CN112391352B

CN112391352B - 一种胸膜肺炎放线杆菌rApxⅣAN的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN112391352B
Application number: CN202011156084.XA
Authority: CN
Inventors: 袁芳艳; 田永祥; 刘泽文; 刘威; 周丹娜; 杨克礼; 段正赢; 郭锐; 高婷
Original assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-10-26
Filing date: 2020-10-26
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2040-10-26
Also published as: CN112391352A

Abstract

本发明是属于临床免疫学技术领域，公开了一种胸膜肺炎放线杆菌rApxⅣAN的单克隆抗体及其应用，本发明通过有效截取ApxⅣ基因的部分片段，并进行突变，获得的基因可在大肠杆菌中高效表达，同时在上清中表达。以表达纯化的rApxⅣAN作为抗原，制备了单克隆抗体，建立了猪胸膜肺炎放线杆菌间接竞争ELISA抗体检测方法，提高了特异性；该方法既可以检测及监测全部APP血清型抗体，又能区别野毒感染和现有疫苗免疫，为猪传染性胸膜肺炎疫苗的效果评价及净化提供了有力工具。

Description

一种胸膜肺炎放线杆菌rApxⅣAN的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明是属于临床免疫学技术领域，涉及一种胸膜肺炎放线杆菌rApxⅣAN的单克隆抗体及其应用。

背景技术

猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)是猪传染性胸膜肺炎的主要病原菌，猪只感染后能引起急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素坏死性胸膜肺炎等症状。猪传染性胸膜肺炎是一种高度接触性的呼吸道传染病，呈爆发性流行，最急性或急性型发病率和死亡率都在50％以上，是当前育肥猪和种猪死亡的主要原因之一；慢性型可导致猪生长缓慢，成为僵猪，严重影响经济效益。而且，由于猪传染性胸膜肺炎常常与猪蓝耳病、猪圆环病等免疫抑制病产生混合感染或继发感染与流行，使得疫病变得更为复杂，临床症状加重、死亡率升高，给养猪业带来了巨大的经济损失。

疫病的精准诊断是疫病防控的重要环节。因为与猪链球菌病、辅助嗜血杆菌病等呼吸道疫病临床症状相似等原因，加上病原菌难以分离与培养，猪传染性胸膜肺炎的快速诊断一直是业界的难题。

猪胸膜肺炎放线杆菌血清型众多。根据荚膜多糖和脂多糖的差异，可分为15血清型。根据烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的依赖性可分为生物Ⅰ型和生物II型，前者生长依赖NAD的菌株为生物Ⅰ型，包括血清型1～12型和15型；后者生长不依赖NAD的菌株为生物Ⅱ型，包括血清型13和14。近些年，国外有报道根据分子生物学方法，可将APP分为18种血清型。其中，APP血清型1-15型已被证实能分泌4种毒素ApxI、ApxII、ApxIII、ApxIV。不同血清型的APP仅产生前三种Apx毒素中的1或2种,而。ApxIV为APP种特异性毒素，所有血清型的APP都能产生ApxⅣ，且只在感染动物体内产生其中(Schaller et al.,1999)。因此建立一种基于ApxIV的通用型检测方法能，克服不同血清型间有限交叉反应的局限，实现多种血清型检测，具有潜在的理论价值和应用前景。

目前，针对猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ在检测方法方面的应用主要有PCR、乳胶凝集试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。如郝成武表达了APP的ApxIV2(1497bp-2873bp)片段，建立了乳胶凝集方法，但是敏感性欠佳，针对同一标准阳性血清LAT的敏感性为1:32倍稀释，而ELISA的敏感性为1:80以上(郝成武，2010)；杨永能合成了2对可扩增长度分别为442bp和378bp的特异引物，建立APP巢式PCR检测方法；(，2019)；黄红亮、石琴分别原核表达了apxIVA基因N端2445bp及ApxlVA3基因A端440bp，建立了间接ELISA方法，但表达产物是以包涵体的形式存在，需要变性和复性的过程。(黄红亮，2005；石琴，2007)

间接竞争ELISA与间接ELISA方法相比，提高了检测的特异性；与间接血凝IHA方法相比，提高了检测的敏感性，结果判定更加客观，还可用于大批量样品的检测。为此，构建APXIVN单克隆抗体，建立理论上可以检测所有血清型APP的间接竞争ELISA方法，为疫病诊断奠定理论基础。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种胸膜肺炎放线杆菌rApxⅣAN的单克隆抗体，该单抗由杂交瘤细胞株2E6分泌得到，保藏编号为：CCTCC NO:C2020186。

本发明的另一个目的在于提供了上述单克隆抗体在制备胸膜肺炎放线杆菌血清抗体竞争ELISA检测试剂盒中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人通过构建突变的ApxⅣAN抗原，制备杂交瘤细胞，经过筛选，最终获得了一株分泌单抗效价高，适合用于制备竞争ELISA检测试剂盒的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞的第12代已于2020年9月28日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：杂交瘤细胞株2E6，保藏编号为：C2020186。

杂交瘤细胞株2E6或其分泌的单抗在制备胸膜肺炎放线杆菌血清抗体竞争ELISA检测试剂盒中的应用；

以上所述的应用中，优选的，所述的试剂盒的包被抗原，是通过将SEQ ID NO.1所示序列在大肠杆菌中表达获得；

以上所述的应用中，所述的试剂盒中的包被抗原为SEQ ID NO.2所示的蛋白质。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本申请根据毒素ApxⅣAN为所有APP血清型均可产生的体内诱导毒素，体外培养时不表达的特点，选取APP毒素apxⅣAN基因并进行突变；使得该外源蛋白在大肠杆菌中的表达量提高，同时在上清中表达。以表达纯化的rApxⅣAN作为抗原，制备了单克隆抗体，建立了猪胸膜肺炎放线杆菌间接竞争ELISA抗体检测方法，提高了特异性；该方法既可以检测及监测全部APP血清型抗体，又能区别野毒感染和现有疫苗免疫，为猪传染性胸膜肺炎疫苗的效果评价及净化提供了有力工具。

