KR20190130355A

KR20190130355A - 살리니비브리오 속 코스티콜라 bao1801 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20190130355A
Application number: KR1020180054900A
Authority: KR
Inventors: 양승환; 정규화; 르바오
Original assignee: 전남대학교산학협력단; 어업회사법인신안새우젓주식회사
Priority date: 2018-05-14
Filing date: 2018-05-14
Publication date: 2019-11-22

Abstract

본 발명은 키티나아제를 생산하는 균주에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 염장새우로부터 분리한 살리니비브리오 속 신균주, 상기 신균주로부터 얻어지는 열안정성 및 내염성을 갖는 키티나아제 및 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

살리니비브리오 속 코스티콜라 BAO1801 균주 및 이의 용도{Novel chitinase-producing Salinivibrio sp. Kostichola BAO1801 strain and use thereof}

본 발명은 키티나아제를 생산하는 균주에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 염장새우로부터 분리한 살리니비브리오 속 신균주, 상기 신균주로부터 얻어지는 열안정성 및 내염성을 갖는 키티나아제 및 이들의 다양한 용도에 관한 것이다.

젓갈은 식품 첨가제 및 식품으로 사용되는 한국 전통의 소금에 절인 발효 식품으로, 10-30% (w/w)의 소금과 혼합되고 15-25℃에서 수개월 동안 저장되는 다양한 생선, 어란, 조개류, 어장, 굴, 새우로 제조 된다 (Guan et al. 2011). 다양한 종류 중에서, 멸치 및 작은 새우로 만든 젓갈은 발효 중에 박테리아에서 생산된 키티나아제(chitinase)에 의한 스케일 및 껍질의 소화로 인해 귀중한 올리고당을 최고 수준으로 포함한다(Adrangi and Faramarzi 2013; Chandrasekaran 2015). 염장 및 발효된 새우는 펩타이드, 유리 아미노산, 포도당 및 비타민이 풍부하여 간에서의 소화활성과 항산화 및 안지오텐신 전환효소 (ACE) 저해제를 보호한다. 이 증가된 영양소들은 발효 중에 미생물에 의한 올리고머 또는 단량체에 대한 조직의 복합 화합물의 가수 분해로 인한 것이다(Goo and Park 2014).

키티나아제(chitinase)는 곤충 외골격의 분해 및 발생에 관여하는 효소로서 특히 탈피와 변태를 일으키는 곤충류의 배후발생에 필수적일 뿐만 아니라, 각종 세균 및 곰팡이류 등의 증식에도 관여한다. 생체를 구성하는 키틴성분은 단당류 단위체인 글루코사민(GlcN)과 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)이 글리코시드 결합(glycosidic bond)을 형성하며, 다시 개개의 사슬들이 수소결합으로 연결되어 있기 때문에 물리적 강도가 대단히 높아 분해가 어려운 물질이다. 이러한 물리화학적 특성으로 인해 키틴은 절지동물(가축 외부 기생충류, 곤충류, 갑각류 등)의 외골격 및 조류(algae), 곰팡이(fungi), 효모(yeast) 등의 세포벽에 존재하면서 매우 효과적인 보호 작용을 수행한다. 키티나아제는 상기 키틴을 일차적으로 분해하는 주요 효소로서, 키틴 중합체를 키틴-올리고당(oligosaccharide)으로 전환시켜 키틴의 구성단위인 GlcN 및 GlcNAc로의 분해를 가능하게 한다.

최근 chitinase는 다양한 분야의 다양한 기능과 응용으로 주목을 받고 있다 (Patel and Goyal 2017). chitinase는 엄청난 약제 가능성을 지닌 생체활성 chitooligosaccharides를 생산하는데 사용되어왔다. 일부 생체활성 chitooligo saccharides은 항염증제, 항고혈압제, 항종양제, 항균제 및 항산화제 효과를 갖는다(Aloise et al., 1996; Park et al., 2000; Wang 등, 2006; Wang et al.Functional properties of chitooligosaccharides are strongly related to their molecular weights (Goo and Park 2014).

키틴 분해 파생물을 획득하기 위해 다양한 미생물에서 키틴 분해 활성이 좋고, 기질 특이성이 있는 키티아나제를 개발하고 있다. 대부분의 세균 chitinase는 Serratia, Chromobacterium, Klebsiella, Bacillus 및 Streptomyces gena (Adrangi and Faramarzi 2013)에서 제조되었다. 키틴을 COS로 전환시키는 높은 chitinase 활성을 가진 박테리아를 선별하는 것은 식품 산업 및 의료응용을 위한 키티나아제를 향상시키는 큰 잠재력을 가지고 있다 (Shehata et al., 2018).

한국등록특허 제10-1658761호

본 발명자들은 열적안정성이 우수한 키티나아제를 생산하는 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.)신균주를 분리함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 식품 산업 및 의료응용에 유리한 특성을 갖는 키티나아제를 생산하는 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 신균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 신균주에 의해 생산되어 일반적인 키티나아제가 활성을 갖는 온도, pH 및 염도에서는 물론, 활성범위를 벗어난 영역의 온도, pH 및 염도에서도 키틴을 분해할 수 있는 특성을 가진 키티나아제 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 신균주 또는 이의 배양물을 포함하는 식품첨가제 및 그 첨가제를 포함함으로써 키토올리고당 함량이 증가되고 항산화 활성이 우수한 발효식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 키티나아제를 생산하는 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주(기탁번호: KACC 81071 BP )를 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 균주는 NaCl 10 내지 30% (w/v)인 배지에서 배양된다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 키티나아제는 30℃ 내지 80℃의 온도범위에서 활성을 갖는다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 키티나아제는 pH 2~9에서 활성을 갖는다.

