CN105246910A - 热稳定的呼吸道合胞病毒融合前f蛋白寡聚物及其在免疫组合物中的用途 - Google Patents

Abstract

热稳定的寡聚重组多肽，其呈现融合前呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白的至少一个抗原表位、包含RSV？F蛋白胞外域、在HRB区域中经功能性删除、跨膜和胞质结构域被替换为异源三聚结构域、并且不存在两个功能性多碱性弗林蛋白酶切割位点，其可用作免疫原性组合物中的抗原性组分，所述免疫原性组合物可用于诱导针对RSV感染的免疫应答和疫苗接种的方法。

Description

热稳定的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白寡聚物及其在免疫组合物中的用途

发明领域

本发明涉及医药特别是疫苗的领域，并且更具体地，涉及可用于疫苗以针对呼吸道合胞病毒(RSV)进行免疫的重组蛋白。

发明背景

人呼吸道合胞病毒(hRSV)导致急性上呼吸道和下呼吸道感染，并且是婴儿在出生第一年中住院治疗的主要原因。RSV的再感染频繁发生并且消除性免疫从未稳固地建立。RSV还在老年人中导致显著的疾病负担和死亡率，这堪比流感。

hRSV是属于副粘液病毒科(Paramyxoviridae)的肺炎病毒亚科(Pneumovirinae)的包膜负链RNA病毒。该亚科的其它成员为牛RSV(bRSV)和人偏肺病毒(hMPV)。hRSV颗粒含有两个主要的糖蛋白(其是中和抗体的主要靶标)：附着蛋白G和融合蛋白F(综述于CollinsPLandJAMelero.2011.Progressinunderstandingandcontrollingrespiratorysyncytialvirus:stillcrazyafteralltheseyears.VirusRes162:80-99)。存在两种RSV血清型(A和B)，它们在其G蛋白中相比于F蛋白更为不同。F蛋白相较于G蛋白似乎是更有效的中和及保护性抗原。这可能与G蛋白的高碳水化合物含量相关，所述碳水化合物可保护蛋白不被免疫识别。此外，G蛋白还从被感染的细胞分泌，在该形式下其可用作抗原诱饵。F蛋白不仅用于使病毒和宿主膜融合，还在病毒-细胞附着中起着主要作用。因此靶向F的中和抗体可干扰病毒-细胞附着和/或病毒-细胞融合。

RSVF蛋白是I型膜蛋白，其被合成为组装成三聚体的无活性前体蛋白(命名为‘F0’)。重组野生型RSVF编码基因的核苷酸序列提供为SEQIDNO：1，而编码的重组可溶性野生型蛋白序列提供为SEQIDNO：2。该前体蛋白在其运输通过分泌途径期间通过弗林蛋白酶样蛋白酶切割为名为‘F2’、‘p27’和‘F1’的形式。F2和F1的同源三聚体(其通过二硫键共价连接)形成亚稳定融合前活性结构。F1含有七肽重复区A和B(称作为HRA和HRB)、融合肽(FP)和跨膜(TM)结构域，后两者位于该分子的相对侧。在病毒-细胞附着后，RSVF蛋白中的构象变化导致疏水性融合肽至宿主细胞膜中的插入。随后，该融合中间体重折叠成高度稳定的融合后结构。该后一种结构的组装由六螺旋束(6HB)的组装决定。此6HB包含反向平行构象的各单体的HRA和HRB，其结果是位于HRB下游的跨膜结构域和位于HRA上游的融合肽被定位在相邻位置并实现病毒和宿主膜的融合。研究已阐明了F蛋白以其融合后构象的结构(McLellanJS等人，2011.JVirol85:7788-96；SwansonKA等人2011.ProcNatlAcadSciUSA108:9619-24)。最近，还阐明了F蛋白以其融合前构象的结构(McLellan等人，2013Science340(6136):1113-7)。为了将F稳定在其所需的构象，将该蛋白与融合前特异性中和抗体D25共表达(US2012/0070446)。共晶体结构显示，D25结合至三聚体顶端上被指定为抗原位点0的位点(图2)。D25与F的融合前形式的结合区包括SEQIDNO：2所示的野生型RSVF蛋白序列的氨基酸60-71(F2区)和氨基酸197-210(F1区)。这些区域分别对应于如McLellan等人，April2013.StructureofRSVfusionglycoproteintrimerboundtoaprefusion-specificneutralizingantibody.Science340:1113-7中的图3所述的氨基酸63-74和200-213。电子显微镜和竞争结合表明，AM22(US2012/0070446)结合相同的抗原位点。

hRSV疫苗开发由于在1960年代测试的福尔马林灭活的病毒疫苗所获得灾难性结果而受到困扰。已接种疫苗的儿童在之后天然感染RSV时，疾病严重程度和住院率升高并且发生一些死亡病例。这种疫苗诱导的疾病增强的机制尚不完全清楚，但似乎与中和抗体的低诱导和嗜酸性粒细胞的招募有关。紧接着这项工作，已探索了大量RSV疫苗策略，其取得了不同的成功，这些疫苗策略包括活的减毒RSV株、亚单位疫苗和病毒载体疫苗(GroothuisJR等人，2011.Preventionofseriousrespiratorysyncytialvirus-relatedillness.I:Diseasepathogenesisandearlyattemptsatprevention.AdvTher28:91-109；HurwitzJL.2011.Respiratorysyncytialvirusvaccinedevelopment.ExpertRevVaccines10:1415-33)。显然，成功的RSV疫苗应诱导保护性免疫但不引起免疫病理学。

已报道的发展情况

目前，预防RSV介导的疾病的唯一可用选择是商购可得的RSV中和单克隆抗体帕利珠单抗的被动施用。该产品被用作为RSV感染的预防法，并识别F蛋白中的高度保守表位(BeelerJAandKvanWykeCoelingh.1989.NeutralizationepitopesoftheFglycoproteinofrespiratorysyncytialvirus:effectofmutationuponfusionfunction.JVirol63:2941-50；GroothuisJR等人，2011.Preventionofseriousrespiratorysyncytialvirus-relatedillness.II:Immunoprophylaxis.AdvTher28:110-25)。然而，由于其高成本，帕利珠单抗的使用局限于被认为处在发生严重呼吸道疾病的高风险中的婴儿。

尽管存在对于用于保护一般人群的疫苗的需求，但目前不存在可用的经批准的针对RSV的疫苗。基于主要RSV中和抗原(其为F蛋白)的许多疫苗候选物由于稳定性、再现性和效力的问题而失败了。

尽管已显示RSVF的融合后形式含有中和表位(McLellanJS等人，2011.Structureofrespiratorysyncytialvirusfusionglycoproteininthepostfusionconformationrevealspreservationofneutralizingepitopes.JVirol85:7788-96；SwansonKA等人，2011.StructuralbasisforimmunizationwithpostfusionrespiratorysyncytialvirusfusionFglycoprotein(RSVF)toelicithighneutralizingantibodytiters.ProcNatlAcadSciUSA108:9619-24)，但Magro和合作者显示，特异于F的融合前形式的抗体占在人血清中发现的中和活性的大部分(MagroM等人，2012.Neutralizingantibodiesagainstthepreactiveformofrespiratorysyncytialvirusfusionproteinofferuniquepossibilitiesforclinicalintervention.ProcNatlAcadSciUSA109:3089-94)。此外，RSV中和抗体被鉴定识别F，但不识别其据推测为融合后构象的重组可溶性胞外域(WO2008/147196；US2012/0070446；McLellanJS等人，2011.JVirol85:7788-96；SwansonKA等人，2011.ProcNatlAcadSciUSA108:9619-24；Gonzalez-ReyesL等人，2001.Cleavageofthehumanrespiratorysyncytialvirusfusionproteinattwodistinctsitesisrequiredforactivationofmembranefusion.ProcNatlAcadSciUSA98:9859-64；Ruiz-ArguelloMB等人，2002.Effectofproteolyticprocessingattwodistinctsitesonshapeandaggregationofananchorlessfusionproteinofhumanrespiratorysyncytialvirusandfateoftheinterveningsegment.Virology298:317-26；Ruiz-ArguelloMB等人，2004.Thermostabilityofthehumanrespiratorysyncytialvirusfusionproteinbeforeandafteractivation:implicationsforthemembrane-fusionmechanism.JGenVirol85:3677-87)，参见图2。这些据推测识别融合前F或融合前和融合后F之间的中间形式而不识别融合后F的抗体被显示比帕利珠单抗更有效地中和RSV，该帕利珠单抗识别所有形式的F蛋白。

已报道了修饰RSVF蛋白用于在免疫组合物中使用的尝试(WO2010/149743；WO2012/158613)。

附图简述

图1A显示来自呼吸道合胞病毒(RSV)的野生型融合(F)蛋白与经工程改造的RSVF抗原的比较。箭头指示弗林蛋白酶切割位点，并且在切割后肽p27被释放。显示了野生型序列的F1和F2片段，其由于弗林蛋白酶切割而产生。图1B是经工程改造的RSV融合前F的模型，其基于来自副流感病毒5(PIV-5)融合前F和经工程改造的RSV融合后F晶体结构的数据。图1C显示了图1A的经工程改造的RSV融合后F结构。CT＝胞质尾；SP＝信号肽(SP的DNA序列提供为SEQIDNO：7，并且氨基酸序列提供为SEQIDNO：8)；TM＝跨膜区。所有图均取自NatureReviewsMicrobiology10,807-813；2012。

