CN117562188A - 一种防治禽坏死性肠炎的功能性饲料添加剂的制备方法 - Google Patents

一种防治禽坏死性肠炎的功能性饲料添加剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株保藏编号为CGMCC No.20659的产高酶活蛋白酶的纳豆芽孢杆菌FMN‑1，并涉及该菌种产的酶和酶的制备方法，以及涉及该菌种和酶的一种防治禽坏死性肠炎的功能性饲料添加剂，并涉及该添加剂的制备方法，属于禽类饲料及饲料添加剂技术领域。其重量份数组成：中药酶解混合物20‑35份、纳豆芽孢杆菌4‑9份、维生素C 4‑10份、维生素E 4‑10份，滑石粉40‑60份。能够提高禽类对饲料的消化率、日增重，降低料肉比。以肉鸡为例，日增重在1.37％～2.48％之间，料肉比在1.64～1.67。提高禽类的免疫机能，增强抗病能力，有效的预防和治疗由产气荚膜梭菌引起的禽坏死性肠炎。

Description

一种防治禽坏死性肠炎的功能性饲料添加剂的制备方法
本申请为分案申请，原申请申请号：202111503213.2申请日：2021.12.09，发明名称：一种防治禽坏死性肠炎的功能性饲料添加剂及其制备方法。
技术领域
本发明涉及一种防治禽坏死性肠炎的功能性饲料添加剂，并涉及该添加剂的制备方法，属于禽类饲料及饲料添加剂技术领域。
背景技术
坏死性肠炎又称肠毒血症，是由产气荚膜梭菌引起的一种传染病，该菌是一种条件致病菌，主要发生在禽类，健康禽类也有携带此菌者，养殖舍通风不好，地面潮湿或喂给发霉变质的鱼粉豆粕等因素，均可诱发此病；在同一区域或同一动物舍中反复发作，病程持续时间长，不但影响禽类的生产性能而且易诱使其他病发生，造成严重的损失。
坏死性肠炎一年四季均可发生，主要发生在夏秋季节，特别是气温突变时，会对禽类产生较大的应激，机体的生理机能暂时失衡，引起发病，该病主要发生在2-6周龄动物，多发生于肉鸡，该病主要通过消化道传播，鸡群的排泄物污染饲养工具、饮水，垫料等，导致病菌随之传播。
坏死性肠炎一般是突然发病，不食，趴卧，排黄绿色或暗黑色的稀便，有的可见粪便中混有血液。呈零星发病和死亡，如发生混合感染，死亡率会大大增加，病鸡表现明显的精神沉郁，闭眼嗜睡，食欲减退，腹泻及羽毛粗乱无光，易折断。发病动物生长发育受阻，排黑色、灰色粪便，有时混有血液，有些情况下与小肠球虫并发，粪便稍稀呈黄色或会有肉样粪便。
传统的治疗方法主要是临床用药，使用抗生素治疗，抗生素治疗效果直接，但是抗生素的应用存在很多残留和耐药性的问题，目前中国所属的养殖大环境里，抗生素的使用越来越受到限制；饲料中已经不允许使用抗生素，只能通过在养殖中额外对动物使用含有西药成分的药物治疗该病，还会在禽畜产品中残留，对人体健康带来一定的危害。人们对健康问题越来越重视，食品安全意识日益提高，因此开发出一种能够防治禽坏死性肠炎的功能性饲料添加剂是必然需求。
目前也有一些中药制剂，治疗由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎，例如如下申请，公开号:105616906A的中国发明《治疗鸡坏死性肠炎的中药组合物及其制备方法》公开了一种治疗鸡坏死性肠炎的中药组合物及其制备方法，该中药组合物的组分及其重量份数比分别为：鱼腥草10-15份；青蒿5-10份；白头翁5-8份；地榆5-10份；木香5-10份；黄芩5-10份；知母5-10份；牵牛子8-15份；大黄5-10份。本发明具有抗菌消炎、清热除胀的功效，且本发明起效快，作用时间长，毒副作用小，无药物残留，是一种较为理想的治疗鸡坏死性肠炎的中药组合物。
公开号:102846700A的中国发明《一种防治家禽球虫病与坏死性肠炎混合感染的中药组合物》公开了一种防治家禽球虫病与坏死性肠炎的中药组合物，该中药组合物以凉血止血、祛瘀消肿的小蓟为君，以清透虚热、凉血除蒸的青蒿为臣，佐以益气固表、托疮生肌的黄芪以及健脾益气、燥湿利水的白术，以补脾益气、清热解毒的甘草调和诸药，共凑凉血逐瘀、清热解毒、固本培元之功效，适应于球虫病与坏死性肠炎单独或混合感染的不同发病阶段的防治需要。本中药组合物经大量禽病临床应用表明，具有效果确切、无毒副作用、无药物残留等优点。
公开号:101697774A的中国发明《一种治疗鸡球虫病的中药饲料添加剂》公开了一种治疗鸡球虫病的中药饲料添加剂，选取的原料中药材及其重量组份分别是：升麻6份、黄芩5份、苦参6份、白头翁6份、鸦胆子3份、常山3份、青蒿6份、百部5份；其制备方法是：将上述原料药材混合后粉碎或分别粉碎后混合。本发明选取的原料药材共凑清热解毒、杀虫止痒之功效。通过日常饲料的饲喂达到预防和治疗鸡球虫病、坏死性肠炎、鸡白冠病的目的。
公开号:111345401A的中国发明《一种麦粒复合减抗微生物的饲料添加剂》公开了一种麦粒复合减抗微生物的饲料添加剂，所述饲料添加剂包括麦粒，所述饲料添加剂中添加有酿酒酵母CCTCCM2019051，所述饲料添加剂中还添加有多粘芽孢杆菌CCTCCM2019024、纳豆芽孢杆菌CCTCCM2019025和植物乳杆菌CCTCCM2019026中的一种或多种；所述酿酒酵母CCTCCM2019051的添加量为0.5～5％，总微生物的添加量为1～8％。本发明不但成本较低，制备过程简单，而且能够有效增强畜禽的免疫力和抗病能力，能够有效替代抗生素，达到降低抗生素用量的效果。
