KR102167819B1

KR102167819B1 - 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102167819B1
Application number: KR1020180069905A
Authority: KR
Inventors: 김성원; 곽승기; 이재선; 박선화; 임정연
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2017-07-28
Filing date: 2018-06-18
Publication date: 2020-10-20
Also published as: US11612620B2; KR20190013465A; US20200254024A1

Abstract

본 발명은 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 류마티스 관절염 치료용 줄기세포 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 인터루킨-17A(IL-17A), 종양괴사인자-알파(TNF-α), 염증유발인자인 IgG2a(immunoglobulin G2a), 및/또는 림프절 T세포의 증식능을 감소시키고, 인터루킨-10(IL-10) 및/또는 비장세포 중 면역관용에 기여하는 조절 T세포(Regulatory T cell, Treg, CD4⁺CD25⁺foxp3⁺ cell)를 증가시키며, 사람의 T세포 증식을 억제하는 효과가 있다. 기존의 중간엽 줄기세포와 비교하여 획득과정이 안전하고 원하는 시기에 충분한 양을 획득할 수 있으므로 저비용, 고효율로 중간엽 줄기세포를 획득할 수 있고, 투여하는 개체와 유전적 기원이 동일하여 부작용이 적으므로 각 개체에 맞추어진 면역적합성 류마티스 관절염 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for preventing or treating rheumatoid arthritis, comprising nasal inferior turbinate derived mesenchymal stem cell as an active ingredient}

본 발명은 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cell)는 성체조직인 골수, 흡입된 지방조직, 제대혈, 탯줄 등에서 얻을 수 있으며 섬유모세포의 형태를 갖는다. 상기 세포는 시험관에서 무한정 증식이 가능하며, 혈액줄기세포와 달리 지방, 골세포, 연골세포, 심근세포, 신경세포 등 다양한 종류의 중요한 세포계열로 분화할 수 있어 조직공학과 재생의학의 영역에서 많은 연구가 이루어지고 있다.

코 하비갑개 조직은 좌우양쪽의 비강 하외측에 있는 패각상을 나타내는 독립한 작은 뼈로, 상악골 및 구개골에 부착하고 있다. 본 발명자들은 폐기되는 사람의 코 하비갑개 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 분리하여 최근 연골세포, 골세포, 지방세포, 및 신경세포로 분화 가능함을 보고하였다(KR 10-1327076).

한편, 류마티스 관절염은 자가면역질환으로서, 관절의 만성 염증과 관련되어 있는 만성 염증성 질환이다. 흔히, 염증은 관절 주변의 조직과 다른 기관으로 퍼진다. 일반적으로, 류마티스 관절염은 관절 파괴 및 기능 장애를 유발할 수 있는 진행성 질환이며, 류마티스 관절염과 관련된 관절 염증은 관절의 부종, 통증, 강직 및 발적을 유발한다. 류마티스 관절염과 관련된 관절 염증은 관절 주변의 조직(건, 인대, 근육)에서도 발생할 수 있다. 일부 류마티스 관절염 환자의 경우, 만성 염증이 연골, 골 및 인대를 파괴하여 관절의 변형이 유발된다. 관절의 손상은 질병 초기에 발생할 수 있고 진행성일 수 있다. 관절의 진행성 손상은 관절에 발생한 통증, 강직 또는 부종의 정도에 반드시 상관관계가 있는 것은 아니다.

류마티스 관절염에 대한 임상적 치료방법들은 여러 가지가 개발되어 있으며, 이는 일반 보존적 요법, 약물요법, 수술적 요법 등으로 나뉜다. 일반적으로 류마티스 관절염의 치료는 이 질병이 만성 관절염에 의한 관절 통증과 관절의 변형, 기능의 소실을 유발하므로 통증과 염증을 억제하고 관절의 기능소실을 최소화하여 정상 생활로 복귀하는데 목표를 두고 있다.

현재 사용되고 있는 류마티스 관절염에 대한 치료방법 중 약물요법의 경우 3개 이상의 약제를 조합하여 치료하여도 관절 파괴를 효율적으로 억제하지 못하여 비효율적이고, 감염, 위장관 출혈 또는 천공, 신장 및 간 기능 악화, 골다공증 또는 쿠싱증후군 등의 부작용이 있을 수 있으며, 고비용이라는 문제점이 있다.

따라서, 이러한 문제점들이 보완된 류마티스 관절염의 예방 또는 치료를 위한 새로운 물질의 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.