附图说明

图1为基因改造前、后重组菌诱导后的SDS-PAGE结果；

泳道M：蛋白质Marker；1：改造后重组菌表达上清；2:改造前重组菌表达上清；3：改造后重组菌表达沉淀。

图2为含pET28a-apxⅣAN2重组菌的SDS-PAGE结果；

泳道M：蛋白质Marker；1：IPTG诱导前；2:IPTG诱导后全菌；3-6：IPTG诱导后上清1-4h。

图3：ApxIVAN蛋白的Western分析示意图；

泳道M:蛋白质Marker；1-2:rApxⅣAN蛋白

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

本发明实施例中，涉及到的阳性血清，阴性血清的描述，如未特别说明，均指得是胸膜肺炎放线杆菌标准阳性猪血清，猪胸膜肺炎放线杆菌标准阴性猪血清；所述的胸膜肺炎放线杆菌标准阳性猪血清：用APP标准菌株免疫猪，然后用IDEXX商品化试剂盒检测效价，效价达到阳性即为该血清；所述的猪胸膜肺炎放线杆菌标准阴性猪血清指得是IDEXX商品化试剂盒检测效价，结果为阴性即为阴性血清。

实施例1：

分泌胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxIVAN单抗杂交瘤细胞株的获得：

(1)ApxIVAN抗原基因的改造与蛋白质表达、纯化：针对APP外毒素apxIVAN基因进行克隆，分析并进行点突变，选取无信号肽且抗原表位丰富的区域进行在大肠杆菌中进行重组表达，基于该序列的重组质粒pET20a-apxⅣAN诱导表达的目的蛋白量占菌体总蛋白32.6％，具体步骤如下：

目的基因的扩增及改造：以猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌株基因组DNA为模板，对apxⅣAN基因(GenBank登录号CP001091)设计两条引物，上游引物P1：ATATACATATGCGCGCCTATATCTGGAATACC，前加酶切位点NdeI；下游引物P2：ATTGCTCGAGCCCTTCGAATTGTTTCGCATTAAC，前加酶切位点XhoI以胸膜肺炎放线杆菌全基因组为模板进行PCR，反应体系：PCR MIX25μL，上下游引物P1、P2各0.5μL，模板4μL，dd H₂O 20μL至总体积50μL；反应程序：95℃2min，95℃15s，57℃30s，72℃1min，72℃10min，4℃10min。用1.0％琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，产物4℃保存。

重组质粒pET28a-apxⅣAN的构建：分别利用引物apxⅣAN-F、apxⅣAN-R对apxⅣAN基因进行PCR扩增，获得截短apxⅣAN基因，进行突变改造，改造后的序列为SEQ ID NO.1所示，对应的蛋白序列为SEQ ID NO.2所示。并将密码子改造前和改造后的基因片段分别用NdeI和XhoI双酶切后，插入到pET-28a(+)的NdeI和XhoI位点之间，获得改造前和改造后的重组质粒pET28a-apxⅣAN1、pET28a-apxⅣAN2。经酶切鉴定证实重组质粒构建正确，测序鉴定证实无碱基错配。

重组质粒pET28a-apxⅣAN1、pET28a-apxⅣAN2的原核表达：分别将改造前、后的重组质粒pET28a-apxⅣAN1、pET28a-apxⅣAN2转化大肠杆菌BL21感受态细胞；挑取单菌落扩大培养，使用质粒小量提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取其质粒进行酶切鉴定。

鉴定正确后，将保存的菌液复苏。次日，按照1：100的体积比进行诱导。在终浓度为1.0mM IPTG、37℃和190r/min的条件下进行诱导1-5h表达。分别在诱导前和诱导后取菌液1mL，通过高压破碎仪破碎后，12000r/min离心10min，将上清和沉淀分别处理后进行SD S-PAGE试验。从结果可以看出，用两种重组原核表达质粒pETapxⅣAN1、pETapxⅣAN2和表达载体pET28a分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布卡那霉素平板，置37℃恒温箱培养，获得重组子。挑取单菌落接种于2mL含卡那霉素的液体LB培养基内，37℃振荡培养，经IPTG诱导表达2-6h后，分别取菌体1mL，裂解等处理后进行SDS-PAGE电泳，确定表达产物位于上清还是包涵体。

结果显示改造前、后的重组转化菌加入IPTG诱导后，在70kDa处均可见明显的蛋白条带产生，与预测的目的蛋白大小一致，而且经过灰度扫描分析，改造后重组菌目的蛋白(本发明称为rApxⅣAN)表达量占总蛋白量的32.6％，比改造前蛋白表达量多45.8％；