图2A(取自McLellanJS等人，2011.JVirol85:7788-96)显示所提出的hRSVF三聚体的融合前构象的三维模型，其使用SWISS-MODEL服务器设施(http://swissmodel.expasy.org)和PIV5F蛋白的融合前结构(蛋白数据库代码，2B9B)的原子坐标作为模板来建立。三个单体的主链结构以灰色显示。在原始公开的彩色图(McLellanJS等人，2011.JVirol85:7788-96)中，一个单体的融合肽序列以粉红色显示，而HRA的融合肽序列显示为黑色。在用单克隆抗体(其表位映射F蛋白的不同抗原位点)选择的病毒分离株或逃逸突变株中发生改变的残基在其中显示为彩色球体(抗原位点I，氨基酸389；抗原位点II，氨基酸262、268、272和275；以及抗原位点IV，氨基酸429、432、433、436和447)。抗原位点0显示在图2A(抗原位点的位置源自McLellan等人，2013Science340(6136):1113-7)中。两个蛋白水解切割位点以单体之一中的箭头表示。图2B(也取自McLellanJS等人，2011.JVirol85:7788-96)显示具有经删除的FP的RSVF上的中和表位。针对莫维珠单抗和帕利珠单抗(抗原位点II)、101F(抗原位点IV)和131-2a(抗原位点I)的表位是溶剂暴露的并且处于与抗体结合相容的构象。残基254至277着色为红色(抗原位点II)，残基429至437着色为蓝色(抗原位点IV)，Pro389的原子被示为球体(抗原位点I)。残基编号根据McLellanJS等人，2011.JVirol85:7788-96。

图3显示在微量中和测定中阻断50％感染所需的抗体的量。该量越低，则抗体越有效。

图4提供在本发明中使用的不同构建体的示意图。TM＝跨膜区；CT＝胞质尾；CD5＝信号肽；HRA＝七肽重复区A；HRB＝七肽重复区B；GCN＝GCN4三聚基序。黑点代表半胱氨酸至丙氨酸的突变。虚线表示弗林蛋白酶切割位点的位置。黑色箭头表示信号肽(CD5)和P27被切割掉的位置。灰色箭头表示胰蛋白酶敏感的切割位点。

图5显示Fwt、Fwt-GCN、Flys和Flys-GCN蛋白被加热且还原(左图)、被加热且不还原(中图)或不被加热且不还原(右图)的western印迹。右图中的高阶蛋白显示了这些蛋白的融合后状态，该融合后状态在于SDS-PAGE上电泳蛋白之前用2-β-巯基乙醇处理(还原)并加热之后几乎完全消失。

图6显示凝胶的考马斯蓝染色，在该凝胶上Fwt、Fwt-GCN、Flys和Flys-GCN蛋白在加热(上图)或不加热(下图)并且在增加用胰蛋白酶(T)的切割之后进行分离。

图7A显示检查不同的可溶性F蛋白(Fwt、Fwt-GCN、Flys和Flys-GCN)与AM22抗体的反应性的ELISA测定的结果。指出了对于Flys和Flys-GCN的胰蛋白酶处理。图7B显示检查不同的可溶性F蛋白(Fwt、Fwt-GCN、Flys和Flys-GCN)与131-2a抗体的反应性的ELISA测定的结果。指出了对于Flys和Flys-GCN的胰蛋白酶处理。图7C显示检查不同的可溶性F蛋白(Fwt、Fwt-GCN、Flys和Flys-GCN)与(帕利珠单抗)抗体的反应性的ELISA测定的结果。指出了对于Flys和Flys-GCN的胰蛋白酶处理。图7D显示检查不同的可溶性F蛋白(Fwt、Fwt-GCN、Flys和Flys-GCN)与抗-strep抗体的反应性的ELISA测定的结果。指出了对于Flys和Flys-GCN的胰蛋白酶处理。

图8显示Fwt-GCN、Fwt、Fwt-cys-GCN、Fwt-cys、Flys-GCN、Flys、Flys-cys-GCN和Flys-cys蛋白被加热且不还原(左图)或被加热且还原(右图)的western印迹。如实施例2所概述的半胱氨酸在HRB结构域中的引入导致较高阶结构，其是抗热的并且对还原只部分敏感。

图9显示凝胶的考马斯蓝染色，在该凝胶上Fwt-cys、Fwt-cys-GCN、Flys-cys和Flys-cys-GCN蛋白在加热(上图)或不加热(下图)并且在增加用胰蛋白酶(T)的消化之后进行分离。

图10A显示检查在其HRB结构域中具有半胱氨酸和丙氨酸突变的不同可溶性F蛋白(Fwt-cys、Fwt-cys-GCN、Flys-cys、Flys-cys-GCN、Fwt-ala、Fwt-ala-GCN、Flys-ala、Flys-ala-GCN)与AM22构象抗体的反应性的ELISA测定的结果。图10B显示检查在其HRB结构域中具有半胱氨酸和丙氨酸突变的不同可溶性F蛋白(Fwt-cys、Fwt-cys-GCN、Flys-cys、Flys-cys-GCN、Fwt-ala、Fwt-ala-GCN、Flys-ala、Flys-ala-GCN)与131-2a构象抗体的反应性的ELISA测定的结果。图10C显示检查在其HRB结构域中具有半胱氨酸和丙氨酸突变的不同可溶性F蛋白(Fwt-cys、Fwt-cys-GCN、Flys-cys、Flys-cys-GCN、Fwt-ala、Fwt-ala-GCN、Flys-ala、Flys-ala-GCN)与(帕利珠单抗)构象抗体的反应性的ELISA测定的结果。图10D显示检查在其HRB结构域中具有半胱氨酸和丙氨酸突变的不同可溶性F蛋白(Fwt-cys、Fwt-cys-GCN、Flys-cys、Flys-cys-GCN、Fwt-ala、Fwt-ala-GCN、Flys-ala、Flys-ala-GCN)与抗-strep构象抗体的反应性的ELISA测定的结果。

图11显示Fwt-ala-GCN、Fwt-ala、Flys-ala-GCN和Flys-ala蛋白被加热且不还原(左图)或不被加热且不还原(右图)的western印迹。

图12A显示具有可用和不可用的抗体不同表位的F蛋白的融合前(左图)和融合后(右图)状态。在融合前状态，其中不存在6HB，针对AM22的表位是可用的(黑星)，针对131-2a的表位被隔离(空心符号)。在F蛋白的融合后状态，其中存在6HB，针对AM22的表位没有呈现出来，而针对131-2a的表位是可用的(实心符合代替开放符号)。针对帕利珠单抗的表位(三角形)在融合前和融合后状态中保持可用。图12B显示F蛋白的融合前状态(无6HB)通过两个中间状态转换并结束于表现出6HB的融合后状态，并且还描述了各种抗原位点的存在、出现和消失(连同各种抗体给出符号，其中对于131-2a的空心符号代表隔离的表位并且对于131-2a的实心符号代表可用的表位)。头部结构域(条纹)的重折叠使得AM22表位从融合前状态到融合后状态消失。

图13显示Flys-ΔHRB和Flys-ΔHRB-GCN蛋白在还原(左图)和非还原条件(中图和右图)下的表达。还检查了热稳定性(中图对右图)。

图14显示Flys-GCN、Flys-ΔHRB和Flys-ΔHRB-GCN在非还原条件下和在热处理(左图)及无热处理(右图)之后的western印迹。显示了增加的胰蛋白酶(T)消化。无胰蛋白酶处理以负号显示(-)。Flys-ΔHRB-GCN形成较高阶结构，无论是否切割和无论是否加热所纯化的产物。这些较高阶结构不涉及6HB，因为功能性HRB结构域不存在。

图15A显示检查两种不同的可溶性F蛋白(Flys-ΔHRB和Flys-ΔHRB-GCN)与AM22构象抗体的反应性的ELISA测定的结果。显示了胰蛋白酶的处理。图15B显示检查两种不同的可溶性F蛋白(Flys-ΔHRB和Flys-ΔHRB-GCN)与131-2a构象抗体的反应性的ELISA测定的结果。显示了胰蛋白酶的处理。图15C显示检查两种不同的可溶性F蛋白(Flys-ΔHRB和Flys-ΔHRB-GCN)与(帕利珠单抗)构象抗体的反应性的ELISA测定的结果。显示了胰蛋白酶的处理。图15D显示检查两种不同的可溶性F蛋白(Flys-ΔHRB和Flys-ΔHRB-GCN)与抗-strep构象抗体的反应性的ELISA测定的结果。显示了胰蛋白酶的处理。

图16是具有功能性HRB结构域的RSVF蛋白(融合前F；左)和由GCN4茎替换HRB茎的RSVF蛋白(Flys-ΔHRB-GCN；上图，中间)的示意图。在融合前状态，其中不存在6HB，针对AM22的表位是可用的(黑星)，而针对131-2a的表位不被呈现(空心符号)。在胰蛋白酶处理后，发生头部结构域的重折叠，通过其AM22的识别显著减少，而针对帕利珠单抗的表位(三角形)被保留。同样地，针对131-2a的表位仍未呈现。当不存在茎时(Flys-ΔHRB；右图)，胰蛋白酶处理也导致头部结构域的重折叠。针对AM22的表位不再存在，但针对131-2a的表位是可用的(实心符号)。