본 발명자들은 류마티스 관절염에 효과적인 신규 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포가 류마티스 관절염에 치료 효과가 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 치료용 줄기세포 치료제를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 류마티스 관절염은 콜라겐 유도 관절염일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 중간엽 줄기세포는 인터루킨-17A (interleukin-17A, IL-17A), 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-α, TNF-α), 염증유발인자인 IgG2a(immunoglobulin G 2a), 및/또는 림프절 T세포의 증식능을 감소시키고, 인터루킨-10(interleukin-10, IL-10) 및/또는 비장세포 중 면역관용에 기여하는 조절 T세포(Regulatory T cell, Treg, CD4⁺CD25⁺foxp3⁺ cell)를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로 상기 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 CD4⁺T 세포의 증식을 억제시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염 치료용 줄기세포 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 류마티스 관절염 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명의 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 인터루킨-17A(IL-17A), 종양괴사인자-알파(TNF-α), 염증유발인자인 IgG2a(immunoglobulin G 2a), 및 림프절 T세포의 증식능을 감소시키고, 인터루킨-10(IL-10) 및 비장세포 중 면역관용에 기여하는 조절 T세포(Regulatory T cell, Treg, CD4⁺CD25⁺foxp3⁺ cell)를 증가시키는 효과가 있으며, 기존의 중간엽 줄기세포가 획득 과정에서 극심한 통증을 동반하고, 충분한 양을 배양하는 과정에서 많은 시간과 비용이 소모되는 반면, 본 발명의 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 안전하게 획득할 수 있고, 원하는 시기에 충분한 양을 획득할 수 있으므로 저비용, 고효율로 중간엽 줄기세포를 획득할 수 있고, 투여하는 개체와 유전적 기원이 동일하여 부작용이 적으면서도 골수 유래 중간엽 줄기세포나 지방 유래 중간엽 줄기세포와 동등하거나 그 이상의 우수한 효과를 가지므로 각 개체에 맞추어진 면역적합성 류마티스 관절염 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 사람 코 하비갑개 줄기세포의 형태학적 분석을 나타낸 도이다.
도 2는 콜라겐 유도 관절염 동물모델링 및 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여 시점을 나타낸 도이다.
도 3은 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 대조군(PBS)과 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC)의 투여에 따른 관절염지수를 측정하여 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 콜라겐 유도 관절염 동물 모델에서 대조군(PBS)과 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC)의 투여에 따른 관절염발생빈도를 측정하여 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 대조군(PBS)과 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC)의 투여에 따른 혈청 내 콜라겐 항원 특이 자가항체의 농도를 측정하여 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 대조군(PBS)과 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC)의 투여에 따른 관절 붓기를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 7a는 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 PBS를 투여한 대조군의 족근골 조직 병리를 나타낸 도이다.
도 7b는 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC)를 투여한 실험군의 족근골 조직 병리를 나타낸 도이다.
도 8은 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 대조군(PBS)과 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC)의 투여에 따른 생쥐의 림프절(LN) 및 비장(SP) 세포 내, 염증성 T 헬퍼 세포 아형 및 조절 T 세포 분포를 측정하여 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 대조군(PBS)과 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC)의 투여에 따른 생쥐의 림프절(LN) 및 비장(SP) T 세포의 증식능을 측정하여 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 대조군(PBS)과 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC)의 투여에 따른 생쥐의 림프절(LN) 세포 및 비장(SP) T 세포의 염증성 및 항염증성 사이토카인 생성능을 측정하여 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 11a는 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC), 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC) 및 지방 유래 중간엽 줄기세포(Ad-MSC) 투여에 따른 관절염지수를 측정하여 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 11b는 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC), 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC) 및 지방 유래 중간엽 줄기세포(Ad-MSC) 투여에 따른 혈청 내 콜라겐 항원 특이 자가항체의 농도를 측정하여 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC), 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC) 및 지방 유래 중간엽 줄기세포(Ad-MSC) 투여후 관절 절편을 헤마톡실린과 에오진(hematoxylin and eosin, H&E), 사프라닌 O(safranin O), 타르타르산염 알칼리인산분해효소 (tartrate alkaline phosphatase)로 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 13a는 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC), 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC) 및 지방 유래 중간엽 줄기세포(Ad-MSC) 투여후 유세포 분석을 통한 Th1, IFNγ⁺CD4⁺/CD3⁺FVD^- 세포 분획 결과를 나타낸 도이다.
도 13b는 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC), 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC) 및 지방 유래 중간엽 줄기세포(Ad-MSC) 투여후 유세포 분석을 통한 Th17, IL-17A⁺CD4⁺/CD3⁺FVD^-세포 분획 결과를 나타낸 도이다.
도 13c는 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC), 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC) 및 지방 유래 중간엽 줄기세포(Ad-MSC) 투여후 유세포 분석을 통한 Treg, CD25⁺Foxp3⁺/CD4⁺CXCR5^-세포 분획 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC), 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC) 및 지방 유래 중간엽 줄기세포(Ad-MSC)를 투여한 동물모델의 림프절 내 인터루킨-10 생성 T세포의 분포를 나타낸 도이다.
도 15a는 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC), 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC), 지방 유래 중간엽 줄기세포(Ad-MSC)를 이용한 인간 말초혈액 CD4⁺ T세포 증식 억제능을 유세포분석을 통해 히스토그램으로 나타낸 도이다.
도 15b는 상기 도 15a의 결과를 그래프로 정리한 도이다.
도 16은 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC)를 인터페론 감마로 자극한 경우 인돌아민-2,3-디옥시게네이즈(indoleamine-2,3-dioxygenase, IDO) mRNA의 상대적인 발현양을 나타낸 도이다.
도 17a는 T세포와 1-메틸-L-트립토판(1-methyl-L-tryptophan, 1MT)이 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC)와 공조배양되는 경우 T세포 증식 억제능을 유세포 분석을 통해 나타낸 도이다.
도 17b는 도 17a의 결과를 그래프로 정리한 도이다.

본 발명자들은 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포가 류마티스 관절염의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 확인하였다. 이에, 본 발명은 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 류마티스 관절염 치료용 줄기세포 치료제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 사람 코 하비갑개 절제술 시행과정에서 얻어지는 코 하비갑개 조직으로부터 분리되는 것일 수 있다(실시예 1-1 참조).

본 발명에서, 상기 류마티스 관절염은 콜라겐 유도 관절염일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시예에서, 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 혈청 내 콜라겐 항원 특이 자가 항체 농도를 비교하기 위해 염증관련인자인 IgG1(immunoglobulin G 1) 및 IgG2a(immunoglobulin G 2a)를 측정한 결과, 상기 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 염증유발인자인 IgG2a를 유의하게 감소시킨다는 것을 확인하였다(도 5 및 실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 일실시예에서, 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 생쥐의 림프절(lymph node, LN) 및 비장(spleen, SP) 세포 내 염증성 T 헬퍼 세포(T helper cell, Th) 아형 및 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg, CD4⁺CD25⁺foxp3⁺ cell) 분포를 비교하기 위해 LN-Th1, LN-Th2, LN-Th17A, LN-Treg, SP-Th1, SP-Th2, SP-Th17A, 및 SP-Treg를 측정한 결과, 상기 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 비장세포 중 면역관용에 기여하는 조절 T 세포(SP-Treg)를 유의하게 증가시킨다는 것을 확인하였다(도 8 및 실시예 8 참조).

본 발명의 또 다른 일실시예에서, 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 생쥐의 림프절 및 비장 T 세포의 증식능을 측정한 결과 상기 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 비장 T 세포의 증식능을 감소시키지 못하였으나, 림프절 T세포의 증식능을 감소시킨다는 것을 확인하였다(도 9 및 실시예 9 참조). 본 발명에서 사용되는 버퍼는 IC fixation buffer(eBioscience 제조) 또는 Foxp3 fixation/permeabilization buffer(eBioscience 제조)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 일실시예에서, 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 생쥐의 림프절 및 비장 T 세포의 염증성 및 항염증성 사이토카인의 생성능을 비교한 결과 상기 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 인터루킨-7 및 종양괴사인자-알파를 감소시키고, 인터루킨-10을 증가시킨다는 것을 확인하였다(도 10 및 실시예 10 참조).

