JP2023521183A - 三量体を形成するインフルエンザウイルス表面タンパク質由来組換え赤血球凝集素タンパク質およびその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、三量体を形成するインフルエンザウイルス表面タンパク質由来組換え血球凝集素（ヘマグルチニン， ＨＡ）タンパク質およびその用途に関し、具体的には、三量体を形成するインフルエンザウイルス表面タンパク質由来ＨＡタンパク質を生産するための組換えベクター、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体、上記組換えベクターを用いた、三量体を形成するインフルエンザウイルス表面タンパク質由来ＨＡタンパク質の生産方法、上記方法で生産された三量体を形成するインフルエンザウイルス表面タンパク質由来ＨＡタンパク質およびそのインフルエンザウイルス感染症の予防、改善または治療用途に関する。

Description

本発明は、三量体を形成するインフルエンザウイルス表面タンパク質由来組換え赤血球凝集素（ヘマグルチニン， ＨＡ）タンパク質およびその用途に関するもので、具体的には、三量体を形成するインフルエンザウイルス表面タンパク質由来のＨＡタンパク質を生産するための組換えベクター、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体、上記組換えベクターを用いた、三量体を形成するインフルエンザウイルス表面タンパク質由来のＨＡタンパク質の生産方法、上記の方法で生産された三量体を形成するインフルエンザウイルス表面タンパク質由来のＨＡタンパク質およびそのインフルエンザウイルス感染症の予防、改善または治療用途に関するものである。

最近、植物から組換えタンパク質を低コストで生産できる可能性が提案され、様々な試みが進められている。特に、多様な医療用タンパク質の生産の可能性などを確認する研究が進められている。植物から組換えタンパク質を生産する場合、様々なメリットがあるが、その一つは大腸菌など微生物に存在する内毒素のように毒素がほとんど存在しないということと人体に感染しうる病原体がないということである。またプリオンのような有害なタンパク質もないことが知られており、動物細胞や微生物に比べて安全な組換えタンパク質を生産できる。製造単価においても動物細胞よりは非常に安価であり、植物の栽培方法によって大規模な生産においては大腸菌などの微生物よりも経済的である。このような可能性を実現するためには、いくつかの必須技術の開発が必要である。その中で最も重要な技術は、植物における遺伝子の高発現を誘導するための発現ベクターの開発である。植物では、様々な方法を通じて遺伝子の発現を誘導することができる。組換え遺伝子を植物体のゲノムに導入させる方法、葉緑体のゲノムに 導入させる方法、アグロバクテリウムを用いて一過性のある遺伝子を発現させる方法など様々な方法が可能である。細胞核ゲノムや葉緑体ゲノムに組換え遺伝子を融合させる方法は、基本的に形質転換体を確保する過程を通じて植物からタンパク質を生産することになる。一方、アグロバクテリウムを植物組織に浸透させ、遺伝子の一過性発現を誘導してタンパク質を生産する場合、形質転換体の製造過程が含まれないためタンパク質の生産期間が短く、概ね形質転換体によるタンパク質の生産に比べてタンパク質の生産水準が著しく高いメリットがある。また、植物の持つ異なる遺伝子の発現抑制機構を、遺伝子沈黙抑制因子を共同浸透させて抑制することができるため、タンパク質の発現水準をさらに高く誘導することができる。しかし、一過性発現をしようとするたびに目的遺伝子を含むバイナリーベクターを導入したアグロバクテリウムの培養と、ｐ３８遺伝子沈黙抑制因子を発現するバイナリーベクターを導入したアグロバクテリウムの培養を別々に作り、これを適切な割合で混ぜて共同浸透させる過程を遂行しなければならない短所がある。特に、二種類のアグロバクテリウムを培養する場合、時間や経済的な面で限界がある。

インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属するＲＮＡウイルスで、呼吸器に炎症を誘発し、感染者の咳や唾液により空気中に直接伝わったり、インフルエンザ患者の接触物などにより間接的にも他人に感染しうる感染力の強いウイルスである。潜伏期は、２４～３０時間程度であり、ウイルスの血清型は、Ａ型、Ｂ型およびＣ型に区分される。そのうちＢ型とＣ型は、人のみ感染が確認されており、Ａ型は人、馬、豚、その他哺乳類、そして多様な種類の家禽と野生鳥類から感染が確認されている。したがって、このような強力な伝染力を持つインフルエンザウイルスの感染を予防するためにワクチンの開発が必要である。

ワクチンとしての組換えタンパク質の抗原は、生産および活用において安全性に優れているが、生きているウイルスを基盤としたワクチンに比べると免疫原性が低く、概ね生産単価が高いのがデメリットである。したがって、この安全性に優れた組換えタンパク質を用いてワクチンとして効能を高めるためには、多様な免疫反応を誘導することができ、高い免疫反応を誘導することができる組換えタンパク質ワクチンの伝達技術を開発することが必須である。また、一種類の抗原だけでなく、複数種類の抗原を同時に伝達することができれば、これはさらに効果的なワクチンになるだろう。実際に最近の傾向は、複数の種類の抗原を一つの注射剤として開発することである。抗原の免疫原性を高めるために最も効果的に活用される方法が強力な補助剤を使うことである。補助剤の効能が高ければ、少量の抗原でも効果的に免疫反応を誘導することができ、これによりワクチンの価格を下げることができるため、強力な補助剤の開発がタンパク質基盤のワクチン開発において非常に重要である。また、補助剤の種類によって異なる免疫反応を誘導できるため、抗原の種類によって適切な補助剤の使用が非常に重要である。現在、水酸化アルミニウムなどの注射用補助剤が開発され人体に使用されており、経口ワクチン用にコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）などが活用されている。家畜などの動物用としては、より多くの種類の補助剤が開発され活用されている。実験用としては、マウスに完全フロイントアジュバント（フロイント完全補助剤）が多く活用されている。しかし、これらがどのように人間と家畜および実験動物において抗原の免疫原性を高めるのか、まだ明確に知られていない。

多様な種類の補助剤が開発されており、ワクチンの伝達方法も多様であるため、このような多様な伝達方法によって異なる種類の補助剤が必要である。最近、バクテリアを経口用ワクチン伝達体および補助剤として活用する研究が多く行われている。特に、ラクトコッカスの場合、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）で「一般的に安全と認められる（ＧＲＡＳ）状態」を確保したバクテリアで人体に安全と考えられ、これを経口補助剤および抗原伝達剤として開発している。バクテリアは、それ自体が非常に抗原性が高いため、バクテリアが伝達する抗原に対して非常に高い免疫反応を示すものと報告された。

ヘマグルチニン（ＨＡ）の全長タンパク質は、膜貫通ドメインを持つ膜結合形態で、細胞から高い水準で生産することは難しい。一方、ＨＡの膜貫通ドメインを除き、エクトドメインだけを発現すれば、これは細胞に可溶性形態で作られ、高い効率で生産できる。しかし、ＨＡのエクトドメインだけを可溶性形態で製造すれば、元の全長ＨＡがインフルエンザウイルスの表面に存在するときに持つ三量体形態がよく作られない。ワクチンの目的で使用するために、ＨＡのエクトドメインの組換えタンパク質を植物から発現および生産する際に三量体を形成するよう誘導する技術を開発しようとした。また、このように生産されたタンパク質をペプチドグリカンに結合する能力を持たせ、ラクトコッカスまたはキトサン粒子などの表面に結合できる遺伝子を結合し、様々な方法で抗原を伝達できるようにＨＡエクトドメイン組換えタンパク質を考案した。このように製造されたＨＡの組換え遺伝子を植物から高発現させるバイナリーベクターを構築した。上記植物から高発現したＨＡ組換えタンパク質をインフルエンザウイルスに感染したマウスに処理した結果、治療効果が確認され、さらに、上記ＨＡ組換えタンパク質抗原および免疫反応を大きく高めるとされるＣＴＢをＧＲＡＳ状態のラクトコッカスを加熱し、トリクロロ酢酸を処理してバクテリアの水溶性タンパク質と核酸を除去した後、上記ラクトコッカス死菌体にコーティングして注射用ワクチンでインフルエンザウイルス感染マウスに処理した結果、治療効果が上昇することを確認した。さらに、水溶性Ｈ５Ｎ６のＨＡ三量体またはラクトコッカス死菌体の表面にコーティングされたＨ５Ｎ６のＨＡ三量体を注射用ワクチンでインフルエンザウイルス感染鶏に処理した結果、高い免疫効果を確認した。ＣＴＢ、可溶性Ｈ５Ｎ６のＨＡ三量体、可溶性Ｈ９Ｎ２のＨＡ三量体をそれぞれラクトコッカス死菌体にコーティングした後、これを混合して免疫組成物を製造し、血球凝集を分析した結果、ＣＴＢを含む群が血球凝集が増加し、ＣＴＢが免疫原性を増加させることを確認した。Ｈ５Ｎ６のＨＡ三量体をコーティングしたラクトコッカスとＨ９Ｎ２のＨＡ三量体をコーティングしたラクトコッカスを１：１の割合で混ぜてワクチン組成物を製造した後、これを用いてマウスに免疫注射した結果、免疫原性が増加することを確認した。Ｈ５Ｎ６のＨＡ三量体とＨ９Ｎ２のＨＡ三量体を１：１で混ぜた後、これをラクトコッカスにコーティングし、これをワクチン組成物として製造してマウスに免疫注射した結果、免疫原性が増加することを確認した。

本発明は、上記の問題を解決するために案出されたもので、本発明の目的は、（ｉ） インフルエンザウイルス由来のＨＡ（ヘマグルチニン）において膜貫通タンパク質部分が欠如したタンパク質をコードする遺伝子；および（ｉｉ） コロニン１の三量体モチーフ部位のタンパク質をコードする遺伝子を含む三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産するための組換えベクターを提供することである。