但是上述的制备过程，中药成分复杂，且以纯中药为主，实际上中药中起主要作用的是其中的活性物质，包括黄酮类、酚类、氨基酸和矿物质等，上述文献中公开的制备过程，没有将中药中具有活性的有效物质更有效的提取出来。同时，纯中药组合的制剂比较单一，没有结合其他原料共同发挥出更良好的防治效果，所以在饲喂过程中的安全性和功效性的综合考虑都有所不足。
同时，上述的制备过程中，如果用到多种微生物进行混合，每个菌种需要单独活化培养，步骤比较繁琐，并且对引起禽类坏死性肠炎的产气荚膜梭菌没有起到特别的专一性和高效性的抑制。
发明内容
天然植物、中草药或者植物源性化合物具有很好的体外抗氧化活性，并作为饲料添加剂广泛应用于动物试验中以提高动物的生长性能和抗氧化性能。但是植物细胞壁限制了细胞内生物活性物质的溶出，不利于植物细胞内天然功能性成分在动物体内的消化吸收和作用的充分发挥。酶解技术是采用纤维素酶、半纤维酶和果胶酶等单独或联合使用，以促进植物细胞内生物活性物质溶出的技术，是一种环保、有效的破坏植物细胞壁的方法。在酶的作用下破坏植物细胞壁基质，以促进细胞内生物活性成分的释放或更有效的被提取出来，酶解技术在动物饲料原料中也有一些研究并取得了很好的效果。
同时微生物对动物的肠道健康均有很好的调节作用，菌种自身产生的代谢产物对一些病原菌均有不同程度的抑制作用。中药和微生物两者结合在一起能够起到更好的协同作用。
本发明的第一个目的是提供一种防治禽坏死性肠炎的功能性饲料添加剂，原料的重量份数组成如下：
中药酶解混合物20-35份、纳豆芽孢杆菌4-9份、维生素C 4-10份、维生素E 4-10份，滑石粉40-60份。
进一步地，所述中药酶解混合物的重量份数组成如下：青蒿30-40份、大黄15-25份、茵陈20-30份、穿心莲25-35份、果胶酶4-10份，纤维素酶4-10份、蛋白酶3-8份。
更进一步地，所述中药酶解混合物的重量份数组成如下：青蒿30-35份、大黄15-20份、茵陈20-25份、穿心莲25-30份、果胶酶4-8份、纤维素酶4-8份、蛋白酶3-6份。
进一步，所述纳豆芽孢杆菌由如下方法制备：
将纳豆芽孢杆菌接入牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，37℃，静置进行活化培养24h，活化后的纳豆芽孢杆菌FMN-1的种子液的活菌数检测为(2.0～5.0)×108CFU/mL-(2.0～5.0)×109CFU/mL，为了应用于大批量的生产应用，需要扩大培养，将种子液按照1％的接种量继续接种于牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，扩大培养的温度为37℃，静置培养24h；
更进一步，所述纳豆芽孢杆菌为FMN-1，保藏编号CGMCC No.20659；
进一步地，所述中药酶解混合物中的蛋白酶由提纯的一株产高酶活蛋白酶的纳豆芽孢杆菌FMN-1提供，所述纳豆芽孢杆菌FMN-1，菌种保藏编号为CGMCC No.20659。
所述的纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)FMN-1，于2020年9月16日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.20659，所述菌种由沈阳丰美生物技术有限公司的姜丹于2020年7月30日-8月30日之间，在沈阳丰美生物技术有限公司的生物试验室中从日本纳豆中筛选得到。
纳豆芽孢杆菌简称纳豆菌，属细菌科、芽孢杆菌属，是枯草芽孢杆菌的一个亚种。大小通常为(0.7～0.8)μm×(0.2～0.3)μm，嗜氧型革兰氏阳性，芽孢呈椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，有鞭毛，能运动。纳豆菌生长的最高温度为45～55℃，最低为5～20℃，最适生长温度37℃；pH 7.0～7.5，最适生长pH 7.3.孢子耐热性强，可在肠道内萌发。纳豆菌的抵抗性较强，其芽孢具有耐酸、耐碱、耐高温(100℃)、耐挤压的高度稳定性，易于保存，实验室可在-70℃的冰箱中长久保存，在胃酸4h后的存活率为100％，同时具有强力的病原菌抑制能力，进入小肠内，能够改变动物肠道菌群生态，调节肠道菌群，产生的抗菌肽具有广谱抗菌作用。
所述功能性饲料添加剂的制备方法如下：
将所有饲料添加剂的各原料按比例混合均匀既得。
本发明的功能性饲料添加剂在禽配合饲料中的应用：所述的饲料添加剂按照0.2-0.5‰的比例添加到禽的配合饲料中。
针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种防治禽坏死性肠炎的功能性饲料添加剂，采用本发明的功能性饲料添加剂，能显著减少禽类的坏死性肠炎的发病率，同时能够提高禽类的生产性能和免疫机能。
有益效果
1、本发明提供的功能性饲料添加剂具有：
(1)改善禽类对饲料的消化率，能够提高禽类的日增重、降低料肉比。以肉鸡为例，日增重在1.37％～2.48％之间，料肉比在1.64～1.67。
(2)提高禽类的免疫机能，增强抗病能力，有效的预防和治疗由产气荚膜梭菌引起的禽坏死性肠炎。
(3)本发明中纳豆芽孢杆菌FMN-1能够对产气荚膜梭菌产生比较好的抑菌效果。同时制备出高效的蛋白酶用于中药的酶解过程，各种酶作用于植物的细胞壁，更利于中药中有效成分的溶出。