본 발명은 또한 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주(기탁번호: KACC 81071 BP )로부터 생산되어, 열안정성 및 내염성을 갖는 키티나아제를 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 키티나아제는 NaCl 10 내지 30% (w/v)에서 활성을 갖는다.

본 발명은 또한 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주(기탁번호: KACC 81071 BP )를 키틴이 함유된 배지에서 배양하는 배양단계;를 포함하는 키티나아제 생산방법으로서, 상기 키티나아제는 내염성 및 열안정성을 갖는 것을 특징으로 하는 키티나아제 생산방법.을 제공한다.

또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주(기탁번호: KACC 81071 BP ) 또는 이의 배양물을 포함하는 식품첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상술된 식품첨가제를 포함하는 발효식품을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 발효식품은 키틴질이 포함된 해산물을 발효시킨 것이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 해산물은 새우류, 게류, 가재류로 구성된 그룹에서 선택되는 1개 이상이다.

또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주(기탁번호: KACC 81071 BP ), 상기 균주의 배양물, 상술된 어느 하나의 키티나아제 및 상술된 방법으로 얻어진 키티나아제 중 하나 이상을 포함하는 친환경미생물제제를 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 친환경미생물제제는 키틴을 세포벽으로 구성하는 식물병원균의 균사를 분해하여 곰팡이성 식물병원균의 균사성장을 억제한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 곰팡이성 식물병원균은 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 중 하나 이상이다.

또한, 본 발명은 상술된 친환경미생물제제를 토양, 식물 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제방법을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 식물병은 키틴을 세포벽으로 구성하는 곰팡이성 식물병원균에 의해 유발되는 것이다.

또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 키티나아제 및 상술된 방법으로 얻어진 키티나아제 중 하나 이상을 포함하는 식품보존제를 제공한다.

먼저, 본 발명에 의하면 식품 산업 및 의료응용에 유리한 특성을 갖는 키티나아제를 생산하는 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 신균주를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 키티나아제는 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 신균주에 의해 생산되어 일반적인 키티나아제가 활성을 갖는 온도, pH 및 염도에서는 물론, 활성범위를 벗어난 영역의 온도, pH 및 염도에서도 키틴을 분해할 수 있는 우수한 특성을 나타내므로, 식품 산업 및 의료산업에 폭넓게 응용될 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 신균주 또는 이의 배양물을 포함하는 식품첨가제를 제공할 뿐만 아니라, 그 첨가제를 포함함으로써 키토올리고당 함량이 증가되고 항산화 활성이 우수한 발효식품을 제공할 수 있으므로, 식품 산업에서 특히 키틴을 함유하는 해산물을 발효시키는데 있어서 starter culture로서의 잠재력을 가지고 있다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 신균주인 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주에서 분석된 16S rRNA 유전자 서열에 의한 관련 종들과의 계통도이다.
도 2는 본 발명에 따른 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주의 배양배지에 따른 키티나아제 생산여부를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주에서 정제된 키티나아제의 SDS-PAGE 분석결과 사진이다. 여기서, Lanes M은 표지단백질이고, lane 1은 조추출물, lane 2는 DEAE 크로마토그래피 후 정제된 키티나아제이다.
도 4는 본 발명에 따른 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주에서 생산된 키티나아제의 활성 및 안정성에 대한 온도 및 pH의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명에 따른 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주에서 생산된 키티나아제의 기질 분해 패턴을 TLC로 분석한 결과사진이다.
도 6은 본 발명에 따른 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주에서 생산된 키티나아제의 기질이 2 % colloidal chitin일 때 가수분해 생성물 농도를 나타낸 HPLC 분석결과 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주에서 생산된 키티나아제의 곰팡이 식물 병원체의 포자 발아 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주가 처리되어 염장 및 발효된 새우의 80% 에탄올 추출물의 항산화 활성 실험결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.

이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

본 발명의 기술적 특징은 일반적인 키티나아제가 활성을 갖는 온도, pH 및 염도에서는 물론, 활성범위를 벗어난 영역의 온도, pH 및 염도에서도 키틴을 분해할 수 있는 활성을 가지므로 식품 산업 및 의료산업 등에 유리한 특성을 갖는 키티나아제를 생산하는 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 신균주 및 이의 다양한 용도를 개발한 것에 있다.

따라서, 본 발명은 키티나아제를 생산하는 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주(기탁번호: KACC 81071 BP )를 제공한다.

살리니비브리오 속 (family Vibrionaceae, class Gammaproteobacteria)의 박테리아는 호열성 박테리아로서 현재 세 가지 종 (Lopez-Hermoso et al., 2017)을 가진 S. costicola를 포함하여 Salinivibrio 속 6 종이 알려져 있다. 이러한 박테리아는 일반적으로 소금에 절인 식품 및 과음 환경 (L

et al., 2017)에서 분리된다. 본 발명의 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주는 염장 및 발효된 새우에서 추출한 것이다.