本発明の別の目的は、前述の組換えベクターにＬｙｓＭドメインのタンパク質をコードする遺伝子が追加挿入された三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産するための組換えベクターを提供することである。

本発明のもう一つの目的は、次の段階を含む植物において三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産する方法を提供することである：
（ａ） 前述の組換えベクターを製造する段階；
（ｂ） 上記組換えベクターを細胞に導入して形質転換体を製造する段階；
（ｃ） 上記形質転換体を培養する段階；および
（ｄ） 上記形質転換体を培養した培養物を植物に浸潤させる段階；および
（ｅ） 上記植物を粉砕して三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を修得する段階。

本発明の別の目的は、前述の方法で生産された三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、前述の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を含む免疫原性が増加したインフルエンザウイルス感染症の予防または治療用ワクチン組成物を提供することである。

本発明の別の目的は、前述の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質がコードされたバクテリアまたはキトサンを含む免疫原性が増加したインフルエンザウイルス感染症の予防または治療用ワクチン組成物を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、前述のワクチン組成物にコレラ毒素Ｂサブユニットが追加で含まれており、免疫原性が増加したインフルエンザウイルス感染症の予防または治療用ワクチン組成物を提供することである。

本発明の別の目的は、前述の三量体を形成する、互いに異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を含む免疫原性が増加した互いに異なる遺伝型インフルエンザウイルス感染症の予防または治療用ワクチン組成物を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、前述の多様な形態のワクチン組成物をこれを必要とする個体に投与することを含む、インフルエンザウイルス感染症の予防または治療方法を提供することである。

上述の課題を解決するために、本発明は、（ｉ） インフルエンザウイルス由来のＨＡで膜貫通タンパク質部分が欠如したタンパク質をコードする遺伝子；および（ｉｉ） コロニン１の三量体モチーフ部位のタンパク質をコードする遺伝子を含む三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡ（ヘマグルチニン）タンパク質を生産するための組換えベクターを提供する。
本発明の望ましい一実施例によれば、上記インフルエンザウイルスは、インフルエンザＡウイルスＨ５Ｎ６、Ｈ７Ｎ９およびＨ９Ｎ２からなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。
本発明の望ましい別の一実施例によれば、上記インフルエンザウイルス由来のＨＡにおいて、膜貫通タンパク質部分が欠如したタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列または配列番号１８のアミノ酸配列を含めることができる。

本発明の望ましいもう一つの一実施例によれば、上記インフルエンザウイルス由来のＨＡにおいて、膜貫通タンパク質部分が欠如したタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１の塩基配列または配列番号１７の塩基配列を含めることができる。
本発明の望ましい別の一実施例によれば、上記コロニン１の三量体モチーフ部位のタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含めることができる。
本発明の望ましいもう一つの一実施例によれば、上記コロニン１の三量体モチーフ部位のタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号３の塩基配列を含めることができる。
本発明の望ましい別の一実施例によれば、前述の組換えベクターにＬｙｓＭドメインのタンパク質をコードする遺伝子が追加挿入されることがある。
本発明の望ましいもう一つの一実施例によれば、上記ＬｙｓＭドメインのタンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列を含めることができる。
本発明の望ましい別の一実施例によれば、上記ＬｙｓＭドメインのタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１３の塩基配列を含めることができる。

本発明の望ましいもう一つの一実施例によれば、上記組換えベクターは、カリフラワーモザイクウイルスから由来した３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスから由来した１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、Ｍａｃプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーターおよびユビキチンタンパク質プロモーターからなる群から選択されるいずれかのプロモーターを追加して含めることができる。

また、本発明は、前述の組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
本発明の望ましい一実施例によれば、上記形質転換体は、原核生物または真核生物であり得る。
さらに、本発明は、次の段階を含む植物において、三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産する方法およびこれから生産された三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を提供する。
ひいては、本発明は、前述の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を含む、免疫原性が増加したインフルエンザウイルス感染症の予防または治療用ワクチン組成物を提供する。

本発明の望ましい一実施例によれば、上記三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質は、細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアまたはキトサンの表面にコーティングされることがある。
本発明の望ましい別の一実施例によれば、上記細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアは、一般的に安全と認められる（ＧＲＡＳ）状態のバクテリアであり得る。
本発明の望ましいもう一つの一実施例によれば、上記ワクチン組成物は、コレラ毒素Ｂサブユニットを追加して含めることができる。

本発明の望ましい別の一実施例によれば、上記ワクチン組成物は、注射剤形態であり得る。
さらに、本発明は、前述の三量体を形成する、異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を含む、免疫原性が増加した異なる遺伝型のインフルエンザウイルス感染症の予防または治療用ワクチン組成物を提供する。

本発明の望ましい一実施例によれば、上記三量体を形成する、異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質は、Ｈ５Ｎ６、Ｈ７Ｎ９およびＨ９Ｎ２からなる群から選択されるいずれかのインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質であり得る。
本発明の望ましい別の一実施例によれば、上記三量体を形成する、異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質は、細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアまたはキトサンの表面にコーティングされることがある。
本発明の望ましいもう一つの一実施例によれば、上記細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアは、一般的に安全と認められる（ＧＲＡＳ）状態のバクテリアであり得る。

本発明の望ましい別の一実施例によれば、上記三量体を形成する、異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質は、次の（ｉ）ないし（ｉｉｉ）のいずれかの方法で細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアまたはキトサンの表面にコーティングされることがある：
（ｉ） 上記三量体を形成する、異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を混合した後、細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアまたはキトサンの表面にコーティングしたり、
（ｉｉ） 上記三量体を形成する、異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質をそれぞれ細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアまたはキトサンの表面にコーティングして混合したり；または
（ｉｉｉ） 上記（ｉ）および（ｉｉ）の２つの方法で異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアまたはキトサンの表面にコーティングする。

本発明の望ましいもう一つの一実施例によれば、上記ワクチン組成物は、コレラ毒素Ｂサブユニットを追加して含めることができる。
さらに、本発明は、前述の多様な形態のワクチン組成物をこれを必要とする個体に投与することを含む、インフルエンザウイルス感染症の予防または治療方法を提供する。

本発明の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質は、高病原性インフルエンザＡウイルスＨ５Ｎ６由来ＨＡで膜貫通タンパク質が欠如したエクトドメイン部分のタンパク質、マウスコロニンＡの三量体モチーフおよびラクトコッカスラクチスのＬｙｓＭペプチドグリカン－結合ドメイン－を含むタンパク質の細胞壁結合ドメインであるＬｙｓＭドメインを含み、植物から大量に製造することができ、三量体を形成して免疫性が増加し、ラクトコッカスなどのバクテリアやキトサンの粒子に結合またはコーティングされ、高課程に抗原を伝達することができる。上記植物から高発現したＨＡ組換えタンパク質をインフルエンザウイルスに感染したマウスに処理した結果、治療効果が現れ、また、上記ＨＡ組換えタンパク質抗原および免疫反応を大きく高めるとされるコレラ毒素Ｂサブユニットを、ＧＲＡＳ状態のラクトコッカスを加熱およびトリクロロ酢酸で処理し、バクテリアの水溶性タンパク質と核酸を除去して製造された死菌体にコーティングして注射用ワクチンでインフルエンザウイルス感染マウスに処理した結果、優れた治療効果を示した。さらに、本発明による可可溶性Ｈ５Ｎ６のＨＡ三量体、可溶性Ｈ９Ｎ２のＨＡ三量体またはこれらをラクトコッカス死菌体の表面にコーティングし、注射用ワクチンでインフルエンザウイルス感染鶏に処理した結果、高い免疫効果を示した。ＣＴＢ（コレラ毒素Ｂサブユニット）、水溶性Ｈ５Ｎ６のＨＡ三量体および水溶性Ｈ９Ｎ２のＨＡ三量体をそれぞれラクトコッカス死菌体にコーティングした後、これを混合して製造された免疫組成物を用いて血球凝集を分析した結果、ＣＴＢを含むグループの血球凝集が増加し、ＣＴＢが免疫原性を増進させる効果があることを確認した。Ｈ５Ｎ６のＨＡ三量体をコーティングしたラクトコッカス死菌体とＨ９Ｎ２のＨＡ三量体をコーティングしたラクトコッカス死菌体を１：１の割合で混合して製造されたワクチン組成物を用いてマウスに免疫注射した結果、免疫原性が増加する効果を示した。Ｈ５Ｎ６のＨＡ三量体とＨ９Ｎ２のＨＡ三量体１：１で混合した後、これをラクトコッカス死菌体にコーティングして製造されたワクチン組成物もマウスで免疫注射した結果、同様に免疫原性が増加する効果を示した。これにより、異なる複数の種類の抗原をラクトコッカス死菌体にそれぞれコーティングした後に混合したり、異なる複数の種類の抗原を同時に混合した後にラクトコッカス死菌体にコーティングしたり、または上記２つの方法を一緒に使用することで、多重の抗原を同時に伝達して免疫原性を効果的に増進させることができる。