含有pET28a-apxⅣAN2的重组菌表达后经超声破碎的上清中有明显的目的蛋白，说明rApxⅣAN蛋白是上清形式存在的(图1)，而含有pET28a-apxⅣAN1的重组菌表达后经超声破碎的上清中几乎无目的蛋白。改造后重组菌经过IPTG诱导后，目的蛋白rApxⅣAN表达量在诱导后3h达到最大量，因此选择IPTG诱导时间为3h(图2)。将成功获得的表达产物rApxⅣAN，经SDS-PAGE电泳后转印硝酸纤维素膜，制备的猪胸膜肺炎放线杆菌阳性血清为一抗，HRP标记的羊抗猪IgG为二抗进行Western blot分析，DAB显色后，仅在约70kDa出现特异性带，结果见图3，表明rApxⅣAN蛋白具有良好的反应原性。最后分别使用透析法和蔗糖透析袋浓缩法对表达的重组蛋白进行纯化和浓缩；收集蛋白，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，1.5mL离心管分装，-80℃保存。

SEQ ID NO.1：ATGAGCATTAAGCAAATGTTAGCTGCAAAATTTACAGCAAATATAGGTGCAGTCGATGGTGTGCTTGAAACCGGTACTGTAAGAAATTGTAATGGGGATAATATTACGGTCGGTCTTTCGGCTGGCGCCTCTGCGGCAAGCTTTATTAGTGGATTTCCTCATTATTTGATGGGGAGGCTAGGAGGCAGTGTCTCTTCTGCTTTTACTGCGATCAACGTAGGTCGAAGCGGAAAACTAACGGCTAGCGATTTATTTACTATTTTAGCCGGAGTTGCAGGATTTGCCTCTACATTCCCTGCTTTTGCTGGGATGGGGGTTGCTGCGGCAGTATTTACCATCAGCGGTATGGCGGTAACTCTGTATGACAATATGAACCATAAAGGCAGTAGCGGCTGTACAAATCCGCCCGGCATTCCGTTAGGGGGAATTGTTCCGCCAGGCGGGAAGGTTCCCGATACAGGAGATGCGGCTGCAGCTTCTTGCCCGTTGATTATTGATATGGATGGTAACGGCGTTAAAACGATTTCTATTAATAAAAATGTATTTTTTGATTTGGATAACAACTTTTTTGCTGAAAATGTCGGTTGGGTGGAGAAAGGAGATGCCTTTTTAGTTTGGGATCGTGATAATAATGGAGTAATTGATTCGGGCAATGAACTATTTGGTAATCATACTTTGTTACGGAACGGTAAAAAGGCGGATAATGGCTTTGCTGCATTGAAAGAACTGGATGATAATAATGATCAGATTTTTGACGAAAAAGATAAAGCTTGGTTTCAACTTCAGTTATGGTTTGATCACAACCAAAACGGTGTTTCCGATGAAGGGGAATTAGTTAAGCTGTCTGAATCTGGTATTAAAAGTATTGATCTTGCTTATAAAAATAATAATAGTACGGATGAAAATGGTAATGAACACCGTCAACAATCTCATGTAACCTGGAATGACGGTAGAACATCAGGTATTACAGATGTCTGGTTTAATACGAATACTGCTCGTTCCTATTATAAAGAAGAGGTTCAAATTAGTGATGATATCAAAGCAATGCCGAATATTATTGCGTTTGGTAATCTATTGGATTTACATGCAGCCATGGCGAAAAGCCCGACTTTGAAATATGTTATTAAAGAATACATGGATGCAAATTTAGCGGAAAGAGATACTTTATTGAATGACCTGATTTATGAATGGACGGGAACTAGTGGCGTTGATCCAAATAGTCGAGGTAGCTCTATTGATGCAAGGAAATTAGCGGTATTGGAATTGATTACCGGTCGAACCTTTCGGCAAGGTTCCTCTTTAAATCCAAATAGCAACGCAGCAAAATTATTAGAAGCAGAATTTAAAAAGTTTGCCGATTATACGCTTGCCCAGCTTGAATCTAAGACGGTTTATAAAGATATTTTTACAATGAATTCCTTTTTAATTAATTCAGAAACTGGTGAACTGGAATTTGATTGGGAAAACTTAAATTCTGCTATTACGCATTTTATTAAAACGAGAAATTTTATAGAAGCAAAACGAGTCATCTCTATAGCTAAAAATTTGGGTATTTATAATGATGAATATTTAGCCGTTATTGATAAAAATTTTGCGAATTTAGCTGAGTCAGACAAAACAATAGCCTATTTTATTAAACGTAATTTTGTTGAAGGTGGAATTGACGATATCAAATTAGTAGGAACAGAAGACCATGATCTTATACTTGCTAATTCACAAGATAATATTTTAGAAGCTGGTAATGGCGATGACACACTCATCGGCGGTATGGGTAACGATACGTTAAAAGGTGGGTTTGGTGCGGACACCTATATCTTTAGCAAAGGGCATGGACAAGATGTAATTTATGAATATTCCGACAGTGCAAACTCTAAAAAAGATATTGATACCTTAAAATTTACCGATGTGAATTATGCGGAAGTGAAGTTTCGACGAGTAGATAATGACTTAATGTTATTCGGTTATCATGATACGGATTCGGTCACGGTAAAATCCTTCTACAGCCATGTAGATTATCAATTTGACAAATTGGAGTTTGCTGACCGCAGTATAACTCGCGATGAACTGATTAAAGCAGGGCTTCATCTATACGGCACCGATGGCAATGATGATATAAAGGATCATGCGGATTGGGACAGCATTTTGGAAGGCGGCAAAGGCAACGATATTCTAAGAGGTGGCTACGGTGCGGACACCTATATCTTTAGCAAAGGACACGGACAGGATATCGTTTATGAAGATACCAATAATGATAACCGCGCAAGAGATATCGACACCTTAAAATTTACTGATGTGAATTATGCGGAAGTGAAATTCCGACGAGTAGATAATGACTTAATGTTATTCGGTTATCATGATACGGATTCGGTCACGATAAAATCCTTCTACAACCATGTAGATTATCAATTTGACAAATTGGAATTTGCTGACCGCAGTATAACTCGTGATGAACTAGGTAAACAAGGTATGGCATTATTTGGCACTGACGGTGATGATAATATCAACGACTGGGGACGTAACTCGGTGATTGATGCCGGTGCGGGTAATGATACGGTTAATGGCGGTAATGGCGATGACACCCTCATCGGCGGCACAGGTAATGATATTCTAAGAGGTGGCTACGGTGCGGACACCTATATCTTTAGCAAAGGACACGGACAGGATATCGTTTATGAAGATACCAATAATGATAACCGCGCAAGAGATATCGACACCTTAAAATTTACTGATATTAATTTATCCGAACTTTGGTTTAGCCGAGAAAATAACGATTTGATTATTAAATCATTATTAAGTGAGGATAAAGTCACGGTTCAAAATTGGTATTCACACCAAGATCATAAAATAGAAAATATTCGTTTATCGAATGAGCAAACGTTGGTGAGCACTCAGGTGGAGAAGATGGTTGAGTCGATGGCCGGCTTTGCTCAGAAGCACGGAGGAGAGATATCTCTTGTGTCGCCTGAAGAGGTAAAACAATATATCAATAGCTTAACAGCTGCTTTATAASEQ ID NO.2