일반적으로 키티나아제는 37℃∼40℃ 환경에서 균성장이 잘 이루지는 Bacillus sp. 및 Serratia marcescens 등에서 보고되어지고 있으며, 키티나아제 활성도 주로 37℃∼40℃에서 활성이 강하게 나타나는 키티나아제가 주를 이루고 있는데, 본 발명의 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주에 의해 생산된 키티나아제는 30℃ 내지 80의℃의 온도 범위, pH2-9의 pH범위 및 NaCl 10 내지 30%의 염도에서도 활성이 강하게 나타나는 우수한 특성을 갖는다.

또한, 본 발명의 키티나아제 생산방법은 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주(기탁번호: KACC 81071 BP )를 배지에서 배양하는 배양단계;를 포함하는데, 배양단계에서 사용되는 배지는 키틴이 함유될 수도 있지만 함유되지 않아도 무방하다. 필요한 경우 배양단계는 NaCl 10 내지 30% (w/v)의 염도를 갖는 배지에서 수행될 수도 있다. 키티나아제만을 얻기 위해, 배양단계에서 얻어진 배양물로부터 키티나아제를 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 즉 배양단계에서 얻어진 배양물에는 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주(기탁번호: KACC 81071 BP ), 상기 균주가 생산한 키티나아제 및 키티나아제에 의해 분해된 키틴분해산물 등이 포함되어 있기 때문이다.

이와 같이 본 발명의 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주(기탁번호: KACC 81071 BP )가 생산하는 키티나아제는 30℃ 내지 80의℃의 온도 범위, pH 2-9의 pH범위 및 NaCl 10 내지 30%의 염도에서도 키틴을 분해하여 키틴올리고당 등 키틴분해유용산물을 생산하게 되므로, 상당히 넓은 범위의 온도 및 pH 조건에서 고분자의 키틴을 저분자로 분해할 수 있다. 즉 버섯 세포벽 유래 키틴, 효모 세포벽 유래 키틴, 곰팡이 세포벽 유래 키틴, 곤충 외골격 유래 키틴, 갑각류 외골격 유래 키틴을 분해할 수 있기 때문에, 본 발명의 키티나아제는 통상 보고된 키틴올리고당의 활용 분야를 포함하여 식품, 의료, 친환경미생물제제 등 다양한 분야에서 이용할 수 있다.

특히, 본 발명의 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주(기탁번호: KACC 81071 BP ) 또는 이의 배양물을 포함하는 식품첨가제를 활용하게 되면, 키토올리고당 함량이 증가되고 항산화 활성이 우수한 발효식품을 제공할 수 있으므로, 식품 산업에서 특히 키틴을 함유하는 해산물을 발효시키는데 있어서 starter culture로서의 잠재력을 가지고 있다. 여기서, 해산물은 체내 조직이 키틴을 함유하고 있기만 하면 제한되지 않으나 특히 새우류, 게류, 가재류로 구성된 그룹에서 선택되는 1개 이상일 수 있다.

또한, 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주(기탁번호: KACC 81071 BP ), 이의 배양물 및 키티나아제 중 하나 이상을 토양에 관주했을 때 곰팡이성 식물병원균의 생육을 억제하는 친환경 미생물제제로서 뛰어난 효능이 기대될 수 있다.

따라서, 본 발명의 친환경 미생물제제는 키틴을 세포벽으로 구성하는 식물병원균 예를 들면 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 알터나리아 브라시시코라 (Alternaria brassicicola) 등을 포함하는 곰팡이성 식물병원균의 균사성장을 억제할 수 있으므로, 본 발명의 친환경미생물제제를 토양, 식물 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하여 키틴을 세포벽으로 구성하는 곰팡이성 식물병원균에 의해 유발되는 식물병을 효과적으로 방제할 수 있다.

실시예 1. 신규한 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주의 분리 및 동정

본 발명의 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주는 다음과 같은 과정을 통해 분리되었다.

1.재료

염장 및 발효된 새우는 한국의 여수에 위치한 Greenmin Food co로부터 얻었다. 콜로이드성 키틴은 새우 쉘 키틴 (Sigma, USA)으로부터 제조 하였다. 간단히 말해서, 10 g의 키틴 분말을 100 ml의 10 N HCl에 첨가하여 혼합하고, 4 ℃에서 밤새 배양 하였다. 배양 후, 콜로이드성 키틴을 침전시키기 위해 혼합물을 50 % 에탄올에 첨가 하였다. 그 후 혼합물을 4 ℃에서 15 분 동안 8000 x g에서 원심 분리 하였다. 이어서 콜로이드성 키틴 침전물을 증류수로 pH 7.0으로 중화시켰다. 그런 다음 동결 건조하여 분말로 만들고 4 ℃에서 보관했다. 해양 배지는 Difco (Detroit, MI, USA)에서 구입 하였다. N-아세틸 글루코사민 및 N- 아세틸 키토 올리고당은 Cayman (Ann Arbor, MI, USA)으로부터 구입하였다. PageRuler prestained protein ladder는 Thermo Fisher Scientific (Schwerte, Germany)에서 구입했다. 이 연구에 사용된 다른 화학 물질은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입했다.

2. 균주의 분리

염장 및 발효된 새우에 0.5 % 콜로이드성 키틴이 공급된 해양 배지에서 클리어링 존 (cleaning zone)을 보이는 미생물을 선택하고 그 키틴 분해 활성을 측정 하였다. 가장 높은 키티나아제 활성을 나타내는 균주를 분리하고 BAO-1801로 명명하였다. 균주 BAO-1801은 그람 양성, 막대 모양 및 포자 형성이 없는 박테리아이다.