図１ａおよび図１ｂは、本発明による三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産するために使用した組換えベクターの構成を模式図で示したものである。 図２ａは、ニコチアナベンタミアナで発現させたタンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離した後、抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った結果を示したものである。図２ｂは、ニコチアナベンタミアナで発現させたタンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離した後、クマシーブリリアントブルーに染色した結果を示したものである。 図３ａおよび図３ｂはゲルろ過カラムクロマトグラフィーを用いてｍＨ５Ｎ６とｔＨ５Ｎ６がそれぞれ単量体および三量体を形成することを確認した結果を示したもので、具体的に、図３ａはゲルろ過カラムクロマトグラフィーによって分画（切片）した結果を示したものであり、図３ｂは各ピークにあたる分画をＳＤＳ／ＰＡＧＥで展開した後、抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った結果を示したものである。図３ｃおよび図３ｄは、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを用いて、ｍＨ９Ｎ２とｔＨ９Ｎ２がそれぞれ単量体および三量体を形成することを確認した結果を示したもので、具体的に、図３ｃはゲルろ過カラムクロマトグラフィーによって分画（切片）した結果を示したものであり、図３ｄは各ピークにあたる分画をＳＤＳ／ＰＡＧＥで展開した後、抗Ｈｉｓ抗体を利用してウェスタンブロット分析を行った結果を示したものである。 図４ａおよび図４ｂは、ＬｙｓＭのラクトコッカスラクチスへの結合において、ｍＣｏｒ１による三量体の効果を確認したもので、具体的に図４ａはＧＦＰ－ＬｙｓＭとＧＦＰ－ｍＣｏｒ－ＬｙｓＭをそれぞれラクトコッカスに結合させた後、これをＳＤＳ／ＰＡＧＥで展開しウェスタンブロット分析およびクマシーブリリアントブルーに染色した結果を示したものであり、図４ｂは蛍光顕微鏡の下でＧＦＰ－ＬｙｓＭおよびＧＦＰ－ｍＣｏｒ－ＬｙｓＭがそれぞれＴＣＡを処理したラクトコッカスに結合する程度を観察した結果を示したものである。 図５は、ニコチアナベンタミアナの葉細胞で製造されたＨ５Ｎ６のＨＡの単量体（ｍＨ５Ｎ６）と三量体（ｔＨ５Ｎ６）をＴＣＡを処理したラクトコッカスに結合させた後、これをＳＤＳ／ＰＡＧＥで展開してクマシーブリリアントブルーに染色した結果を示したものである。 図６ａは、可溶性ｔＨＡおよびラクトコッカスの表面にコーティングされたｔＨＡに対するマウスの免疫原性反応を確認するための投与スケジュールを示したものである。図６ｂは、可溶性ｔＨＡおよびラクトコッカスの表面にコーティングされたｔＨＡに対するマウスの免疫原性反応をＥＬＩＳＡで測定した結果を示したものである。 図７ａおよび図７ｂは、可溶性ｔＨＡおよびラクトコッカスの表面にコーティングされたｔＨＡが血球凝集を阻害する程度を分析した結果を示したものである。 図８ａは、鶏を対象にＰＢＳ、ラクトコッカス菌体、可溶性Ｈ５Ｎ６のＨＡ三量体、ラクトコッカスの表面にコーティングされたＨ５Ｎ６のＨＡ三量体を抗原として抗体誘導実験を行った結果を示したものである。図８ｂは、鶏を対象にＰＢＳ、ラクトコッカス菌体、可溶性Ｈ９Ｎ２のＨＡ三量体、ラクトコッカスの表面にコーティングされたＨ５Ｎ６のＨＡ三量体を抗原として抗体誘導実験を行った結果を示したものである。 図９は、ＣＴＢ（コレラ毒素Ｂサブユニット）、可溶性Ｈ５Ｎ６のＨＡ三量体、可溶性Ｈ９Ｎ２のＨＡ三量体をそれぞれコーティングしたラクトコッカスを混合して免疫原性を確認した結果を示したものである。 図１０は、Ｈ５Ｎ６のＨＡ三量体をコーティングしたラクトコッカスとＨ９Ｎ２のＨＡ三量体をコーティングしたラクトコッカスを１：１の割合で混合して製造されたワクチン組成物を用いてマウスに免疫注射した後、２種類の抗原に対して強力な免疫原性を確認した結果を示したものである。 図１１は、Ｈ５Ｎ６のＨＡ三量体とＨ９Ｎ２のＨＡ三量体を１：１で混合した後、これをラクトコッカスにコーティングして製造されたワクチン組成物をマウスに免疫注射した後、２種類の抗原に対して強力な免疫原性を確認した結果を示したものである。

以下、本発明を詳細に説明する。
上述のように、インフルエンザウイルス由来のＨＡ（ヘマグルチニン）の全長タンパク質は、膜貫通領域を有する膜結合形態で、細胞から高い水準で生産することが難しいという限界がある。このため、生産水準を高めるために、ＨＡの膜貫通領域を除いてエクトドメインのみを発現させ、細胞で可溶性形態にすると、高い効率で生産できるというメリットがある。しかし、ＨＡのエクトドメインのみを可溶性の形態で製造する場合、元の全長ＨＡがインフルエンザウイルスの表面に存在するときに有する三量体形態がよく作られないという限界がある。このため、本発明者らは、免疫原性が増加したワクチンとして使用する目的でＨＡのエクトドメインの組換えタンパク質を植物から発現および生産する際、三量体を形成するよう誘導する技術を開発しようとした。また、このように生産されたタンパク質がペプチドグリカンに結合する能力を持つように、ラクトコッカスまたはキトサン粒子などの表面に結合できる遺伝子と結合して様々な方法で抗原を伝達できるＨＡエクトドメイン組換えタンパク質を開発しようとした。これにより、大量生産できるインフルエンザウイルス由来ＨＡの膜貫通領域を除いたエクトドメインのみを発現するＨＡ、三量体構造を形成するマウスコロニンＡの三量体モチーフおよびラクトコッカスまたはキトサン粒子などの表面に結合して効果的に抗原を伝達するラクトコッカスラクチスのＬｙｓＭペプチドグリカン結合ドメインを含むタンパク質をデザインし、一つのベクターに発現させることにより、三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質および上記タンパク質を植物から大量発現できるバイナリーベクターを構築した。

したがって、本発明の第一の側面は、（ｉ） インフルエンザウイルス由来のＨＡ（ヘマグルチニン）において、膜貫通タンパク質部分が欠如したタンパク質をコードする遺伝子；および（ｉｉ） コロニン１の三量体モチーフ部位のタンパク質をコードする遺伝子を含む、三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡ（ヘマグルチニン）タンパク質を生産するための組換えベクターに関するものである。

本発明の組換えベクターにおいて、上記インフルエンザウイルスは、ヒト、イヌ、豚、馬、家禽類、野生鳥類、オットセイなどに感染する様々な種類のインフルエンザウイルスを制限なく含み、従来知られているインフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型、Ｃ型、イサウイルスまたはトゴトウイルスを含めることができる。

インフルエンザウイルスＡ型は、季節性インフルエンザや汎流行性インフルエンザ伝染病の原因である。野生の水生鳥類は、非常に多様なインフルエンザＡの天然宿主である。時々、ウイルスは、別の種に伝染し、家禽類で破壊的な集団発病を誘発したり、ヒトインフルエンザの汎流行を引き起こすことがある。Ａ型ウイルスは、３つのインフルエンザタイプの中で最も致命的なヒト病原菌で、最も深刻な疾患を誘発する。インフルエンザＡウイルスは、このようなウイルスに対する抗体反応を基盤に、異なる血清型に細分化される。ヒトから確認された血清型は（告知されたヒト汎流行病死亡者数の順に）、次のとおり：Ｈ１Ｎ１（１９１８年スペインインフルエンザの原因）、Ｈ２Ｎ２（１９５７年アジアインフルエンザの原因）、Ｈ３Ｎ２（１９６８年香港インフルエンザの原因）、Ｈ５Ｎ１（２００７－２００８年インフルエンザシーズンの汎流行病の脅威）、Ｈ７Ｎ７（潜在的な汎流行病の脅威）、Ｈ１Ｎ２（ヒトおよび豚における風土病）、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３およびＨ１０Ｎ７。

インフルエンザウイルスＢ型は、季節インフルエンザの原因であり、一種類のインフルエンザＢウイルスを持つ。インフルエンザＢは、ほとんど独占的にヒトに感染し、インフルエンザＡよりは稀である。インフルエンザウイルスＢ型の感染に敏感なことが公示された唯一の動物はオットセイである。このような類型のインフルエンザは、Ａ型より２倍から３倍遅い速度で変異するため、遺伝的に多様ではなく、たった一つのインフルエンザＢ血清型を持つ。このような抗原多様性の不足の結果として、インフルエンザＢに対するある程度の免疫力は通常幼い年齢で獲得されるが、インフルエンザＢは持続的な免疫が不可能なほど十分変異する。
インフルエンザウイルスＣ型は、ヒトや豚に感染し、深刻な病気や局所伝染病を誘発することもあるが、他の類型より稀で、通常、児童から軽い疾患を誘発するものと考えられる。

本発明においてインフルエンザＡウイルスは、例えば、Ｈ５Ｎ６、Ｈ７Ｎ９およびＨ９Ｎ２からなる群から選択されるいずれかであり得るが、これに限らない。

本発明の具体的な一実施例では、インフルエンザＡウイルスＨ５Ｎ６およびＨ９Ｎ２由来のＨＡタンパク質を用いて三量体を形成する組換えＨＡタンパク質を製造した。具体的には、ＨＡの生産性を高めるために、Ｈ５Ｎ６またはＨ９Ｎ２のＨＡから膜貫通領域を除き、エクトドメインのみをコードするアミノ酸配列、すなわちＨ５Ｎ６のＨＡ（ゲンバンク：ＡＪＤ０９９５０．１）の１７番目ないし５３１番目の位置のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列およびＨ９Ｎ２のＨＡ（ゲンバンク：ＡＦＭ４７１４７．１）の１９番目ないし５２４番目の位置のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をそれぞれ選択して使用した。本発明に伴う組換えベクターは、三量体を形成する組換えＨＡタンパク質を製造するために、Ｈ５Ｎ６のＨＡ（ゲンバンク：ＡＪＤ０９９５０．１）の１７番目から５３１番目の位置までのアミノ酸残基からなる領域の多様なアミノ酸配列を選択して使用することができ、同様にＨ９Ｎ２のＨＡ（ゲンバンク：ＡＦＭ４７１４７．１）の１９番目から５２４番目の位置までのアミノ酸残基からなる領域の多様なアミノ酸配列を選択して使用することができる。