본 발명에서 사용되는 용어 “줄기세포(stem cell)”란, 개체를 구성하는 세포나 조직의 근간이 되는 세포로서 그 특징은 반복 분열하여 자가 재생(self-renewal)할 수 있고, 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는 세포를 의미한다. 태아의 발생과정 중 모든 조직에서 생겨나며, 성인이 되어서도 골수, 상피조직 등 세포가 활발히 교체되는 일부 조직에서 발견된다. 줄기세포는 분화 가능한 세포의 종류에 따라 수정란이 첫 분열을 시작할 때 형성되는 전능성 줄기세포(totipotent stem cells)와, 이 세포들이 계속 분열해 만들어진 포배 내막에 있는 만능성 줄기세포(pluripotent stem cells), 그리고 성숙한 조직과 기관 속에 존재하는 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류된다. 이때, 다능성 줄기세포는, 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 세포로써 태아기, 신생아기, 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직 손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있다. 이러한 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라고도 한다.

성체 줄기세포로 분류되는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)는 재생의학의 재료로 각광받고 있는 세포로, 골수, 제대혈, 탯줄 혈액 등의 조직에서 채취될 수 있으며, 혈액 줄기세포와 달리 지방조직세포, 골세포, 연골세포, 신경세포, 심근세포 등 다양한 인체 조직을 구성하는 세포로의 분화능을 가진다. 본 발명에서는 사람 코 하비갑개 조직으로부터 분리한 중간엽 줄기세포를 이용하였다.

성체 중간엽 줄기세포 중 골수 유래 중간엽 줄기세포 및 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포는 획득하기 위한 수술에 극심한 통증을 동반하고 시간이 많이 소요되며, 획득되는 중간엽 줄기세포의 양이 매우 적고 임상적으로 충분한 양을 배양하는 과정에서 많은 시간과 비용이 소모되며 감염과 세포 손실의 위험성이 높다는 단점이 있다. 또한, 탯줄 혈액 유래 중간엽 줄기세포는 필요로 하는 시기에 얻기 어려우며 장기간 보관해야 하는 문제점을 갖고 있다.

반면, 사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 경우 획득하기 위한 수술에 출혈 및 통증이 매우 적고 시간이 적게 소요되며, 이비인후과 영역에서 최다빈도로 시행되는 코 하비갑개 수술(비염 수술) 과정의 폐기 코 하비갑개 조직에서 분리한 중간엽 줄기세포의 재활용을 통해 중간엽 줄기세포를 지속적으로 확보할 수 있고, 줄기세포의 증식능이 상기 골수 유래 및 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포보다 높다는 장점이 있다. 하기의 표 1은 사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포, 및 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포에 대하여 줄기세포 분리를 위한 수술의 위험성, 줄기세포 분리가 가능한 수술의 빈도 등을 분석한 자료이다.

	사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포	골수유래 중간엽 줄기세포	지방 조직 유래 중간엽 줄기세포
줄기세포 분리를 위한 수술의 위험성	매우 낮음	높음	높음
줄기세포 분리가 가능한 수술의 빈도	매우 높음	낮음	높음
줄기세포 분리 외의 목적으로 폐기 조직의 수술 후 재활용도	매우 높음	낮음	높음
수술 시 소요시간	5 분 ~ 10 분	1 시간	3 ~ 4 시간
수술 후 회복기간 (일상 활동 가능정도 )	수 시간이내	3 주	1 주 이내
수술 시 출혈	10 cc 이내	500 cc ~ 1000 cc	100 cc ~ 500 cc
수술 과정에서 획득되는 조직의 부피	적음	많음	많음
단위 조직 당 분리되는 줄기세포의 수	6.55 x 10 ³ cells/mg	0.2 ~ 0.29 x 10 ³ cells/mg(골수와 지방 유래 줄기세포는 유사함)
줄기세포의 증식능 (P 1 -> P 2)	약 10 배	약 2 배(골수와 지방 유래 줄기세포는 유사함)

이는 사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포가 기존의 중간엽 줄기세포와 비교하여 원하는 시기에 보다 안전한 방법으로 충분한 양을 획득할 수 있으므로 저비용, 고효율의 류마티스 관절염 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 보여준다. 또한, 투여하는 개체와 유전적 기원이 동일하므로 부작용이 적어, 각 개체에 맞추어진 면역적합성 류마티스 관절염 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "세포 치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 동종 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포 치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포 치료제, 줄기세포 치료제로 분류되며, 본 발명은 특히 줄기세포 치료제에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 류마티스 관절염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 류마티스 관절염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체로는 식염수, 완충 식염수, 물, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 이소프로필미리스테이트 및 에탄올 등이 있으나 이에 한정되지 않으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 모두 사용 가능하다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 mg 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 mg 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재료 및 방법

1-1. 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 배양

본 연구에 이용한 코 하비갑개 조직은 코 하비갑개 절제술 시행과정에서 얻어진 조직으로서 수술 전 환자의 동의하에 이용하였다. 상기 코 하비갑개 조직을 채취한 직후 겐타마이신(국제약품공업, 성남, 대한민국)이 포함된 생리식염수로 3-5회 세척하여 섬유모세포를 분리하였다.

사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 분리를 위해 수술과정에서 제거된 코 하비갑개 조직을 4℃에서 냉장 보관하였고, 이 조직을 실온에서 항생-항진균 용액(Gibco, Gaithersberg, MD)으로 3회 세척하였다. 이를 다시 중성 phosphate buffered saline(PBS)으로 3회 세척한 뒤 작은 수술용 가위를 이용하여 1mm³ 크기로 잘게 절단하였다.

100mm 배양용 접시에 상기 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 놓고 소독된 슬라이드 글라스로 덮어 배양용 접시에 유착시켰고 10% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지를 넣어 37℃, 5% CO₂환경의 배양기에서 배양하였다. 2-3주간의 배양 후 슬라이드 글라스를 제거하고, 배양액에 부유하는 세포를 세척하여 버리고, 배양용 접시 바닥에 붙은 사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 트립신을 사용해서 바닥으로부터 떼어내어 3대까지 계대 배양된 세포를 사용하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 방법을 통해서 얻어진 세포들의 현미경학적 소견에서는 모두 방추형의 섬유모세포 형태로 유사한 모습을 보였다.

