CN102016010A - 用于治疗免疫缺陷或免疫抑制相关之病症和骨疾病的人骨形成细胞 - Google Patents

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恩里科·巴斯蒂亚内利
辛迪·巴德
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Abstract

本发明涉及分离的骨形成细胞的新的治疗性用途，特别是在治疗免疫缺陷或免疫抑制相关之疾病和病症中的用途。

Description

用于治疗免疫缺陷或免疫抑制相关之病症和骨疾病的人骨形成细胞
技术领域
本发明涉及骨形成细胞在治疗免疫缺陷或免疫抑制相关之病症和骨疾病中的治疗性应用。
背景技术
免疫缺陷疾病代表多种严重的病症，其中免疫系统功能缺损导致患者对各种机会性感染或状况的易感性增加。
免疫缺陷还可由于施用免疫抑制剂(例如，为了防止移植器官的排斥)而导致，或者作为针对其它病理之治疗(例如化疗)的副作用。
需要针对免疫缺陷疾病的另外的治疗方式。
人间充质干细胞(MSC)表达高水平的I类人白细胞抗原(HLA)，而不表达II类HLA，但是通过用干扰素-γ(IFNγ)刺激可诱导表达后者(Le Blanc等，2003.Exp Hematol 31：890-6)。
据报道，MSC还可作为抗原呈递细胞。该功能在极短的时间段内观察到，并且仅在IFNγ施用和/或刺激之后，但在未刺激的MSC中则观察不到该功能。在特定抗原(来自白色念珠菌(Candida albicans)或破伤风类毒素)存在下，MSC细胞能够通过自分泌低水平的IFNγ来上调其II类HLA抗原的表达。但是，当培养物中IFNγ浓度增加时，II类HLA表达下调，并且MSC的APC功能被抑制(Stagg等，2006.Blood 107：2570-7；Chan等，2006.Blood 107：4817-24)。
已显示来自骨小梁或来自细胞系的成骨细胞具有免疫活性并且刺激同种异体的外周血单个核细胞(Skjodt等，1989.Immunology 68：416-20)。
发明内容
除非另外指明，本发明中所使用的所有术语(包括技术和科学术语)均具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
本文所用的无数量词修饰的形式包含单数和复数的含义，上下文有明确指定的除外。例如，“细胞”是指一个(种)或多个(种)细胞。
本文使用的术语“包含”和“含有”与“包括”等是同义词，其是非排他性的或开放式的，即不排除另外的未记载的成员、要素或方法步骤。
通过端点描述的数值范围包括各范围内的所有数值和分数以及所述端点。
当涉及可测量的值(如参数、数量、时间段等)时，本文使用的术语“约”意在包括相对于指定值的+/-10％或更小的变化，优选地+/-5％或更小，更优选地+/-1％或更小，以及更加优选地+/-0.1％或更小，在该范围内这些变化适用于本发明。应理解，“约”所修饰的数值本身也被具体地且优选地公开了。
本说明书引用的所有文献均通过引用以其整体并入本文中。特别地，本文明确引用的所有文献的教导均通过引用并入本文中。
本发明人出人意料地发现骨形成细胞除了具有预期的骨再生作用之外，还显示出强效的抗原呈递细胞(APC)的性质，因此可用于治疗免疫缺陷或免疫抑制相关的疾病和病症。
有利地，本发明人还发现骨形成细胞(例如特别是通过由分离的间充质干细胞(MSC)或骨髓基质细胞(BMSC)分化而在体外可获得的骨形成细胞)基本上不依赖于活化或者刺激(例如通过干扰素γ)就能够展示出独特的免疫学标志物(例如II类HLA抗原)和抗原呈递细胞的性质。因此，所述APC标志物和性质不必局限于活化或刺激后的极短时间段中。这种相对稳定的APC性质使得骨形成细胞成为治疗上述疾病和病症的有利药剂。
因此，在一些方面中，本发明提供了：
-分离的骨形成细胞，其用于治疗免疫缺陷或免疫抑制相关的疾病或病症；
-分离的骨形成细胞在制备用于治疗免疫缺陷或免疫抑制相关之疾病或病症的药物中的用途；
-用于预防和/或治疗有此治疗需要的对象中与免疫缺陷或免疫抑制相关的疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用预防或治疗有效量的分离的骨形成细胞；
-包含分离的骨形成细胞的药物组合物，其用于治疗免疫缺陷或免疫抑制相关的疾病或病症；
涉及特定组分时，术语“分离”表示将该组分与组合物中至少另一组分分开，即前一组分从组合物中被“分离”。当涉及细胞或细胞群时，术语“分离”还暗指这些细胞或细胞群不形成动物体或人体的部分，而是从其中取出或分开(例如以细胞培养物进行维持和/或增殖)。