3. 16s-rRNA 서열분석을 통한 균주의 동정

균주 BAO-1801은 도 1에 도시된 바와 같이 16S rRNA 서열 분석에 기초로 Salinivibrio sp.로 확인되었다. 도 1은 neighbor-joining을 이용하여 관련 종들과 함께 16S rRNA 서열을 기반으로 구축된 계통도(A phylogenetic tree)로서, 도 1에 도시된 바와 같이 균주 BAO-1801은 Salinivibrio sp 균주 YM-12 (KX099322)와 가장 높은 서열 유사성을 보였다. 균주 BAO-1801의 16S rRNA 서열은 GenBank에 수탁 번호 KX990293으로 기탁되었고, 상기 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주는 국립농업과학원 미생물은행(농업생명공학연구원, KACC)에 2018년 5월 4일자로 기탁하여 KACC 81071 BP의 수탁번호를 부여받았다.

실시예 2. 키티나아제 준비

1.키티나아제 생산

키티나아제 생산을 위해 Salinivibrio sp. OD600이 0.5에 도달할 때까지 BAO-1801을 37 ℃ 진탕 배양기에서 0.5 % 콜로이드성 키틴이 있는 해양 배지에서 24 시간 동안 성장시켰다. 그런 다음 동일한 배지 100 mL에 밤새 배양 (1 %)을 접종하고 오비탈 쉐이커 / 배양기에서 200 rpm으로 3 일 동안 37 ℃에서 성장시켰다. 이어서, 배양액을 12,000g에서 20 분간 원심 분리 한 후 키티나아제를 수집 하였다.

2.키티나아제 정제

무 세포 배양액을 포화 (80 %) 황산 암모늄으로 침전시켰다. 침전물을 6198 ×g에서 30 분 동안 원심 분리 한 후에 수집 하였다. 이를 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7)에 용해시키고, 동일한 완충액에 대해 24 시간 동안 4 ℃에서 연속 교반하면서 투석 하였다. 그 다음, 투석액을 50 mM 인산 나트륨 완충액 (pH 7)으로 평형화 된 DEAE- 세 파로스 CL-6B 음이온 크로마토 그래피 컬럼 (5 cm x 30 cm)에 로딩하고, 상기 완충액으로 세척하고, 0-1 M NaCl 함유 완충액으로 용출시켰다. 그 후 키티나아제는 4ml 분획으로 용출되었다. 단백질 함량은 Bradford 분석법 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)으로 측정하였다.

실시예 3. 키티나아제 준비

0.5 % 콜로이드성 키틴이 없는 해양배지를 사용한 것을 제외하면 실시예2와 동일한 방법을 수행하여 키티나아제를 준비하였다.

실험예 1.

실시예 2 및 실시예 3과 같이 키티나아제 생산을 colloidal chitin이 있거나 없는 배지에서 성장한 균주 BAO-1801을 이용하여 측정 하고 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 도시된 바와 같이 균주 BAO-1801의 성장은 두 가지 배지 모두에서 동일했다 (colloidal chitin의 유무에 관계없이). colloidal chitin이 존재하지 않는 경우에도 chitinase 활성이 배지에서 검출되었다. 그러나, 0.5%colloidal chitin의 첨가는 12시간에서 키틴 분해 효소의 생산을 현저히 증가시켰는데, 이는 고정 성장단계 동안 16U/ml에서 유지되었다.

실험예 2

실시예2 및 3에서 정제된 키티나아제의 정제결과는 하기 표 1에 나타내었다.

Purification step	Total protein (mg)^b	Total activity (U)^c	Specific activity (U/mg)	Purification (fold)	Recovery (%)
Culture supernation	77.0	84.7	1.1	1	100
(NH₄)₂SO₄ precipitation	15.5	82.3	5.3	4.8	97.2
DEAE-Sapharose	0.8	29.9	39.7	36.2	35.3

Total protein (mg)^b는 Bradford 분석법 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)으로 측정하였다.

Total activity(U)^c 는 기질로 콜로이달 키틴을 이용하여 40℃에서 50 mM의 소듐포스페이트 버퍼(pH 7)에서 측정되었다.

표 1로부터, 황산암모늄에 의해 침전된 조 추출물은 chitinase의 비특이적 활성을 4.8배 증가시켰고, DEAE-Sepharose chromatography후, 용출물은 35.3%의 수율로 비 활동성이 약 36.2배 증가했음을 알 수 있다.

실험예 3

정제된 효소를 4 % 폴리 아크릴아미드 스태킹 겔 및 12 % 분해 겔을 사용하여 SDS-PAGE로 분석 하였다. 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 염색을 사용하여 단백질 밴드를 시각화했다. 정제된 키티나아제의 분자량은 표준 단백질을 사용하여 결정하였다. 정제된 키티나아제의 N- 말단 아미노 서열을 단백질을 폴리비닐리덴디플루오라이드 막 상에 전기 블랏팅 한 후 Procise Model 492 단백질 시퀀서 (Applied Biosystems, CA, USA)를 사용하는 에드만 분해법으로 분석하였다.