图17A描述了用作比较RSVF蛋白的构建体Fwt-ΔFP-ΔHRB的示意图，其中：TM＝跨膜区；CT＝胞质尾；P27＝弗林蛋白酶切割之后从F解离的27个氨基酸的肽；CD5＝信号肽；FP＝融合肽；HRA＝七肽重复区A；HRB＝七肽重复区B。虚线指示弗林蛋白酶切割位点的位置。箭头表示其中信号肽(CD5)和P27被切割掉的位置。图17B显示对于不同可溶性F蛋白(Fwt-ΔFP-ΔHRB和Flys-ΔHRB-GCN)与不同构象抗体(D25和131-2a)的反应性的ELISA测定的结果。重组蛋白与MAbD25和131-2a的反应性通过应用这些抗体的2倍稀释物来测定。抗体的结合通过使用HRP-缀合的二抗来检测。柱形图描述对应于抗体的单个稀释度的值。对于各F蛋白制剂，显示相同的抗体稀释度，它们取自具有对于这些抗体的最高反应性的F蛋白制剂的曲线的线性部分。

图18A描述本发明中使用的构建体Fala-GCN的示意图，其中：TM＝跨膜区；CT＝胞质尾；CD5＝信号肽；FP＝融合肽；HRA＝七肽重复区A；HRB＝七肽重复区。黑色箭头指示其中信号肽(CD5)被切割掉的位置。两个多碱性弗林蛋白酶切割位点(用虚线灰色箭头表示)中的精氨酸和赖氨酸残基被突变成丙氨酸残基(RARR至RAAA和RKRR至RKAA)。这个切割位点(arg->ala)突变构建体被称为‘Fala-GCN’(核苷酸序列：SEQIDNO：23；氨基酸序列：SEQIDNO：24)。图18B显示使用聚乙烯亚胺I(PEI)转染至HEK293T细胞中的RSVF胞外域编码序列(Fwt、Fwt-ΔFP-ΔHRB、Flys-ΔHRB-GCN、Fala-GCN和Flys-GCN)在瞬时转染后的产生水平(mgF/L组织培养上清液)。产率使用ELISA和SDS-PAGE测定。

图19A、B和C显示其中纯种品系新西兰白兔(N＝2/组)用不同的可溶性F蛋白(Fwt、Fwt-ΔFPΔHRB和Flys-ΔHRB-GCN)肌内接种的疫苗接种研究的结果。对最终血清进行ELISA以测定针对图19A显示的融合前F(涂覆有用T4折叠子(foldon)三聚化的Flys-ΔHRB的ELISA板)或图19B显示的融合后F(涂覆有Fwt的板)的抗体滴度。所报告的滴度(2log)是所计算的对应于至少0.2的OD450的样品稀释度的倒数。图19C显示融合前和融合后F特异性滴度之间的比率。

图20显示使用图19的图例中描述的血清的ELISA分析的结果。ELISA板用包含部分抗原位点0的合成肽hA-his涂覆。所报告的滴度(2log)是所计算的对应于至少0.2的OD450的样品稀释度的倒数。图20A显示经历特异性针对肽hA-his的ELISA的单克隆抗体D25、Synagis和131-2A的抗体滴度。图20B显示经历特异性针对肽hA-his的ELISA的最终兔血清的抗体滴度。

图21A和B显示在图19A、B和C的图例中描述的血清的RSV病毒中和滴度。图21A描述用针对RSV株A和B的最终血清获得的融合前特异性ELISA滴度(2log)的平均值。图21B描述用针对RSV株A和B的最终血清获得的融合后特异性ELISA滴度(2log)的平均值。

发明概述

本发明涉及呈现融合前呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白的至少一种抗原表位的重组多肽的热稳定寡聚复合物，所述多肽包含RSVF蛋白胞外域，从中功能性删除了HRB区域并且从中删除了跨膜和胞质结构域并替换为异源三聚结构域，以及其中所述胞外域中的两个多碱性弗林蛋白酶切割位点被删除或突变，从而使所述位点是缺陷性的。本发明还涉及含有上述热稳定寡聚重组多肽的免疫原性组合物和在受试者中诱导针对RSVF的免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用所述免疫原性组合物。

发明详述

RSV的重组可溶性F蛋白的设计和评估由于缺乏显示重组F蛋白的构象状态的工具而遭受相当大的困难。根据现有的文献，本发明的发明人推测F的融合后形式应包含稳定的6HB，并且其应由融合后特异性抗体识别而非融合前特异性抗体。相对地，F蛋白的融合前形式应不携带6HB，将由融合前特异性抗体识别而非融合后特异性抗体。通过应用这样的认识，合理的是这样的融合前特异性抗体会使得能够鉴定RSVF蛋白突变体，所述突变体是稳定的(例如耐热)并且在应激条件下仍保持其融合前构象。这样的稳定融合前突变体可在下一步骤中用于针对RSV的疫苗，因为它们在其稳定的构象下会引起免疫应答(体内)并产生中和抗体，所述中和抗体将能够中和携带融合前状态F蛋白的病毒。本发明公开了本发明人确实能够鉴定稳定地保持其融合前构象并因此可用于RSV疫苗的重组RSVF蛋白突变体。

可参照下列定义理解本发明。

‘功能性删除’意指氨基酸序列(其可被称为‘结构域’)从天然蛋白序列的删除，以使得被删除结构域的功能丢失，从而改变蛋白的性质。

‘热稳定’意指多肽在一定温度范围内在水溶液中保持其三维构象，从而保持其性质，包括例如这样的多肽的抗原性质。优选的温度范围是约5摄氏度至约60摄氏度。更优选的范围是约10摄氏度至约80摄氏度。最优选的范围是约20摄氏度至约100摄氏度。示例性的构象是被表征为融合前状态的构象。

‘寡聚物’或‘寡聚复合物’意指由两个、三个或四个多肽单体组成的多肽，例如基本上相同的多肽单体的二聚、三聚或四聚复合物。根据本发明的最优选的寡聚多肽是三聚多肽。

‘融合后构象’或‘融合后状态’意指不同于多肽或多肽寡聚物在初始表达或寡聚组装后所采取的形态的三维蛋白形态，其由这样的多肽或寡聚物与其它蛋白或蛋白组装体例如细胞膜通过酶促作用和/或物理接触的相互作用引起。形成融合后状态的RSVF蛋白是包括HRA-HRB6HB的RSVF蛋白。

‘融合前构象’或‘融合前状态’意指由多肽或多肽寡聚物在初始表达或寡聚组装后采取的三维蛋白形态。RSVF蛋白形成在与细胞膜融合前表现出融合前形态的RSVF蛋白寡聚物。融合前RSVF蛋白包括以下特征：HRA区域堆靠于RSVF头部区域中的结构域III，并且HRB区域在靠近结构域I和II处形成三聚体卷曲螺旋茎部，而不与HRA区域在六螺旋束(6HB)的背景下联合。

‘纯化的’蛋白或多肽意指从多肽产生系统的其它组分分离蛋白或多肽，以使得相对于存在于组合物中的其它大分子成分，蛋白质的量比存在于粗制剂中的量实质更高。一般而言，纯化的蛋白或多肽将是至少约50％均质的且更优选为至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或基本上均质的。

RSVF胞外域蛋白序列由SEQIDNO：18的氨基酸序列示例。相应的核苷酸序列由SEQIDNO：17提供。RSVF蛋白的氨基酸序列编号和可辨认结构域的提及在本文将针对SEQIDNO：18进行。然而，还可使用RSV的其它株来产生等价的重组多肽。

本发明涉及热稳定的寡聚重组多肽，其呈现融合前呼吸道合胞病毒F蛋白的至少一个抗原表位，所述多肽包含呼吸道合胞病毒F蛋白胞外域，从中功能性删除了HRB区域，并且从中删除了跨膜和胞质结构域并替换为异源三聚结构域；以及其中所述呼吸道合胞病毒F蛋白胞外域中的两个多碱性弗林蛋白酶切割位点被删除或突变，从而使所述弗林蛋白酶切割位点是缺陷性的。在优选的实施方案中，所述弗林蛋白酶切割位点通过用赖氨酸残基取代所述位点中的所有精氨酸残基来突变。在另一个优选的实施方案中，所述异源三聚结构域是GCN4亮氨酸拉链三聚基序。在另一个优选的实施方案中，HRB区域的所述功能性删除包括SEQIDNO：10的删除。在本发明的另一个方面中，根据本发明的热稳定寡聚重组多肽还包含连接至所述三聚结构域的羧基末端的LysM肽聚糖结合结构域，并且在另一个优选的实施方案中，根据本发明的重组多肽还包含三重Strep-标签。优选，所述胞外域是可溶性胞外域，并且在另一个优选的实施方案中，抗原表位由融合前特异性单克隆抗体例如AM22或D25、或AM22和D25两者识别。

本发明还涉及包含本发明的寡聚重组多肽的免疫原性组合物。优选，本发明的组合物还包含佐剂。合适的佐剂是本领域熟知的，并且本领域技术人员清楚地知道哪些佐剂可适当地在本发明的免疫原性组合物中使用。在另一个优选的实施方案中，寡聚重组多肽共价或非共价地结合至载体颗粒，而在另一个优选的方面中，所述载体颗粒是细菌样颗粒。