1-2. 콜라겐 유도 관절염 확립 및 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포( TMSC ) 투여

7주령의 수컷 DBA1/J(JAX™ 제조) 마우스는 1주간 동안 동물실험실의 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물사육실의 조건은 22.0±2℃, 1일 중 12시간 동안 200~300 Lux로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다. DBA1/J 마우스에 제 2형 콜라겐 (Chondrex) 100㎍과 완전 프로인트 항원 보강제(complete Freund's adjuvant(CFA; Chondrex 제조))를 1:1(w/v)로 혼합하여 꼬리에 피내로 1차 면역유도주사 하고 나서 2주 후 한쪽 뒷다리 발바닥에 제2형 콜라겐 100㎍과 불완전 프로인트 항원 보강제(incomplete Freund's adjuvant)를 1:1(v/v)로 혼합하여 피하로 2차 면역유도주사 하였다. 1차 면역유도주사 후, 5주-6주 사이에 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 1x10⁶cells/100㎕/mouse로 준비하여 꼬리정맥 내로 3회 주입하였으며, 대조군에는 PBS(phosphate- buffered saline)용액을 100㎕/mouse로 같은 부위에 주입하였다.

1-3. 관절염의 평가

1차 면역유도주사 후 14일부터 홍반이 서서히 나타나 관절염의 발병이 진행됨을 확인한 후, 각 그룹당 평균 관절염지수가 일치되도록 케이지를 재분배한 뒤, 대조군에는 PBS용액을, 실험군에는 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 주입하였다.

관절염 병변의 육안적 관찰은 참고 문헌에 근거하여 하기와 같은 스코어를 사용하여 실시하였다. (Barnett ML, Kremer JM, St Clair EW, Clegg DO, Furst D, Weisman M, et al. Treatment of rheumatoid arthritis with oral type II collagen. Results of a multicenter, double-blind, placebo-controlled trial. Arthritis Rheum 1998; 41:290-7).

0점: 부종 이나 종창이 없음, 1점: 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적, 2점: 발목관절에서 족근골에 걸친 경한 부종과 발적, 3점: 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종 과 발적, 4점: 발목에서 다리전체에 걸쳐 부종과 발적이 있고 관절경직이 나타남.

따라서, 관절염 병변의 최고 스코어는 2차 면역유도 주사된 다리의 점수를 제외하고 마우스 한 마리당 12점이며, 1차 면역유도 주사한 시점으로부터 11주까지 일주일에 3회씩 관찰하였고, 평가 자료는 실험과 관계없는 3인이 작성하였다. PBS 투여군과 TMSC 투여군 간의 평균 관절염 지수를 비교하였다. 또한, 상기 평가방법을 통하여 각 마우스의 관절염 지수를 발생빈도로 표시하였다. 한 마리의 3개 다리 중에 1개 다리의 관절염 지수가 1에 도달하면 33.3%, 2개 다리의 관절염 지수가 1에 모두 도달하면 66.7%, 3개 다리의 관절염 지수가 모두 1 이상 도달하면 100%의 incidence값을 주고 총 마우스의 관절염 발생빈도를 평균 내어 산출하였다.

1-4. 면역글로불린G ( immunoglobulin G) 측정

1차 면역유도주사 후 11주차에 안와채혈을 통해 얻은 혈청을 1000배 희석하여 준비하였다. 제2형 콜라겐(Chondrex)을 4㎍/㎖의 농도로 탄산나트륨(sodium carbonate, pH 9.6, Sigma 제조) 용액에 희석한 뒤, 96웰 플레이트 (Nunc 제조)에 100㎕씩 분주하고 4℃ 냉장고에서 16시간 동안 코팅하였다. 1% 소혈청알부민(bovine serum albumin, Amresco 제조)이 함유된 PBS용액을 200㎕/well씩 넣고 30분간 상온에 두어 비특이적 반응을 억제하였다. 희석된 혈청을 100㎕/well씩 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.05% Tween20 (Amresco 제조)가 함유된 PBS용액으로 4회 세척 후, horse peroxidase conjugated anti-mouse IgG1 또는 IgG2a 항체 (Bethyl Laboratories)를 1시간 동안 반응하였다. 4회 세척 후 TMB substrate reagent (ebioscience) 50㎕/well를 가한 후 1M H₂SO₄50㎕/well을 첨가하여 반응을 중지시켰다. Microplate reader (Molecular Devices 제조)로 파장 450㎚에서 흡광값을 측정하여 비교하였다.

1-5. 관절의 조직학적 변화

관절 붓기를 육안으로 관찰하기 위해 실험 종료 시 2차 면역유도주사 되지 않은 반대편 뒷다리의 사진을 촬영해 육안으로 관절 붓기를 비교 하였다.

각 그룹의 마우스를 희생하여 관절 조직을 채취하여 10% 중성완충 포르말린용액으로 하루 동안 고정한 후 Calci-Clear Rapid (National Diagnostics 제조)으로 7시간 동안 탈회하였다. 수돗물로 수세 후 70% 내지 100% 농도의 에탄올로 단계적 탈수하고 자일렌(xylene)으로 명화 한 후 파라핀으로 포매하였고, 완성된 다리관절조직 파라핀 블록을 7㎛ 두께로 절편 한 후 H-E (Hematoxylin-Eosin) 염색을 시행하였다.

1-6. 림프절세포 및 비장세포의 분리 및 자극

실험종료 시 희생된 마우스의 axillary lymph node와 inguinal lymph node를 혼합하여 10% FBS가 포함된 RPMI1640 배지에서 잘게 잘라 단일세포단위로 준비하였다. 비장조직 또한 림프절과 같은 방법으로 단일세포단위로 준비한 뒤, 적혈구의 용혈을 위해 용해용액(2.06% Tris(tris-(hydroxymethyl)-aminomethane) 및 0.83% NH₄Cl을 1:9로 섞음)에 5분간 반응시키고 40㎛의 셀 스트레이너(BD Falcon 제조)로 걸러 내 비장세포를 얻었다. 각 세포를 10% FBS가 포함된 RPMI1640 (Gibco 제조)배지를 사용하여 1x10⁶cells/well로 24웰 플레이트에 분주하였다.