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(2)单克隆抗体的制备

①制备分泌胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅣA单抗杂交瘤细胞株

选取6周龄体积适中的健康雌性BALB/c小鼠12只，随机平均分为2组，一组小鼠颈背部皮下多点注射免疫乳化后的胸膜肺炎放线杆菌rApxⅣAN蛋白(100ug/只)，另一组小鼠免疫同体积生理盐水作为空白对照。三免后第14天，用间接ELISA方法检测小鼠血清效价，判断是否需要进行第四次免疫。在进行细胞融合前4天，需要对效价较高的小鼠进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射不加佐剂、不进行乳化处理的免疫抗原100ug/只。

②细胞融合：将实验室冻存的SP2/0骨髓瘤细胞复苏，用1640完全培养基进行培养到1×10⁷左右，收集细胞并注射6-8周龄的BALB/c小鼠；待小鼠背部长出一定大小的实体瘤后，剪下实体瘤匀浆后加1640基础培养基；加入淋巴细胞分离液进行分离，最后用10mL1640基础培养基重悬，计数后备用。

③筛选阳性克隆细胞：细胞融合后第5天，用HAT培养基进行培养；观察细胞集落的大小，在达到培养孔1/4时，进行间接ELISA检测，分别培养物作为一抗，羊抗鼠HRP-IgG(H+L)为二抗和胸膜肺炎放线杆菌rApxⅣAN为包被抗原进而筛选阳性杂交瘤细胞；对应的阳性杂交瘤细胞做好标记，补加HT培养基准扩大，准备做亚克隆。

④有限稀释法筛选单一阳性孔：制备好饲养细胞，将饲养细胞铺至96孔板4～8块，150μL/孔；将需要亚克隆的阳性杂交瘤细胞从96孔板培养孔内重悬并吸取至无菌的EP管内，细胞计数，按倍比稀释的原则，逐步稀释至20cells/mL。

⑤腹水的制备及单抗特性鉴定

腹水制备：选取6周龄BALB/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL/只；3天后腹腔注射阳性杂交瘤细胞，每只小鼠注射10⁵-10⁶个细胞；注射第9天起可观察到小鼠腹腔微隆，继续饲养，直至小鼠腹腔涨圆，行动不便时，可收取腹水；酒精棉球擦拭小鼠腹部皮毛经消毒，在超净工作台中，用20mL注射器的针头穿刺至小鼠腹腔，流出的淡黄色液体收集至15mL离心管中，1000r/min，离心10min，取上清即为腹水，于-20℃冻存。

单克隆抗体的鉴定：采用间接ELISA法检测所获得的腹水的效价：用胸膜肺炎放线杆菌毒素rApxⅣAN蛋白包被酶标板，将腹水从1：1000倍开始进行倍比稀释作为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，酶标仪OD₄₅₀读数，结果筛选到3株效价≥1×10⁵的rApxⅣAN单抗细胞株，如下。选择效价最高的2号杂交瘤菌株，作为本发明的保藏菌株。

APP间接ELISA抗体检测方法检测的小鼠腹水效价

亚类鉴定：参照Biodragon公司小鼠单抗Ig类/亚类鉴定试剂盒说明书进行单克隆抗体亚类的检测，酶标仪波长(OD₄₅₀nm)读数，获得的3株单克隆抗体均属于IgG1亚型。

特异性鉴定：

利用间接ELISA的方法，利用本发明的单抗，对APP血清1型-15型、大肠杆菌K88、SS2、HPS血清4型、Pm的阳性血清进行检测，同时设猪胸膜肺炎放线杆菌阴性、阳性血清对照，结果表明制备的单克隆抗体只与APP抗原反应，本发明的单抗具备特异性；且对APP血清1型-15型均可检出，本发明的单抗具备普适性。

rApxIVAN单克隆抗体的特异性

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稳定性鉴定

冻存：将生长状态良好的杂交瘤细胞株2(即腹水效价最高的一株)转移到1.5mL离心管中，1000r/min离心10min，弃上清，用细胞冻存液(90％血清+10％DMSO)将细胞调整到约5×10⁶个/ml，加入到2.0ml细胞冻存管中，做好标记，于-80℃过夜，再转入液氮中保存。