本发明还涉及包含编码形成本发明的热稳定寡聚物的多肽的核苷酸序列的重组表达载体。所述多肽和表达载体以及包含这样的蛋白或载体的组合物可适当地在治疗性环境下使用。本发明因此还涉及在受试者中诱导针对RSV的免疫应答的方法，其包括给所述受试者施用根据本发明的免疫原性组合物。

本发明涉及模拟人RSVF蛋白的融合前状态的重组可溶性蛋白。对于描述RSVF蛋白的融合前和融合后构象的图像，参见图1。如本文所公开的被发现是热稳定的高阶修饰RSVF蛋白结构是多肽的寡聚物，并且最可能地是经修饰的RSVF多肽的多肽三聚体。基于如在本文公开的实验中检测的大小和由于三聚基序存在于经修饰的多肽构建体中，本发明的多肽可能形成为三聚体形态。

优选地，根据本发明的热稳定寡聚多肽在室温下是稳定的。更优选，所述多肽在高达40℃的温度下是稳定的，更优选，所述多肽在高达60℃的温度下是稳定的，但在更优选的实施方案中，本发明的热稳定的重组多肽在高达70℃的温度下是稳定的。在最优选的方面，根据本发明的热稳定的重组多肽在约96℃的温度下保持稳定至少约5至约15分钟。

根据本发明的热稳定的重组多肽包含功能性删除的HRB区域。这与本领域中所执行的以及如本文所显示的例如通过引入(半胱氨酸或丙氨酸)突变至HRB区域中(WO2012/158613)是不同的。这样的突变体不能形成6HB结构(类似于其中已显示的)，但仍导致不稳定的构象。这种不稳定的构象通过如本文所公开的从RSVF蛋白除去HRB区域而防止。本发明的多肽具有RSVF蛋白的HRB区域的功能性删除，使得HRB区域不再能够执行其天然功能，例如建立6螺旋束(6HB)从而使得蛋白不能形成融合后构象。HRB区域的删除优选包含SEQIDNO：10的氨基酸(删除的核苷酸由SEQIDNO：9给出)。本领域技术人员将理解的是，这样的删除可在HRB区域的任一侧上略小和/或稍大，和/或可移位少量的氨基酸。尽管如此，这样的删除仍将使HRB区域功能性删除并且结合弗林蛋白酶切割位点的突变和异源三聚基序的添加，将提供如本文所示的热稳定的多肽。

RSV蛋白的弗林蛋白酶切割位点可通过本领域中已知的不同方法进行突变，例如通过用任何其它类型的氨基酸替换精氨酸残基，或通过关键残基的删除。在优选的实施方案中，弗林蛋白酶切割位点的突变包括用赖氨酸残基替换所有的精氨酸残基。

本发明的热稳定寡聚多肽包括选自以下的异源三聚结构域：GCN4亮氨酸拉链三聚基序，来自流感病毒HA蛋白、SARS刺突蛋白、HIVgp41、NadA、ATCase和折叠子序列的三聚基序。在优选的实施方案中，所述异源三聚结构域是GCN4亮氨酸拉链三聚基序。亮氨酸拉链基序例如GCN4以及其它三聚基序诱导三聚卷曲螺旋的形成，其中三个α-螺旋卷曲在一起如同绳索的绳股。这样的三聚基序已在本领域中被用于产生基于RSVF蛋白的RSV疫苗(WO2010/149743和WO2012/158613)。用于本发明中的GCN4三聚基序序列提供于SEQIDNO：15(核苷酸)和SEQIDNO：16(氨基酸)中。

根据本发明的热稳定的寡聚多肽优选由融合前特异性单克隆抗体AM22和D25识别，所述抗体的制备和特性描述于WO2008/147196中，该识别表示融合前特异性抗原表位是可用的。

本发明的多肽适合作为保护免受由人RSV(血清型A和B)引起的感染和疾病的疫苗的抗原性组分。通过将本发明的F蛋白突变/删除策略应用于属于肺炎病毒亚科的其它病毒的F蛋白，可制备保护免受由这些类似病毒例如牛RSV或人类偏肺病毒导致的感染的免疫原性多肽。

本发明还涉及的免疫原性组合物是针对RSV感染免疫的有效疫苗。在优选的实施方案中，所述免疫原性组合物包含佐剂以增强免疫原性。在另一个方面，本发明涉及包含根据本发明的编码热稳定多肽的核苷酸序列的重组表达载体。

本发明的重组蛋白还可用于诊断测定，通过其可测量针对RSV(或其亲缘物)的F蛋白的融合前形式特异性靶向的抗体应答。该应答可具有相对于疾病的预测价值。此外，本发明的重组蛋白可用于测试由候选疫苗诱导的抗体应答的质量，并且可用来产生可用作为治疗剂的构象特异性抗体，以研究存在于候选疫苗上的表位，或者以控制(候选)疫苗的抗原性。

在另一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的重组多肽的热稳定寡聚复合物，其还包含LysM肽聚糖结合结构域作为标签。用于本发明的LysM标签核苷酸序列由SEQIDNO：13提供，而氨基酸序列由SEQIDNO：14提供。为便于纯化和检测重组多肽，所述多肽优选包含三重Strep-标签。用于本发明的三重Strep-标签的核苷酸序列由SEQIDNO：11提供，而氨基酸序列由SEQIDNO：12提供。在另一个优选的方面，所述多肽内的胞外域是可溶性胞外域。

本发明的重组多肽的热稳定寡聚复合物处于融合前构象，其是抗原性的，并且可通过使用中和并识别RSVF蛋白中的某些表位的抗体来确认。在优选的方面，根据本发明的热稳定的重组多肽包含由单克隆抗体AM22识别的可用的表位。AM22是否识别多肽可通过本领域中常用的方法容易地检查，并且如本文所公开。

本发明可用于医药领域，特别是针对RSV感染的疫苗的领域。本发明的热稳定多肽可用于免疫原性组合物，其可在呈现储存和操作挑战的地区例如第三世界应用于疫苗接种方案以保护处于发生由RSV引起的疾病的风险的(人)受试者。

因为本发明的多肽在其融合前构象下是稳定的，呈现由强效的中和抗体识别的融合前特异性表位(这是不存在于折叠为融合后构象的多肽中的表位)，故所述多肽能够诱导优良的保护免受RSV感染的融合前特异性中和抗体。融合前特异性VN抗体在天然RSV感染的人中的重要性已由MagroM等人证实(2012.Neutralizingantibodiesagainstthepreactiveformofrespiratorysyncytialvirusfusionproteinofferuniquepossibilitiesforclinicalintervention.ProcNatlAcadSciUSA109:3089-94)。因此，本发明还涉及免疫原性组合物，其包含本发明的纯化的热稳定寡聚多肽，以及任选地还包含在疫苗制剂中常用的赋形剂。

应当理解的是，在本发明的免疫原性组合物中使用的本发明的多肽不包括信号肽，所述信号肽与热稳定多肽共表达，但其从该多肽在离开生产细胞之前被切割。在优选的方面，虽然不是绝对必要的，但在纯化过程期间或之后通过酶消化去除另外的(非RSVF蛋白)标签序列。优选地，根据本发明的免疫原性组合物还包含佐剂以进一步增强免疫应答。

本发明还涉及包含编码本发明的热稳定多肽的核苷酸序列的重组表达载体。此外，本发明涉及在受试者中诱导针对RSVF的免疫应答的方法，其包括给所述受试者施用根据本发明的免疫原性组合物，并涉及通过应用如本文所公开的免疫原性组合物来给人受试者针对RSV感染接种疫苗的方法。本发明还涉及根据本发明的热稳定多肽用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗RSV感染或在RSV感染后发生的疾病。本发明还涉及根据本发明的热稳定的重组多肽和/或重组表达载体，其用于针对RSV感染的疫苗。

可采用公开的PCT申请WO2012/128628(其通过引用并入本文)中公开的技术制备根据本发明的免疫原性组合物，并测试其免疫原性、效力和安全性。疫苗制剂可基于来源于灭活乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)细菌的颗粒，所述细菌是在食品工业中传统使用(例如用于生产奶酪)的安全的细菌(其在别处描述为革兰阳性增强基质或细菌样颗粒并在本文中称为“BLP”)。BLP由乳酸乳球菌细菌的酸性热处理获得，导致主要由肽聚糖表面组成的无活性球形颗粒，BLP的制备在WO02/101026中公开。本发明的抗原性多肽可被装载到BLP上，这采用被称为Protan技术的非共价偶联技术，其在US7,312,311中公开(其通过引用并入本文)。所得的抗原联合BLP构成最终疫苗，其可经由鼻(如滴剂或喷雾)或口(例如胶囊、片剂或液体)的粘膜层被递送至人中而无需注射。

实施例

实施例1RSVF蛋白制剂

本实施例描述不同的F蛋白构建体的产生和它们关于抗体结合和凝胶电泳迁移率的特征。该分析表明工具和测定适合用于显示RSVF蛋白的构象状态。此外，公开了显示模拟人RSVF的融合前状态的重组可溶性蛋白的产生的方法。