1-7. 유세포분석

단일세포단위로 준비된 림프절세포 및 비장세포 중 조절 T 세포 분석용 웰을 제외한 나머지를 25ng/㎖ phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, Sigma 제조)과 250ng/㎖ 이오노마이신(ionomycin)에서 총 4시간 동안 37℃ 배양기에서 자극하였다. 이때 Golgistop (BD 제조)을 함께 자극하여 단백질 분비를 억제시켜 세포 내에 쌓이도록 하였다. 반응이 끝난 세포는 튜브로 회수하여 0.5% bovine serum albumin(BSA)이 포함된 PBS 용액으로 세척하고, anti-CD3 PerCP-Cy5.5 항체, anti-CD4 Pacific Blue 항체, anti CD25 APC 항체 (모두 Biolegend)로 30분간 형광염색 하였다. 세척 후 T 헬퍼 세포(Th1, Th2, Th17A 세포)는 IC fixation buffer(eBioscience 제조)에, 조절 T 세포는 Foxp3 fixation/permeabilization buffer(eBioscience 제조)에서 반응 후, Permeabilization Buffer(eBioscience 제조)용액으로 세척하였다. 염증성 세포(Th1, CD3⁺CD4⁺ IFN gamma(γ)+세포; Th2, CD3⁺CD4⁺IL-4⁺세포; Th17A, CD3⁺CD4⁺IL-17A⁺ 세포)를 염색하기 위하여 Alexa488로 표지 된 anti-IL-17A 항체(ebioscience 제조), APC로 표지된 anti-IFNγ 항체(BD 제조), APC로 표지된 anti-IL-4 항체(BD 제조)를 사용 하였고 조절 T 세포(CD4⁺CD25⁺foxp3⁺ cell)의 염색을 위해서 PE로 표지된 anti foxp3 항체(ebioscience 제조)를 사용하여 30분간 반응시킨 후 세척하고 분석하였으며, 장비는 BD LSRII fortessa를 사용하였다.

1-8. 림프절 및 비장 T 세포 증식능 관찰

림프절(LN)및 비장(SP)세포를 2x10⁵cells/well로 96웰 플레이트(Thermo 제조)에 분주하고 0.5㎍/㎖의 plate-bounded anti-CD3e monoclonal 항체 (BD 제조) 2일간 자극하였다. 반응종료 2시간 전에 CCK-8 시약(Dojindo 제조)을 10㎕/well로 분주하였고, 반응종료 시 microplate reader(Molecular Devices 제조)를 이용하여 450㎚에서 흡광값을 측정하였다.

1-9. 사이토카인 생성 관찰

림프절과 비장세포를 1x10⁶cells/well로 24웰 플레이트(Eppendorf 제조)에 분주하고 0.5㎍/㎖의 plate-bounded anti-CD3e monoclonal 항체에 (BD 제조) 2일간 자극하여 반응 종료 후 얻은 상등액을 냉동보관 하여 분석에 사용하였다. 단클론성 anti-IL-17A 항체, anti-TNFα 항체, 및 anti-IL-10 항체 (모두 R&D systems 제조)를 각각 탄산나트륨 용액(pH 9.6)에 희석하여 4℃ 냉장고에서 16시간 동안 반응시켰다. 1% BSA(Amresco 제조)가 함유된 PBS를 200㎕/well씩 넣고 2시간 동안 상온에 두어 비 특이적 반응을 억제하였다. 수집된 배양 상등액을 100㎕/well씩 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시키는데 이때 재조합 인터루킨-17A, 종양괴사인자-알파, 인터루킨-10 단백질(R&D systems 제조)을 계열 희석(serial dilution)하여 기준으로 사용하였다. 0.05% Tween20 (Amresco 제조)이 함유된 PBS용액으로 4회 세척 후, 비오틴(biotin)이 부착된 anti-mouse IL-17A 항체, anti-TNFα 항체, anti-IL-10 항체(R&D systems 제조)로 실온에서 2시간 동안 반응시키고 4회 세척시켰다. 그 후 Extravidin-HRP (Sigma 제조)용액을 1:4000 비율로 희석하여 50㎕/well로 분주하고 실온에서 2시간 반응시킨 뒤 4회 세척 후, TMB substrate reagent (ebioscience 제조) 50㎕/well를 가하고 1M H₂SO₄50㎕/well를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 반응종료 시 microplate reader를 이용하여 450㎚에서 흡광값을 측정하였다.

1-10. 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포( TMSC )의 건강인 T세포 증식억제 관찰

건강한 자원자의 혈액 20cc를 채혈 후, PBS용액으로 1:1의 비율로 희석하였다. 이를 10ml의 피콜-하이팩(Ficoll-Hypaque, GE Healthcare 제조)이 담긴 50ml 튜브로 천천히 흘려 상층에 띄우고 2000rpm, 20분간 실온에서 원심분리하였다. 피콜(Ficoll)층과 혈장 층 사이에 존재하는 버피코트(Buffy coat)층을 따로 수집하여 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리했다. 이들을 PBS용액으로 세척하고 나서, 3% 우태아혈청과 10mM EDTA가 포함된 PBS용액으로 한번 더 세척하고 원심분리하였다. 말초혈액 단핵세포가 뭉치지않게 풀어주고 나서 Magnisort Human CD4⁺T cell enrichment kit (eBioscience 제조)를 이용하여 CD4⁺T 세포를 분리하였다 (분리방법은 제조사의 추천을 따름). CD4⁺T 세포는 다시 CD25 microbead (Milteny biotec 제조)로 표지 후 CD4⁺CD25^-T세포를 분리하였으며 Cell trace violet dye (Thermo 제조)를 1:1000으로 37℃에서 20분간 반응시켜 표지하였다. 표지된 CD4⁺CD25^- T세포(5x10⁴ cells per well)는 anti-CD3 및 anti-CD28 dynabead (Invitrogen 제조)와 1:1 비율 조건에서 활성화 시켰다. 이 때, T 세포와 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포 및 지방 유래 중간엽 줄기세포를 5:1 내지 2:1 비율로 함께 배양 하였으며, T 세포 증식 억제에 IDO가 관여하는지 알아보기 위해 IDO 효소의 기질 아날로그인 1-methyl-L-tryptophan을 100nM의 농도로 T세포와 TMSC의 공조배양 조건에 추가하였다. 6일 후 세포를 5ml 튜브로 수집하고 0.5% BSA가 포함된 PBS용액으로 한번 세척 한 뒤 유세포분석 장비를 통해 cell trace violet dye가 표지된 CD4⁺CD25^-T 세포를 excitation 401nm/emission 452nm 파장에서 형광 감도가 줄어드는 세포의 빈도로 분석하였다.