复苏：30天后从液氮罐中取出保存的杂交瘤细胞，立即放入37℃水浴锅中使其快速融化；无菌将细胞悬液转移到1.5mLEP管中，1000r/min离心10min，弃上清；用完全培养基重悬细胞，移入24孔细胞培养板，置于37℃条件下，5％CO₂培养箱中培养；用ELISA法检测细胞上清，如果检测结果为阳性，进一步将杂交瘤细胞进行传代，直到最高限制代次(F20代)，每次传代前均用ELISA法检测细胞上清。结果显示，所传细胞每代抗体阳性率均为100％，杂交瘤分泌单抗的能力没有显著性下降。

说明该杂交瘤细胞具有稳定分泌抗体的能力。

单克隆抗体的纯化

辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化腹水：

(1)将待纯化的腹水上清12000r/min离心5min，取上清到50mL烧杯内，加入四倍体积的醋酸缓冲液，磁力搅拌器上搅拌混匀；

(2)待腹水与醋酸缓冲液充分混匀后，加入辛酸33μL/毫升，于磁力搅拌器上，边加边缓慢搅拌，加完继续搅拌30min后，4℃12000r/min离心30min；

(3)离心后的上清用中性滤纸过滤，调制滤出液pH至7.0-7.4；

(4)的饱和硫酸铵(SAS)沉淀抗体，将烧杯置于磁力搅拌器上，一边缓慢滴加饱和硫酸铵至总体积45％，一边缓慢搅拌，加完继续搅拌30min，4℃静置4-5h；

(5)静置后悬液4℃12000r/min离心30min，吸弃上清，取与腹水等体积的pH9.010mM的Tris-base溶液重悬沉淀，装入透析袋，用pH9.0 10mM的Tris-base溶液透析24h；

(6)透析结束后，4℃12000r/min离心30min，取上清分装-80℃保存备用。

最终选取了一株杂交瘤细胞2送至中国典型培养物保藏中心保藏，该杂交瘤细胞的第12代已于2020年9月28日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：杂交瘤细胞株2E6，保藏编号为：CCTCC NO:C2020186。

实施例2：

一种胸膜肺炎放线杆菌rApxⅣAN的单克隆抗体在制备间接竞争ELISA检测试剂盒中的应用：

①最佳抗原包被浓度及酶标单抗工作浓度的选择

将抗原蛋白rApxIVAN(初始浓度162.88μg/mL)倍比稀释6个梯度，包被ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤板子3遍，加入1％的BSA封闭2h；用PBST洗板3遍，加2倍稀释的标准阴性血清和阳性血清37℃反应1h；用PBST洗板3次，加入已经按照1:2000-1:25600倍稀释的HRP酶标单抗，进行间接竞争ELISA方阵试验，计算抑制率(Percentage inhibi tion，PI)，PI＝(1-阳性血清OD₄₅₀nm值/阴性血清OD₄₅₀nm值)×100％，PI值最大的反应孔中使用的抗原包被浓度和酶标抗体稀释度，即为最佳使用浓度。

选择阴性OD₄₅₀nm值在1.0左右，阴性值与阳性值比值较高的稀释度作为最佳工作浓度。检测得到蛋白最佳稀释度为80(即工作浓度2.036μg/mL)，酶标单抗选择16000倍稀释为最佳的工作浓度(单抗原始浓度为1.42mg/mL)。

②待检血清稀释倍数的选择

根据方阵实验选取的最佳蛋白包被浓度和酶标单抗工作浓度，将阴、阳性参考血清以按1、2、4、8、16、32、64、128倍稀释，不改变其他条件，摸索最佳的血清稀释倍数。血清稀释度为1：16时，阴性血清竞争结合不明显，因此16为被检血清的最佳稀释度。

③酶标单克隆抗体、待检血清反应时间的选择

用已确立的抗原包被浓度、酶标单抗工作浓度以及待检血清稀释度进行间接竞争ELIS A试验，试验中加入阴、阳性血清以及PBS对照，血清和PBS反应时间设置为10、20、40、80min等时间梯度，摸索最佳的血清反应时间。结果可知，反应时间小于20min的时候，阳性血清未完全反应；反应时间40-80min，无明显的变化。因此，确定血清最佳反应时间为40min。

④最佳反应条件摸索

按照上述确定条件对封闭物质(PBS+0.5％BSA、PBS+1.0％BSA、PBS+1.5％BSA)、封闭时间(0.5h、1.0h、1.5h)、底物显色时间(10min、15min、20min)等条件进行优化。经方阵滴定法建立的间接竞争ELISA方法的最佳反应条件见下表。

APP间接竞争ELISA抗体检测方法的反应条件优化结果

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⑤间接竞争ELISA检测方法的结果判定

阴阳性临界值(Cutoff值)的确定：参考OIE推荐的方法，使用商品化试剂盒确定为阳性和阴性的血清来确定Cutoff值。用于确定Cutoff值的血清共125份，其中阳性血清23份，阴性的血清102份，均来自本实验室采自湖北省武汉、宜昌等地的猪场。按照摸索的最佳血清稀释浓度稀释，用间接竞争ELISA检测，参考阴性血清、阳性血清和PBS各做三次重复。计算阻断率阻断率(PI)，PI＝(阴性对照OD₄₅₀nm值平均值N-测试样本OD₄₅₀nm值S)/阴性对照OD₄₅₀nm值平均值N×100％(下表)。