优选地，所述骨形成细胞可来源于动物，更优选地来源于哺乳动物(包括非人哺乳动物)，更加优选来源于人。
所述骨形成细胞通常可获得自或源自对象(例如优选为人或非人哺乳动物对象)的生物样品(例如，从对象中取出并含有其细胞的样品)。
所述骨形成细胞可优选地用于自体施用(即，施用于获得所述细胞或所述细胞来源的同一对象)或同种异体施用(即，施用于除了获得所述细胞或所述细胞来源之对象以外的、属于同一物种的对象)。还可以异种施用所述骨形成细胞(即，其中获得自或源自一个物种之对象的细胞被施用于不同物种的对象)。
优选地，将本文中的人骨形成细胞自体或同种异体施用于患有免疫缺陷或免疫抑制相关之疾病或病症的人对象。
本文使用的术语“骨形成细胞”一般是指能够形成骨材料和/或骨基质的细胞，特别是指已部分或全部地沿骨生成分化途径发育的分离的细胞或细胞群。非限制性地，骨形成细胞特别地包括骨祖细胞、成骨细胞、骨细胞和本领域中已知的骨生成谱系的其它细胞类型。
因此，本领域技术人员一般理解本文所指的术语“骨形成细胞”的界限。但是，为了进一步引导但非限制性地，本发明的骨形成细胞可表现出以下特征中的一个、多个或所有：
a)细胞包含碱性磷酸酶(ALP)(更具体为骨-肝-肾型ALP)的表达；
b)细胞包含I型前胶原氨基端前肽(procollagen type 1 amino-terminal propeptide，P1NP)、骨连蛋白(ON)、骨桥蛋白(OP)、骨钙蛋白(OCN)和骨唾液酸蛋白(BSP)中一种或多种或所有的表达；
c)细胞显示出能够矿化外部环境或者合成含钙的细胞外基质(如，当暴露于骨生成培养基时；参见Jaiswal等.1997.J Cell Biochem 64：295-312)。可常规地测量细胞中的钙积累和基质蛋白中的钙沉积，例如通过在45Ca2+中培养，清洗以及再次培养，然后测定细胞中存在的或细胞外基质中沉积的任何放射性(US 5,972,703)来实现，或者使用基于茜素红(Alizarin red)的矿化测定来实现(参见，如Gregory等，2004.Analytical Biochemistry329：77-84)。
d)细胞基本上不向脂肪细胞谱系的细胞(如脂肪细胞)或软骨细胞谱系的细胞(如软骨细胞)中的任意一种分化，优选地不向上述两类细胞分化。可使用本领域确立的标准分化诱导条件(如，参见Pittenger等，1999.Science 284：143-7)和测定方法(如，当诱导时，通常用油红O对脂肪细胞染色来显示脂质积累；通常用阿尔新蓝(alcian blue)或番红O(safraninO)对软骨细胞染色)来测试向这些细胞谱系之分化的缺乏。基本上缺乏向脂肪生成和/或软骨生成分化的倾向通常可意味着，当应用于各测试时，所测试细胞中少于50％、或少于30％、或少于5％、或少于1％显示出脂肪生成或软骨生成分化的迹象。
在一个实施方案中，所述骨形成细胞可显示上述a)、c)和d)中所列的所有特征。
在一个实施方案中，所述骨形成细胞针对II类HLA抗原呈阳性(即，包含其的表达)。
在一个实施方案中，所述骨形成细胞针对I类HLA和II类HLA抗原呈阳性(即，包含其的表达)。
在另一实施方案中，所述骨形成细胞显示出抗原呈递细胞(APC)的性质。
在另一实施方案中，所述骨形成细胞可显示免疫抑制性质。
细胞上特定组分(例如标志物或酶)呈阳性意指，当进行合适的测量时，与合适的对照相比，本领域技术人员能够得出该组分之特有信号(如抗体可检测的信号，或通过逆转录聚合酶链式反应来检测)的存在或证据。当所述方法允许定量评估组分时，阳性细胞通常可产生与对照显著不同的信号(例如但非限制性地，与对照细胞产生的该信号相比至少高1.5倍，如至少2倍、至少4倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或更高)。
可使用本领域已知的任何合适的免疫学技术(如免疫-细胞化学或亲和吸附、Western印迹分析、FACS、ELISA等)或者通过任何合适的酶活性生化测定(例如，针对ALP)或者通过任何合适的测定标志物mRNA之量的技术(如Northern印迹、半定量或定量RT-PCR等)来检测上述细胞特异性标志物的表达。本公开内容中所列的标志物的序列数据是已知的，其可以从公共数据库(例如GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/))获取。