在初始步骤中，进行本文所用的MAb的病毒中和能力的比较分析(图3)。与以前的研究相一致，抗体131-2a相较于帕利珠单抗或AM22几乎没有表现出任何的中和能力(McLellanJS等人，2011.JVirol85:7788-96)。与此相反，AM22有效地中和hRSV的感染并且甚至比帕利珠单抗更有效，这与US2012/0070446中所显示的相一致。帕利珠单抗显示识别hRSVF的融合后形式，但它还可能识别F的融合前形式，因为基于针对副流感病毒5F蛋白解析的X射线结构，它的表位似乎还存在于融合前形式中(YinHS等人，2006.Structureoftheparainfluenzavirus5Fproteininitsmetastable,prefusionconformation.Nature439:38-44)。抗体131-2a识别的表位对于F的融合前形式可能是不可用的。推测的131-2a不能结合RSVF的融合前形式相应于其中和活性的缺乏。

本发明的发明人及其它人先前已证实重组可溶性I类融合蛋白可通过加入人工三聚结构域稳定地保持在其融合前构象(deVriesRP等人，2010.TheinfluenzaAvirushemagglutininglycosylationstateaffectsreceptor-bindingspecificity.Virology403:17-25；WeiCJ等人，2008.ComparativeefficacyofneutralizingantibodieselicitedbyrecombinanthemagglutininproteinsfromavianH5N1influenzavirus.JVirol82:6200-8；YangX等人，2000.Characterizationofstable,solubletrimerscontainingcompleteectodomainsofhumanimmunodeficiencyvirustype1envelopeglycoproteins.JVirol74:5716-25；YinHS等人，2006.Nature439:38-44)。利用了以前用来表达重组可溶性生物活性A型流感病毒HA蛋白以表达可溶性F蛋白的类似构建体(CornelissenLA等人，2010.AsingleimmunizationwithsolublerecombinanttrimerichemagglutininprotectschickensagainsthighlypathogenicavianinfluenzavirusH5N1.PLoSOne5:e10645；deVriesRP等人，2011.OnlytworesiduesareresponsibleforthedramaticdifferenceinreceptorbindingbetweenswineandnewpandemicH1hemagglutinin.JBiolChem286:5868-75；deVriesRP等人，2010.Virology403:17-25)。

在本发明使用的表达构建体(其概述提供于图4)中，欧洲临床分离株(TanL等人，2012.GeneticVariabilityamongCompleteHumanRespiratorySyncytialVirusSubgroupAGenomes:BridgingMolecularEvolutionaryDynamicsandEpidemiology.PLoSOne7:e51439)的人密码子优化的RSVF胞外域序列位于为编码信号肽的序列之后。该胞外域序列之后任选地紧接着编码GCN4亮氨酸拉链三聚基序(HarburyPB等人，1993.Aswitchbetweentwo-,three-,andfour-strandedcoiledcoilsinGCN4leucinezippermutants.Science262:1401-7)的序列。具有经密码子优化的胞外域序列(其编码蛋白的该部分的野生型形式)、其中存在野生型弗林蛋白酶切割位点和HRB结构域、并且其中胞外域后紧接着GCN4基序的蛋白被称为Fwt-GCN。为了进行比较，还将编码野生型F蛋白的基因克隆到缺少三聚基序的载体中(被称为Fwt)。标签由三重Strep标签组成以便于纯化，或由LysM肽聚糖结合结构域紧接三重Strep标签组成，因为发现，出于未知的原因，含GCN的F构建体在也存在LysM结构域时被表达至更高的水平。除了野生型构建体(Fwt和Fwt-GCN)之外，还构建了编码具有经修饰的弗林蛋白酶切割位点的F蛋白的表达载体。这些突变在SEQIDNO：20的蛋白序列中指明，显示为在第1个弗林蛋白酶切割位点中(位置81、83和84)和在第2个弗林蛋白酶切割位点中(位置108、110和111)的R至K突变。这些突变体的核苷酸序列示于SEQIDNO：19中。这些切割位点(arg->lys)突变构建体被称为‘Flys’。其他人显示在不存在弗林蛋白酶切割的情况下F蛋白被阻止采用融合后构象(Ruiz-ArguelloMB等人，2002.Virology298:317-26；Ruiz-ArguelloMB等人，2004.JGenVirol85:3677-87)。这与膜融合的活化需要F的切割的观点是一致的。

基因构建和克隆如下进行：使用人优选的密码子通过GenScriptUSAInc合成对应于RSV血清型A(Genbank登录号JX015498.1)的欧洲分离株的F蛋白的残基26至515的cDNA克隆的两个变体。一个cDNA克隆编码野生型F蛋白胞外域，另一个克隆编码其中两个多碱性弗林蛋白酶切割位点中的精氨酸残基被突变为赖氨酸(RARR至KAKK以及RKRR至KKKK)的F蛋白胞外域。每个cDNA被克隆到pCD5表达载体中用于在哺乳动物细胞中有效表达(deVriesRP等人，2010.Virology403:17-25)。pCD5载体已被修饰，使得编码F蛋白的序列被克隆在编码CD5信号肽的DNA序列的下游和当需要时编码异源GCN4异亮氨酸拉链三聚基序和指定标签的序列的上游的框架中。标签由三重Strep-tagII(IBA，Germany)或者由之后紧接三重Strep-tagII的LysM肽聚糖结合结构域(vanRoosmalenML等人，2006.Mucosalvaccinedeliveryofantigenstightlyboundtoanadjuvantparticlemadefromfood-gradebacteria.Methods38:144-9；WO2012/128628)组成。通过GenScriptUSAInc合成编码抗体AM22(US2012/0070446A1)的可变重和轻链的两个经密码子优化的DNA片段并分别读框内克隆到含有人IgG1重链和轻链恒定结构域的pCAGGS哺乳动物表达载体中。

F蛋白胞外域的表达通过瞬时转染如下实现：使用聚乙烯亚胺I(PEI)以1:5w/w的比率(μgDNA:μgPEI)将含有编码RSVF胞外域的序列的pCD5表达载体转染入HEK293T细胞。在转染后6小时，将转染混合物替换为293SFMII表达培养基(Invitrogen)，补充碳酸氢钠(3.7g/L)、葡萄糖(2.0g/L)、PrimatoneRL-UF(3.0g/L)、青霉素(100单位/ml)、链霉素(100μg/ml)、glutaMAX(Gibco)和1,5％二甲亚砜。转染后5-6天收获组织培养上清液。F蛋白任一使用Strep-tactin琼脂糖珠根据制造商的说明(IBA，Germany)进行纯化用于进一步分析蛋白。类似地如上所述将AM22和D25表达载体以1:1的比率共转染至HEK293T细胞。细胞培养基通过离心澄清并且AM22和D25抗体用蛋白A琼脂糖珠在标准条件下进行纯化。纯化的蛋白的浓度通过使用NanoDrop1000分光光度计(IsogenLifeSciences)根据制造商的说明来测定。

通过十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE；10％NuPAGEBisTris,Invitrogen)随后使用缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的抗Strep-标签抗体(StrepMAB-classic-HRP,IBA)、帕利珠单抗(AbbottLaboratories)随后HRP缀合的抗人IgG抗体(ITKSouthernBiotech)的Western印迹，来确认重组蛋白的表达和分泌。该后一种抗体还被用来确认重组抗体AM22的表达。在SDS-PAGE分析之前，将样品重新悬浮于Laemmli样品缓冲液(LSB)，其含有或不含有5％2-巯基乙醇(Sigma)，并且当需要时在96℃加热5-15分钟。

结果示于图5。由帕利珠单抗识别的表位位于F蛋白的F1的部分。结果表明，当F胞外域在还原条件下(即在2-巯基乙醇的存在下，这导致否则以二硫键连接的F1和F2的分离)经历SDS-PAGE时，它们以对应于GCN-LysM序列的不存在或存在的不同的电泳迁移率迁移。此外，当弗林蛋白酶切割位点发生突变时，F蛋白在凝胶中迁移至较高的位置(比较Fwt与Flys以及Fwt-GCN与Flys-GCN)，这与这些蛋白没有被切割是一致的。当相同的F蛋白制剂在不存在还原剂的情况下经历SDS-PAGE时，未切割的F蛋白的迁移没有显示受到较大的影响。

与此相反，虽然在还原条件下Fwt和Fwt-GCN蛋白在凝胶中清楚地电泳至比Flys和Flys-GCN更低的位置，但电泳迁移率的差异显示在不存在还原剂的情况下要小得多，这与同样在弗林蛋白酶切割的蛋白中F2部分仍经由二硫键附着至F1部分是一致的。在切割和未切割F蛋白之间的较小但仍显著的电泳迁移率的差异很可能由糖基化p27序列从切割蛋白的解离来解释。有趣的是，当制剂在非还原条件下电泳之前未被加热时，切割的F蛋白的电泳迁移率发生显著改变。与未切割蛋白(Flys和Flys-GCN，其电泳迁移率未受太大影响)相反，多数Fwt和Fwt-GCN蛋白在凝胶中迁移至高得多的位置。后者的这些蛋白的迁移由切割F蛋白采用特征是极稳定的6HB的存在的稳定的融合后构象(其耐SDS除非蛋白制剂被加热)来解释。这些结果表明，绝大多数的可溶性、被切割的F胞外域采用融合后构象。当胞外域用人工三聚结构域扩展时，融合后构象不被阻止。然而，当F蛋白不被切割时，不形成稳定的融合后构象。