本発明の組換えベクターにおいて、上記インフルエンザウイルス由来のＨＡ（ヘマグルチニン）において膜通過タンパク質部分が欠如したタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号１８のアミノ酸配列を含めることができるが、これに限らない。

上記インフルエンザウイルス由来のＨＡにおいて、膜貫通タンパク質部分が欠如したタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１の塩基配列または配列番号１７の塩基配列を含めることができ、具体的には、上記遺伝子は配列番号１の塩基配列または配列番号１７の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含めることができる。

ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、二つの最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、二つの配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわち、ギャップ）を含めることができる。

本発明の組換えベクターにおいて、上記コロニン１はマウス由来のコロニン１（ｍＣｏｒ １） （ゲンバンク：ＥＤＬ１７４１９．１）であり得、その三量体モチーフ部位のタンパク質は配列番号４のアミノ酸配列を含めることができる。本発明の組換えベクターにおいて、上記コロニン１（ｍＣｏｒ １）はインフルエンザウイルス由来ＨＡのエクトドメインのＣ末端につながり、ＨＡのエクトドメインだけを発現させても三量体を形成できるようにする。

上記コロニン１（ｍＣｏｒ １）の三量体モチーフ部位のタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号３の塩基配列を含めることができ、具体的に上記遺伝子は配列番号３の塩基配列と７０％以上、より望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含めることができる。

本発明の組換えベクターは、ＬｙｓＭドメインのタンパク質をコードする遺伝子を追加して含めることができる。
本発明の組換えベクターにおいて、上記ＬｙｓＭドメインのタンパク質は配列番号１４のアミノ酸配列を含めることができ、上記ＬｙｓＭドメインのタンパク質をコードする遺伝子は配列番号１３の塩基配列を含めることができ、具体的に上記遺伝子は配列番号１３の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含めることができる。

本発明によるインフルエンザウイルス由来のＨＡにおいて膜貫通タンパク質部分が欠如したタンパク質およびコロニン１（ｍＣｏｒ １）の三量体モチーフ部位のタンパク質を含む組換えＨＡタンパク質に多様な免疫効果を促進し、抗原の効果的な伝達のために、ラクトコッカスのようなバクテリアやキトサン粒子に結合できる、ラクトコッカスラクチスのＬｙｓＭペプチドグリカン－結合ドメインを含むタンパク質の細胞壁結合ドメインであるＬｙｓＭドメイン（ゲンバンク：ＷＰ＿０１１８３４３５３）の２２０番目から３２０番目までのアミノ酸残基（計１０１個のアミノ酸残基）を６個のアミノ酸残基を有するリンカーを用いてコロニン１（ｍＣｏｒ１）の三量体モチーフのＣ末端に融合した。続いて、組換えタンパク質の分離精製のために６つのＨｉｓ残基を有するＨｉｓタグを融合し、ＥＲ蓄積のためにＨＤＥＬモチーフを融合して構造体ｔＨＡを完成させた（図１ａ）。対照群としてｍＣｏｒ１の三量体モチーフのない構造体ｍＨＡを構築して比較した（図１ｂ）。

このように構築されたＨＡの組換え遺伝子を植物体発現ベクターであるｐＴＥＸ１に導入し、植物発現ベクター（それぞれｐＴＥＸ－ｔＨＡおよびｐＴＥＸ－ｍＨＡ）を製造した。その後製造された発現ベクターをアグロバクテリウムに導入した後、植物体に浸潤させて一過性発現を誘導した。発現した組換えＨＡタンパク質は、Ｈｉｓタグを用いたＮｉ^２＋－ＮＴＡ親和カラムで分離するか、ＬｙｓＭドメインを用いてラクトコッカスとの結合を通じて分離することができる。

これらの遺伝子を導入したニコチアナベンタミアナの葉抽出物におけるタンパク質の発現を確認するために、抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。図２ａに示すようにＨＡ－ＬｙｓＭ－Ｈｉｓ－ＨＤＥＬは、約８０ｋＤａの位置でタンパク質が確認された。これは、計算上のタンパク質の位置より大きいもので、ＨＡタンパク質のＮ－グリコシル化（Ｎ－糖化）のためと考えられる。また、ｔＨＡは、ｍＨＡより若干大きいものを図２ｂで確認できる。

続いて、上記タンパク質の三量体の形成を確認するために、単量体形態であるｍＨＡと三量体形態であるｔＨＡを混合してゲルろ過を行った。その結果、図３ａで確認されるように二つのピークが現れ、これら各ピークに該当する分画（切片）を抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロットを行った結果、図３ｂに示すように、三量体に該当するピークのタンパク質はｔＨＡと確認され、単量体に該当するピークではｍＨＡタンパク質が確認された。

本発明の具体的な一実施例では、上記組換えタンパク質のＬｙｓＭのラクトコッカスへの結合を確認するために、対照群タンパク質としてＧＦＰを用いてＨｉｓタグされたＧＦＰ－ｍＣｏｒ１－ＬｙｓＭ（ＧＦＰ－ｍＣｏｒ１－ＬｙｓＭ）構造体とＨｉｓタグされたＧＦＰ－ＬｙｓＭ（ＧＦＰ－ＬｙｓＭ）構造体を製造し、これを大腸菌の発現ベクターであるｐＲＳＥＴ－Ａに導入し、大腸菌で発現できる発現ベクターを構築した。上記タンパク質ＧＦＰ－ｍＣｏｒ１－ＬｙｓＭとＧＦＰ－ＬｙｓＭを大腸菌で発現させ、分離および精製してラクトコッカスに結合する程度を蛍光顕微鏡下で観察した。その結果、図４に示すようにＧＦＰ－ｍＣｏｒ１－ＬｙｓＭがＧＦＰ－ＬｙｓＭよりＧＦＰ発現が高いことが確認された。

本発明の具体的な他の一実施例では、ＬｙｓＭによるＨＡのラクトコッカス表面結合において、ｍＣｏｒ１による三量体化効果を確認した。このために、単量体形態のｍＨＡ（ｍＨ５Ｎ６）と三量体形態のｔＨＡ（ｔＨ５Ｎ６）を発現するニコチアナベンタミアナの葉組織を粉砕して総抽出物を修得し、これをＴＣＡで処理したラクトコッカスと混合して結合を誘導した後、これからラクトコッカスをペレット化して回収した後、ＳＤＳ／ＰＡＧＥで展開し、クマシーブリリアントブルーに染色した。その結果、図５で確認されるようにｔＨＡ（ｔＨ５Ｎ６）は三量体構造のＨＡを形成する反面、ｍＨＡ（ｍＨ５Ｎ６）は三量体構造のＨＡを形成せず、三量体構造を形成したｔＨＡ（ｔＨ５Ｎ６）はＨＡの量が増加するに伴い、ラクトコッカスに結合する量が増加した反面、ｍＨＡはラクトコッカスにほとんど結合しなかった。

本発明の組換えベクターはカリフラワーモザイクウイルスから由来した３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスから由来した１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、Ｍａｃプロモーター、植物のエクチンタンパク質プロモーターおよびユビキチンタンパク質プロモーターからなる群から選択されるいずれかのプロモーターを追加して含めることができ、望ましくはＭａｃプロモーターを含めることができ、より望ましくはＭａｃＴプロモーターを含めることができるが、これに限定されない。

上記ＭａｃＴプロモーターは、Ｍａｃプロモーター塩基配列の３’末端塩基であるＡをＴに置き換えたプロモーターであり得、上記ＭａｃＴプロモーターは配列番号１５の塩基配列を含めることができ、具体的に上記遺伝子は配列番号１５の塩基配列と７０％以上、より望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含めることができる。

本発明の組換えベクターは、ＲＤ２９Ｂ－ｔ終結部位を追加して含めることができ、上記ＲＤ２９Ｂ－ｔ終結部位の遺伝子は配列番号１６の塩基配列を含めることができ、具体的に上記遺伝子は配列番号１６の塩基配列と７０％以上、より望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上、最も望ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含めることができる。

本発明の組換えベクターにおいて、組換えタンパク質をコードする遺伝子のＮおよびＣ末端にそれぞれＢｉＰ（シャペロン結合タンパク質）のシグナル配列と小胞体保留シグナル（ＥＲ保留配列）であるＨＤＥＬを挿入することにより、ＥＲ（小胞体）に高濃度に蓄積を誘導する効果がある。したがって、本発明の組換えベクターは、ＢｉＰをコードする遺伝子および／またはＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）ペプチドをコードする遺伝子を追加して含めることができ、上記ＢｉＰをコードする遺伝子は配列番号９の塩基配列を含めることができ、ＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）は配列番号１０の塩基配列を含めることができる。

本発明において用語「組換え」とは、細胞が異種の核酸を複製し、または上記核酸を発現し、もしくはペプチド、異種のペプチドまたは異種の核酸によって暗号化されたタンパク質を発現する細胞を指すものである。組換え細胞は、上記細胞の天然形態では発見されない遺伝子または遺伝子の切片をセンスまたはアンチセンス形態のどちらかで発現し得る。また、組換え細胞は、天然状態の細胞から発見される遺伝子を発現し得る。しかし、上記遺伝子は、変形したもので、人為的な手段によって細胞内に再導入されたものである。