本发明中使用的分离的骨形成细胞或细胞群可通过本领域已知的任何合适的方式获得。非限制性地，一种获得骨形成成骨细胞(更特别是II类HLA阳性的成骨细胞和成骨细胞群的合适方法公开于WO2007/093431中，其包括在血清或血浆以及碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)存在下培养分离的骨髓基质细胞(BMSC)或间充质干细胞(MSC)。在另一实例中，如Skjodt等1985(J Endocrinol 105：391-6)所述地，可以直接从骨小梁分离并培养骨形成成骨细胞(更特别是II类HLA阳性的成骨细胞)。在又一实例中，如Pittenger等1999(Science 284：143-7)和Jaiswal等1997(如上)所述地，可通过在骨生成培养基使MSC分化而获得骨生成谱系细胞，优选地在FGF-2存在下，以获得II类HLA阳性的成骨细胞和成骨细胞群。
在一个优选的实施方案中，用于本发明所定义之用途的分离的骨形成细胞可通过从BMSC或MSC分化获得或者直接由其获得。有利地，这样的分化可包括将BMSC或MSC暴露于FGF-2以获得II类HLA阳性的成骨细胞和成骨细胞群。这些细胞表现出相当稳定的APC性质，并且该性质可以在外部活化因子不存在的情况下获得。
术语“免疫缺陷”通常指对象的特异性和/或非特异性免疫系统功能被病理性降低或缺乏的状态。免疫缺陷相关的疾病或病症或者“免疫缺陷疾病”是指主要具有以下特征的多种病症：由于免疫系统的一个或多个缺陷造成的免疫缺陷所导致对各种机会性感染的易感性增加，以及由此带来的严重急性、复发或慢性疾病。免疫缺陷疾病包括但不限于：“免疫缺陷综合征”(其中所有特征均是由免疫缺陷引起的)和“包括免疫缺陷的综合征(syndromes with immunodeficiency)”(其中某些、甚至主要的特征不能用免疫缺陷来解释)。
所述多种免疫缺陷疾病还包括与免疫抑制有关的疾病和病症，“免疫抑制”是指人为地(通常受控地)减少或阻止对象的免疫应答。对象中的免疫抑制可以由免疫抑制剂(“免疫抑制剂”是指已知或发现其抑制或阻止不期望的免疫应答(例如阻止免疫系统对移植器官的排斥)的任何化合物或药剂；免疫抑制剂的实例包括但不限于：环孢菌素A、吗替霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、雷帕霉素、FK506和皮质类固醇)导致，或者可以是针对其它适应症之治疗的副作用(例如，癌症化疗的副作用)。
例如但非限制性地，免疫缺陷或免疫抑制相关的疾病和病症包括：人免疫缺陷病毒(HIV)感染和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、低丙种球蛋白血症、血癌(如白血病和淋巴瘤)、总骨髓消融(total bone marrow ablation)、骨髓移植、器官移植、任何缘起的淋巴细胞减少(lymphocytopenia(lymphopenia)of any origin)、红斑狼疮、恶病质、阿片类物质滥用、肥大细胞增多、风湿热、锥虫病、酒精滥用；以及使用如下药物进行治疗：化疗药物、皮质类固醇、抗TNF药物、辐射、免疫抑制药物(如他克莫司(tacrolimus)、环孢菌素A、甲氨喋呤、霉酚酸酯、硫唑嘌呤、干扰素和免疫球蛋白(如抗CD20抗体和抗CD3抗体)等)。
在一个实施方案中，免疫缺陷或免疫抑制相关的疾病或病症还可包括骨功能异常或骨病变(例如骨质疏松、骨质坏死、骨质减少、骨脆弱、骨坏死、骨折(或微小骨折)、骨硬化和骨质溶解)。有利地，本发明的骨形成细胞能够通过改善免疫缺陷和刺激骨重建来协同作用于这些疾病。
因此，在一些实施方案中，本发明还提供了：
-分离的骨形成细胞，其用于治疗免疫缺陷或免疫抑制相关的骨疾病或病症；
-分离的骨形成细胞在制备用于治疗免疫缺陷或免疫抑制相关之骨疾病或病症的药物中的用途；
-用于预防和/或治疗有此治疗需要的对象中与免疫缺陷或免疫抑制有关的骨疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用预防或治疗有效量的分离的骨形成细胞；
-包含分离的骨形成细胞的药物组合物，其用于治疗免疫缺陷或免疫抑制相关的骨疾病或病症。
优选地，人骨形成细胞可自体或同种异体施用于患有免疫缺陷或免疫抑制相关之疾病或病症的人对象。
可以向对象施用分离的骨形成细胞用于治疗免疫缺陷或免疫抑制相关的疾病或病症(包括上述的免疫缺陷或免疫抑制相关的骨疾病或病症)。
任选地，为了刺激骨形成细胞的APC性质，可以在施用之前用促炎细胞因子处理所述细胞，或者可以与促炎细胞因子一起施用(例如同时地或依次地或以任何顺序分开地)。促炎细胞因子的实例包括但不限于IFNγ、TNFα、IL-1β、IL-17、IL-18。