1-11. T세포와 공조배양 된 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포( TMSC )의 인돌아민 -2,3-디옥시게네이즈(indoleamine-2,3-dioxygenase, 이하 IDO) mRNA 분석

공조배양이 끝난 후, 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로 간주된 부착성세포에 RNA iso(Takara 제조)를 1㎖씩 처리하여 총 RNA를 추출하였다. 추출방법은 제조사의 추천을 따랐다. 추출된 RNA는 나노드랍(Nanodrop)장비를 이용해 정량화 하고 나서 2㎍의 RNA를 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche 제조)를 이용해 cDNA로 역전사시켰다. 1㎕의 cDNA를 0.2㎖ 튜브에 넣고 1pmole의 IDO 전방 프라이머(forward primer, 서열번호1), 5´-GCC AAC TCT CCA AGA AAC TG-3´, 1pmole IDO 후방 프라이머(reverse primer, 서열번호2), 5´-GCA GTC TCC ATC ACG AAA TG-3´, 10㎕ SYBR Green I Master (Roche 제조), 8㎕의 Nuclease Free water (Roche 제조)를 섞고, LightCycler96장비 (Roche 제조)에서 60℃의 에널링(Annealing) 조건으로 실시간 증폭을 수행하였다. IDO mRNA 상대 정량을 위해 베타 엑틴(beta actin) 유전자를 같은 방법으로 증폭하였으며 사용된 프라이머는 다음과 같다. 베타엑틴 전방 프라이머(서열번호3) 5´- GGA CTT CGA GCA AGA GAT GG -3´, 1pmole 베타엑틴 후방 프라이머(서열번호4), 5´- TGT GTT GGG GTA CAG GTC TTT G -3´. 상대정량은 기존의 통상적인 방법처럼, 실시간 증폭 후 mRNA농도가 증폭되기 시작하는 시점을 자동계산한 Cq level을 얻어, 베타엑틴 의 Cq수치만큼 빼서 델타 Cq값을 얻었으며, 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 단독 배양 조건에서 얻어진 델타 Cq(dCq)값으로 나머지 공조배양조건에서 얻어진 Cq값을 빼 델타 델타 Cq(ddCq)값을 얻었다. 이를 2^- ^ddCq값으로 환산하여 비교하였다.

실시예 2. 콜라겐 유도 관절염 동물 모델링 준비 및 코 하비갑개 유래 중간 엽 줄기세포의 투여

도 2에 나타난 바와 같이, 8주령의 수컷 DBA1/J 마우스에 bovine type II collagen 100㎍과 완전 프로인트 항원 보강제를 1:1(w/v)로 혼합하여 꼬리에 피내로 1차 면역유도주사 하고 나서 2주 후 한쪽 발바닥에 bovine type II collgen 100㎍과 불완전 프로인트 항원 보강제를 1:1(v/v)로 혼합하여 피하로 2차 면역유도 주사하였다.

1차 면역유도주사 후, 5주-6주 사이에 사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 1 x 10⁶ 개씩 꼬리정맥에 3회 주입하였으며, 대조군에는 PBS 용액을 100㎕씩 주입하고 11주차까지 5주간 더 관절염 지수를 관찰하였다.

실시예 3. 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 관절염 지수 비교

코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 의해 관절염 지수가 영향을 받는지 확인하기 위해 상기 실시예 1-3에 따라 관절염 지수에 대한 점수를 측정하였다. 모든 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다 (***P < 0.001).

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 1차 면역유도주사 후 35일째 시행한 첫 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 주입 이후 실험종료까지 지속적으로 관절염의 발병이 대조군에 비해 유의한 차이로 더디게 진행됨을 확인하였다.

실시예 4. 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 관절염발생빈도 비교

코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 의해 관절염 발생빈도가 영향을 받는지 확인하기 위해 상기 실시예 1-3에 따라 관절염 발생빈도를 측정하였다. 모든 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다 (***P < 0.001).

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 1차 면역유도주사 후 49일째부터 실험종료까지 관절염 발생빈도 수치가 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 투여에 의해 둔화됨을 확인하였다.

실시예 5. 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 혈청 내 콜라겐 항원 특이 자가 항체 농도 비교

코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 의해 콜라겐 유도 관절염 동물모델인 마우스의 혈청 내 콜라겐 항원 특이 자가 항체의 농도가 영향을 받는지 확인하기 위해 상기 실시예 1-4에 따라 면역글로불린G를 측정하였다. 마우스에서 IgG1은 염증억제관련, IgG2a는 염증유발관련인자로 알려져 있으며, 모든 데이터는 중앙값(Median)으로 나타내었다 (***P < 0.001).

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 콜라겐 유도 관절염(Collagen-induced Arthritis, CIA) 유도 시 IgG2a가 관절염 유도 시간에 비례하여 증가하는데, 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 주입한 마우스의 혈청에는 염증유발성 콜라겐 특이 IgG2a 항체의 농도가 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.

실시예 6. 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 관절 붓기 비교

코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 의해 관절의 붓기 정도가 영향을 받는지 확인하기 위해 1차 면역유도 주사 후 77일에 PBS용액을 투여한 대조군과 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 투여한 치료군 생쥐의 뒷다리 사진을 촬영하였다. 관절염 발생 척도를 평가하는 대상은 2차 면역유도 주사가 시행되지 않은 다리만 포함하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, PBS용액을 투여한 대조군의 다리에서 족지골(①)-중족골(②)-족근골(③)에 걸친 부종이 모두 관찰되었다. 이에 비해, 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 투여한 생쥐의 다리에서는 족지골의 부종이 거의 관찰되지 않았으며, 대조군에 비해 경미한 중족골의 부종이 관찰되었다. 또한 족근골 부위의 부종 역시 감소함을 확인하였다.

실시예 7. 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 관절조직 절편 내 염증침윤정도 비교

코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 의해 관절조직 절편 내 염증침윤 정도가 영향을 받는지 확인하기 위해 대조군 마우스와 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 투여 마우스의 뒷다리 족근골 조직 병리를 촬영하였다.

그 결과, 도 7a 및 도 7b에 나타난 바와 같이, 대조군 마우스의 뒷다리 족근골 부위 talus (Ta) bone 주변에 염증세포가 침윤되어 판누스(pannus)구조가 파괴되고 talus bone(Ta)과 tibia bone(Ti)사이, Tibia bone(Ti)과 navicular bone(N)사이 및 talus bone(Ta)과 navicular bone(N)사이 염증세포 침윤이 관찰된 데 비해, 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 의해 염증세포의 침윤이 유의하게 감소함을 확인하였다.