用語「組換え発現ベクター」とは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルスまたは他のベクターを意味する。概ね、任意のプラスミドおよびベクターは、宿主内で複製および安定化させることができれば使用できる。上記発現ベクターの重要な特性は、複製原点、プロモーター、マーカー遺伝子および翻訳制御要素を有することである。上記組換え発現ベクターおよび適当な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターは、当業者に周知された方法により構築され得る。上記方法は、試験管内組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術および生体内組換え技術などを含む。

本発明の組換えベクターの望ましい例は、適当な宿主に存在するとき、それ自体の一部、いわゆるＴ領域を植物細胞に転移させることができるＴｉプラスミドベクターである。他のタイプのＴｉプラスミドベクターは現在、植物細胞、または雑種ＤＮＡを植物のゲノム内に適当に挿入させる新しい植物が生産され得る原形質体で、雑種ＤＮＡ配列を転移させるのに利用されている。Ｔｉプラスミドベクターの特に望ましい形態は、ＥＰ ０ １２０ ５１６ Ｂ１号および米国特許第４，９４０，８３８号に請求されたようないわゆるバイナリーベクターである。本発明においてデザインされた三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質をコードする構造体を植物宿主に導入するのに利用できる他の適合するベクターは、二本鎖植物ウイルス（例えば、ＣａＭＶ）および一本鎖ウイルス、ジェミニウイルスなどに由来し得るようなウイルスベクター、例えば不完全性植物ウイルスベクターから選択され得る。そのようなベクターの使用は、特に植物宿主を適当に形質転換することが困難なときに有利である。

本発明の第二の側面は、前述の組換えベクターで形質転換された形質転換体に関するものである。
本発明の形質転換体は、原核生物または真核生物であり得、その例として酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）、大腸菌などのカビ、昆虫細胞、ヒト細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株（チャイニーズハムスターの卵巣）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮおよびＭＤＣＫ細胞株）および植物細胞などが利用され得、望ましくはアグロバクテリウムになり得る。昆虫細胞、ヒト細胞などの場合、三量体を形成する組換えＨＡタンパク質をコードする遺伝子を各種類の細胞の発現に必要な発現ベクターを用いて発現することができる。

本発明の組換えベクターを宿主細胞内に運搬する方法は、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２法、ハナハン法および電気穿孔法などにより実施されることができる。また、宿主細胞が真核細胞である場合、微細注入法、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔法、リポソーム媒介形質感染法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、および遺伝子バームバードメントなどによりベクターを宿主細胞内に注入することができる。

本発明の第三の側面は、次の段階を含む、植物において三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産する方法に関するものである：
（ａ） 前述の組換えベクターを製造する段階；
（ｂ） 上記組換えベクターを細胞に導入して形質転換体を製造する段階；
（ｃ） 上記形質転換体を培養する段階；
（ｄ） 上記形質転換体を培養した培養物を植物に浸潤させる段階；および
（ｅ） 上記植物を粉砕して三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡ（ヘマグルチニン）タンパク質を修得する段階。
本発明の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産する方法において、上記（ａ）および（ｂ）は前述のとおり同じであるでため、その記載を省略する。
本発明の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産する方法において、上記（ｃ）段階は、本発明の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産するために、当業界に告知された任意の方法を適切に選択して利用することができる。
本発明の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産する方法において、上記（ｄ）段階は、例えば、化学セル法、真空または注射器浸潤法を用いて形質転換体を培養した培養物を植物に浸潤させる方式で行うことができ、望ましくは注射器湿潤法で湿潤させることができるが、これに限られるわけではない。

本発明の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産する方法において、上記（ｄ）段階の植物は、稲、小麦、麦、トウモロコシ、豆、ジャガイモ、小麦、小豆、エンバク、モロコシを含む食糧作物類；シロイヌナズナ、白菜、大根、唐辛子、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、ネギ、タマネギ、ニンジンを含む野菜作物類；高麗人参、タバコ、綿花、ゴマ、サトウキビ、テンサイ、エゴマ、ピーナッツ、アブラナを含む特用作物類；リンゴ、ナシ、ナツメ、桃、ブドウ、みかん、柿、スモモ、アンズ、バナナを含む果樹類；バラ、カーネーション、菊、ユリ、チューリップを含む花卉類から選択され得る。

本発明の第四の側面は、前述の生産方法で生産された三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質およびこれを含む免疫原性が増加したインフルエンザウイルス感染症の予防、改善または治療用ワクチン組成物に関するものである。

本発明のワクチン組成物において、上記三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質は、細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアまたはキトサンの表面にコーティングされ得る。上記細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアは、一般的に安全と認められる（ＧＲＡＳ）状態のバクテリアであり得る。例えば、ラクトコッカス、ラクトバチルス、ストレプトコッカスなどがあるが、これに限らない。
本発明の具体的な一実施例では、ラクトコッカスラクチスの表面に一つまたは異なる２種以上の組換えＨＡタンパク質を様々な方法でコーティングすることで抗原を効果的に伝えようとした。

このために、本発明の三量体を形成する、異なる２つ以上の種類のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質は、次の（ｉ）ないし（ｉｉｉ）のいずれかの方法で細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアまたはキトサンの表面にコーティングされ得る：
（ｉ） 上記三量体を形成する、異なる２つ以上の種類のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を混合した後、細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアまたはキトサンの表面にコーティングしたり、
（ｉｉ） 上記三量体を形成する、異なる２つ以上の種類のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質をそれぞれ細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアまたはキトサンの表面にコーティングして混合したり；または
（ｉｉｉ） 上記（ｉ）および（ｉｉ）の２つの方法で異なる２つ以上の種類のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアまたはキトサンの表面にコーティングする。
例えば、本発明のワクチン組成物は三量体を形成する、異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質をラクトコッカスにそれぞれ個別にコーティングした後、それぞれ異なるＨＡ組換えタンパク質がコーティングされたラクトコッカスを同じ割合で混合したり（例えば、２種の異なるＨＡ組換えタンパク質がコーティングされたラクトコッカスを混合する場合、１：１で混合されることがあるる）、任意の適切な割合で混合して一つの単一ワクチン組成物として製造することができる。また、異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を同じ割合または任意の適切な割合で混合した後、ラクトコッカスの表面にコーティングして一つの単一ワクチン組成物として製造できる。これにより、２種以上の抗原を同時に効果的に伝達できる単一ワクチン組成物を製造することが可能である。また、異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質をコーティングしたラクトコッカス死菌体に、さらに異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質をコーティングしたラクトコッカス死菌体を追加混合し、多重の抗原を伝達するワクチン組成物を製造することができる。

したがって、本発明のワクチン組成物に含まれる異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質は、従来知られているインフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型、Ｃ型、イサウイルスおよびトゴトウイルスからなる群から選択される１種または２種以上から由来するものであり得る。上記インフルエンザＡウイルスは、例えば、Ｈ５Ｎ６、Ｈ７Ｎ９およびＨ９Ｎ２からなる群から選択されるいずれか一つ以上または二つ以上であり得るが、これに限らない。

本発明のワクチン組成物は、コレラ毒素Ｂサブユニットを追加して含めることができる。これにより、本発明の組換えＨＡタンパク質の免疫原性を増加させ、より効果的に免疫反応を誘導することができる。
本発明のワクチン組成物は、注射剤形態であり得るが、これに限らない。

本発明のワクチン組成物において、インフルエンザウイルス感染症は、インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型またはＣ型感染による急性呼吸器疾患またはこれによる臨床症状および合併症を含む。インフルエンザウイルス感染による急性呼吸器疾患による臨床症状は、例えば、高熱（約３８～４０℃）、乾いた咳、喉の痛みなどの呼吸器症状および頭痛、筋肉痛、疲労感、衰弱感、食欲不振といった全身症状がある。最もよくある合併症は、２次呼吸器疾患で、副鼻腔炎および中耳炎などの上部呼吸器感染症であり、その他にも脳炎、脊髄炎、ギラン・バレー症候群などの神経系合併症、横断性脊髄炎、心筋炎、筋炎および気胸などがある。
本発明における用語「予防」、「改善」および／または「治療」は、疾病または病症の発症を抑制または遅延させるすべての行為、疾病または病症状態を好転または利するように変更するすべての行為、および疾病または病症の進行を遅延、中断または逆転させるすべての行為を意味する。

本発明のワクチン組成物は、抗原、薬剤学的許容可能な担体、適切な補助剤、その他通常の物質で構成され得、免疫学的効果量で投与する。本発明における用語、「免疫学的効果量」とは、免疫反応を誘導できる程度の十分な量であるが、副作用や深刻または過度な免疫反応を起こさない程度の量を意味し、正確な投与濃度は投与される特定の免疫原によって異なり、免疫反応の発生を検査するために当業者が公知の方法を用いて決定することができる。また、投与形態および経路、受容者の年齢、健康および体重、症状の特性および程度、現在の治療法の種類および治療回数によって変化することがある。

担体は、当分野における公知のもので、安定化剤、希釈剤、緩衝液を含めることができる。適切な安定化剤はソルビトール、ラクトース、マンニトール、デンプン、糖、デキストランおよびブドウ糖などの炭水化物；アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質などを含めることができる。適切な希釈剤には、塩、ハンクス平衡塩、点滴液などを含む。適切な緩衝液には、アルカリ金属リン酸塩、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ土類金属炭酸塩などを含む。また、本発明のワクチン組成物は、追加で溶媒、アジュバント（補助剤）および賦形剤からなる群から選択された１種以上をさらに含めることができる。上記溶媒には、生理食塩水または蒸留水があり、免疫増強剤にはフロイント不完全または完全アジュバント、水酸化アルミニウムゲルと植物性および鉱物性オイルなどがあり、賦形剤にはリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたは硫酸アルミニウムカリウムがあるが、これに限られるものではなく、当該分野の通常の知識を持つ者が技術者によく知られたワクチンの製造に使用される物質をさらに含めることができる。