术语“对象”或“患者”优选地指作为治疗、观察或实验之客体的动物，更优选为温血动物，更加优选为脊椎动物，更优选为哺乳动物(具体地包括人和非人哺乳动物)。术语“哺乳动物”包括任何归入此类的动物，包括但不限于：人、家畜和农场动物、动物园动物、运动动物、宠物、陪伴动物和实验动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、狗、猫、豚鼠、牛、奶牛、绵羊、马、猪和灵长类(如猴和猿)。特别优选的是人对象，包括两种性别以及所有年龄段的人。
本发明的治疗特别地施与有此需要的对象，所谓“有此需要的对象”包括得益于针对给定病症(如免疫缺陷或免疫抑制相关的疾病或病症，包括免疫缺陷或免疫抑制相关的骨疾病或病症)之治疗的对象。这些对象可包括但不限于已被诊断为所述病症、倾向于发展为所述病症和/或有待预防所述病症的对象。
术语“治疗”包括对已发生之疾病的治疗性治疗(如对已发生的免疫缺陷或免疫抑制相关之疾病或病症(包括免疫缺陷或免疫抑制相关之骨疾病或病症)的治疗)以及预防性的治疗(其目的是预防或降低不期望之病痛的发生几率，如防止免疫缺陷或免疫抑制相关之疾病或病症得病和发展的机会)。有益的或期望的临床结果可包括但不限于：一种或多种症状的缓解或者一种或多种生物标志物的减少，疾病程度减轻，稳定的(即不愈加恶化的)疾病状况，推迟或减缓疾病进展，疾病状态的改善或减轻等。“治疗”还可意指：与未接受治疗的预期生存期相比，延长了生存期。
术语“预防有效量”是指由研究人员、兽医、医生或其它临床医师找出的能抑制或推迟对象发病的活性化合物或药剂的量。本文使用的术语“治疗有效量”是指由研究人员、兽医、医生或其它临床医师找出的能引发对象中的生物学或医学响应(其可包括缓解所治疗之疾病或病症的症状等)的活性化合物或药剂的量。用于确定治疗和预防有效量的方法是本领域中已知的。
所述治疗可应用自体的(即来自待治疗对象的细胞)、同种异体的(即来自除了待治疗对象以外的、属于同一物种的对象的细胞)或异种的(即来自属于除所治疗对象以外之物种的对象的细胞)本文定义的骨形成细胞和细胞群。
特别是还包括使用人自体的或同种异体的本文定义的骨形成细胞或细胞群进行治疗。
适当地，可以将本文定义的骨形成细胞和细胞群作为药物组合物进行配制和施用。
药物组合物通常包含作为活性成分的骨形成细胞或细胞群，以及一种或多种可药用的载体/赋形剂。本文使用的“载体”或“赋形剂”包括任何或所有的溶剂、稀释剂、缓冲剂(如中性缓冲盐溶液或磷酸盐缓冲液)、增溶剂、胶体、分散介质、运载体(vehicle)、填充剂、螯合剂(如EDTA或谷胱甘肽)、氨基酸(如甘氨酸)、蛋白质、崩解剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、增香剂、增稠剂、为实现贮存效果的试剂、包衣、抗真菌剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、渗透压控制剂(tonicity controlling agent)、吸收延迟剂等。这些介质和试剂在药物活性物质中的用途是本领域公知的。这些材料应当是无毒的并且应当不干扰细胞的活性。
所述载体或赋形剂或其它材料的具体性质取决于施用途径。例如，所述组合物可采用肠道外可用的水溶液形式，该水溶液是无热源的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。作为药物配制的一般性原则，读者可参考Cell Therapy：Stem Cell Transplantation，Gene Therapy，and Cellular Immunotherapy，G.Morstyn&W.Sheridan编，Cambridge University Press，1996；以及Hematopoietic Stem Cell Therapy，E.D.Ball，J.Lister&P.Law，Churchill Livingstone，2000。
这些药物组合物还可包含确保其中细胞之生存力的组分。例如，所述组合物可包含合适的缓冲系统(如磷酸盐或碳酸盐缓冲系统)以实现期望的pH(更常用为接近中性的pH)，并且可包含足够的盐以确保针对细胞的等渗条件以防止渗透压。例如，为这些目的的合适溶液可以是本领域已知的磷酸盐缓冲液(PBS)、氯化钠溶液、林格注射液或乳酸林格注射液。此外，所述组合物可包含载体蛋白质(如白蛋白)，其可以提高细胞的生存力。
所述药物组合物还可包含可用于修复骨病变和缺陷的组分。例如，这样的组分可包括但不限于骨形态生成蛋白、骨基质(如由本发明的细胞或由其它方法在体外产生的骨基质)、羟基磷灰石/磷酸三钙颗粒(hydroxyapatite/tricalcium phosphate particle，HA/TCP)、明胶、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸、透明质酸、壳聚糖、聚L-赖氨酸和胶原蛋白。例如，可以将成骨细胞与去矿化的骨基质(demineralised bone matrix，DBM)或其它基质联用以制备具有骨生成(其自身形成骨)和骨诱导作用的复合物。使用自体骨髓细胞与同种异体DBM的类似方法也得到了好的结果(Connolly等.1995.Clin Orthop 313：8-18)。