2、本发明提供的功能性饲料添加剂的制备温和，方便操作控制，容易实现工业化生产。
3、本发明中的原料中药经过混合酶解后，能够产生多种活性物质，相互协同在动物生产应用中能够发挥更好的效果。
青蒿属于菊科蒿属一年生草本植物，在传统医学中具有抗寄生虫和解热的作用，除含有抗疟成分青蒿素外，青蒿中还含有挥发油、酚类、黄酮类以及氨基酸、维生素、矿物质等多种营养成分而具有抗氧化、抑菌、抗炎、免疫调节等多种功能。
茵陈又名棉茵陈、白蒿、绒蒿、松毛艾等，多年生草本或灌木状植物，性微寒，味辛、苦、有清湿热等功效。其有效成分主要是黄酮类化合物和绿原酸，黄酮类化合物具有多种生物活性，有抗过敏、抗菌、抗炎、抗氧化等功能。
穿心莲为爵床科穿心莲属植物，别名榄核莲、一见喜等，其味苦，性寒，具有清热解毒、消肿止痛、抗炎、抗菌等作用。穿心莲对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有表现出不同程度的敏感性，均有不同程度的抑制作用。穿心莲中的内酯成分具有明显的抗炎和调节机体非特异性免疫功能等。
大黄又名锦纹、黄良。酶解后有效成分为蒽醌衍生物，其中以大黄酸、大黄素及芦荟大黄素的抗菌作用最强，有清热、解毒、增加血小板、抗菌等作用。其抗菌作用强且抗菌谱广，对多数革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有抗菌作用。
维生素C能直接参与动物机体的体液免疫，主要通过促进淋巴细胞的产生来促进动物机体抗体的生成，进一步提高动物机体的免疫力，另外能提高动物机体免疫功能，参与各种有毒物质的解毒过程，还对于细胞中多种酶的活性起到至关重要的作用。
维生素E一般在体内不能合成，必须由饲料供给，能够提高动物机体的抗氧化能力，提高免疫能力和繁殖性能；通过阻止过氧化反应和自由基对淋巴细胞的破坏作用来增强机体体液免疫能力，不仅能增强体液免疫，而且能提高细胞免疫能力和嗜中性白细胞的功能，给动物补饲适量的维生素E之后，体内抗体水平提高，吞噬细胞增多，同时吞噬作用加强。
本发明中，中药经过酶解处理干燥后与维生素C、E和纳豆芽孢杆菌进行混合后应用于禽类养殖，对禽类在其免疫功能、生产性能和防治坏死性肠炎上具有显著的协同改善效果。
4、本发明中纳豆芽孢杆菌FMN-1能够产生高酶活的蛋白酶，已于2020年9月16日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号：CGMCC No.20659，分类命名：纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)。
具体实施方式
一种防治禽坏死性肠炎的功能性饲料添加剂，原料的重量份数组成如下：
中药酶解混合物20-35份、纳豆芽孢杆菌FMN-1 4-9份、维生素C 4-10份、维生素E4-10份，滑石粉40-60份。
本发明优选的实施例为：中药酶解混合物为25-28份，纳豆芽孢杆菌为4-7份；维生素C为5-8份；维生素E为5-8份，滑石粉40-60份。
作为本发明优选的实施例，中药酶解混合物可以为25份、26份、27份、28份，纳豆芽孢杆菌FMN-1可以为4份、5份、6份、7份；维生素C可以为5份、6份、7份、8份；维生素E可以为5份、6份、7份、8份。
本发明更优选的实施例为：中药酶解混合物为26份，纳豆芽孢杆菌为6份；维生素C为6份；维生素E为6份，滑石粉50份。
本发明中青蒿、大黄、茵陈、穿心莲经过纤维素酶、果胶酶和蛋白酶组合酶解后，有效成分被释放，与纳豆芽孢杆菌FMN-1、维生素C、维生素E均匀混合后应用在禽类配合饲料中，具有显著的抗菌、抗氧化，调节机体免疫机能的作用，能够提高动物的生产性能及防治禽类坏死性肠炎。
本发明的实施例中，中药酶解混合物中应用的蛋白酶由纳豆芽孢杆菌产生，所述的纳豆芽孢杆菌为保藏号为CGMCC No.20659的纳豆芽孢杆菌FMN-1，该菌种从日本纳豆中筛选得到。
所述的纳豆芽孢杆菌FMN-1的筛选方法如下：
称取纳豆于0.85％的无菌生理盐水中，振荡，将菌悬液在80℃的恒温水浴锅中加热10min后，迅速冷却至室温，此菌悬液为原始菌液。
将原始菌液用生理盐水梯度稀释制备10-1～10-8浓度的稀释液，各取100μL上述的10-5～10-8浓度的稀释菌悬液加到牛肉膏蛋白胨培养基的平板上，涂匀稀释液，将上述平板放入37℃恒温培养箱中倒置培养24h。
挑取不同菌落形态的单菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察，根据常见细菌系统鉴定手册中关于芽孢杆菌属形态的描述，挑取具有芽孢杆菌细胞形态的菌株，对产气荚膜梭菌进行抑菌试验，反复纯化出对产气荚膜梭菌具有较强的抑菌效果的菌株，纳豆芽孢杆菌的菌株形状为圆形，边缘不规则，中间凸起，表面褶皱，颜色为白色，呈不透明状，致密。
对产气荚膜梭菌有较强的抑菌效果的菌株的筛选方法如下：
将C型产气荚膜梭菌于胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基上复苏，挑单个黑色菌落至液体硫乙醇酸盐培养基中，37℃厌氧培养10h。同时准备好试管，装入已灭菌过的液体硫乙醇酸盐培养基待用。