本発明のワクチン組成物は、公知の投与経路を通じて投与される。このような方法には、経口、経皮、筋肉、腹膜、静脈、皮下、鼻腔経路を利用できるが、これに限らず、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与され得る。

本発明のワクチン組成物は、体液性または選択的に細胞－媒介性免疫反応および／または上記２つの免疫反応の組み合わせを誘導することができる。
本発明の第五の側面は、前述の様々な形態のワクチン組成物を必要とする個体に投与する段階を含むインフルエンザウイルス感染症の予防、改善または治療方法に関するものである。

本発明のインフルエンザウイルス感染症の予防、改善または治療方法において、「個体」とは、インフルエンザウイルスに既に感染しているか、感染しうるヒトを含むすべての動物を意味する。例えば、ヒト、犬、猫、豚、馬、鶏、アヒル、ガチョウ、七面鳥、オットセイなどを含むが、これに限らない。本発明のワクチン組成物を必要とする個体に投与することにより、インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型またはＣ型感染による急性呼吸器疾患またはこれによる臨床症状および合併症を効果的に予防または治療することができる。例えば、本発明のワクチン組成物で多様なインフルエンザウイルス亜型または変異型インフルエンザウイルスに感染したヒトを治療することができる。また、本発明の組成物で多様なインフルエンザウイルス亜型または変異型の鳥インフルエンザに感染した鶏または豚を治療することができる。本発明の組成物は、従来のインフルエンザウイルス感染症治療剤および／またはコレラ毒素Ｂサブユニットと併用投与することができる。

用語「併用投与」は、本発明のワクチン組成物が従来のインフルエンザウイルス感染症治療剤および／またはコレラ毒素Ｂサブユニットと共にこれを必要とする個体に投与されることを意味する。それぞれの成分が一緒に投与されるということは、望む効果を得るために、各成分を同時に、別にまたは順次投与されることを意味する。

本発明のインフルエンザウイルス感染症の予防、改善または治療方法において、上記ワクチン組成物は、経口、非経口、吸入スプレーにより、局所的に、直腸、鼻腔、頬側、膣または移植された貯蔵所を通じて投与され得る。本出願書に使用された用語「非経口」は、非制限的に、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、脊髄腔内、肝臓内、病変内および頭蓋内注射が含まれる。特に、上記組成物は、経口、腹腔内または静脈内に投与され得る。

本発明のインフルエンザウイルス感染症の予防、改善または治療方法において、上記ワクチン組成物の投与は２回以上実施することが望ましい。例えば、１次予防接種後に追加接種を１－１０週間隔で１－４回程度実施することができるが、これは当該動物の種類によって当業者が適切に変形して実施することができる。

本発明の第六の側面は、インフルエンザウイルス感染症の予防、改善または治療のための薬剤の製造時、本発明の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質の用途に関するものである。

以下、本発明の理解を助けるために望ましい実施例を示す。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、下記の実施例により本発明の内容が限られるわけではない。

三量体を形成するインフルエンザウイルス表面タンパク質由来血球凝集素（ＨＡ）組換え遺伝子の設計
Ｈ５Ｎ６またはＨ９Ｎ２のＨＡをＥＲルーメンに可溶性形態で発現させるために、膜貫通ドメインとＥＲ標的化先導配列がないＨ５Ｎ６のＨＡ（ゲンバンク：ＡＪＤ０９９５０．１）のアミノ酸位置１７－５３１）およびＨ９Ｎ２のＨＡ（ゲンバンク：ＡＦＭ４７１４７．１）のアミノ酸位置１９－５２４）を確保した。上記ＨＡの５’末端にシロイヌナズナタンパク質であるＢｉＰから確保したＥＲ標的化シグナルを融合してＥＲ標的化するようにした。また、ラクトコッカスラクチスのＡｃｍＡからラクトコッカス結合ドメインであるＬｙｓＭの３反復配列のうち、１番目の反復配列をＨＡのＣ末端にリンカーを用いて融合させた。そして、Ｈｉｓｘ６タグおよびＥＲ保留モチーフであるＨＤＥＬをＨＡの精製およびＥＲでの高蓄積のために、ＬｙｓＭのＣ末端に順次融合してｍＨＡを構築した（図１ａ）。このように作られたＨＡ組換えタンパク質の三量体の形成を誘導するために、追加的にマウスｍコロニン１というタンパク質から同種の三量体の形成を誘導するモチーフをＨＡとＬｙｓＭの間に添加してｔＨＡを構築した（図１ｂ）。発現のためにｍａｃＴを使用し、Ｒｄ２９ｂの末端をターミネーターとして使用した。これらは、高い転写効率を示すことが確認された。実験に使用される塩基配列は、下記表１のとおりである。

三量体を形成するインフルエンザウイルス表面タンパク質由来血球凝集素（ＨＡ）組換え遺伝子の発現および確認
ｍＨＡとｔＨＡを真空浸潤法を用いて４－５週齢のタバコ植物ニコチアナベンタミアナ植物の葉から一過性発現を通じて発現を誘導した。 浸潤した葉を浸潤後３日、５日および７日（ｄｐｉ）にそれぞれ収穫し、液体窒素で完全に粉砕し、３容積の緩衝液に溶解させた。浸潤した葉抽出物からの総可溶性タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで展開した後、ウェスタンブロット分析を行った。図２ａで確認されるようにＨＡ組換えタンパク質は、抗Ｈｉｓ抗体によって予測された大きさに相応する位置であるおおよそ８５ｋＤａ（ｍＨ５Ｎ６）および９０ｋＤａ（ｔＨ５Ｎ６）の地点に鮮明にバンドを示した。また、図２ｂで確認されるように、同じメンブレンをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）に染色してバンドを確認した際も同様に観察された。これらの組換えタンパク質の発現水準をバンド強度から判断すると、浸潤した葉から１００μｇ／ｇ生重量程度と推定された。

三量体を形成するインフルエンザウイルス表面タンパク質由来血球凝集素（ＨＡ）組換え遺伝子の三量体構造形成を確認
ウイルス表面上のＨＡタンパク質は、同種の三量体として存在し、高い安定性および免疫原性を示す。一方、組換えＨＡは、発現システムによって凝集体または単量体として発現する傾向がある。ウイルスの表面に存在するようにＨＡの三量体を模倣するために、コイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ）構造をなし、同種の三量体を形成するモチーフであるマウスコロニン１－１Ａ（ｍＣｏｒ１、ゲンバンク：ＥＤＬ１７４１９．１ ３２個のアミノ酸）を図１ｂのようにＨＡのＣ末端に添加した。これら遺伝子をニコチアナベンタミアナに導入して発現を誘導し、それぞれ５ｄｐｉ葉組織からの総可溶性タンパク質を確保し、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡ親和性カラムクロマトグラフィーで精製した。分離精製されたｍＨＡとｔＨＡをＢＳＡ標準曲線に基づいて定量化した。ｍＣｏｒ１によってＨＡが三量体を形成するか確認するために、約１０μｇのｍＨＡおよび１０μｇのｔＨＡにＰＢＳを追加して全体の容積が１ｍＬになるよう混合し、これをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した。図３ａおよび図３ｃで確認されるように、ｍＨＡおよびｔＨＡ混合物は、２８０ｎｍ吸収スペクトルにおいて２つのピークを示した。これら２つのピークを含む分画を抗His抗体を用いてウェスタンブロッティングで分析し、その結果をそれぞれ図３ｂおよび図３ｄに示した。図３ａおよび図３ｃのＳＥＣ分析結果と図３ｂおよび図３ｄのウェスタンブロッティングの結果に示されたように、ｍＣｏｒ１を含むｔＨＡ（すなわち、ｔＨ５Ｎ６およびｔＨ９Ｎ２）は、ｍＣｏｒ１がないｍＨＡ（すなわち、ｍＨ５Ｎ６およびｍＨ９Ｎ２）より前に溶出した。これによりｍＣｏｒ１がＨＡの三量体の形成を誘導することが確認できた。

三量体を形成するインフルエンザウイルス表面タンパク質由来血球凝集素（ＨＡ）組換え遺伝子のペプチドグリカンの結合能力を確認
ラクトコッカスラクチスのファージであるＭＧ１３６３の主要自己分解酵素であるＡｃｍＡは、Ｃ末端にＬｙｓＭと呼ばれるドメインが第三反復で現れ、このＬｙｓＭの第三反復部分がラクトコッカスの細胞壁成分であるペプチドグリカンに結合する能力を持っている。ペプチドグリカンに対する最適な活性化のためには、３つの反復が必要である。しかし、３つの反復区間を含む場合、ドメインの長さが長すぎるため、１つのＬｙｓＭだけをＧＦＰのＣ末端に融合して確認した。その結果、図４ａおよび４ｂで確認されるように、ＧＦＰ－ＬｙｓＭはラクトコッカスによく結合しなかった。ここにＨＡの三量体を形成するために使用したマウスコロニン１Ａ（ｍＣｏｒ－１Ａ）の三量体形成モチーフを追加してＧＦＰ－ｍＣＯｒ１－ＬｙｓＭを構築し、ＨＡにおける三量体のような三量体を形成するよう誘導した後、ラクトコッカスに結合するか確認した。その結果、図４ａおよび４ｂに示すように、ＧＦＰ－ＬｙｓＭに比べて著しく増加したＧＦＰシグナルをラクトコッカスで確認することができた。これにより、ｍＣｏｒ１Ａの三量体形成モチーフがＧＦＰの三量体の形成を誘導し、このように形成されたＧＦＰ三量体は、ＬｙｓＭモチーフ３つを持つことになるため、これによりＧＦＰがラクトコッカスによく結合すると解釈できた。このような結果は、ｔＨＡがラクトコッカスによく結合することを提示するものと判断される。