所述药物组合物还可包含补充性生物活性因子(如骨形态生成蛋白(如BMP-2、BMP-7或BMP-4)或任何其它生长因子)或与之共施用。其它可能的附加组分包括适于辅助骨再生的无机钙源或磷酸源(WO00/07639)。需要时，可利用载体基质或材料来施用细胞制备物，以提供改善的组织再生。例如，所述材料可以是陶瓷颗粒或生物聚合物(如明胶、胶原蛋白、骨连蛋白、纤维蛋白原或骨钙蛋白)。可根据标准技术合成多孔基质(如，Mikos等，Biomaterials 14：323，1993；Mikos等，Polymer35：1068，1994；Cook等，J.Biomed.Mater.Res.35：513，1997)。
所述药物组合物还可包括可增强骨形成细胞之APC性质的任何促炎细胞因子或者与之共施用。因此，本发明还提供了包含骨形成细胞和促炎细胞因子的药物组合物，用于同时、依次或分开用于治疗免疫缺陷或免疫抑制相关的疾病或病症(包括免疫缺陷或免疫抑制相关的骨疾病或病症)。促炎细胞因子的实例包括但不限于IFNγ、TNFα、IL-1β、IL-17、IL-18。
作为替代或另外地，在导入所述对象之前，本发明的细胞可以用目的核酸稳定地或瞬时地转化。目的核酸序列包括但不限于那些编码增强成骨细胞之生长、分化和/或矿化的基因产物的序列。例如，为治疗非愈合性骨折或骨质疏松，可以稳定或瞬时的方式导入BMP-2表达系统。细胞转化的方法是本领域技术人员已知的。
另一方面，本发明涉及一种装置，其包含用于向对象(例如全身地、局部地或者在骨病变部位)施用组合物的手术器械，还包含本发明的细胞或细胞群或者包含所述细胞或细胞群的药物组合物，其中所述装置适用于(例如全身地、局部地或者在骨病变部位)施用药物组合物。例如，合适的手术器械可以例如全身地、局部地或在骨病变部位注射包含本发明之细胞的液体组合物。
所述细胞或细胞群可以这样的方式施用，即允许它们移植或迁移到期望的组织部位并使功能缺陷的区域重建或再生。例如，所述细胞可以施用于肌骨骼病变部位。例如，重塑组织或插入裂隙的手术操作或者假肢设备(如髋关节置换)有利于骨生成。在另一些情况下，不需要侵入性手术，可使用引导式内窥镜通过注射来施用所述组合物(如用于修复脊柱)。
在一个实施方案中，上述定义的药用细胞制备物可以液体组合物的形式来施用。在一些实施方案中，所述细胞或包含该细胞的药物组合物可全身性地、局部地或在病变部位处施用。
在另一实施方案中，所述细胞或细胞群可被移至和/或培养于合适的基底上，以提供植入物。细胞可施加和培养于其上的基底可以是金属(如钛、钴/铬合金或不锈钢)、生物活性表面(如磷酸钙)、聚合物表面(如聚乙烯)等。尽管并非优选地，也可以使用硅质材料(如玻璃陶瓷)作为基底。最优选的是金属(如钛)和磷酸钙(即使磷酸钙并非是基底的必不可少的组分)。所述基底可以是多孔的或无孔的。
例如，需要时，可以将已增殖的细胞或正在培养皿中进行分化的细胞转移至三维固体支持物上，从而通过将该固体支持物孵育在本发明的液体营养培养基中来使所述细胞扩增和/或继续分化进程。可以例如通过用含有所述细胞的混悬液浸渍所述支持物来使细胞转移至三维固体支持物上。经上述方法获得的经浸渍的支持物可被植入人对象中。在最终植入前，还可以通过使所述经浸渍支持物浸没于液体培养基中而对其进行再次培养。
所述三维固体支持物需要是生物相容性的，从而使其能够被植入人中。它可以采用任意合适的形状，如圆柱状、球状、盘状或任意形状的一部分。对于适合于生物相容性三维固体支持物的材料来说，可特别关注碳酸钙特别是霰石(特别是珊瑚骨骼的形式)，基于氧化铝、氧化锆、磷酸三钙和/或羟磷灰石的多孔性陶瓷，通过水热交换使碳酸钙转化成羟磷灰石而制得的仿珊瑚骨骼，或者其它磷灰石-硅矿石玻璃陶瓷、生物活性玻璃陶瓷(如Bioglass(TM)玻璃)。
以下非限制性实施例进一步支持了上述方面和实施方案。
实施例表明，通过天然地或诱导地方式展示I类和II类HLA的骨形成细胞可具有令人感兴趣的免疫调节性质，因为它在具有高的骨重建能力的同时还可以调节T细胞增殖。这些骨形成细胞的特征是高水平表达间充质标志物和骨表面标志物以及高的矿化能力，这些反映出它们的骨生物学潜力。
它们的特征在于在其表面表达I类HLA和II类HLA分子，以及缺乏共刺激分子。此外，II类HLA分子可通过不同的免疫刺激分子(例如IFNγ、TNFα、IL-1β等)进行调节。