阴阳性Cutoff值结果

计算102份阴性血清样品阻断率平均值(X)和标准差(SD)。当样品阻断率PI≥(X)+3(SD)，则样品判定为阳性；当样品阻断率PI<(X)+3(SD)，则样品判定为阴性。由表19可以得出结果判定标准为：血清样品PI值≥51.05％判断为阳性，血清样品PI值<51.05％判断为阴性。

⑥APP间接竞争ELISA检测方法的实验室评价

特异性试验：使用建立的间接竞争ELISA方法检测APP血清1型、3型和7型、副猪嗜血杆菌HPS血清4型、猪链球菌2型(SS2)、猪多杀性巴氏杆菌(Pm)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪圆环病病毒(PCV)阳性血清。结果显示，本方法仅能与APP血清1型、3型和7型的阳性血清抗体特异性竞争结合所包被抗原，其它阳性血清PI值均低于临界值51.05％，表明本研究建立的间接竞争ELISA方法具有良好的特异性。

敏感性试验：使用建立的间接竞争ELISA方法检测1:2-1:2048倍比稀释的APP血清标准猪阳性血清，检测其敏感性。结果显示，APP阳性血清稀释倍数为1:128时抑制率仍大于临界值，表明本该方法具有较高的敏感性。

重复性试验：用10份随机临床猪血清进行竞争ELISA方法批内和批间重复性实验(n＝10)，计算批内和批间的变异系数CV。结果显示，批内和批间重复试验变异系数均小于10％(下表)，表明建立的间接ELISA方法具有较好的重复性。

竞争ELISA方法批内和批间重复性试验(n＝10)

⑦APP间接竞争ELISA检测方法的符合性试验

使用建立的间接竞争ELISA方法对216份临床采集的猪血清进行检测，同时与IDEXX公司生产的间接ELISA试剂盒和阻断ELISA(SN/T1447-2011)进行检测与比较。结果表明(下表)，该方法与与我国现行标准(SN/T1447-2011)阻断ELISA方法的符合率达到85.2％(184/216)，时间节约90min/反应；与IDEXX间接ELISA试剂盒符合率达到89.8％(194/216)，时间节约30min/反应。

竞争ELISA方法的符合性试验结果

/>

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种胸膜肺炎放线杆菌rApxⅣAN的单克隆抗体及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3009

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagcatta agcaaatgtt agctgcaaaa tttacagcaa atataggtgc agtcgatggt 60