三量体を形成するインフルエンザウイルス表面タンパク質由来血球凝集素（ＨＡ）組換え遺伝子の最大結合量を確認
ＨＡの組換えタンパク質であるｍＨＡとｔＨＡ共にニコチアナベンタミアナで高く発現した。浸潤した葉を液体窒素で完全に粉砕し、０．５％トリトンＸ－１００、１ ｍＭ ＥＤＴＡおよび２５％グリセロールを含有する１０倍容積ＰＢＳバッファーに溶解させた。葉から総可溶性タンパク質を確保し、葉の２００ｍｇから２ｇに該当する総可溶性タンパク質の量を３７℃で１時間ＴＣＡ前処理したラクトコッカスラクチス（Ｌ． ｌａｃｔｉｃｓ）と共にインキュベーションした後、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。それぞれの試料からラクトコッカスを沈殿し、これをＳＤＳバッファーに入れて加熱した後、多様な量のＢＳＡと共にＳＤＳ－ＰＡＧＥで展開した後、クマシーブリリアントブルーに染色してＨＡを確認した。その結果、図５で確認されるように、三量体モチーフであるｍＣｏｒ１を持つｔＨＡは、ＨＡの量が増加するにつれラクトコッカスラクチスに結合する量が増加した反面、ｍＨＡはラクトコッカスにほとんど結合しなかった。三量体であるｔＨＡの最大結合量は、約１．７μｇ／１ ｍｌのラクトコッカスラクチス（ＯＤ ＝ １）と推定された（図５）。

ラクトコッカス死菌体の製造および三量体を形成するインフルエンザウイルス表面タンパク質由来血球凝集素（ＨＡ）組換えタンパク質を上記死菌体にコーティングする方法
ラクトコッカス（韓国微生物保存センター； ＫＣＣＭ Ｎｏ． ４３１４６）をＯＤ６００から１．０まで培養した後、培養液を遠心分離で細胞をペレット化して回収した後、これを同じ容積の１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で再懸濁して１００℃で１０分間処理した。ＴＣＡを除去するために、細胞を遠心分離でペレット化した後、これをＰＢＳで３回洗浄し、ペレットを再懸濁してラクトコッカス死菌体を製造した。緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ ＝ ７．５、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、カクテルおよび２５％グリセロール）を用いて作った総可溶性タンパク質抽出液の多様な量を添加し、１時間３７℃で培養した。１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離してラクトコッカス死菌体をペレット化し、これをタンパク質抽出液用ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。

マウスを用いた三量体を形成する抗原の免疫原性を確認
実施例２および実施例６において、それぞれ製造された組換えｔＨ５Ｎ６、ラクトコッカス死菌体にコーティングしたｔＨ５Ｎ６、ｔＨ９Ｎ２およびラクトコッカス死菌体にコーティングしたｔＨ９Ｎ２ワクチンを６週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス雌（オリエントバイオ、韓国）に２週間隔で２回にわたって腹腔内注射をした。対照群としては、ＰＢＳとラクトコッカス死菌体を投与した。下記表２のような組成でアジュバントを混合、または混合せず、上記組換えワクチンを添加して試験ワクチンを製造した。

上記投与された試験ワクチンによって誘導された体液性免疫反応を分析するために、免疫前である０週目の２次ワクチン投与後、２週目である４週目にマウスの血清に分離して抗原特異的な抗体の形成をＥＬＩＳＡ法で分析して抗体価を決めた。全体のＩｇＧ抗体価は、次の方法で確認した。

具体的には、精製された上記組換え抗原を９６ウェルマイクロプレートに５０ｎｇ／ウェルの濃度でコーティングした後、非特異的結合を防ぐために、３％のスキムミルクを含むＰＢＳＴバッファー（ＮａＣｌ １３７ｍＭ， ＫＣｌ ２．７ｍＭ， Ｎａ２ＨＰＯ４ １０ｍＭ， ＫＨ２ＰＯ４ １．８ｍＭ， Ｔｗｅｅｎ ２０ １％）２００μｌを添加して２時間反応させた。上記マイクロプレートを洗浄し、各ウェルに順次３％スキムミルクを含むＰＢＳＴ溶液で希釈した血清を入れ、室温で１時間マイクロプレートシェーカーの上で反応させた。続いて、２００μｌ ＰＢＳＴバッファーで３回洗浄した後、２次抗体として抗マウスＩｇＧＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＫＰＬ、米国、Ｂｅｔｈｙｌ．）を入れ、２時間同じ条件で反応させた。上記反応させたマイクロプレートを洗浄し、発色試薬ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）とフェロキシダーゼ基質（ＫＰＬ、米国）を添加し、１０分間常温で反応させた後、０．１８Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４静止溶液を用いて発色反応を止め、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍでＯＤを測定した。抗体価は、陰性対照群ＯＤ値の２倍にあたるＯＤ値を示す抗体希釈倍数の逆数に定義した。その結果、図６ｂで確認されるように、補助剤なしでラクトコッカスの表面にコーティングされたｔＨＡがアジュバントを含むものと同じ抗体誘導効果を示した。これによってラクトコッカスにコーティングされた抗原は、アジュバントなしで強力に免疫を誘導することができ、ラクトコッカス死菌体は腹腔内および筋肉内投与において強力な補助剤になることを暗示し、これは予防接種の費用効率性が適用され得る。

インフルエンザウイルス表面タンパク質由来血球凝集素（ＨＡ）組換えタンパク質がラクトコッカスの表面にコーティングされた形態と水溶性三量体の血球凝集における阻害程度の比較分析
ＰＢＳを対照群として使用し、ｔＨ９Ｎ２（Ｈ９Ｎ２のＨＡ三量体）、ｔＨ５Ｎ６（Ｈ５Ｎ６のＨＡ三量体）、ラクトコッカス死菌体、Ｌａｃｔ．－ｔＨ９Ｎ２（ラクトコッカスの表面にコーティングされたＨ９Ｎ２のＨＡ三量体）、Ｌａｃｔ．－ｔＨ５Ｎ６（ラクトコッカスの表面にコーティングされたＨ５Ｎ６のＨＡ三量体）を２の倍数で希釈された抗原を用いて血球凝集抑制実験を行い、血球凝集を分析した。Ｕ底マイクロプレートに最初から最後のウェル前まで希釈バッファー２５μｌを添加した。前処理された試料を最初のウェルに希釈バッファーを２５μｌ添加した後、最後のウェル前まで２５μｌずつ２倍希釈した。このとき試料の非特異反応を確認するために、最後のウェルに前処理された試料２５μｌを添加した。８ ＨＡユニット（Ｕｎｉｔ） に希釈されたそれぞれの抗原を最初から最後のウェル前まで２５μｌずつ添加し、密封して室温で４５分間培養した。１％鶏の血球２５μｌを各ウェルに添加し、室温で１時間反応させた後に判読した。図７ａおよび７ｂで確認されるように、血球凝集抑制実験においても抗原がコーティングされたラクトコッカス、すなわちラクトコッカスの表面にＨ９Ｎ２のＨＡ三量体がコーティングされたＬａｃｔ．－ｔＨ９Ｎ２とＨ５Ｎ６のＨＡ三量体がコーティングされたＬａｃｔ．－ｔＨ５Ｎ６がはるかに活性が高かった。

家禽類を対象としたラクトコッカスの表面にコーティングされた三量体の抗原性を確認
６週齢の鶏（ナムドクＳＰＦ、大韓民国）をグループ当たり５羽ずつに分け、ＰＢＳ、ラクトコッカス死菌体、可溶性Ｈ５Ｎ６のＨＡ三量体およびラクトコッカスの表面にコーティングされたＨ５Ｎ６のＨＡ三量体をそれぞれ抗原として１回の筋肉注射で投与した後、抗体の生成を確認した。
同様に、Ｈ９Ｎ２のＨＡを抗原として利用し、上記と同様の方法で鶏の筋肉に注射した後、抗体の生成を確認した。本実施例において使用したワクチンの組成は、下記表３のとおりである。このとき、対照群にＨ９Ｎ２ウイルス１ｘ１０７ ＥＩＤ５０を注射して抗体の生成を確認した。

上記投与された試験ワクチンによって誘導された体液性免疫反応を分析するために、免疫２週目、３週目、４週目にそれぞれ鶏の血清を分離した後、抗原特異的な抗体の形成をＥＬＩＳＡ法で分析して抗体価を決定した。全体のＩｇＧ抗体価は、次の方法で確認した。

具体的には、精製された上記組換え抗原を９６ウェルマイクロプレートに１００ｎｇ／ウェルの濃度でコーティングした後、非特異的結合を防ぐために、１％のウシ血清アルブミンを添加して１時間反応させた。上記マイクロプレートを洗浄し、各ウェルに順次希釈された血清を入れ、３７℃で２時間反応させ、２次抗体として抗マウスＩｇＧＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＫＰＬ、米国）を入れ、１時間同じ条件で反応させた。上記反応させたマイクロプレートを洗浄し、発色試薬ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）とフェロキシダーゼ基質（ＫＰＬ、米国）を添加し、１０分間常温で反応させた後、静止溶液を用いて発色反応を止め、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍでＯＤを測定した。抗体価は、陰性対照群ＯＤ値の２倍にあたるＯＤ値を示す抗体希釈倍数の逆数と定義した。図８ａおよび８ｂで確認されるように、鶏においても、ラクトコッカスの表面にコーティングした抗原が可溶性形態で注射したものよりはるかに強力な免疫反応を誘導した。特に、ラクトコッカスの表面にコーティングされたＨ９Ｎ２のＨＡ三量体２μｇがＨ９Ｎ２ウイルス１ｘ１０^７ ＥＩＤ５０を注射したものよりはるかに強力な免疫効果を有することを確認した。