这些骨形成细胞能够以自体的和同种异体的形式下调经刺激T细胞的增殖应答。这表明自体的和同种异体的骨形成细胞产品均对于治疗免疫相关疾病特别有用。
另外以及出人意料地，当涉及上述免疫抑制性质时，这些骨形成细胞还可以作为抗原呈递细胞(APC)起作用，并因此能够刺激T细胞和另一些炎性细胞的增殖。
此外，进行了小规模的、随机的、有参照对照的临床试验，其有力地证明了这些骨形成细胞对于免疫缺陷或免疫抑制相关之严重病症(即与由于针对器官移植、自身免疫病或重度哮喘施用高口服剂量的皮质类固醇而导致的慢性免疫抑制有关的I期或II期股骨头坏死)的有益作用。
总之，这些数据表明所述细胞对于治疗免疫缺陷或免疫抑制相关之疾病或病症特别有用，任选地，其中所述疾病包括骨功能异常或骨病变(包括免疫缺陷或免疫抑制相关的骨疾病或病症)。
附图说明
图1示意II类HLA阳性的骨形成细胞的矿化作用。
图2示意II类HLA阳性的骨形成细胞的ALP表达。图2A显示细胞的HLA-DR染色。图2B显示细胞的ALP染色。在每幅图中，上方的图显示对照染色，中间的图分别显示HLA-DR或ALP染色，下方的图显示叠加效果。
图3示意在对照vs APC-OB治疗之患者中VAS的发展变化。
图4示意在对照vs APC-OB治疗之患者中WOMACTM指标的发展变化。
图5示意在对照vs APC-OB治疗之患者中的骨病变存活分析。
图6：在对照vs APC-OB治疗之患者中放射性评分的发展变化。
实施例1
表型分析。使用流式细胞术对细胞的免疫生物学细胞表面标志物进行分析。将骨形成细胞与下列经标记的单克隆抗体一起孵育15分钟：HLA-I、HLA-DR、CD80、CD86、CTLA-4、CD40L和CD28，然后用PBS清洗，随后进行离心并用0.3ml PBS重悬。
细胞分化。使用添加了FGF-2(10ng/ml)的常规骨生成培养基(包括添加有10％FCS或者自体的或同种异体的血清或血浆、地塞米松(10-8M)、抗坏血酸(50μg/ml)和β-甘油磷酸酯(10mM)的DMEM或α-MEM培养基)在体外从间充质干细胞(MSC)产生实施例中使用的II类HLA阳性成骨细胞。
矿化测定-骨髓间充质细胞在骨生成培养基中分化。通过与胰蛋白酶或维尔烯一起孵育来回收培养物中的细胞，并以60～120,000个细胞/孔在6孔板的扩增培养基(12，500个细胞/cm2)中铺板。第二天，用2.5ml骨生成培养基更换该培养基。将细胞培养2、3或4周。培养基每3～4天更换一次。培养2周后，用3.7％甲醛/PBS固定细胞，并用茜素红染色。
培养基
地塞米松稀释剂：
Dex1(5.10-4M)：2μl地塞米松母液(5.10-2M)+198μlαMEM
Dex2(10-6M)：2μl Dex1(5.10-4M)+998μlαMEM
骨生成培养基(40ml)
  体积   终浓度
  αMEM   31ml   /
  FCS   6ml   15％
  PenStrepGlu(100×)   400μl   1×
  地塞米松(Dex2)   400μl   10-8M
  抗坏血酸   200μl   50μg/ml
  β-甘油磷酸酯   2ml   10mM
增殖测定。在PHA(或另一刺激试剂)存在或不存在下，将来自个体A的200,000个人T细胞/ml(PBMCa)与来自个体B的经辐射的人骨形成细胞(OBb)一起在96孔微量滴定板中铺板，维持7天，总体积为200μl。
或者，在个体b的PBMCb(或个体c的PBMCc)存在或不存在下，将来自个体A的200,000个人T细胞/ml(PBMCa)与来自个体B的经辐射的人骨形成细胞(OBb)一起在96孔微量滴定板中铺板，维持7天，总体积为200μl。
以100,000个细胞/ml的密度接种所述骨形成细胞。在培养期间，将所述培养物与1μCi/ml 3H-胸苷孵育18小时，以测定T细胞增殖。用冰冷的PBS清洗细胞两次，然后用冰冷的5％三氯乙酸(TCA)清洗两次。最后，用含有0.1N NaOH和0.1％Triton-X100的溶液裂解细胞。收集上清液，并将其与闪烁液混合从而利用β-计数器进行分析。
实施例2
细胞表型
流式细胞术显示该骨形成细胞群表达高水平的间充质标志物(CD90、CD105和CD73)。造血细胞表面分子较少(CD45、CD34)或缺乏(CD14、CD19)。所述细胞表达高水平的I类HLA，并且还出人意料地表达高水平的II类HLA分子。但是，所有被测试的共刺激分子(CD80、CD86、CD28、CTLA-4)均缺乏(表1)。
令人感兴趣的是，如Le Blanc等，2003年(Exp Hematol 31：890-6)针对MSC细胞所示，我们观察到IFNγ(5ng/ml)在培养基中存在24～48小时诱导了II类HLA表达的增加(表1)。使用TNFα、IL-1β、IL-17、IL-18和另一些促炎细胞因子也观察到类似的结果。