选取十株已经经过鉴定和挑单菌落经过培养的纳豆芽孢杆菌继续筛选，将纳豆芽孢杆菌与产气荚膜梭菌加入装有液体硫乙醇酸盐培养基的试管中，37℃厌氧培养24h，通过肉眼观察细菌的生长情况，如果试管中的溶液澄清透明，说明没有细菌生长，如果试管中有絮状细菌或浑浊，说明有细菌生长。
选取能够使溶液澄清透明的试管，纳豆芽孢杆菌产生的蛋白酶是一种中性丝氨酸蛋白酶，可水解酪素平板形成透明圈，挑取上述经过鉴定且经抑菌筛选出的纳豆芽孢杆菌单菌落在酪素培养基的平板上分别连续划线分离，将上述平板放入37℃恒温培养箱中倒置培养24h，选取菌落周围产生水解圈的菌株，并且水解圈直径与菌落直径比值最大的菌落进一步分离纯化得到产高酶活蛋白酶的纳豆芽孢杆菌，命名为纳豆芽孢杆菌FMN-1，并进行保藏，保藏编号为CGMCC No.20659。
所述的牛肉膏蛋白胨培养基的组成：琼脂粉20.0g/L，蛋白胨10.0g/L，牛肉膏5.0g/L，氯化钠5.0g/L，其余为水，pH值7.0～7.2。
所述的胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基的组成：胰胨15.0g/L，大豆胨5.0g/L，酵母粉5.0g/L，焦亚硫酸钠1.0g/L，柠檬酸铁铵1.0g/L，0.5％的D-环丝氨酸溶液10％，琼脂15.0g/L，其余为水，pH值为7.6±0.2。
所述的液体硫乙醇酸盐培养基的组成：胰酶消化酪蛋白胨15.0g/L，L-胱氨酸0.5g/L，葡萄糖5.0g/L，酵母膏5.0g/L，氯化钠2.5g/L，硫乙醇酸钠0.5g/L，刃天青0.001g/L，其余为水，pH值为7.1±0.2。
所述的酪素培养基的组成：琼脂粉20.0g/L，酪素5.0g/L，葡萄糖1.0g/L，酵母膏1.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.1g/L，其余为水，pH值7.0～7.2。
所述用于中药酶解混合物的蛋白酶的制备方法如下：
将纳豆芽孢杆菌FMN-1，按照12％的接种比例接入牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，37℃、180r/min下恒温培养24h，活菌数达到(4.0～6.0)×108～(4.0～6.0)×109cfu/g，以2％接种量接种至液体发酵培养基，37℃、180r/min下恒温培养48h后取发酵液，5000r/min离心10min，取上清液即为蛋白酶粗酶液。
所述牛肉膏蛋白胨的液体培养基组成：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏5.0g/L，氯化钠5.0g/L，其余为水，pH值7.0～7.2。
所述的液体发酵培养基组成：葡萄糖10.0g/L，蔗糖10.0g/L，大豆蛋白胨20.0g/L，磷酸氢二钾4.0g/L,磷酸二氢钾2.0g/L,氯化钙0.2g/L，硫酸镁0.5g/L，其余为水,pH值7.0。
本发明提供的由纳豆芽孢杆菌FMN-1产生的粗酶液中蛋白酶的酶活特性稳定性如下表1：
表1蛋白酶活性的稳定性试验
该菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上连续传代10代，每代菌株在48h的发酵液中蛋白酶的活性测定结果表明，在其6代内，产生的蛋白酶的特性仍然可以保持稳定，第4代时达到了26.23U/mL，酶活高且产酶好。
将硫酸铵缓慢加入在上述的粗酶液中，直至25％饱和度，4-8℃过夜，8000rpm离心30min，取上清液，在上清液中加硫酸铵至终饱和度为60％，4-8℃过夜，8000rpm离心30min，收集沉淀，目的主要是去除上清液中的杂蛋白和多糖类物质。取上述沉淀100mg，用10mL20mm的PB缓冲溶液复溶，取复溶后的蛋白溶液进行凝胶层析和阳离子交换层析。
为了确定凝胶层析中最佳的缓冲溶液浓度，首先将上述复溶的蛋白质溶液取10mL进行凝胶层析，层析柱选择的是XK 26/100，分别选择10mm、20mm、30mmPB的缓冲溶液，流速为3mL/min，样品经过凝胶层析柱洗脱后收集所有滤液，干燥后得到蛋白酶粉末，提纯后蛋白酶活性及比活力见表2。可以得出：20mmPB缓冲溶液，凝胶层析柱洗脱的效果最佳，确定凝胶层析柱洗脱中，缓冲溶液的浓度为20mmPB。
表2凝胶层析提纯后的蛋白酶的活性
收集经20mmPB缓冲溶液，凝胶层析柱洗脱的滤液继续进行阳离子交换层析，阳离子交换层析柱为Hitrap SP FF,用不同pH值的20mm PB缓冲溶液分别洗脱优化，pH值分别为6.5、7.0、7.5，流速为2mL/min，洗脱后收集滤液进行干燥后得到蛋白酶粉末，提纯后蛋白酶活性及比活力见表3。
10mmPB溶液的配制过程为：取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g,定容至1000mL。
20mmPB溶液的配制过程为：取NaCl 16g，KCl 0.4g，Na2HPO4 2.88g，KH2PO4 0.48g,定容至1000mL。
30mmPB溶液的配制过程为：取NaCl 24g，KCl 0.6g，Na2HPO4 4.32g，KH2PO4 0.72g,定容至1000mL。