gtgcttgaaa ccggtactgt aagaaattgt aatggggata atattacggt cggtctttcg 120

gctggcgcct ctgcggcaag ctttattagt ggatttcctc attatttgat ggggaggcta 180

ggaggcagtg tctcttctgc ttttactgcg atcaacgtag gtcgaagcgg aaaactaacg 240

gctagcgatt tatttactat tttagccgga gttgcaggat ttgcctctac attccctgct 300

tttgctggga tgggggttgc tgcggcagta tttaccatca gcggtatggc ggtaactctg 360

tatgacaata tgaaccataa aggcagtagc ggctgtacaa atccgcccgg cattccgtta 420

gggggaattg ttccgccagg cgggaaggtt cccgatacag gagatgcggc tgcagcttct 480

tgcccgttga ttattgatat ggatggtaac ggcgttaaaa cgatttctat taataaaaat 540

gtattttttg atttggataa caactttttt gctgaaaatg tcggttgggt ggagaaagga 600

gatgcctttt tagtttggga tcgtgataat aatggagtaa ttgattcggg caatgaacta 660

tttggtaatc atactttgtt acggaacggt aaaaaggcgg ataatggctt tgctgcattg 720

aaagaactgg atgataataa tgatcagatt tttgacgaaa aagataaagc ttggtttcaa 780

cttcagttat ggtttgatca caaccaaaac ggtgtttccg atgaagggga attagttaag 840

ctgtctgaat ctggtattaa aagtattgat cttgcttata aaaataataa tagtacggat 900

gaaaatggta atgaacaccg tcaacaatct catgtaacct ggaatgacgg tagaacatca 960

ggtattacag atgtctggtt taatacgaat actgctcgtt cctattataa agaagaggtt 1020

caaattagtg atgatatcaa agcaatgccg aatattattg cgtttggtaa tctattggat 1080

ttacatgcag ccatggcgaa aagcccgact ttgaaatatg ttattaaaga atacatggat 1140

gcaaatttag cggaaagaga tactttattg aatgacctga tttatgaatg gacgggaact 1200

agtggcgttg atccaaatag tcgaggtagc tctattgatg caaggaaatt agcggtattg 1260

gaattgatta ccggtcgaac ctttcggcaa ggttcctctt taaatccaaa tagcaacgca 1320

gcaaaattat tagaagcaga atttaaaaag tttgccgatt atacgcttgc ccagcttgaa 1380

tctaagacgg tttataaaga tatttttaca atgaattcct ttttaattaa ttcagaaact 1440

ggtgaactgg aatttgattg ggaaaactta aattctgcta ttacgcattt tattaaaacg 1500

agaaatttta tagaagcaaa acgagtcatc tctatagcta aaaatttggg tatttataat 1560

gatgaatatt tagccgttat tgataaaaat tttgcgaatt tagctgagtc agacaaaaca 1620

atagcctatt ttattaaacg taattttgtt gaaggtggaa ttgacgatat caaattagta 1680

ggaacagaag accatgatct tatacttgct aattcacaag ataatatttt agaagctggt 1740

aatggcgatg acacactcat cggcggtatg ggtaacgata cgttaaaagg tgggtttggt 1800

gcggacacct atatctttag caaagggcat ggacaagatg taatttatga atattccgac 1860

agtgcaaact ctaaaaaaga tattgatacc ttaaaattta ccgatgtgaa ttatgcggaa 1920

gtgaagtttc gacgagtaga taatgactta atgttattcg gttatcatga tacggattcg 1980

gtcacggtaa aatccttcta cagccatgta gattatcaat ttgacaaatt ggagtttgct 2040

gaccgcagta taactcgcga tgaactgatt aaagcagggc ttcatctata cggcaccgat 2100

ggcaatgatg atataaagga tcatgcggat tgggacagca ttttggaagg cggcaaaggc 2160

aacgatattc taagaggtgg ctacggtgcg gacacctata tctttagcaa aggacacgga 2220

caggatatcg tttatgaaga taccaataat gataaccgcg caagagatat cgacacctta 2280

aaatttactg atgtgaatta tgcggaagtg aaattccgac gagtagataa tgacttaatg 2340

ttattcggtt atcatgatac ggattcggtc acgataaaat ccttctacaa ccatgtagat 2400

tatcaatttg acaaattgga atttgctgac cgcagtataa ctcgtgatga actaggtaaa 2460

caaggtatgg cattatttgg cactgacggt gatgataata tcaacgactg gggacgtaac 2520

tcggtgattg atgccggtgc gggtaatgat acggttaatg gcggtaatgg cgatgacacc 2580

ctcatcggcg gcacaggtaa tgatattcta agaggtggct acggtgcgga cacctatatc 2640

tttagcaaag gacacggaca ggatatcgtt tatgaagata ccaataatga taaccgcgca 2700

agagatatcg acaccttaaa atttactgat attaatttat ccgaactttg gtttagccga 2760

gaaaataacg atttgattat taaatcatta ttaagtgagg ataaagtcac ggttcaaaat 2820

tggtattcac accaagatca taaaatagaa aatattcgtt tatcgaatga gcaaacgttg 2880

gtgagcactc aggtggagaa gatggttgag tcgatggccg gctttgctca gaagcacgga 2940

ggagagatat ctcttgtgtc gcctgaagag gtaaaacaat atatcaatag cttaacagct 3000

gctttataa 3009

<210> 2

<211> 1002

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Ile Lys Gln Met Leu Ala Ala Lys Phe Thr Ala Asn Ile Gly