도 3에 도시된 바와 같이, SDS-PAGE 후 겔을 염색한 후 약 94.2 kDa의 분자량으로 단일 밴드가 나타났다. 이것은 키티나아제가 단량체 단백질이라는 것을 나타낸다.

실험예 4

정제된 chintinase에 대한 N-terminal sequencing의 결과는 AAPSTPSLDWKPQNYSFVEVD의 서열을 보였다. Internal peptide sequencing homology를 확인하기 위해 NCBI 데이터베이스에 기탁된 다른 chitinase와 상동성을 표 2와 같이 비교하였다.

표 2의 결과는 AAPSTPSLDWKPQNYSFVEVD의 서열이 NCBI 데이터베이스에 기탁된 다른 chitinase와 상동성을 공유함을 보여준지다. 특히, BAO-1801가 생산한 키티나아제 서열은 Thalassomonas actiniarum(90 %), Pseudoalteromonas spp.로부터 chitinase ChiC와 높은 서열 동일성을 공유 하였다. (81 %), Colwellia sp. 12G3 (76 %). 이러한 결과는 Salinivibrio sp. BAO-1801은 ChiC chitinase의 일종임을 보여준다.

Enzyme	Origin	NH₂-terminalaminoacid	Identity (%)
ChiC (this work)	Salinivibrio sp.	AAPSTPSLDWKPQNYSFVEVD	-
ChiC (WP_044834007)	Thalassomonas actiniarum	AAPSTPSLDWQPQNYSFVEVV	90
ChiC (WP_010362144)	Pseudoalteromonas citrea	AAPSTPSITWKPQNYSFVDVN	81
ChiC (WP_077537999)	Pseudoalteromonas aliena	AAPSTPSINWEPQQYSFVEVD	81
ChiC (WP_101232706)	Colwellia sp. 12G3	AAPSAPSIDWTPQSYSFVEVN	76
ChiA (ADM13645)	Pseudomonas sp. TxG6-1	AAPGKPTIAWGNTKFAIVEVD	43
ChiA (ADR30609)	Serratia marcescens	AAPGKPTIAWGNTKFAIVEVD	43
ChiB (AAM94336)	Vibrio harveyi	AVDCTPLEAWDSSKVYNGGDQ	19

실험예 5

키티나아제 활성에 대한 최적의 온도는 정제된 키티나아제를 표준 분석 조건하에서 상이한 온도 (30-90 ℃)에서 기질과 함께 배양함으로써 결정되었다. 열 안정성을 연구하기 위해 정제된 효소를 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7)에서 30 ~ 90 ℃의 온도에서 1 시간 동안 사전 배양했다. 지시된 배양 시간 후, 표준 조건 하에서 효소의 잔류 활성을 측정 하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

또한, 키티나아제 활성의 최적 pH는 potassium chloride-hydrochloric acid (pH 2.0-3.5), phosphate-citrate (pH3.0-4.5), acetate (pH 4.5-6.5), 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOS) (pH 6.5-8.0), 및 N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES) (pH 8.0-10.0)를 포함하는 pH 2-10인 50mM의 상이한 완충액을 사용하여 결정되었다. 상이한 pH에서 키티나아제의 안정성을 확인하기 위해, 정제된 효소를 40 ℃에서 30 분 동안 상기 완충액에 대해 투석 하였다. 얼음에서 10 분 동안 냉각시킨 후 표준 조건 하에서 키티나아제의 잔류 활성을 측정하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.

여기서, 키틴 분해 효소 활성은 약간 변형하여 공지 된 방법 (Miller 1959)에 따라 기질의 가수 분해로부터 생성된 GlcNAc를 측정하여 결정 하였다. 간단히, 동일한 양의 1 % (w / v) 콜로이드성 키틴과 희석된 효소를 혼합하고 40 ℃에서 30 분 동안 배양 하였다. 키티나아제 활성의 한 단위는 분석 조건 하에서 분당 1 몰의 GlcNAc를 방출하는 양으로 정의 하였다.

도 4의 A에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 키티나아제의 활성은 30℃에서 50℃로 서서히 증가했다. 그러나 85에서 90℃는 비활성화되었다. 다른 박테리아 chitinase의 최적 온도는 30℃ ~ 50℃이다. 도 4의 B는 본 발명의 키티나아제가 55℃와 60℃에서는 각각 82.6%와 78.7%의 효소활성이 유지되었음을 보여주는데, 이것은 본 발명의 키티나아제가 매우 열에 안정성이 있음을 시사한다.

도 4의 C는 본 발명의 키티나아제의 최대 활성이 pH 7에서 관찰됨을 보여준다. 또한 도 4의 D는 본 발명의 키티나아제가 초기 활성의 80% 이상을 유지하면서 pH 4~8.5에서 비교적 안정했음을 보여준다. 본 발명의 키티나아제는 pH 9 이상에서 변성되었다.

따라서, 본 발명의 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주로부터 얻어진 키티나아제(BAO-1801 chitinase)가 넓은 온도범위에서 활성을 갖는 특성은 미생물오염의 발생을 줄이기 위해 고온이 사용되는 식품산업에 적합하며, 또한 처리 시간을 줄일 수 있는 장점이 있다.

실험예 6

본 발명의 BAO-1801 chitinase의 기질 특이성을 콜로이드 키틴, 글리콜 키틴, 가용성 키토산, 글리콜 키토산, 산화 키토산 및 새우 분말을 비롯한 다양한 기질을 사용하여 실험하고 그 결과를 표 3에 나타내었다. 효소 활성은 표준 조건 하에서 측정 하였다.