不同pH值的20mmPB溶液的配制过程为：取NaCl 16g，KCl 0.4g，Na2HPO4 2.88g，KH2PO40.48g,定容至1000mL，分别配制三份，然后用氢氧化钠和冰乙酸调节pH值为6.5、7.0、7.5。
表3阳离子层析提纯后的蛋白酶的活性
在凝胶层析中，选择不同浓度的PB缓冲溶液进行洗脱，可以得出在20mmPB缓冲溶液下，洗脱的效果最佳。阳离子交换层析过程中，选择20mmPB而不同pH的缓冲溶液进行洗脱，可以得出在20mmPB缓冲溶液的pH为7.0的时候，总蛋白的质量、蛋白酶酶活、比活力的结果均是最理想的。
最终确定凝胶层析及阳离子交换层析为：将上述复溶的蛋白质溶液取10mL进行凝胶层析，层析柱选择的是XK 26/100，20mm的缓冲溶液，流速为3mL/min，样品经过凝胶层析柱洗脱后收集滤液，然后将收集的滤液继续进行阳离子交换层析，阳离子交换层析柱为Hitrap SP FF,用pH值7.0的20mm PB缓冲溶液洗脱优化，流速为2mL/min，洗脱后收集滤液进行干燥后得到蛋白酶粉末。
该蛋白酶在pH5.0-11.0范围内稳定；在50℃下放置6-7h，残余活力仍能达到20％。37℃放置48h仍能保持约80％的活性。因此在制备中药酶解混合物时，在酶解温度40℃，此蛋白酶仍能达到良好的分解蛋白质的效果，协同纤维素酶和果胶酶的共同作用，能够加快中药酶解过滤速度，提高中药中的有效物质浓度。
本发明的防治禽坏死性肠炎的功能性添加剂在纳豆芽孢杆菌有效抑菌的作用下，加以中药酶解混合后的混合物，与维生素C和E均匀混合后获得。
所述中药酶解混合物的制备方法如下：
青蒿30-40份、大黄15-25份、茵陈20-30份、穿心莲25-35份和果胶酶4-10份，纤维素酶4-10份、蛋白酶3-8份均匀混合，添加混合物总重量40％的水进行酶解，酶解温度为40℃，pH值6.0，水解48h，酶解后采用干燥处理，粉碎过40目筛备用；
所述蛋白酶由纳豆芽孢杆菌产生，具体制备方法如前所述；
更进一步地，所述中药酶解混合物的重量份数组成如下：青蒿30-35份、大黄15-20份、茵陈20-25份、穿心莲25-30份、果胶酶4-8份、纤维素酶4-8份、蛋白酶3-6份。
所述的功能性饲料添加剂在基础日粮中的添加量为0.2～0.5‰(质量比)。
实施例1
一种防治禽坏死性肠炎的功能性饲料添加剂，由包括如下步骤的方法制备：
1、中药酶解混合物的制备
青蒿30份、大黄15份、茵陈20份、穿心莲25份和果胶酶4份，纤维素酶4份、蛋白酶3份均匀混合，添加混合物总重量40％的水进行酶解，酶解温度为40℃，pH值6.0，水解48h，酶解后采用干燥处理，粉碎过40目筛备用；
2、纳豆芽孢杆菌的制备
将纳豆芽孢杆菌FMN-1(保藏编号CGMCC No.20659)接入牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，37℃，静置进行活化培养24h，活化后的纳豆芽孢杆菌FMN-1的种子液的活菌数检测为(2.0～5.0)×108CFU/mL-(2.0～5.0)×109CFU/mL，为了应用于大批量的生产应用，需要扩大培养，将种子液按照1％的接种量继续接种于牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，扩大培养的温度为37℃，静置培养24h，获得菌液中菌活力为5.2×109CFU/ml。
所述牛肉膏蛋白胨的液体培养基组成：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏5.0g/L，氯化钠5.0g/L，其余为水。
3、混合
将中药酶解混合物25份，纳豆芽孢杆菌4份、维生素C 5份、维生素E 5份，滑石粉60份进行混合均匀既得。
所述的功能性饲料添加剂可用于防治禽的坏死性肠炎，在基础日粮中的添加量为0.3‰质量比。
实施例2
1、中药酶解混合物的制备
青蒿33份、大黄18份、茵陈22份、穿心莲27份和果胶酶6份，纤维素酶6份、蛋白酶4份均匀混合，添加混合物的总重量的40％的水进行酶解，酶解温度为40℃，pH值6.0，水解48h，酶解后采用干燥处理，粉碎过40目筛备用。
2、纳豆芽孢杆菌的制备同实施例1
3、混合
将中药酶解混合物26份，纳豆芽孢杆菌6份、维生素C 6份、维生素E 6份，滑石粉50份进行混合均匀既得。
所述的功能性饲料添加剂可用于防治禽的坏死性肠炎，在基础日粮中的添加量为0.3‰质量比。
实施例3
1、中药酶解混合物的制备
青蒿35份、大黄20份、茵陈25份、穿心莲30份和果胶酶8份，纤维素酶8份、蛋白酶6份均匀混合，添加混合物的总重量的40％的水进行酶解，酶解温度为40℃，pH值6.0，水解48h，酶解后采用干燥处理，粉碎过40目筛备用。
2、纳豆芽孢杆菌的制备同实施例1
3、混合
将中药酶解混合物28份，纳豆芽孢杆菌7份、维生素C 8份、维生素E 8份，滑石粉40份进行混合均匀既得。
所述的功能性饲料添加剂可用于防治禽的坏死性肠炎，在基础日粮中的添加量为0.3‰质量比。
实施例4
1、中药酶解混合物的制备
青蒿38份、大黄23份、茵陈28份、穿心莲32份和果胶酶9份，纤维素酶9份、蛋白酶7份均匀混合，添加混合物的总重量的40％的水进行酶解，酶解温度为40℃，pH值6.0，水解48h，酶解后采用干燥处理，粉碎过40目筛备用。
2、纳豆芽孢杆菌的制备同实施例1
3、混合
将中药酶解混合物20份，纳豆芽孢杆菌4份、维生素C 4份、维生素E 4份，滑石粉40份进行混合均匀既得。