表1：在IFNγ存在或不存在下培养的骨形成细胞的表型标志物(通过FACS测定呈阳性的细胞的百分比)
Figure BPA00001253487700141
实施例3
免疫调节
检查上述骨形成细胞群在体外条件下调节免疫系统的能力。测试了在自体或同种异体条件下对T细胞(外周血单个核细胞，PBMC)的诱导或增殖。
从患有免疫相关骨疾病的患者中分离HLA II类阳性的骨形成细胞和/或进行扩增。通过流式细胞术测定它们的II类HLA标志物的表达水平，并使用其细胞(骨形成细胞和/或PBMC)用于T细胞增殖测定。
在自体(来自供者a)或同种异体(来自供者b)的条件下，当与HLAII类阳性的骨形成细胞共培养时，未观察到来自受者a的PBMC的增殖应答(表2)。这表明HLA II类阳性的骨形成细胞未被外周血单个核细胞识别为“外来”细胞，因此不能引发同种异体应答。
此外，在自体(来自供者a)或同种异体(来自供者b)的条件下，当用有丝分裂激活物(例如PHA)进行刺激时，PBMC被骨形成细胞显著下调。免疫抑制水平与初始II类HLA表达水平相关(表2)。
表2：成骨细胞对同种异体T细胞增殖的抑制作用(数值表示为增加或减少的百分数，以起始时的PBMC数为100％)
Figure BPA00001253487700151
＊PBMC-PHA水平的百分数
这些作用未受到用促炎细胞因子预处理的影响。
实施例4
抗原呈递性质
添加来自另一供者的第二PBMC集合导致受者的PBMC增殖增加，这表明HLA II类阳性骨形成细胞起到APC的作用(表3)。该观察结果也与II类HLA的表达水平有关。
表3：在来自另一供者的PBMC存在下，骨形成细胞对T细胞增殖(来自受者)的增殖作用(数值表示为增加或减少的百分数，以起始时的PBMC数为100％)
Figure BPA00001253487700152
令人感兴趣的是，从细胞培养开始时加入某些特定的细胞因子(例如IL2、IL3、IL4、IL11、IL12或PBMC)导致PBMC增殖增加，这表明HLA II类阳性的骨形成细胞起到APC的作用(表4)。该观察结果也与II类HLA的表达水平有关。
表4：在IL2存在下，骨形成细胞对T细胞增殖(来自受者)的增殖作用(数值表示为增加或减少的百分数，以起始时的PBMC数为100％)
Figure BPA00001253487700161
这些作用未受到用促炎细胞因子预处理的影响。
实施例5
骨重建性质
通过流式细胞术对细胞标志物(骨和间充质细胞标志物)或膜标志物的水平进行评估(表1)。骨(ALP)和间充质(CD105、73、90)标志物分别以＞65％和＞95％的水平高表达。
通过ALP产生(ALP染色)和II类HLA标志物表达水平(矿化作用，图1)进行骨生物学功能关联，表明表达高水平II类HLA分子的细胞能够具有高的骨重建潜力。
大多数(如果不是全部的话)细胞都表达ALP(与IFNγ共孵育的细胞中)(图2)。
实施例6
人临床疗效数据
研究设计与患者群
进行了小规模的、随机的、参照对照的临床试验，其中对8名患有免疫缺陷或免疫抑制相关的严重病症(即，I期或II期股骨头坏死)的患者进行如下治疗，即在病变部位植入具有上述特征的展示APC的骨形成细胞(APC-OB，患者#4～8)或骨髓来源的间充质基质细胞群(对照治疗，CTRL，患者#1～4)实施髓芯减压术(core decompression)。
在这些患者中，由于器官移植、自身免疫病或重度哮喘而高剂量口服施用的皮质类固醇导致慢性免疫抑制。
使用临床的(分别使用直观模拟标度(visual analogue scale)——VAS和WOMACTM指标测量髋关节疼痛和功能)和放射学的(根据ARCO骨坏死分类，骨折进展III期或IV期的X射线和MRI证据)的标准和终点对疗效进行研究。对患者进行系统性评价并随访24个月。
研究结果
1.临床症状
1.1疼痛
总体上，相比于对照组，12～24个月之后，在APC-OB治疗组中观察到疼痛减少。
在APC-OB治疗组中，用VAS评价的平均疼痛评分从基线时的45.5(±23)减少到3个月时的16.3(±14)，6个月时的17.8(±15)，12个月时的15(±11)，18个月时的16.8(±11)以及24个月时的7.8(±12)。相反，对照组的平均疼痛评分有所增加，从基线时的49(±32)分别增加到第18和24个月时的60.5(±30.7)和58.5(±18)。
用APC-OB治疗的益处与对照治疗显示出随时间的差异，在24个月时两组间的差异超过100％(见图3)。
1.2.功能评分