1 5 10 15

Ala Val Asp Gly Val Leu Glu Thr Gly Thr Val Arg Asn Cys Asn Gly

20 25 30

Asp Asn Ile Thr Val Gly Leu Ser Ala Gly Ala Ser Ala Ala Ser Phe

35 40 45

Ile Ser Gly Phe Pro His Tyr Leu Met Gly Arg Leu Gly Gly Ser Val

50 55 60

Ser Ser Ala Phe Thr Ala Ile Asn Val Gly Arg Ser Gly Lys Leu Thr

65 70 75 80

Ala Ser Asp Leu Phe Thr Ile Leu Ala Gly Val Ala Gly Phe Ala Ser

85 90 95

Thr Phe Pro Ala Phe Ala Gly Met Gly Val Ala Ala Ala Val Phe Thr

100 105 110

Ile Ser Gly Met Ala Val Thr Leu Tyr Asp Asn Met Asn His Lys Gly

115 120 125

Ser Ser Gly Cys Thr Asn Pro Pro Gly Ile Pro Leu Gly Gly Ile Val

130 135 140

Pro Pro Gly Gly Lys Val Pro Asp Thr Gly Asp Ala Ala Ala Ala Ser

145 150 155 160

Cys Pro Leu Ile Ile Asp Met Asp Gly Asn Gly Val Lys Thr Ile Ser

165 170 175

Ile Asn Lys Asn Val Phe Phe Asp Leu Asp Asn Asn Phe Phe Ala Glu

180 185 190

Asn Val Gly Trp Val Glu Lys Gly Asp Ala Phe Leu Val Trp Asp Arg

195 200 205

Asp Asn Asn Gly Val Ile Asp Ser Gly Asn Glu Leu Phe Gly Asn His

210 215 220

Thr Leu Leu Arg Asn Gly Lys Lys Ala Asp Asn Gly Phe Ala Ala Leu

225 230 235 240

Lys Glu Leu Asp Asp Asn Asn Asp Gln Ile Phe Asp Glu Lys Asp Lys

245 250 255

Ala Trp Phe Gln Leu Gln Leu Trp Phe Asp His Asn Gln Asn Gly Val

260 265 270

Ser Asp Glu Gly Glu Leu Val Lys Leu Ser Glu Ser Gly Ile Lys Ser

275 280 285

Ile Asp Leu Ala Tyr Lys Asn Asn Asn Ser Thr Asp Glu Asn Gly Asn

290 295 300

Glu His Arg Gln Gln Ser His Val Thr Trp Asn Asp Gly Arg Thr Ser

305 310 315 320

Gly Ile Thr Asp Val Trp Phe Asn Thr Asn Thr Ala Arg Ser Tyr Tyr

325 330 335

Lys Glu Glu Val Gln Ile Ser Asp Asp Ile Lys Ala Met Pro Asn Ile

340 345 350

Ile Ala Phe Gly Asn Leu Leu Asp Leu His Ala Ala Met Ala Lys Ser

355 360 365

Pro Thr Leu Lys Tyr Val Ile Lys Glu Tyr Met Asp Ala Asn Leu Ala

370 375 380

Glu Arg Asp Thr Leu Leu Asn Asp Leu Ile Tyr Glu Trp Thr Gly Thr

385 390 395 400

Ser Gly Val Asp Pro Asn Ser Arg Gly Ser Ser Ile Asp Ala Arg Lys

405 410 415

Leu Ala Val Leu Glu Leu Ile Thr Gly Arg Thr Phe Arg Gln Gly Ser

420 425 430

Ser Leu Asn Pro Asn Ser Asn Ala Ala Lys Leu Leu Glu Ala Glu Phe

435 440 445

Lys Lys Phe Ala Asp Tyr Thr Leu Ala Gln Leu Glu Ser Lys Thr Val

450 455 460

Tyr Lys Asp Ile Phe Thr Met Asn Ser Phe Leu Ile Asn Ser Glu Thr

465 470 475 480

Gly Glu Leu Glu Phe Asp Trp Glu Asn Leu Asn Ser Ala Ile Thr His

485 490 495

Phe Ile Lys Thr Arg Asn Phe Ile Glu Ala Lys Arg Val Ile Ser Ile

500 505 510

Ala Lys Asn Leu Gly Ile Tyr Asn Asp Glu Tyr Leu Ala Val Ile Asp

515 520 525

Lys Asn Phe Ala Asn Leu Ala Glu Ser Asp Lys Thr Ile Ala Tyr Phe

530 535 540

Ile Lys Arg Asn Phe Val Glu Gly Gly Ile Asp Asp Ile Lys Leu Val

545 550 555 560

Gly Thr Glu Asp His Asp Leu Ile Leu Ala Asn Ser Gln Asp Asn Ile

565 570 575

Leu Glu Ala Gly Asn Gly Asp Asp Thr Leu Ile Gly Gly Met Gly Asn

580 585 590

Asp Thr Leu Lys Gly Gly Phe Gly Ala Asp Thr Tyr Ile Phe Ser Lys

595 600 605

Gly His Gly Gln Asp Val Ile Tyr Glu Tyr Ser Asp Ser Ala Asn Ser

610 615 620

Lys Lys Asp Ile Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val Asn Tyr Ala Glu

625 630 635 640

Val Lys Phe Arg Arg Val Asp Asn Asp Leu Met Leu Phe Gly Tyr His

645 650 655

Asp Thr Asp Ser Val Thr Val Lys Ser Phe Tyr Ser His Val Asp Tyr

660 665 670

Gln Phe Asp Lys Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser Ile Thr Arg Asp Glu

675 680 685

Leu Ile Lys Ala Gly Leu His Leu Tyr Gly Thr Asp Gly Asn Asp Asp

690 695 700

Ile Lys Asp His Ala Asp Trp Asp Ser Ile Leu Glu Gly Gly Lys Gly

705 710 715 720

Asn Asp Ile Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Thr Tyr Ile Phe Ser

725 730 735

Lys Gly His Gly Gln Asp Ile Val Tyr Glu Asp Thr Asn Asn Asp Asn

740 745 750

Arg Ala Arg Asp Ile Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Val Asn Tyr Ala

755 760 765

Glu Val Lys Phe Arg Arg Val Asp Asn Asp Leu Met Leu Phe Gly Tyr

770 775 780

His Asp Thr Asp Ser Val Thr Ile Lys Ser Phe Tyr Asn His Val Asp

785 790 795 800

Tyr Gln Phe Asp Lys Leu Glu Phe Ala Asp Arg Ser Ile Thr Arg Asp

805 810 815

Glu Leu Gly Lys Gln Gly Met Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Asp Asp

820 825 830

Asn Ile Asn Asp Trp Gly Arg Asn Ser Val Ile Asp Ala Gly Ala Gly

835 840 845

Asn Asp Thr Val Asn Gly Gly Asn Gly Asp Asp Thr Leu Ile Gly Gly

850 855 860

Thr Gly Asn Asp Ile Leu Arg Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Thr Tyr Ile

865 870 875 880

Phe Ser Lys Gly His Gly Gln Asp Ile Val Tyr Glu Asp Thr Asn Asn

885 890 895

Asp Asn Arg Ala Arg Asp Ile Asp Thr Leu Lys Phe Thr Asp Ile Asn

900 905 910

Leu Ser Glu Leu Trp Phe Ser Arg Glu Asn Asn Asp Leu Ile Ile Lys

915 920 925

Ser Leu Leu Ser Glu Asp Lys Val Thr Val Gln Asn Trp Tyr Ser His

930 935 940

Gln Asp His Lys Ile Glu Asn Ile Arg Leu Ser Asn Glu Gln Thr Leu

945 950 955 960

Val Ser Thr Gln Val Glu Lys Met Val Glu Ser Met Ala Gly Phe Ala

965 970 975

Gln Lys His Gly Gly Glu Ile Ser Leu Val Ser Pro Glu Glu Val Lys

980 985 990

Gln Tyr Ile Asn Ser Leu Thr Ala Ala Leu

995 1000

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atatacatat gcgcgcctat atctggaata cc 32

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attgctcgag cccttcgaat tgtttcgcat taac 34

Claims

1. 一种人工制备的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC NO:C2020186。

2.一种胸膜肺炎放线杆菌rApxⅣAN的单克隆抗体，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌得到。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的胸膜肺炎放线杆菌rApxⅣAN的单克隆抗体在制备胸膜肺炎放线杆菌血清抗体竞争ELISA检测试剂盒中的应用。

4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒中包括包被抗原，所述的包被抗原是通过将SEQ ID NO.1所示序列在大肠杆菌中表达获得。

5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒包括包被抗原，所述的包被抗原的序列为SEQ ID NO.2所示。