为了确认并扩展这些观察结果，进行了随后的实验，其中纯化的F蛋白经历限制性蛋白水解随后进行非还原条件下的SDS-PAGE。尽管事实上Flys和Flys-GCN中的弗林蛋白酶切割位点已通过用赖氨酸取代精氨酸来突变，但这些位置仍对胰蛋白酶消化敏感。因此用胰蛋白酶处理Flys和Flys-GCN蛋白将导致这些蛋白的切割并且可能导致对应于F蛋白的融合后构象的耐SDS的高阶结构的形成。

纯化的F蛋白(模拟组-)用不同量的来自牛胰腺的经TPCK处理的胰蛋白酶(Sigma)在23℃下处理30分钟。随后将样品置于冰上并加入胰蛋白酶抑制剂(Sigma)，然后如上所述将它们进行SDS-PAGE分析。蛋白条带通过使用胶体蓝染色试剂盒(Invitrogen)的一般染色来可视化。结果示于图6。显然，用胰蛋白酶消化确实导致对应于F蛋白的融合后构象的耐SDS的高阶结构的出现。Fwt和Fwt-GCN蛋白用作为对照。纯化的蛋白用胶体考马斯蓝染色来检测。同样地，当样品在电泳之前被加热时，Fwt和Fwt-GCN在凝胶中电泳至其预期的位置(上图)。当样品未加热时，蛋白在凝胶中电泳至高得多的位置(下图)。正如预期的那样，用胰蛋白酶处理这些样品没有过多影响较高阶结构的迁移。然而，胰蛋白酶处理在一定程度上导致F蛋白标签的去除，这由当在电泳之前加热样品时较低迁移F蛋白物质的出现证实。用胰蛋白酶处理未切割F蛋白导致在非还原条件下在凝胶中迁移至高得多的位置的F蛋白的出现，类似于对于其Fwt和Fwt-GCN对应物所观察到的。当与Flys-GCN相比较时，Flys的耐SDS高阶结构的形成更为明显，这表明GCN三聚基序在一定程度上阻止了融合后构象的形成。

F蛋白制剂与RSVF特异性MAb帕利珠单抗()、AM22和131-2a的反应性使用ELISA形式来探测。对于此，将96孔Nuncmaxisorp板用不同的F蛋白制剂(50ng/孔)在4℃下涂覆过夜。在封闭和充分洗涤后，将板用帕利珠单抗(以3mg/ml储液的1:500稀释开始)、AM22(以0.7mg/ml储液的200倍稀释开始)、131-2a(Millipore，以1mg/ml储液的500倍稀释开始)、或抗-strep(来自IBA的StrepMAbclassic，以储液的500倍稀释开始)的有限稀释液温育。充分洗涤后，将板用1:500稀释的HRP缀合的山羊抗人IgG抗体(ITKSouthernBiotech)或HRP缀合的兔抗小鼠IgG抗体(DAKO)在RT温育1小时。使用四甲基联苯胺底物(BioFX)和ELISA读板器(来自Biotek的EL-808)进行HRP反应性的检测。结果示于图7中。

所有F蛋白以相似的效率涂覆，如由特异于Strep标签的MAb(抗-Strep实验对象组)的结合证实。帕利珠单抗显示与所有F蛋白制剂的浓度依赖性结合，这与该抗体识别F蛋白而不论其构象状态的假设一致。与此相反，AM22不能结合Fwt，这与该抗体不能结合融合后构象的蛋白的假设一致。然而，当切割蛋白用三聚基序扩展(Fwt-GCN)或当切割被阻止(Flys)时观察到中等的结合。当组合这两种特征时(Flys-GCN)，观察到最高的反应性。在涂覆孔之前用胰蛋白酶处理Flys和Flys-GCN导致降低的AM22反应性，其随后与Fwt和Fwt-GCN所观察到的反应性是可比较的。帕利珠单抗与F蛋白的反应性不受胰蛋白酶处理的影响。MAb131-2a有效结合所有的F蛋白制剂。

这些结果显示，中和抗体AM22的结合在不同的F蛋白制剂之间不同：采用融合后构象的Fwt几乎检测不到，而对于Flys-GCN观察到最高的反应性。从这些结果可得出结论，多数Fwt处于融合后构象(6HB+，131-2a+，AM22-)。Fwt-GCN可能以混合的构象存在(6HB+，131-2a+，AM22+/-)。在不存在切割的情况下，F蛋白不采取融合后构象(无6HB)。其与131-2a和AM22两者的反应性表明，这些未切割蛋白处于某种形式的中间状态。

实施例2半胱氨酸残基在HRB区域中的引入

随后，研究了其中在其HRB结构域中引入了4个半胱氨酸残基的F蛋白(指定为Fwt-cys；Fwt-cys-GCN；Flys-cys；Flys-cys-GCN；图4)的特性。先前已显示，当被引入全长F蛋白(含有跨膜结构域和胞质尾区)时这些cys取代导致似乎将F蛋白稳定在其融合前构象的分子间二硫键(MagroM等人，2012.ProcNatlAcadSciUSA109:3089-94)。在存在或不存在还原剂的情况下通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白。如图8所示，将半胱氨酸残基引入HRB导致形成更高阶结构，这可甚至在加热样品时，在非还原凝胶上观察到。这些更高阶结构对于具有GCN4三聚基序的F蛋白(Fwt-cys-GCN和Flys-cys-GCN)是最明显的，但对于缺乏GCN4基序的F蛋白(Fwt-cys和Flys-cys)也存在一定程度的更高阶结构。在这些条件下对于含有野生型HRB的F蛋白没有观察到这些更高阶结构，这与图5和6所示的结果相一致。虽然Fwt-cys和Flys-cys的更高阶结构对还原剂的存在敏感(图8；右图)，但对于额外含有GCN4基序的蛋白则远非如此。这些数据表明了通过将半胱氨酸残基引入HRB同时还存在GCN4基序时高阶结构的极大的稳定性。

为了确认并扩增这些观察结果，进行了随后的实验，其中纯化的F蛋白经历限制性蛋白水解随后进行非还原条件下的SDS-PAGE。结果示于图9。使用胶体考马斯蓝染色检测纯化的蛋白。再一次，在引入半胱氨酸残基后观察到的更高阶结构显示对于凝胶电泳前样品的加热不敏感。此外，结果表明，胰蛋白酶处理的Fwt-cys和Flys-cys(缺乏GCN4基序并且仅以有限量存在为耐热高阶结构)在电泳前不加热样品时不形成高阶结构，如对于胰蛋白酶处理的Fwt和Flys所观察到的(图6)。从这些结果可得出结论，在HRB中引入半胱氨酸残基之后观察到的更高阶结构不同于对于具有野生型HRB的切割F蛋白所观察到的高阶结构，因为与后者相比，前者对加热具有抗性并且还在F蛋白不被切割时形成。此外，数据显示，半胱氨酸残基在HRB中的引入阻止热敏高阶结构的形成。这表明，这些蛋白不组装存在于融合后构象中的6HB。

如上所述，使用RSVF特异性MAb帕利珠单抗、AM22和131-2a利用ELISA形式研究了半胱氨酸突变F蛋白制剂的反应性(图10中的数字1-4)。所有半胱氨酸突变F蛋白以相似的效率涂覆，如由特异于Strep标签的MAb的结合证实。帕利珠单抗显示与所有F蛋白制剂的浓度依赖性结合，其在不同的F制剂之间仅略微不同。MAb131-2a和AM22显示与不同F蛋白的差异结合。Fwt-cys-GCN和Flys-cys-GCN不与131-2a结合，但与AM22明显结合。这些结果表明，这两种蛋白所观察到的高阶结构对应于稳定的融合前F蛋白(6HB-，131-2a-，AM22+)。该结果还表明，AM22识别的表位在一定程度上受到F的切割的影响。Fwt-cys由131-2a有效识别(Flys-cys稍差)，这与仅这些蛋白的一部分形成不与该抗体反应的融合前高阶结构是一致的。与其一致的是，这些制剂还与AM22反应。所观察到的与AM22的反应性还可由Fwt-cys和Flys-cys处于某种形式的中间状态(6HB-,131-2a+,AM22+)来部分解释。虽然根据Flys的结果这对于Flys-cys是可预期的，但另一种解释必须考虑Fwt-cys的中间表型。半胱氨酸的引入还可由于HRB不能够结合HRA而增强AM22反应性，因为形成6HB的失能可直接偶联至AM22表位的保存。