Substrate	Relative activity (%)
Colloidal chitin	100
Glycol chitin	89.8
Colloidal chitin azure	42.3
Soluble chitosan	11.2
Glycol chitosan	ND
Oxidized chitosan	ND
(GlcNAc)6	134.1
(GlcNAc)5	112.6
(GlcNAc)4	86.1
(GlcNAc)3	11.5
(GlcNAc)2	ND
GlcNAc	ND

표 3으로부터, 본 발명의 BAO-1801 chitinase가 colloidal chitin과 glycol chitin (89.8 %) 기질에 높은 활성을 보였음을 알 수 있다. 그러나, 시험한 다른 다당류를 가수분해 할 수 없었다. 더욱이, 이 효소는 (GlcNAc)6와 (GlcNAc)5에 대해 매우 활성이었지만, 작은 이량체기질 (GlcNAc)2에 대해서는 활성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 그 특이성이 효소 가수 분해 속도에 영향을 줄 수 있는 기질의 크기 및 물리적 형태에 의존한다는 것을 나타낸다. 본 발명의 BAO-1801 chitinase는 발효 해산물과 같이 키틴 함량이 높은 식품에 chitooligosaccharides을 생산하는 데 유용 할 수 있다.

실험예 7

본 발명의 BAO-1801 chitinase에 의한 colloidal chitin및 N-acetyl-chitooligosaccharides (GlcNAc) n (n = 2-5) 기질의 분해 패턴을 TLC 분석을 사용하여 조사 하고 그 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.

도 5a에 나타낸 바와 같이, colloidal chitin의 분해에 의한 주요 생성물은 GlcNAc2 및 소량의 GlcNAc이었다. 마이너 생성물인 GlcNAc3도 생산되었다. 배양 시간이 연장되면서 주 생성물 (GlcNAc2)와 GlcNAc로 가수분해되었다.

본 발명의 BAO-1801 chitinase는 1시간에 (GlcNAc)5와 (GlcNAc)2 및 (GlcNAc)3를 가수 분해시켰다. (GlcNAc) 3를 8 시간 후에 (GlcNAc)2 및 GlcNAc로 전환시켰다 (도 5b). (GlcNAc)4는 가수분해 기간 동안 GlcNAc 및 (GlcNAc)2로 분해되는 반면 (GlcNAc)4는 (GlcNAc)2로만 전환되었다. 그러나, 키틴 분해 효소는 (GlcNAc)2를 소화하지 않았다.

실험예 8

본 발명의 BAO-1801 chitinase에 의한 colloidal chitin및 N-acetyl-chito oligosaccharides (GlcNAc) n (n = 2-5) 기질의 분해 패턴을 다음과 같이 HPLC 분석을 사용하여 조사 하고 그 결과를 도 6에 나타내었다.

효소의 가수 분해 특성을 결정하기 위해, GlcNAc2, GlcNAc3 GlcNAc4 및 GlcNAc6를 기질로 사용 하였다. 반응 혼합물은 동일한 부피의 정제 효소 (0.2 U / ml) 및 2 % (w / v) 기질 현탁액으로 구성되었다. 그런 다음 40 ℃에서 8 시간 동안 배양했다. 분취액을 상이한 시간 간격으로 취하여 12000 ×g에서 10 분 동안 원심 분리하여 소화되지 않은 기질을 제거 하였다. 실리카 겔 60 플레이트에 10 ㎕ 분취량을 적재하고 1- 부탄올 - 아세트산 - 물 (2 : 1 : 1, v / v)을 함유하는 용매 계에서 전개시켰다. 0.5 % (w / v) GlcNAc 및 다른 (GlcNAc) n (n = 2-6)의 혼합물을 표준으로 사용하였다. 전개 후, 플레이트에 아닐린-디 페닐 아민 시약을 분무하고 100 ℃에서 5 분 동안 가열하여 가수 분해 생성물을 가시화한다. 가수분해된 N- 아세틸 - 키토 올리고사카라이드의 농도는 이동상으로 70 ℃의 아세토 니트릴을 사용하여 Shodex NH2P-50 4E 컬럼이 장착 된 HPLC 분석 (Shimadzu LC-10)으로 1ml / min의 유속으로 40oC로 설정하고 굴절 지수 검출기에서 210 nm로 측정 하였다.

colloidal chitin 을 기질로 사용하여 TLC 분석 결과를 확인하는 HPLC 결과가 도시된 도 6으로부터, (GlcNAc)2 (GlcNAc)3~4의 증가된 양과는 대조적으로 (GlcNAc)6 및 (GlcNAc)5의 분해패턴은 중간 생성물처럼 작용하였다. 이것들은 (GlcNAc)1~2로 더 분해되었다. GlcNAc 및 (GlcNAc)2의 최종 수율은 각각 10.5% 및 71.5%였다. 이러한 결과는 본 발명의 BAO-1801 chitinase가 (GlcNAc)2를 형성하는 높은 능력을 갖는 키틴기질상에 무작위 촉매 작용 방식을 나타내어, 식품 기능을 향상시킬 잠재력을 갖는 것을 보여주는 결과가 될 수 있다.