类似地，在APC-OB治疗组中，平均WOMACTM指标从基线时的48(±25)减少到3个月时的17.8(±23)，6个月时的20.5(±24)，12个月时的15.5(±12)，18个月的18(±11)以及24个月的18(±8)。相反，在同样的时间段中，对照组的WOMACTM指标发生恶化，从基线时的39.8(±25)分别增加到第18和24个月时的56.8(±22)和57(±26)。
用APC-OB治疗的益处与对照治疗显示出随时间的差异，在24个月时两组间的差异超过100％(见图4)。
1.3放射学进展
在24个月时，存活分析表明对照组中75％的骨病变恶化成骨折，而APC-OB-治疗组中则没有(图5)。
此外，如示意两个患者组中平均放射学评分发展变化的图6所示，在对照组中，平均放射学评分从基线时的1.3恶化到3个月时的2，6个月时的2.5，12个月时的2.8，18和24个月时的3。相比之下，APC-OB治疗的患者仅显示出平均放射学评分的最低限度的增加，从基线时的1.5分别到12、18和24个月时的1.5、1.8和1.8。
结论
总之，我们的数据表明，与对照组相比，接受用显示APC特征的骨形成细胞治疗的患者(患有皮质类固醇诱导的免疫抑制相关的I期或II期股骨头坏死)表现出明显的临床和放射学终点的改善。

Claims (13)

1.分离的骨形成细胞，其用于治疗与免疫缺陷或免疫抑制有关的疾病或病症。
2.根据权利要求1所述的分离的骨形成细胞，其中所述骨形成细胞包含HLA-II的表达。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的分离的骨形成细胞，其中所述骨形成细胞表现出下列特征：
a)所述细胞包含碱性磷酸酶(ALP)的表达；
b)所述细胞包含I型前胶原氨基端前肽(P1NP)、骨连蛋白(ON)、骨桥蛋白(OP)、骨钙蛋白(OCN)和骨唾液酸蛋白(BSP)中一种或多种的表达；
c)所述细胞显示出能够矿化外部环境或者合成含钙的细胞外基质；
d)所述细胞包含HLA-I和HLA-II的表达。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的骨形成细胞，其中所述骨形成细胞是骨祖细胞、成骨细胞、骨细胞或骨生成谱系的细胞类型。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的骨形成细胞，其中所述骨形成细胞可通过从间充质干细胞(MSC)或骨髓基质细胞(SMSC)分化而获得。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的分离的骨形成细胞，其中所述骨形成细胞显示出抗原呈递性质。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离的骨形成细胞，其中所述骨形成细胞来源于人，并且所述药物以自体或同种异体的方式施用于人对象。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的骨形成细胞，其中所述疾病或病症选自：人免疫缺陷病毒(HIV)感染和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、低丙种球蛋白血症、血癌例如白血病和淋巴瘤、总骨髓消融、骨髓移植、器官移植、任何缘起的淋巴细胞减少、红斑狼疮、恶病质、阿片类物质滥用、肥大细胞增多、风湿热、锥虫病和酒精滥用；以及使用包括以下的药物进行治疗：化疗药物、皮质类固醇、抗TNF药物、辐射、免疫抑制药物例如他克莫司、环孢菌素A、甲氨喋呤、霉酚酸酯、硫唑嘌呤、干扰素和免疫球蛋白如抗CD20抗体和抗CD3抗体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的骨形成细胞，其中所述疾病还包括骨功能异常或骨病变。
10.根据权利要求9所述的分离的骨形成细胞，其中所述骨功能异常或骨病变是骨质疏松、骨质坏死、骨质减少、骨脆弱、骨坏死、骨折(或微小骨折)、骨硬化和骨质溶解。
11.包含骨形成细胞和促炎细胞因子的药物组合物，其用于同时、依次或分开用于治疗与免疫缺陷或免疫抑制有关的疾病或病症。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述骨形成细胞包含HLA-II的表达。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的药物组合物，其中所述促炎细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-1β、IL-17或IL-18。
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