实施例3丙氨酸残基在HRB区域中的引入

为了更详细地研究HRB结构域中的突变的效应，产生了其中与实施例2中概述的相同的氨基酸(还参见MagroM等人，2012.ProcNatlAcadSciUSA109:3089-94)被丙氨酸而非半胱氨酸取代以防止二硫键稳定化的融合前三聚体的形成的突变F蛋白(图4)。同样地，使这些蛋白经历SDS-PAGE以分析高阶结构的不存在或存在。结果示于图11。在不存在GCN4的情况下丙氨酸取代的引入(构建体被称为Fwt-ala)阻止非还原条件下热敏性高阶结构(6HB)的形成(比较图11和图5)，与Fwt-cys所观察到的相似。在GCN4的存在下，观察到一些高阶结构，其对于电泳前样品的加热不敏感。这些较少的高阶结构可对应于融合前结构。Fwt-ala和Flys-ala均不能组装6HB，并且也不与AM22反应(右上图，图10线5和6)，表明阻止6HB的形成不保留针对AM22的表位。这些蛋白可能处于中间状态，其中融合前蛋白中由HRB形成的茎解离，从而使针对131-2a的表位是可用的。同时，头部结构域重折叠从而导致针对AM22的表位的丢失。即使如此，由于HRB中的丙氨酸突变，6HB不能形成，这可能阻止HRB与HRA的相互作用。将GCN4基序引入这些蛋白(Fwt-ala-GCN和Flys-ala-GCN)可能导致混合群体，其具有一些对于AM22而非131-2a呈阳性的融合前F蛋白。其结果是，这些蛋白与AM22的反应性增加，而它们与131-2a的反应性降低。引人注目的是，所有在其HRB中具有丙氨酸突变的F蛋白相较于它们的野生型HRB对应物均显示降低的与AM22的反应性。显然，HRB的突变既可帮助保留融合前表位(在HRB中具有半胱氨酸突变的F蛋白)还可降低与融合前特异性表位的反应性(在HRB中具有丙氨酸突变的F蛋白)。引人注目的是，这些突变是在蛋白中的相同位置引入并且以相同的程度阻止6HB形成，这表明蛋白采取融合后结构的能力不是融合前结构的构象变化的驱动力。

所公开的数据显示开发了一组可用来确定重组可溶性F蛋白的构象的测定。通过使用这些测定，可鉴别F蛋白的4种构象状态，其在图12A和12B中示意性示出：

1)融合前F(6HB-，131-2a-，AM22+)，见图12A(左图；比较示意图和蛋白的三维表示)及图12B(左上图)。稳定的形式是Fwt-cys-GCN和Flys-cys-GCN；

2)中间体1(6HB-，131-2a+，AM22+)，见图12B(左下图)。由HRB形成的茎解离，但具有HRA的头部结构域尚未重折叠。实例是Flys和Flys-GCN；

3)中间体2(6HB-，131-2a+，AM22-)，见图12B(右下图)。由HRB形成的茎解离，并且可能包含由AM22识别的表位的头部结构域重折叠。6HB尚未组装在此中间体2形式中。实例是Fwt-ala和Flys-ala；

4)融合后F(6HB+，131-2a+，AM22-)，见图12A(右图；比较示意图和蛋白的三维表示)及图12B(右上图)。最好的实例是Fwt。

实施例4模拟人RSVF蛋白的融合前状态的重组可溶性蛋白的合成

在上述实施例中，显示了融合前构象的F蛋白与具有其它构象的F蛋白是抗原性不同的。针对融合前F表位特异性靶向的免疫应答可由非融合前特异性表位的存在(其相应的抗体不中和病毒(例如131-2a))而受到阻碍。虽然Fwt-cys-GCN和Flys-cys-GCN处于融合前构象，但这些蛋白不被认为适合用于以较大规模产生融合前F蛋白，主要是因为这些蛋白以非常低的水平表达。为了解决这个问题，本发明人着手设计替代策略以表达高水平的包含融合前特异性表位并且缺乏融合后特异性表位的重组F蛋白。数据显示，GCN4能够赋予重组蛋白融合前状态，但这仅在融合前状态中的HRB茎是稳定的情况下有效地发生(例如在Fwt-cys-GCN和Flys-cys-GCN中)。该不稳定性可能甚至被HRB中其它突变(例如本文所述的丙氨酸突变)增加。

本发明人推测在HRB中可能存在某种形式的固有不稳定性，这使得HRB可能发生解离，并随后与经扩展的HRA相互作用。没有试图通过引入分子间二硫键(这严重降低蛋白表达水平)来稳定HRB，而是决定完全去除HRB区域(及其固有的不稳定性)。然而，在完全不存在HRB的情况下，预期在融合前状态下通常不可用的表位会直接通过HRB的去除(例如131-2a的表位)或由于所得的无茎蛋白可能表现为单体而非三聚体而暴露。此外，数据表明，在不存在切割的情况下，AM22表位和可能地其它融合前特异性表位被更好地维持在重组F蛋白中(比较Flys-cys-GCN和Fwt-cys-GCN)。鉴于这些考虑，产生了重组蛋白，其中HRB被去除，添加了GCN4三聚基序，并将弗林蛋白酶切割位点突变(图4)。被删除的胞外域HRB部分提供在SEQIDNO：10中。编码所表达的多肽Flys-ΔHRB-GCN的完整核苷酸序列提供在SEQIDNO：5中，而氨基酸序列提供在SEQIDNO：6中。作为对照，合成了缺乏GCN4的变体(SEQIDNO：3和4)。本发明的构建体中的删除(即SEQIDNO：2中的位置478-512)稍微大于在文献中被视为HRB的区域(Swanson等人，2011,ProcNatlAcadSciUSA10.1073.PNAS.1106536108)，该文献认为HRB处于位置482-510(SEQIDNO：2中的)。

这些重组蛋白通过SDS-PAGE使用还原和非还原条件进行分析(图13)。这两种蛋白在还原凝胶中迁移至预期位置。然而，在不存在还原剂的情况下，大部分的Flys-ΔHRB-GCN在凝胶中电泳至高得多的位置。而对于Flys-ΔHRB则并非如此。加热样品不怎么影响蛋白的电泳迁移率(图13，中图)。此结果表明，对于Flys-ΔHRB-GCN所观察到的高阶结构不对应于热敏的6HB。这是所预期的，因为在不存在功能性HRB的情况下不能形成6HB。

接着，通过胰蛋白酶处理诱导这些重组蛋白的切割，以研究蛋白消化对蛋白构象的效应。作为对照，采用Flys-GCN并在非还原凝胶上电泳蛋白。结果示于图14。在胰蛋白酶处理Flys-GCN后，并且在不存在加热的情况下，切割的Flys-GCN蛋白电泳为指示6HB形成的(热敏的)高阶结构。与此相反，大多数Flys-ΔHRB在凝胶中电泳至其预期(经计算的)的位置，并且胰蛋白酶切割不诱导更高阶结构的形成。这是所预期的，因为在不存在HRB的情况下，不可能形成6HB。多数Flys-ΔHRB-GCN4再次电泳为耐热的高阶结构。这种迁移不受到胰蛋白酶处理的显著影响。结果显示，用GCN4替换HRB结构域导致明显不对应于6HB的非常稳定的高阶结构。

如上所述在ELISA中测试Flys-ΔHRB和Flys-ΔHRB-GCN蛋白与单克隆抗体的反应性(图15)。Flys-ΔHRB由131-2a和AM22识别。在GCN4的额外存在下(Flys-ΔHRB-GCN)，对于131-2a的反应性丢失，而与AM22的反应性增加。显然，GCN4结构域隔离了131-2a表位(类似地作为稳定的HRB)并刺激AM22的表位的存在。样品的胰蛋白酶处理不影响131-2a反应性，但是明显降低AM22反应性。与帕利珠单抗或针对Strep-标签的单克隆抗体的反应性不受胰蛋白酶处理的影响。从这些结果可得出结论，Flys-ΔHRB-GCN代表RSVF蛋白的融合前构象，因为该蛋白不形成6HB，并与AM22反应，但不与131-2a反应(对于该突变体的示意性表示和胰蛋白酶处理对不同表位的可用性的效应，见图16)。

在实施例1-4中，已显示1)HRB的去除；2)弗林蛋白酶切割位点的失活；和3)异源三聚基序的添加的组合是将可溶性人RSVF蛋白维持在融合前状态所需要的。在下面的比较实施例中，研究了其中HRB和融合肽(FP)区域被删除的F蛋白(指定为Fwt-ΔFP-ΔHRB；见图17)的特性。WO2012/158613公开这些删除在引入可溶性RSVF蛋白(缺乏跨膜结构域和胞质尾区)中时将F蛋白(部分地)稳定在其融合前构象，如用电子显微镜通过其多聚化状态和外观所确定(WO2012/158613A1；第87页；第5节，缺乏融合肽和HRB区的构建体R057)。

实施例5人RSVF蛋白的缺乏融合肽和七肽重复B区域的重组可溶性蛋白的表达

合成了缺乏与WO2012/158613A1中描述的完全相同的FP和HRB区域的蛋白(本文称为Fwt-ΔFP-ΔHRB；核苷酸序列：SEQIDNO：21；氨基酸序列：SEQIDNO：22)。该蛋白的示意图提供在图17A中。基因构建和克隆如下进行：使用人优选的密码子通过GenScriptUSAInc合成cDNA克隆编码。将cDNA克隆到pCD5表达载体中用于在哺乳动物细胞中有效表达(deVriesRP等人，2010.Virology403:17-25)。pCD5载体已被修饰，使得编码F蛋白的序列被克隆在编码CD5信号肽的DNA序列的下游和和编码指定的由三重Strep-tagII(IBA，Germany)组成的标签的序列的上游。使用聚乙烯亚胺I(PEI)以1:5w/w的比率(μgDNA:μgPEI)将含有编码Fwt-ΔFP-ΔHRB的基因的pCD5表达载体转染入HEK293T细胞。转染后6-7天收获组织培养上清液。F蛋白使用Strep-tactin琼脂糖珠根据制造商的说明(IBA，Germany)进行纯化用于进一步分析蛋白。重组蛋白的表达和分泌由十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳来确认。