실험예 9

본 발명의 BAO-1801 chitinase의 항진균 활성은 공개된 방법(Kim et al., 2017)을 사용하여 다음과 같이 측정되었다. Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani를 포함한 병원성 진균은 한국 농업 문화 회관 (KACC)에서 얻은 감자 덱스트로오스 한천 (PDA)에 접종하고 25 ℃에서 배양하여 분생균(conidia)을 생산하였다. 포자를 수집하고, 여과하여, 감자 덱스트로스 브로스에서 10⁴포자/ml로 조정하였다. 반응 혼합물은 포자 현탁액 10 μl와 BAO-1801 chitinase의 희석액으로 구성되었고, 24 시간 동안 25 ℃에서 배양되었다. 포자 발아 횟수는 인버티드 현미경 (Olympus IX70, Melville, NY, USA) 하에서 측정 하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 도시된 바와 같이 본 발명의 BAO-1801의 정제된 chitinase는 3가지 진균성 식물병원체의 포자발아에 대해 상이한 정도의 억제를 나타냈다. BAO-1801 키티나아제는 고농도 (>200μg/ml)에서 모든 시험 균주로부터 포자 발아를 억제했다. 그러나 F. oxysporum과 R. solani는 다른 균주보다 낮은 농도의 BAO-1801 chitinase(>50μg/ml)에 더 민감했다. 이러한 결과는 chitinase의 항진균 활성이 포자의 세포벽 구조에 의존함을 확인시켜 준다. 많은 다른 박테리아 chitinase가 포자 발아를 억제할 수 있다고 보고되었지만 본 발명과 같이 살리니비브리오 속 균주가 생산하는 chitinase C 계열 효소의 항진균 활성에 대해서는 지금까지 알려진 바 없다.

실험예 10

다음과 같이 염장 및 발효된 새우에 본 발명의 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주를 처리하여 얻어진 발효물의 추출물의 항산화활성을 다음과 같이 측정하고 그 결과를 표 4 및 도 8에 나타내었다.

1.염장 및 발효된 새우의 발효 및 추출

Salinivibrio sp. BAO-1801은 MRS broth 10 mL에서 37 ℃로 하룻밤 배양되어 0.5 OD에 도달 하였다. 배양된 현탁액을 염장 및 발효 된 새우 페이스트에 106 CFU/g 첨가 하였다. 발효는 0, 1, 2, 3, 4 개월 동안 20 ℃에서 유지되었다.

추출을 준비하기 위해, 5g의 발효된 샘플을 80 % 에탄올 (1 : 5 비율 w / v)에 현탁시키고, 일정하게 교반하면서 30 ℃에서 1 시간 인큐베이션하여 자가 분해시켰다. 현탁액을 원심 분리하고 (10,000 x g, 30 분, 4 ℃), 상등액을 조추출물로서 수집하였다.

2.염장 및 발효된 새우의 산화 방지제

DPPH 소거 능력은 약간 수정된 문헌 [Wang et al. (2010) 방법을 사용하여 측정되었다. 탈 이온수 및 DPPH 용액을 대조 시료로 사용하였다. 공시료는 조 추출물에만 해당한다. 4,000 ×g (Hettich, EBA21, Germany)에서 15 분간 원심 분리 한 후, 517 nm를 사용하여 3 배로 흡광도를 측정 하였다. 활성은 μmol 트롤록스 당량 (TE) / g 샘플로 나타내었고, 저해 활성은 소거 활성의 백분율로서 보고되었다.

ABTS 라디칼 소거 능력은 문헌 [Binsan et al. (2008)에 기재된 방법으로 측정되었다. 활성은 μmo 트롤 록스 당량 (TE) / g 샘플로 나타내었고, 저해 활성은 소거 활성의 백분율로서 보고되었다.

ferric reduction / antioxidant power (FRAP) 분석은 이전에 기술된 Binsan et al. (2008)에 의해 수행되었다. 활성은 μmol 트롤록스 당량 (TE) /g 샘플로 표현되었다.

3. 결과

표 4에 나타난 바와 같이 4개월간 발효시킨 새우는 DPPH 라디칼 소거능이 가장 높았으며 (4.30μmol TE/g), 신선한 새우 (0 개월)는 가장 낮은 DPPH 라디칼 소거능 (1.47μmol TE/g)을 보였다 (P<0.05). ABTS 소거 활성은 발효기간의 증가에 따라 증가 하였다.

Fermentation period (month)	DPPH activity (μTE/g sample)	ABTS activity (μTE/g sample)	FRAP activity (μTE/g sample)
0	1.47 ±0.23^d	7.99 ±0.34^d	16.03 ±0.90^b
1	1.67 ±0.27^d	9.20 ±0.10^c	16.77 ±0.12^b
2	2.57 ±0.40^c	10.60 ±0.53^b	21.73 ±0.84^a
3	3.40 ±0.20^b	11.73 ±0.32^a	22.03 ±0.21^a
4	4.30 ±0.22^a	12.33 ±0.25^a	23.13 ±0.31^a

도 8의 A로부터 새우 발효 추출물의 IC50 값은 발효 0~4 개월 동안 231.15mg/mL, 193.35mg/mL, 165.40mg/mL, 137.86mg/mL 및 101.59mg/mL이었음을 알 수 있다.