ＣＴＢ（コレラ毒素Ｂサブユニット）、可溶性Ｈ５Ｎ６のＨＡ三量体および可溶性Ｈ９Ｎ２のＨＡ三量体をそれぞれ死菌体ラクトコッカスにコーティングした後に免疫の誘導を確認
ＣＴＢ（コレラ毒素Ｂサブユニット）、可溶性Ｈ５Ｎ６のＨＡ三量体、可溶性Ｈ９Ｎ２のＨＡ三量体をそれぞれ死菌体ラクトコッカスにコーティングした後、これをマウス（系統名：ＢＡＬＢ／ｃ；動物規格：５週齢、雌、２０ｇ；動物購入先：セムタコ、大韓民国；使用個体数：３匹／グループ）抗原腹腔注射により免疫原性を確認した。ＣＴＢ（１μｇ）がコーティングされたｉＬａｃｔを対照群とし、ｉＬａｃｔ－ｔＨ５Ｎ６ （０．１ μｇ） ＋ ｉＬａｃｔ－ｔＨ９Ｎ２ （０．１ μｇ）、ｉＬａｃｔ－ｔＨ５Ｎ６ （０．５ μｇ） ＋ ｉＬａｃｔ－ｔＨ９Ｎ２ （０．５ μｇ）、ＣＴＢ （１μｇ） ＋ ｉＬａｃｔ－ｔＨ５Ｎ６ （０．１ μｇ） ＋ ｉＬａｃｔ－ｔＨ９Ｎ２ （０．１ μｇ）、またはＣＴＢ （１μｇ） ＋ ｉＬａｃｔ－ｔＨ５Ｎ６ （０．５ μｇ） ＋ ｉＬａｃｔ－ｔＨ９Ｎ２ （０．５ μｇ） をワクチン組成物として製造し、２週間隔で２回腹腔注射した後、２週間後に血液を採取して血液に存在する抗体をＥＬＩＳＡによって確認した。その際、ＥＬＩＳＡプレートにＨ５Ｎ６とＨ９Ｎ２抗原をそれぞれ２０ｎｇずつコーティングした。その結果、図９に示すようにＣＴＢをｔＨＡ抗原と同時に腹腔注射したとき、ＨＡの免疫原性を増進させる効果を示すことを確認した。

ラクトコッカスにＨ５Ｎ６のＨＡとＨ９Ｎ２のＨＡを個別にそれぞれコーティングしてラクトコッカスを混合した後、免疫誘導能力を確認
ラクトコッカスの表面にそれぞれ異なる２種類のＨＡをコーティングした後、これらを混ぜてマウスに注射したとき、それぞれの抗原に対する免疫原性の効能を確認した。このために、Ｈ５Ｎ６のｔＨＡ ０．１μｇ、０．５μｇまたは１．０μｇをラクトコッカスの表面にコーティングしてｉＬａｃｔ－ｔＨＡ^Ｈ５Ｎ６を準備し、同様にＨ９Ｎ２のｔＨＡ ０．１μｇ、０．５μｇまたは１．０μｇをラクトコッカスの表面にコーティングしてｉＬａｃｔ－ｔＨＡ^Ｈ９Ｎ２を準備した後、濃度別に１：１で混合したワクチン組成物（ｉＬａｃｔ－ｔＨＡ^Ｈ５Ｎ６ ＋ ｉＬａｃｔ－ｔＨＡ^Ｈ９Ｎ２）を製造した。製造された組成物をマウスに２週間隔で腹腔注射して免疫反応を誘導し、２回目の注射をした後、２週間後に血液を採取して抗体の量を測定した。ＥＬＩＳＡプレートにｔＨＡ^Ｈ５Ｎ６およびｔＨＡ^Ｈ９Ｎ２の２種類の抗原を５０ｎｇコーティングした後、それぞれの抗原に結合する抗体の量を［実施例７］に記載されたものと同じ方法で測定した。その結果、図１０に示すように、両抗原に対して強力な免疫原性を確認した。

ラクトコッカスにＨ５Ｎ６のＨＡとＨ９Ｎ２のＨＡの２種類を同時にコーティングした後、これによる免疫誘導能力を確認
それぞれ０．１μｇ、０．５μｇまたは１．０μｇ濃度を有する２種類の抗原Ｈ５Ｎ６のｔＨＡ（ｔＨＡ^Ｈ５Ｎ６）とＨ９Ｎ２のｔＨＡ（ｔＨＡ^Ｈ９Ｎ２）を１：１で混合してラクトコッカスの表面にコーティングした後［ｉＬａｃｔ（ｔＨＡ^Ｈ５Ｎ６ ＋ ｔＨＡ^Ｈ９Ｎ２）］、これをマウスに２週間隔で腹腔注射し、２回目の免疫注射をした後、２週間後に血液を採取して抗体の形成をＥＬＩＳＡを通じて確認した。ＥＬＩＳＡには、使用した抗原を５０ｎｇコーティングした後、血液を適切な割合で希釈し、血液に存在する抗体の量を［実施例７］に記載されたものと同じ方法で測定した。図１１に示すように、本実施例の方法で製造されたワクチン組成物は、２つの抗原両方に対して強力な免疫反応を誘導することを確認した。したがって、ラクトコッカスが２種類の抗原（ｔＨＡ^Ｈ５Ｎ６およびｔＨＡ^Ｈ９Ｎ２）を同時に伝達できることを確認した。

Claims (19)

1. （ｉ） インフルエンザウイルス由来のＨＡ（ヘマグルチニン） において、膜貫通タンパク質部分が欠如したタンパク質をコードする遺伝子；および
   （ｉｉ） コロニン１の三量体モチーフ部位のタンパク質をコードする遺伝子；
   を含む、三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡ（ヘマグルチニン）タンパク質を生産するための組換えベクター。
2. 前記インフルエンザウイルスは、インフルエンザＡウイルスＨ５Ｎ６、Ｈ７Ｎ９およびＨ９Ｎ２からなる群から選択されるいずれか一つである、請求項１に記載の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産するための組換えベクター。
3. 前記インフルエンザウイルス由来のＨＡで膜貫通タンパク質部分が欠如したタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産するための組換えベクター。
4. 前記インフルエンザウイルス由来のＨＡで膜貫通タンパク質部分が欠如したタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１の塩基配列または配列番号１７の塩基配列を含む、請求項１に記載の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産するための組換えベクター。
5. 前記コロニン１の三量体モチーフ部位のタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産するための組換えベクター。
6. 前記コロニン１の三量体モチーフ部位のタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号３の塩基配列を含む、請求項１に記載の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産するための組換えベクター。
7. 前記組換えベクターにＬｙｓＭドメインのタンパク質をコードする遺伝子を追加して含める、請求項１に記載の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産するための組換えベクター。
8. 前記ＬｙｓＭドメインのタンパク質を配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産するための組換えベクター。
9. 前記ＬｙｓＭドメインのタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１３の塩基配列を含む、請求項７に記載の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産するための組換えベクター。
10. 請求項１から請求項９のいずれか一項の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
11. （ａ） 請求項１による組換えベクターを製造する段階；
    （ｂ） 前記組換えベクターを細胞に導入して形質転換体を製造する段階；
    （ｃ） 前記形質転換体を培養する段階；
    （ｄ） 前記形質転換体を培養した培養物を植物に浸潤させる段階；および
    （ｅ） 前記植物を粉砕して三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡ（ヘマグルチニン）タンパク質を得る段階；
    を含む植物から三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を生産する方法。
12. 請求項１１に記載の生産方法で生産された三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質。
13. 請求項１２に記載の三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を含む、免疫原性が増加したインフルエンザウイルス感染症の予防または治療用ワクチン組成物。
14. 前記三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質は、異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を含む、請求項１３に記載の免疫原性が増加した異なる遺伝型のインフルエンザウイルス感染症の予防または治療用ワクチン組成物。
15. 前記三量体を形成するインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質は、細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアまたはキトサンの表面にコーティングされる、請求項１３または請求項１４に記載の免疫原性が増加したインフルエンザウイルス感染症の予防または治療用ワクチン組成物。
16. 前記細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアは、一般的に安全と認められる（ＧＲＡＳ）状態のバクテリアであるものである、請求項１５に記載の免疫原性が増加したインフルエンザウイルス感染症の予防または治療用ワクチン組成物。
17. コレラ毒素Ｂサブユニットを追加して含める、請求項１３または請求項１４に記載の免疫原性が増加したインフルエンザウイルス感染症の予防または治療用ワクチン組成物。
18. 前記ワクチン組成物は、注射剤形態である、請求項１３または請求項１４に記載の免疫原性が増加したインフルエンザウイルス感染症の予防または治療用ワクチン組成物。
19. 前記三量体を形成する、異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質は、次のｉ）ないしｉｉ）のいずれかの方法で細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアまたはキトサンの表面にコーティングされる、請求項１４に記載の免疫原性が増加した異なる遺伝型インフルエンザウイルス感染症の予防または治療用ワクチン組成物：
    （ｉ） 前記三量体を形成する、異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を混合した後、細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアまたはキトサンの表面にコーティングするか、
    （ｉｉ） 前記三量体を形成する、異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質をそれぞれ細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアまたはキトサンの表面にコーティングした後、混合するか；または
    （ｉｉｉ） 前記（ｉ）および（ｉｉ）の２つの方法で異なる２種以上のインフルエンザウイルス由来の組換えＨＡタンパク質を細胞壁にペプチドグリカンを含むバクテリアまたはキトサンの表面にコーティングする。
    

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