Fwt-ΔFP-ΔHRB与单克隆抗体的反应性如上对图15所述在ELISA中与Flys-ΔHRB-GCN比较测试。图17B显示，Fwt-ΔFP-ΔHRB由131-2a和D25识别。与此相反，Flys-ΔHRB-GCN具有与融合后特异性的131-2a的明显降低的反应性，但与融合前特异性的D25良好反应。Fwt-ΔFP-ΔHRB与131-2a和D25两者的反应性表明，HRB和FP删除的组合不足以将F蛋白维持在其完全的融合前状态(如对于Flys-ΔHRB-GCN所观察到的)但导致某种形式的中间状态。

实施例6可溶性F蛋白的表达水平

使用聚乙烯亚胺I(PEI)在HEK293T细胞中表达可溶性F蛋白(对于表达的描述见实施例1)。表达水平通过ELISA和SDS-PAGE测定。对于ELISA，将96孔板过夜用Synagis在4℃涂覆过夜。在封闭和充分洗涤后，将板用3倍稀释的细胞培养基温育。充分洗涤后，将板用1:1000稀释的HRP缀合的山羊抗RSV抗体(Meridian)在RT温育1小时。使用四甲基联苯胺底物和ELISA读板器进行HRP反应性的检测(Fwt,Flys-GCN,Fala-GCN)。对于Fala-GCN的示意图见图18A。对于使用SDS-PAGE的定量，首先使用C末端strep标签从细胞培养基纯化F蛋白。纯化的蛋白的量在SDS-PAGE上使用牛血清白蛋白作为参照来测定(Fwt，Flys-GCN，Flys-ΔHRB-GCN，和Fwt-ΔFP-ΔHRB)。

弗林蛋白酶切割位点的失活是将RSVF蛋白维持在其融合前构象的必要条件。失活通过用赖氨酸(Flys-GCN，Flys-ΔHRB-GCN)或丙氨酸(Fala-GCN)替换位于弗林蛋白酶切割位点中的精氨酸来实现。这里测定了其弗林蛋白酶切割位点通过丙氨酸或赖氨酸取代而失活的RSVF蛋白的表达水平。图18B显示了表达实验的结果。Fala-GCN(0.2mg/L)相较于Flys-GCN(1mg/L)和Fwt(2.5mg/L)被表达至显著更低的水平。通过用中性氨基酸(丙氨酸)取代带正电荷的氨基酸来使2个弗林蛋白酶切割位点灭活显然导致非常低的生产水平。在弗林蛋白酶切割位点保留位点的正电荷的氨基酸取代仅轻度影响生产水平：其弗林蛋白酶切割位点通过用赖氨酸取代精氨酸来突变的两个F蛋白(Flys-ΔHRB-GCN和Flys-GCN)显示的表达水平较接近于对于Fwt所测量的水平。弗林蛋白酶切割位点的操纵显然容易导致F蛋白的显著降低的表达(见Fala-GCN)。然而切割位点中一个带正电荷的氨基酸(R)至另一个(K)的改变保留与Fwt可比较的表达水平；这对于将该蛋白应用于疫苗是重要的特征。

Fwt-ΔFP-ΔHRB(0.5mg/L)表达至对于Flys-ΔHRB-GCN(1.2mg/L)所观察到的水平的大约50％的水平。

实施例7使用F蛋白对兔进行疫苗接种

为了研究各种构象的F蛋白的疫苗潜力，将突变F蛋白制剂(Fwt，Fwt-ΔFP-ΔHRB和Flys-ΔHRB-GCN)用于通过肌内途径接种纯种品系新西兰白兔(N＝2/组；40μg/接种)。将动物通过Eurogentec(Belgium)根据其快速的28天方案(在0.7天、10和21天疫苗接种)接种。在第0天(免疫前)和28天(最终抽血)采集血清。

能够与融合前或融合后构象的F蛋白相互作用的血清抗体的比例使用ELISA形式来探测。对于此，将96孔Nuncmaxisorp板用Fwt蛋白(融合后)或Flys-ΔHRB-T4折叠子蛋白(融合前)(100ng/每孔)在4℃下涂覆过夜。这两种蛋白均包含用于纯化目的的C-末端flag标签。在封闭(2.5％Provitar)和充分洗涤后，将板用以1:500稀释开始的兔血清的有限(3倍)稀释液温育。充分洗涤后，将板用1:500稀释的HRP缀合的山羊抗兔IgG抗体(Biorad)在RT温育1小时。使用四甲基联苯胺底物(BioFX)和ELISA读板器(来自Biotek的EL-808)进行HRP反应性的检测。结果示于图19A和19B。在从Flys-ΔHRB-GCN接种的动物采集的血清中测量的融合前特异性抗体水平分别是来自Fwt和Fwt-ΔFPΔHRB接种家兔的血清的25和8倍。融合后特异性抗体滴度在各组之间类似。免疫前血清是阴性的。

接下来，使用ELISA形式测定了能够与肽hA-his相互作用的血清抗体的比例。肽hA-his包括SEQIDNO:2的残基191-212。这些残基代表抗原位点0的F1部分。hA-his肽合成产生。

序列是：GSDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISASHHHHHH(SEQIDNO：25)。此处，SEQIDNO：2的残基191-212以粗体给出。N-末端GS和C-末端AS是接头序列。位于C末端的HHHHHH是6-组氨酸标签。

对于相互作用实验，将96孔Nuncmaxisorp板用100ng/孔的肽hA-his涂覆过夜。在封闭和充分洗涤后，将板用以1:500稀释开始的兔血清的有限稀释液温育。将D25(以0.7mg/ml储液的40倍稀释开始)、131-2a(Millipore，以1mg/ml储液的670倍稀释开始)用作涂覆对照。如上所述进行HRP反应性的检测。D25与F的融合前形式的结合区域包括SEQIDNO：2所示的F蛋白的残基60-71(在F2区域中)和残基197-210(在F1区域中)(McLellan等人，2013Science340(6136):1113-7)。结果示于图20A。显然仅F1部分的存在对于D25结合到肽是足够的。如所预期的，对照抗体131-2A和Synagis不能结合肽hA-his。接着，测试兔血清样品。结果示于图20B。在从Flys-ΔHRB-GCN接种的动物采集的血清中测量的特异于肽hA-his的抗体滴度分别是Fwt和Fwt-ΔFP-ΔHRB接种的兔的血清滴度的12和3.5倍。

随后，用在第0天(免疫前)和28天(最终血清)采集的兔血清进行针对RSVA或B型的病毒中和能力的比较分析。免疫前血清没有显示如所预期的病毒中和能力。来源于用Flys-ΔHRB-GCN接种的兔的最终血清的中和能力分别是来源于用Fwt和Fwt-ΔFP-ΔHRB接种的动物的血清的4和2倍。病毒中和的水平似乎与融合前特异性ELISA滴度关联(见图21A)，而不与融合后特异性ELISA滴度关联(见图21B)。

这些结果共同表明，稳定在其融合前构象的Flys-ΔHRB-GCN，相较于分别处在融合后和中间融合构象的Fwt或Fwt-ΔFP-ΔHRB，能够在疫苗接种后诱导更高水平的融合前和抗原位点0特异性抗体。此外，由Flys-ΔHRB-GCN诱导的高水平的融合前和抗原位点0特异性抗体与高水平的病毒中和抗体正相关。

Claims (14)

1.热稳定的寡聚重组多肽，其呈现融合前呼吸道合胞病毒F蛋白的至少一个抗原表位，所述多肽包含

呼吸道合胞病毒F蛋白胞外域，

从中功能性删除了HRB区域，并且

从中删除了跨膜和胞质结构域并替换为异源三聚结构域，

以及

其中所述呼吸道合胞病毒F蛋白胞外域中的两个多碱性弗林蛋白酶切割位点被删除或突变，从而使所述弗林蛋白酶切割位点是缺陷性的。

2.根据权利要求1所述的热稳定的寡聚重组多肽，其中所述弗林蛋白酶切割位点通过用赖氨酸残基取代所述位点中的所有精氨酸残基来突变。

3.根据权利要求1所述的热稳定的寡聚重组多肽，其中所述异源三聚结构域是GCN4亮氨酸拉链三聚基序。

4.根据权利要求1所述的热稳定的寡聚重组多肽，其中HRB区域的所述功能性删除包括SEQIDNO：10的删除。

5.根据权利要求1所述的热稳定的寡聚重组多肽，其还包含连接至所述三聚结构域的羧基末端的LysM肽聚糖结合结构域。

6.根据权利要求1所述的热稳定的寡聚重组多肽，其还包含三重Strep-标签。

7.根据权利要求1所述的热稳定的寡聚重组多肽，其中所述胞外域是可溶性胞外域。

8.根据权利要求1所述的热稳定的寡聚重组多肽，其中所述抗原表位由融合前特异性单克隆抗体AM22或D25、或AM22和D25识别。

9.免疫原性组合物，其包含权利要求1所述的寡聚重组多肽。

10.根据权利要求9所述的免疫原性组合物，其还包含佐剂。

11.根据权利要求9所述的免疫原性组合物，其中所述寡聚重组多肽共价或非共价地结合至载体颗粒。

12.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述载体颗粒是细菌样颗粒。

13.重组表达载体，其包含编码形成权利要求1的热稳定寡聚物的多肽的核苷酸序列。

14.在受试者中诱导针对RSV的免疫应答的方法，其包括给所述受试者施用根据权利要求9所述的免疫原性组合物。