실시예 8. 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 생쥐의 림프절( LN ) 및 비장( SP ) 세포 내 염증성 T 헬퍼 세포 아형 및 조절 T 세포 분포 비교

코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 의해 생쥐의 림프절(LN) 및 비장(SP) 세포 내 염증성 T 헬퍼 세포 아형 및 조절 T 세포의 분포가 영향을 받는지 알아보기 위해 상기 실시예 1-6에 따라 림프절세포 및 비장세포를 분리 및 자극 시켜 각 세포의 T 세포 분획을 분석하였다. 모든 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다 (*P < 0.05).

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 말초부위에 존재하는 2차 림프기관인 림프절과 비장세포 집단에서 염증성 세포(Th1, CD3⁺CD4⁺IFNγ⁺세포; Th2, CD3⁺CD4⁺IL-4⁺세포; 및 Th17A, CD3⁺CD4⁺IL-17A⁺ 세포)의 분획이 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 의해 유의하게 감소하는 것은 확인할 수 없었으나, 비장세포 중 면역관용에 기여하는 조절 T (Regulatory T cell, Treg, CD4⁺CD25⁺foxp3⁺ cell)세포 분획이 증가하는 것을 확인하였다.

실시예 9. 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 생쥐의 림프절(LN) 및 비장(SP) T세포의 증식능 비교

코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 의해 림프절(LN) 및 비장(SP) T세포의 증식능이 영향을 받는지 알아보기 위해 상기 실시예 1-７ 및 실시예 1-8에 따라 유세포 분석 및 T세포 증식능을 측정하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, aCD3 항체로 인한 자극은 T 세포 수용체를 갖는 T세포에 선택적으로 작용하고, 관절부종의 중등도가 강할수록 말초 림프절 T세포의 증식능이 활발하였으며, 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여로 인하여 림프절 T세포의 증식능이 대조군에 비해 감소하는 경향을 확인하였으나, 비장 T세포의 증식능은 대조군과 차이 없음을 확인하였다.

실시예 10．콜라겐 유도 관절엽 동물모델에서 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 생쥐의 림프절( LN ) 및 비장( SP ) T세포의 염증성 및 항염증성 사이토카인 생성능 비교

코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 투여에 의해 림프절(LN) 및 비장(SP) T세포의 염증성 및 항염증성 사이토카인의 생성능이 영향을 받는지 알아보기 위해 상기 실시예 1-9에 따라 사이토카인 생성을 관찰하였다. 인터루킨-17A와 종양괴사인자-알파는 관절염 동물모델에서 알려진 대표적인 염증성 사이토카인이며, 인터루킨-10은 염증성사이토카인에 반응하는 염증 억제성 조절T세포에서 생성되는 사이토카인이다.

그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이, 림프절 T세포를 aCD3 항체로 자극하였을 때 생성되는 인터루킨-17A와 종양괴사인자-알파는 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 투여에 의해 감소하는 경향을 확인하였으며, 반대로 염증 억제성 인터루킨-10의 생성능은 증대됨을 확인하였다. 반면, 비장 T세포를 이용한 실험에서는 줄기세포 투여에 의한 사이토카인 생성능의 차이를 확인할 수 없었다.

실시예 11. 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 서로 다른 부위 유래인 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 관절염 지수 및 혈청 내 콜라겐 항원 특이 자가 항체 농도 비교

코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포와 다른 부위 유래인 중간엽 줄기세포를 콜라겐 유도 관절염 동물모델에 투여시 관절염 진행 약화 효과를 비교하기 위해, 수컷 DBA1/J 마우스(n=32)에 bovine type II 콜라겐(collagen)과 완전 프로인트 항원 보강제를 1:1(w/v)로 혼합하여 100μg/100μL의 용량으로 꼬리에 피하로 1차 면역유도주사 하고 나서 2주 후 한쪽 발바닥에 bovine type II 콜라겐과 불완전 프로인트 항원 보강제를 1:1(v/v)로 혼합하여 100μg/100μL의 용량으로 피하로 2차 면역유도 주사를 하였다.

1차 면역유도주사 시행 5주후, 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(TMSC), 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC), 지방 유래 중간엽 줄기세포(Ad-MSC)를 각각 1 x 10⁶ 개씩 마우스의 꼬리정맥에 이틀 간격으로 총 3회 주입하고 9주차까지 4주간 더 관절염 지수를 관찰하였다. 모든 결과는 평균(±SEM)으로 나타냈다.

관절염 지수는 일주일에 2~3일마다 3명의 관찰자에 의해 측정되었으며 모든 데이터는 평균 ±SD(standard deviation)으로 나타내었다. 마우스의 혈청은 1차 면역유도주사 9주뒤 수집하였으며 혈청은 anti-CII IgG1 또는 anti-CII IgG2a 확인을 위해 1:1000 또는 1:5000로 각각 희석되었다.

그 결과, 대조군을 제외하고 관절염 지수 및 염증 관련인자인 콜라겐 항원 특이 IgG1, IgG2a 수치가 모두 유사하게 나타나고 있어 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포는 동등한 수준의 관절염 억제효능이 있음을 확인하였다(*P < 0.05; **P < 0.01)(도 11a 및 도 11b).

실시예 12. 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 서로 다른 부위 유래인 중간엽 줄기세포 투여시 관절 파괴 억제 효과 비교

코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포와 다른 부위 유래인 중간엽 줄기세포를 콜라겐 유도 관절염 동물모델에 투여시 관절파괴 억제 효과를 비교하기 위해 1차 면역유도주사를 하고 나서 9주후 관절을 채취하였다. 5μm의 관절 절편을 헤마톡실린과 에오진(hematoxylin and eosin, H&E)으로 염색하여 관찰하였으며(도 12 상단), 관절연골세포는 사프라닌 O(safranin O)로 염색하여 관찰하였고(도 12 중단), 파골세포 확인을 위해 칼슘이 제거된 뼈 조직을 타르타르산염 알칼리인산분해효소 (tartrate alkaline phosphatase)로 염색하여 관찰하였다(도 12 하단).