도 8의 B에 나타난 바와 같이 IC50 값이 188.27 및 159.76mg/mL 인 3개월 및 4개월 발효의 ABTS 활동에는 차이가 없었고, 도 8의 C로부터 FRAP 활동은 발효 2개월 후에 변화하지 않고 최종 실험에서 가장 높은 활성 (23.13μmol TE/g sample)을 보였음을 알 수 있다.

실험예 11

실험예 10에서 얻어진 염장 및 발효된 새우에 본 발명의 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주를 처리하여 얻어진 발효물의 추출물의 항진균활성을 다음과 같이 측정하고 그 결과를 표 5에 나타내었다.

확산 방법이 멸균 여과지(5mm 직경, Whatman No. 1)를 사용하여 공지된 방법

이 한천에서 염장 및 발효된 새우의 항균 활성을 평가하기 위해 사용되었다. 즉 멸균 여과지를 각 조 추출물 50 mL로 함침시키고 미리 선택된 병원균을 접종한 한천 플레이트 표면에 놓았다. 한천 플레이트를 37 ℃에서 24 시간 동안 배양했다. 배양 후, 억제 영역의 디스크 직경을 측정 하였다(mm 단위). 각 측정은 두 번씩 수행되었다.

paper diffusion분석 결과가 나타난 표 5로부터, 본 발명의 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주가 처리된 염장 및 발효된 새우 추출물의 항균활성은 두 가지 그람 박테리아 중 4가지 다른 식인성 병원균에 민감했다. 그 중에서도 조 추출물은 Yersinia enterocolitica ssp. enterocolitica KACC 15320에서 우수한 활성을 나타냈다. 또한, 본 발명의 살리니비브리오 속(Salinivirbrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주 처리 후 발효 시간이 길수록 항균 활성이 높았다.

Pathogens	Diameter (mm) of inhibition zone by crude extract from salted shrimp fermentation
Pathogens	Control	1 month	2 months	3 months	4 months
Gram-positive bacteria
Staphylococcus aureus KCCM 11335	1 ±0.4	1 ±0.8	1 ±0.6	1 ±0.2	2 ±0.2*
Listeria monocytogenes KACC 10764	-	-	-	1 ±0.5	2 ±1.4*
Bacillus cereus KACC1124	1 ±0.2	1 ±0.4	1 ±0.4	1 ±0.6	1 ±0.2
Gram-negative bacteria
Yersinia enterocolitica ssp. enterocolitica KACC 15320	1 ±1.4	1 ±0.4	1 ±0.8	3 ±0.5*	4 ±0.6*
Salmonella choleraesuis KCTC2932	1 ±0.2	1 ±0.2	1 ±0.3	1 ±0.4	1 ±0.2
Escherichia coli K99 KCTC 2617	-	-	1 ±0.2	2 ±0.4*	3 ±0.8*
* P < 0.05

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

농업생명공학연구원

KACC81071

20180504

Claims

키티나아제를 생산하는 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주(기탁번호: KACC 81071 BP ).
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 NaCl 10 내지 30% (w/v)인 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주.
제 1 항에 있어서,
상기 키티나아제는 30℃ 내지 80℃의 온도범위에서 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주.
제 1 항에 있어서,
상기 키티나아제는 pH 2~9에서 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주.
살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주(기탁번호: KACC 81071 BP )로부터 생산되어, 열안정성 및 내염성을 갖는 키티나아제.
제 5 항에 있어서,
상기 키티나아제는 NaCl 10 내지 30% (w/v)에서 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 키티나아제.
제 5 항에 있어서,
상기 키티나아제는 30℃ 내지 80℃의 온도범위에서 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 키티나아제.
살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주(기탁번호: KACC 81071 BP )를 키틴이 함유된 배지에서 배양하는 배양단계;를 포함하는 키티나아제 생산방법으로서, 상기 키티나아제는 내염성 및 열안정성을 갖는 것을 특징으로 하는 키티나아제 생산방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주(기탁번호: KACC 81071 BP ) 또는 이의 배양물을 포함하는 식품첨가제.
제 9 항의 식품첨가제를 포함하는 발효식품.
제 10 항에 있어서,
상기 발효식품은 키틴질이 포함된 해산물을 발효시킨 것을 특징으로 하는 발효식품.
제 11 항에 있어서,
상기 해산물은 새우류, 게류, 가재류로 구성된 그룹에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 발효식품.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 살리니비브리오 속(Salinivibrio sp.) 코스티콜라 BAO1801 균주(기탁번호: KACC 81071 BP ), 상기 균주의 배양물, 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 키티나아제 및 제 8 항의 방법으로 얻어진 키티나아제 중 하나 이상을 포함하는 친환경미생물제제.
제 13 항에 있어서,
상기 친환경미생물제제는 키틴을 세포벽으로 구성하는 식물병원균의 균사를 분해하여 곰팡이성 식물병원균의 균사성장을 억제하는 것을 특징으로 하는 친환경미생물제제.
제 13 항에 있어서,
상기 곰팡이성 식물병원균은 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 중 하나 이상인 것을 특징으로 친환경미생물제제.
제 13 항의 친환경미생물제제를 토양, 식물 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제방법.
제 16 항에 있어서,
상기 식물병은 키틴을 세포벽으로 구성하는 곰팡이성 식물병원균에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 식물병 방제방법.
제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 키티나아제 및 제 8 항의 방법으로 얻어진 키티나아제 중 하나 이상을 포함하는 식품보존제.