所述的功能性饲料添加剂可用于防治禽的坏死性肠炎，在基础日粮中的添加量为0.2‰质量比。
实施例5
1、中药酶解混合物的制备
青蒿40份、大黄25份、茵陈30份、穿心莲35份和果胶酶10份，纤维素酶10份、蛋白酶8份均匀混合，添加混合物的总重量的40％的水进行酶解，酶解温度为40℃，pH值6.0，水解48h，酶解后采用干燥处理，粉碎过40目筛备用。
2、纳豆芽孢杆菌的制备同实施例1
3、混合
将中药酶解混合物35份，纳豆芽孢杆菌9份、维生素C10份、维生素E10份，滑石粉60份进行混合均匀既得。
所述的功能性饲料添加剂可用于防治禽的坏死性肠炎，在基础日粮中的添加量为0.5‰质量比。
实验例1功能性饲料添加剂在饲料中的应用实验
在禽类中，由于坏死性肠炎在肉鸡中发病率最高，所以本发明中试验动物均以肉鸡为例。将480只28日龄白羽肉鸡随机分为4组，每组12个重复，每个重复10只(公母各占1/2)。分别为对照组，饲喂玉米-豆粕型日粮；试验组，在对照组基础上添加本发明的饲料添加剂，试验组1、2、3分别添加实施例1、2、3饲料添加剂，添加量为0.3‰(质量百分比)。试验饲粮组成及营养水平见表4。
表4肉鸡饲粮配方及营养水平
注：对照组和试验组饲喂的日粮的营养水平均相同，本发明中所有的试验用饲料及饲料添加剂均由沈阳丰美生物技术有限公司提供。
试验地点为辽宁某肉鸡笼养小区，采用多层笼养于同一鸡舍内，自由采食和饮水，免疫程序和栏舍消毒按常规进行,试验15天。试验期间以每个重复组为单位记录上料量和剩料量，由此计算出平均日增重、日采食量和料重比。
表5本发明功能性饲料添加剂对肉鸡生产性能的影响
各组试验肉鸡的体重、采食量、料肉比如表5。与对照组的试验结果比较，试验组1、2、3的日增重比对照组分别提高了1.37％、2.48％和1.40％，料肉比对照组分别降低了1.01、2.20％和0.95％，结果均与对照组存在显著性的差异(P<0.01)。本发明的效果体现在：一方面通过组合酶对中药进行酶解后，使中药中的有效成分最大程度的分解出来，这些有效成分具有很高的生物活性功能，可以协助改善家禽的健康状态、促进家禽的生长，提高日增重和降低料肉比。另一方面，本发明中的纳豆芽孢杆菌FMN-1可以产生蛋白酶，该酶可以降解饲料中的抗营养因子，可以提高饲料的利用率的同时，也可以相应的补充动物体内内源酶的不足，提高动物对饲料的消化利用率，进而提高动物的生产性能。
实验例2功能性饲料添加剂在动物中的应用试验
为了说明本发明中的功能性饲料添加剂对肉鸡免疫器官指数的影响，免疫器官指数＝免疫器官重量(mg)/体重(g)，各组均选择80只28日龄的白羽肉鸡，将试验进行以下分组：
对照组：选择80只健康白羽肉鸡，饲喂玉米-豆粕型日粮(组成同表4)。
感染组：选择80只出现坏死性肠炎症状的白羽肉鸡，饲喂玉米-豆粕型日粮(组成同表4)。
抗生素组：选择80只出现坏死性肠炎症状的白羽肉鸡，饲喂玉米-豆粕型日粮(组成同表4)，按照0.3‰(质量比)加入杆菌肽锌。
功能性添加剂组：选择80只出现坏死性肠炎症状的白羽肉鸡，饲喂玉米-豆粕型日粮(组成同表4)，按照0.3‰(质量比)加入功能性饲料添加剂。
实验采用实施例2的功能性饲料添加剂。
饲喂15天后，对各试验组的鸡进行称重，然后取肝脏、脾脏、法氏囊、胰脏和胸腺并称重，计算各器官指数，结果如表6。
表6：本发明功能性饲料添加剂对肉鸡免疫器官指数的影响
从表6可以看出，抗生素组和功能性饲料添加剂组对比对照组和感染组，其法氏囊指数、肝脏指数、脾脏指数、胸腺指数均有提高。其中抗生素组和添加剂组与对照组相比，均有显著性提高(P<0.05)，对于肝脏指数、脾脏指数、法氏囊指数和胸腺指数来说，添加剂组、抗生素组均显著高于对照组和感染组(P<0.01)。法氏囊是禽特有而且特别重要的中枢免疫器官，主要是诱导来自骨髓的干细胞，使其分化成B细胞，对体液免疫的形成和功能具有特别重要的作用。而胸腺是禽的一级淋巴器官，参与机体的细胞免疫。脾脏是重要的外周免疫器官。抗生素组和功能性饲料添加剂组均能显著增加肉鸡的免疫器官指数，而且功能性饲料添加剂组在肝脏指数、法氏囊指数、脾脏指数上分别高于抗生素组，差异不显著(P>0.05)。在正常生理情况下，免疫器官是指实现免疫功能的器官或组织,是免疫活性细胞发育、增殖的场所,免疫器官的机能状况及发育状态,直接决定禽类全身免疫水平。免疫器官的增长是生长发育快的表现，而免疫器官指数的提高则说明免疫系统成熟较快。免疫器官的生长发育和成熟的速度愈快,禽的整体免疫机能就愈强,抵抗各种病原微生物感染的能力和抗各种应激的能力也会得到提高。因此,通过测量免疫器官的重量是研究机体免疫体况的主要方法之一。脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏是鸡的主要的免疫器官,它们的重量可用于评价禽类的免疫状态。上述数据充分说明本发明功能性饲料添加剂能够显著改善肉鸡免疫器官指数。
实验例3功能性饲料添加剂在动物中的应用试验
为了说明此功能性添加剂中，普通的纳豆芽孢杆菌和本发明中提纯的纳豆芽孢杆菌FMN-1(编号CGMCC No.20659)应用在功能性饲料添加剂中，饲喂肉鸡后对鸡肠道菌群的影响，将试验进行以下分组，各组均以感染坏死性肠炎的鸡作为试验对象：
对照组：饲喂玉米-豆粕型日粮(组成同表4).