그 결과, 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포와 동등한 수준으로 관절 내 판누스(pannus) 염증침윤, 연골의 소실, 파골세포의 증가에 대해 억제효과가 있음을 확인하였다(도 12).

실시예13 . 콜라겐 유도 관절염 동물모델에서 서로 다른 부위 유래인 중간엽 줄기세포 투여시 병인 T 세포 억제 및 조절 T 세포 증진효과 비교

코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포와 다른 부위 유래인 중간엽 줄기세포를 콜라겐 유도 관절염 동물모델에 투여시 병인 T 세포(Th1, Th17 세포) 억제 및 조절 T 세포 증진효과를 비교하기 위해 1차 면역유도주사를 하고 나서 9주뒤 비장과 림프절에서 단일세포를 분리하였으며, 병인 T 세포는 비장에서, 조절 T 세포는 림프절에서 분리하여 실시예 1-7의 방법으로 분석을 진행하였다.

그 결과, 도 13에서 나타난 바와 같이, 비장세포 집단에서 염증성 세포(Th1, IFNγ⁺CD4⁺/CD3⁺FVD^-세포, Th17, IL-17A⁺CD4⁺/CD3⁺FVD^-세포)는 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 투여한 경우가 골수 유래 중간엽 줄기세포나 지방 유래 중간엽 줄기세포를 투여한 경우보다 더 감소 하는 것을 확인할 수 있었으며(도 13a, 도 13b), 림프절세포 중 면역관용에 기여하는 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg, CD25⁺Foxp3⁺/CD4⁺CXCR5^-cell)는 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 투여한 경우가 다른 유래의 중간엽 줄기세포를 투여한 경우보다 증가하는 것을 확인하였다(**P < 0.01, ***P <0.001)(도 13c).

실시예 14. 서로 다른 부위 유래인 중간엽 줄기세포를 투여한 동물모델의 림프절 내 인터루킨-10 생성 T 세포의 분포 비교

코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포와 다른 부위 유래인 중간엽 줄기세포를 콜라겐 유도 관절염 동물모델에 투여시 인터루킨-10을 생산하는 T 세포 증가를 비교하기 위하여 사타구니/겨드랑이 림프절을 분리하여 0.5㎍/㎖의 anti-CD3 교차결합(crosslinking) 항체로 코팅된 24웰 플레이트에 1x10⁶ cells/well로 분주하였다. 그리고 1μg/mL의 anti-CD28 교차결합(crosslinking) 항체를 부가하여 3일간 배양하였으며 인터루킨-10의 생성정도는 엘라이자(ELISA)로 확인하였다.

그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 림프절 T세포를 aCD3 및 aCD28 항체로 자극하였을 때 염증억제성 인터루킨-10 생성 T세포의 빈도는 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 투여한 경우가 가장 증대됨을 확인하였다.

실시예 15. 서로 다른 유래인 중간엽 줄기세포를 이용한 인간 말초혈액 CD4 ⁺ T세포 증식 억제능 비교.

코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포와 다른 부위 유래인 중간엽 줄기세포의 인간 말초혈액에서 분리한 CD4⁺CD25^- T세포 증식 억제 정도를 실시예 1-10의 방법으로 비교하였다.

그 결과, 도 15a 및 15b에서 나타난 바와 같이, 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 경우 골수 유래 중간엽 줄기세포나 지방 유래 중간엽 줄기세포와 동등한 정도의 T세포 증식 억제능력을 가진 것을 확인하였다(도 15a, 도 15b).

실시예 16. 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포( TMSC )에 인터페론 감마( IFNg ) 처리시 인돌아민 -2,3- 디옥시게네이즈 ( indoleamine -2,3- dioxygenase , IDO) 발현 증가 확인

기존 줄기세포들의 T세포 증식 억제에는 IDO가 관여하며, 이는 인터페론 감마에 의해 유도 되므로 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에서도 동일한지 확인하기 위해 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 인터페론 감마 10ng/ml를 처리하여 24시간 동안 자극하였으며 IDO 발현은 실시예 1-11의 방법에 따라 real-time RT-PCR로 분석하였다.

그 결과, 도 16에서 나타난 바와 같이, 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에서도 인터페론 감마 처리에 의해 IDO mRNA발현이 크게 증가함을 확인하였다.

실시예 17. 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포( TMSC )와 T세포를 공조배양시 1-메틸-L-트립토판(1-methyl-L-tryptophan 이하 1MT )처리에 따른 T세포 증식억제능 감소 확인

코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 T세포 증식억제 메커니즘에 IDO가 관여하는지 확인하기 위해 건강인의 T세포와 TMSC와 공조배양 시, 1MT를 전처리 하였다. 6일 후 T 세포를 실시예 1-10과 같이 유세포분석하였으며 도 17 막대그래프의 바(Bar)는 3번의 실험 평균 ±SD(standard deviation)를 나타낸다.

그 결과, 도 17a 및 17b에 나타난 바와 같이, IDO의 기능을 억제하는 1MT가 처리되지 않은 경우에는 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 T세포 증식 억제능이 우수했으나, 1MT가 처리된 경우는 T세포 증식 억제능이 일부 소실되었다. 상기 결과는, 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 T 세포 증식 억제 메커니즘에 IDO가 관여한다는 것을 의미한다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY Industry Academic Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating rheumatoid arthritis, comprising nasal inferior turbinate derived mesenchymal stem cell as an active ingredient <130> MP18-093 <150> KR 10-2017-0096321 <151> 2017-07-28 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDO(indoleamine-2,3-dioxygenase) forward primer <400> 1 gccaactctc caagaaactg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDO(indoleamine-2,3-dioxygenase) reverse primer <400> 2 gcagtctcca tcacgaaatg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin forward primer <400> 3 ggacttcgag caagagatgg 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin reverse primer <400> 4 tgtgttgggg tacaggtctt tg 22

Claims

코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 인터루킨-17A(interleukin- 17A)를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 류마티스 관절염은 콜라겐 유도 관절염인 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 염증유발인자인 IgG2a(immunoglobulin G 2a)를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 비장세포 중 면역관용에 기여하는 조절 T세포(Regulatory T cell)를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 림프절 T세포의 증식능을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-α)를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 인터루킨-10(interleukin-10)을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 코하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 CD4⁺T 세포의 증식을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 류마티스 관절염 치료용 줄기세포 치료제로서,
상기 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 인터루킨-17A(interleukin- 17A)를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 치료제.