에서 인간 지방 유도된 세포에 의해 나타난 면역원성의 수준과 관련된다. 스트로마 혈관 분획 세포 및 초기 계대 지방 유도된 줄기 세포 (P0/P1)가 동종 T 세포로부터 증식성 반응을 유도하였으나, 후기 계대는 상기 달성에 실패하였다. 실제로, 혼합된 림프구 반응 내로 지방 유도된 줄기 세포의 첨가는, 동종 자극자 세포에 대한 T 세포의 증식성 반응을 억제하였다. 본원에 개시된 결과는, 지방 유도된 줄기 세포를 전통적 조직적합성 장벽을 넘어서 이식 가능함을 시사한다.

실시예 3: ADAS 세포의 선별

본 내용은, ADAS 세포가, 비제한적으로 인간 다중약물 수송체 (ABCG2) 및 알데하이드 탈수소효소 (ALDH)를 포함하는 줄기 세포 관련 마커를 발현함을 나타낸다. ALDH에 있어서, ALDH는 ADAS 세포 선별에 사용 가능한 세포 내 효소이다. 임의의 특정 이론에 구애되기를 바라지 않으면서, 절단 가능한 기질을 ADAS 세포에 제공 가능하며, 여기에서 기질이 ADLH+ ADAS 세포 내에 존재하는 경우, 절단되게 되어, 절단된 기질이 ADLH+ ADAS 세포의 존재를 신호하도록 한다. 그러한 신호는, ADLH+ ADAS 세포를 분류하기 위해 사용 가능한 형광 형태일 수 있다.

본원에 인용된 각각 및 모든 특허, 특허 출원 및 문헌의 내용은, 그 전체가 여기에 참조로 편입된다.

본 발명이 특정 구현을 참조로 하여 설명되었으나, 본 발명의 참 정신 및 범 위를 벗어나지 않고, 당업자에 의해 본 발명의 다른 구현 및 변형이 고안 가능함은 명백한 것이다. 부가된 청구범위는, 그러한 구현 및 균등한 변형을 포함하는 것으로 이해하고자 하는 것이다.

Claims (36)