试验组1：饲喂玉米-豆粕型日粮(组成同表4)+0.3‰(质量比)添加剂组合(不加纳豆芽孢杆菌)。
其中，添加剂组合的制备方法如下：
(1)中药酶解混合物的制备同本发明实施例2步骤(1)
(2)将中药酶解混合物26份，维生素C 6份、维生素E 6份，滑石粉50份进行混合均匀既得。
试验组:2：饲喂玉米-豆粕型日粮(组成同表4)+0.3‰(质量比)添加剂组合(纳豆芽孢杆菌，经纳豆提取，由沈阳丰美生物技术有限公司微生物试验室提供，属于未经过纯化，但是经过鉴定的菌株)。
其中，添加剂组合的制备方法如下：
(1)纳豆芽孢杆菌的制备：
称取纳豆于0.85％的无菌生理盐水中，振荡，将菌悬液在80℃的恒温水浴锅中加热10min后，迅速冷却至室温，此菌悬液为原始菌液。
将原始菌液用生理盐水梯度稀释制备10-1～10-8浓度的稀释液，从上述稀释液中分别取10-8、10-7、10-6、10-5浓度的稀释菌悬液各100μL，分别加到牛肉膏蛋白胨培养基的平板上，涂匀稀释液，将上述平板放入37℃恒温培养箱中倒置培养24h。
挑取不同的菌落形态的单菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察，根据常见细菌系统鉴定手册中关于芽孢杆菌属形态的描述，挑取具有芽孢杆菌细胞形态的菌株，纯化获得纯种菌株进行保存。
其中，纳豆芽孢杆菌活化步骤同实施例2(2)步骤制备。
(2)原料：组成同本发明实施例2步骤(1)
(3)混合，同本发明实施例2步骤(3)。
试验组3：饲喂玉米-豆粕型日粮(组成同表4)+0.3‰(质量比)实施例2的功能性饲料添加剂组合。
试验结束后，分别取对照组和各试验组的鸡的粪便，称取一定数量的鸡粪样品用无菌水进行稀释，取三个合适梯度的稀释溶液0.1mL，分别在乳酸平板培养基、大肠杆菌平板培养基上和胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基上涂匀稀释液，放置在培养箱中37℃，倒置培养24～48h后分别计算乳酸菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌的活菌总数，结果如表7。
表7本发明功能性饲料添加剂对肉鸡肠道菌群数的影响
从结果中可以看出，试验组3可显著降低肉鸡肠道内产气荚膜梭菌、大肠杆菌的数量，并增加了乳酸杆菌的活菌数量，与试验组2的结果进行对比，试验组3的数据仍然具有非常明显的优势，说明：本发明限定的纳豆芽孢杆菌FMN-1与普通的纳豆芽孢杆菌，在改善肉鸡肠道菌群结构方面的效果，有显著的差异。纳豆芽孢杆菌可以调节动物肠道内的微生物循环，因为动物肠道中的有益菌和病原菌会有竞争的关系，在动物肠道内，乳酸菌可以与一些病原菌竞争利用动物肠道内的营养物质，并且竞争肠道上皮与黏膜内共同的黏附位点，同时乳酸菌还可以通过本身分泌的产物例如有机酸类降低肠道的pH值，这样也可以抑制一些病原菌的生长，能够对产气荚膜梭菌达到很好的抑制作用，同时也可以抑制其他病原性菌，因此改善肉鸡肠道菌群结构，就等于改善了肉鸡的肠道。本发明的饲料添加剂在此方面有着明显的优势。
实验例4功能性饲料添加剂在动物中的应用试验
为了说明此功能性饲料添加剂对饲喂肉鸡后，对鸡坏死性肠炎的防治效果的影响，分别记录鸡群的坏死性肠炎的发病率、死亡率和治愈率，将试验进行以下分组：
对照组：饲喂玉米-豆粕型日粮(组成同表4)
试验组1：饲喂玉米-豆粕型日粮(组成同表4)，如果发病后额外添加抗生素(杆菌肽锌)进行治疗，添加量为0.3‰(质量比)。
试验组2：饲喂玉米-豆粕型日粮(组成同表4)，如果发病后额外添加功能性饲料添加剂应用在配合料中。
其中，功能性饲料添加剂组合的制备同实施例2，添加量为0.3‰(质量比)。
试验组3：饲喂玉米-豆粕型日粮(组成同表4)+0.3‰(质量比)功能性饲料添加剂。
其中，功能性饲料添加剂组合的制备同实施例2。
试验组4：饲喂玉米-豆粕型日粮(组成同表4)+0.3‰(质量比)功能性饲料添加剂。
其中，功能性饲料添加剂组合的制备如下：
(1)青蒿33份、大黄18份、茵陈22份、穿心莲27份和果胶酶6份，纤维素酶6份、蛋白酶(产品购自邢台市思倍特生物科技有限公司，酶活5万U/g)4份均匀混合，添加混合物的总重量的40％的水进行酶解，酶解温度为40℃，pH值6.0，水解48h，酶解后采用干燥处理，粉碎过40目筛备用。
(2)纳豆芽孢杆菌活化步骤同实施例2(2)步骤
(3)将(1)(2)与其他原料，同本发明实施例2步骤(3)进行混合。
表8本发明功能性饲料添加剂对肉鸡坏死性肠炎的防治效果
试验组3在发病率、死亡率方面均比其他组低，差异显著，同时治愈率也比对照组、试验组2、试验组4高，与抗生素组的治愈率没有显著的差异。说明本发明的功能性饲料添加剂对肉鸡的坏死性肠炎有很好的预防和治愈效果，与抗生素相比安全性和稳定性更好，不存在药物残留以及产生耐药性的问题。同时试验组4的效果高于对照组，但是低于试验组3，说明对中药组合进行酶解时，本申请保藏菌种产生的酶具有非常明显的优势，在中药酶解的过程中会更多的释放出具有生物活性的物质，与纳豆芽孢杆菌等其他原料协同作用，应用于动物养殖，特别是肉鸡坏死性肠炎的防治方面能够达到更显著的效果。而试验组3明显优于试验组2也说明：本发明功能性饲料添加剂的防治效果显著，远优于发病后的治疗效果。目前饲料中禁止使用抗生素，所以养殖终端都在动物发病后额外加入抗生素，这样药物残留问题和耐药性也逐渐显现出来，所以本发明对中药进行酶解，有针对性的筛选菌株并综合利用，既可以有效的治疗和预防疾病，同时也不存在耐药性和药物残留的问题。