1. 비면역원성 특성을 나타내는 분리된 지방 조직 유도된 성인 스트로마 (ADAS) 세포로서, 상기 세포는 적어도 2 계대까지 계대된 세포이며, 나아가 상기 세포는 인간 다중약물 수송체 (ABCG2) 및 알데하이드 디하이드로게나제 (ALDH)로 이루어진 군에서 선택된 줄기 세포 관련 특성을 발현하는, 지방 조직 유도된 성인 스트로마 (ADAS) 세포.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포가 적어도 16 계대 까지 계대된 세포.
3. 제 1 항에 있어서, 외래 유전 물질이 상기 세포로 도입된 세포.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 세포가 인간으로부터 유도된 것인 세포.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 세포가 그 수용자에 대해 동종인 세포.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 세포가 그 수용자에 대해 이종인 세포.
7. 이식편 수용자 내에서 동종항원에 대항한 효과자 세포의 면역 반응을 감소시키기 위한 이식편 수용자의 치료 방법으로서, 이식편 수용자에게 비면역원성 특성 을 나타내는 분리된 지방 조직 유도된 성인 스트로마 (ADAS) 세포를, 동종항원에 대항한 효과자 세포의 면역 반응을 감소시키기에 유효한 양으로 투여하는 것이며, 여기에서 상기 ADAS 세포는 적어도 2 계대 까지 계대된 것이며, 나아가 상기 ADAS 세포는 인간 다중약물 수송체 (ABCG2) 및 알데하이드 탈수소효소 (ALDH)로 이루어진 군에서 선택되는 줄기 세포 관련 특성을 발현하는 것으로서, 이에 따라 이식편 수용자 내에서 상기 효과자 세포가 상기 동종항원에 대하여 감소된 면역 반응을 가지게 되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 효과자 세포가 T 세포인 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 T 세포는 공여자로부터이고, 상기 동종항원은 수용자로부터인 방법.
10. 제 8 항에 있어서, 상기 T 세포는 수용자로부터이고, 상기 동종항원은 공여자로부터인 방법.
11. 제 8 항에 있어서, 상기 T 세포가 이식편 내에 존재하는 방법.
12. 제 7 항에 있어서, 상기 효과자 세포는 수용자에게 상기 ADAS 세포를 투여하기 이전에 활성화된 T 세포이고, 나아가 상기 면역 반응은 공여자로부터의 상기 T 세포의 재활성화인 방법.
13. 제 7 항에 있어서, 상기 ADAS 세포가 이식편 수용자에 의한 이식 거부를 치료하기 위해 이식 수용자에게 투여되는 방법.
14. 제 7 항에 있어서, 상기 ADAS 세포가 포유류로부터 유도된 것인 방법.
15. 제 14 항에 있어서 상기 포유류가 인간인 방법.
16. 제 7 항에 있어서, 상기 수용자에게 면역 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
17. 제 7 항에 있어서, 상기 ADAS 세포를 상기 이식편 이전에 수용자에게 투여하는 방법.
18. 제 7 항에 있어서, 상기 ADAS 세포를 상기 이식편과 동시에 수용자에게 투여하는 방법.
19. 제 7 항에 있어서, 상기 ADAS 세포를 이식편의 일부로 투여하는 방법.
20. 제 7 항에 있어서, 상기 ADAS 세포를 이식편의 이식에 이어서 수용자에게 투여하는 방법.
21. 제 7 항에 있어서, 상기 ADAS 세포를 수용자에게 정맥내로 투여하는 방법.
22. 제 7 항에 있어서, 상기 효과자 세포가 상기 공여자 이식편 수용자의 세포인 방법.
23. 제 7 항에 있어서, 상기 ADAS 세포가 유전적으로 변형된 것인 방법.
24. 동종항원에 대항한 효과자 세포에 의한 면역 반응을 감소시키는 방법으로, 비면역원성 특성을 나타내는 분리된 지방 조직 유도된 성인 스트로마 (ADAS) 세포를, 상기 동종항원에 대항한 상기 효과자 세포의 면역 반응을 감소시키기에 유효한 양으로 상기 효과자 세포와 접촉시키는 것으로서, 여기에서 상기 ADAS 세포는 적어도 2 계대 까지 계대된 것이며, 나아가 상기 세포 ADAS는 인간 다중약물 수송체 (ABCG2) 및 알데하이드 탈수소효소 (ALDH)로 이루어진 군에서 선택되는 줄기 세포 관련 특성을 발현하는 것인 방법.
25. 제 24 항에 있어서, 상기 효과자 세포가 T 세포인 방법.
26. 지방 조직 유도된 세포군으로부터 지방 조직 유도된 스트로마 (ADAS) 세포를 분리하는 방법으로, ABCG2에 특이적인 항체를 제공하고; 항체-지방 조직 유도된 스트로마 세포 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 상기 항체와 지방 유도된 세포의 상기 군을 접촉시키고; 그리고 지방 유도된 세포의 상기 군으로부터 상기 항체-지방 조직 유도된 스트로마 세포 복합체를 실질적으로 분리하여; 상기 지방 조직 유도된 스트로마 세포를 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 26 항에 있어서, 상기 항체가 물리적 지지체에 컨쥬게이션된 것인 방법.
28. 제 27 항에 있어서, 상기 물리적 지지체가 마이크로비드, 자기 비드, 팬닝 표면, 밀도 원심분리를 위한 조밀한 입자, 흡착 컬럼 및 흡착 막으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
29. 제 27 항에 있어서, 상기 물리적 지지체가 스트렙타비딘 비드 및 비오틴 비드로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
30. 제 26 항에 있어서, 상기 항체-지방조직 유도된 스트로마 세포 복합체가, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS) 및 자기 활성화된 세포 분류 (MACS)로 이루어지는 군에서 선택되는 방법을 사용하여 지방 유도된 세포의 상기 군으로부터 실질적으로 분리되는 방법.
31. 지방 유도된 세포군으로부터의 지방 조직 유도된 스트로마 세포를 풍부하게 하는 방법으로, ABCG2에 특이적인 항체를 제공하고; 항체-지방 조직 유도된 스트로마 세포 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 상기 항체와 지방 유도된 세포의 상기 군을 접촉시키고; 그리고 지방 유도된 세포의 상기 군으로부터 상기 항체-지방 조직 유도된 스트로마 세포 복합체를 실질적으로 분리하여; 지방 조직 유도된 스트로마 세포를 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 31 항에 있어서, 상기 항체가 물리적 지지체에 컨쥬게이션된 것인 방법.
33. 제 32 항에 있어서, 상기 물리적 지지체가 마이크로비드, 자기 비드, 팬닝 표면, 밀도 원심분리를 위한 조밀한 입자, 흡착 컬럼 및 흡착 막으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
34. 제 32 항에 있어서, 상기 물리적 지지체가 스트렙타비딘 비드 및 비오틴 비드로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
35. 제 31 항에 있어서, 상기 항체-지방조직 유도된 스트로마 세포 복합체가, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS) 및 자기 활성화된 세포 분류 (MACS)로 이루어지는 군에서 선택되는 방법을 사용하여 지방 유도된 세포의 상기 군으로부터 실질적으로 분리되는 방법.
36. 지방 조직으로부터 유도된 세포군으로부터 ALDH에 대해 양성인 지방 조직 유도된 스트로마 (ADAS) 세포를 동정하는 방법으로, 상기 세포군에 대해서 ALDH에 특이적인 절단가능한 기질을 제공하는 것으로서, 여기에서 상기 기질은 ALDH+ 세포에 존재시 절단되는 것이며, 나아가 절단된 상기 기질은 형광을 방출함으로써 ALDH+ADAS 세포를 동정하는 것을 특징으로 하는 방법.

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