本发明的作用体现在：一方面因为纳豆芽孢杆菌具有显著的抗菌作用，可以产生多种抗菌素，如杆菌肽、多粘菌素等，具有广谱抗菌作用，对各种细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌等都具有一定的抗菌活性。同时能够促进有益菌的生长，有益菌可以与一些病原菌竞争的利用动物肠道内的营养物质，保持动物的肠道健康。另一方面本发明中的中药组合物经过特定的酶复合酶解后，可以将中药中的具有生物活性的物质更好的释放出来，在动物体内能够发挥很好的抗氧化、抗炎和抗菌的作用。同时本发明中额外加入维生素C和E，两者都有很好的抗氧化和提高机体免疫的功能，各因素协同作用，一方面可以良好的调节动物的肠道健康、同时结合中药组合的作用以及酶解后中药中具有生物活性的物质对动物产生的影响，能够达到显著的抗菌作用，同时可以提高机体的免疫机能，对于禽类由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎具有很好的防治效果。
需要说明的是：为了统一实验条件，虽然各实验例均采用了实施例2的饲料添加剂，但是其他实施例制备的添加剂也能够取得相当的效果，只是实施例2效果更加突出一些。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种防治禽坏死性肠炎的功能性饲料添加剂的制备方法，将饲料添加剂原料按比例混合均匀；
所述饲料添加剂原料的重量份数组成如下：
中药酶解混合物20-35份、纳豆芽孢杆菌4-9份、维生素C 4-10份、维生素E 4-10份，滑石粉40-60份；
其特征在于，所述纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)菌种保藏编号为CGMCC No.20659。
2.根据权利要求1所述饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述饲料添加剂原料的重量份数组成如下：中药酶解混合物为25-28份，纳豆芽孢杆菌为4-7份；维生素C为5-8份；维生素E为5-8份，滑石粉40-60份。
3.根据权利要求1所述饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述饲料添加剂原料的重量份数组成如下：中药酶解混合物为26份，纳豆芽孢杆菌为6份；维生素C为6份；维生素E为6份，滑石粉50份。
4.根据权利要求1-3任一所述饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述中药酶解混合物的制备方法如下：
青蒿30-40份、大黄15-25份、茵陈20-30份、穿心莲25-35份和果胶酶4-10份，纤维素酶4-10份、蛋白酶3-8份均匀混合，添加混合物总重量40％的水进行酶解，酶解温度为40℃，pH值6.0，水解48h，酶解后采用干燥处理，粉碎过40目筛备用。
5.根据权利要求4所述饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述中药酶解混合物的重量份数组成如下：青蒿30-35份、大黄15-20份、茵陈20-25份、穿心莲25-30份、果胶酶4-8份、纤维素酶4-8份、蛋白酶3-6份。
6.根据权利要求4所述饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述中药酶解混合物的重量份数组成如下：青蒿30份、大黄15份、茵陈20份、穿心莲25份、果胶酶4份、纤维素酶4份、蛋白酶3份。
7.根据权利要求4所述饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述中药酶解混合物的重量份数组成如下：青蒿33份、大黄18份、茵陈22份、穿心莲27份、果胶酶6份、纤维素酶6份、蛋白酶4份。
8.根据权利要求4所述饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述中药酶解混合物的重量份数组成如下：青蒿35份、大黄20份、茵陈25份、穿心莲30份、果胶酶8份、纤维素酶8份、蛋白酶6份。
9.根据权利要求4-8任一所述饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶由纳豆芽孢杆菌CGMCC No.20659制备。
10.根据权利要求9所述饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶的制备方法，包括如下步骤：
将纳豆芽孢杆菌，按照12％的接种比例接入牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，37℃、180r/min下恒温培养24h，活菌数达到4.0～6.0×108～4.0～6.0×109cfu/g，以2％接种量接种至液体发酵培养基，37℃、180r/min下恒温培养48h后取发酵液，5000r/min离心10min，取上清液即为蛋白酶粗酶液；
将硫酸铵缓慢加入上述的粗酶液中，直至25％饱和度，4-8℃过夜，8000rpm离心30min取上清液；在上清液中加硫酸铵至终饱和度为60％，4-8℃过夜，8000rpm离心30min，收集沉淀，取100mg沉淀用10mL 20mm的PB缓冲溶液复溶后，进行凝胶层析，层析柱为XK 26/100，20mm PB的缓冲溶液，流速为3mL/min，然后将收集的滤液进行阳离子交换层析，阳离子交换层析柱为Hitrap SP FF,用pH值7.0的20mm PB缓冲溶液洗脱优化，流速为2mL/min，洗脱后收集滤液进行干燥后得到蛋白酶粉末。
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