CN105166387A - 一种银杏叶生物饲料添加剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种银杏叶生物饲料添加剂的制备方法，以银杏叶为主要的固态发酵基质，以黑曲霉为菌株，在适宜的营养条件和培养条件下进行固态发酵，通过干燥、粉碎处理后，获得了该生物饲料添加剂，该生物饲料添加剂含有黄酮类化合物多种生物活性物质，能提高动物机体免疫力和抗氧化能力。同时生物转化后的产品营养价值及生物活性都有了较大幅度的提高，从而为复合型、多功能型银杏叶生物饲料添加剂的深入研究和开发打下了基础。

Description

一种银杏叶生物饲料添加剂的制备方法

技术领域

本发明属于生物饲料研制技术领域，具体涉及一种银杏叶生物饲料添加剂的制备方法。

背景技术

银杏(GinkgobilobaL.)是我国的特产果木和庭园植物。银杏除供食用外，亦可药用。银杏叶含有大量的黄酮类化合物，其药用功能主要是治疗冠状动脉硬化、脑血管疾病、心绞痛以及降低胆甾醇、降低血压、抑制某些细菌及真菌。目前，国内外对银杏的开发利用已经有多方面报道，如银杏茶、银杏饮料、银杏保健品等。随着消费者对畜产品品质要求的提高，防病促生长的激素及抗生素等易产生残留、抗药性和环境污染的化学类饲料添加剂的应用将逐渐受到限制或被陶汰。

黑曲霉(Aspergillusniger)，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。分生孢子梗自基质中伸出，直径15-20pm，长约1-3mm，壁厚而光滑。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状分生孢子。孢子直径2.5-4.0μm。分生孢子头球状，直径700-800μm，褐黑色。菌落蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状。背面无色或中央略带黄褐色。有时在新分离的菌株中能找到白色、圆形、直径约1mm的菌核。分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一，顶囊球形，双层小梗，而分生孢子褐色球形。

微生物饲料添加剂是指利用动物体内正常微生物及其代谢产物或生长促进物质经特殊加工工艺制成的制剂，它可以补充、调整或维持动物肠道内微生态平衡，起到防病治病，促进健康或提高生产性能的作用。微生物饲料添加剂既包括正常微生物，尤其是优势菌群，还包括由一些能促进正常微生物菌群生长繁殖的物质所制备的制剂，能产生一定的生物效应或生态效应。随着集约化、规模化、现代化动物养殖业的兴起，生物饲料添加剂得到越来越广泛的应用，生物饲料添加剂具有促进动物生长、提高饲料效率、改善畜产品品质、调节养殖生产、保持生态环境等方面的作用，对养殖业起到保障生产、降低成本、增加产量、改善质量、提高社会和生态效益的功效。而我国生物饲料添加剂研发方面的投入少、技术力量薄弱，以致在我国鲜有具有自己知识产权和特色的生物饲料添加剂。

本申请以资源丰富的银杏叶为原料，研究了固态培养一株对银杏叶抑制物不敏感的复合酶产生菌的较佳条件。初步结果表明，生物转化后的产品营养价值及生物活性都有了较大幅度的提高，从而为复合型、多功能型银杏叶生物饲料添加剂的深入研究和开发打下了基础。与此同时，研究成果将进一步提高银杏叶的综合利用和经济价值。

发明内容

本发明提供了一种银杏叶生物饲料添加剂的制备方法，旨在提供以银杏叶为主要原料，固体发酵法制备生物饲料添加剂，结果表明，生物转化后的产品营养价值及生物活性都有了较大幅度的提高，从而为复合型、多功能型银杏叶生物饲料添加剂的深入研究和开发打下了基础。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种银杏叶生物饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：

1)菌种活化

将黑曲霉菌种接入种子培养基中活化，孢子长满斜面后用无菌水制成孢子菌悬液；

2)固体发酵

称取固体发酵培养基于锥形瓶中，于121℃下灭菌30min，待冷却后于无菌室中接入活化的黑曲霉菌种，发酵培养；

3)制备饲料添加剂

对完成发酵后的物料进行干燥及粉碎处理，即得产品。

进一步，所述的种子培养基为：将葡萄糖20g、酵母膏5g、蛋白胨5g、琼脂粉10g加水煮沸，定容至1000mL，121℃，灭菌30min。

进一步，步骤(1)中活化条件为黑曲霉的菌活力为10⁷-10⁸个/mL。

进一步，所述的固体发酵培养基为：按质量含量银杏叶91％、麸皮4％、硫酸铵5％，及终浓度为1.5mmol/L的Cu²⁺，1.4mmol/LCa²⁺，1.3mmol/LMn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺，1mmol/L的Mg²⁺，1.25mmol/L的Zn²⁺，水分含量100％，于121℃下灭菌30min。

进一步，步骤(2)中发酵培养的条件为：含水量140％，发酵时间27h，发酵温度27℃，固体发酵培养基初始pH为4～7，装瓶量10g。

优选的，所述的固体发酵培养基初始pH为5。

本发明的有益效果为：对本发明产品中还原糖和黄酮含量进行测定，结果表明，固体发酵后，固体发酵物中还原糖含量增加，黄酮转移率提高，表明了优化了发酵培养基和发酵条件后发酵所得到的固体发酵物产品营养价值及生物活性都有了较大幅度的提高，从而为复合型、多功能型银杏叶生物饲料添加剂的深入研究和开发打下了基础。

附图说明

图1是C源种类对产还原糖含量的影响；

图2是C源含量对产还原糖含量的影响；

图3是N源种类对产还原糖含量的影响；

图4是N源含量对产还原糖含量的影响；

图5是金属离子对产还原糖含量的影响；

图6是含水量对产还原糖含量的影响；

图7是温度对产还原糖含量的影响；

图8是时间对产还原糖含量的影响；

图9是初始pH对产还原糖含量的影响；

图10是装瓶量对产还原糖含量的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

本发明以银杏叶为原料，固体发酵法制备生物饲料添加剂。以产还原糖含量为指标为指标，以黑曲霉作为出发菌株，然后对碳源、氮源和金属离子的种类及添加量进行比较优化固体发酵培养基；对培养基中含水量、发酵温度、发酵时间、培养基初始pH和装瓶量进行优化确定最佳发酵培养条件。对发酵生产的饲料添加剂进行黄酮等成分分析探讨生物饲料添加剂的可能应用前景。

实施例1

本发明提供了一种银杏叶生物饲料添加剂的制备方法，主要通过以下过程完成：

1)制备种子培养基

葡萄糖20g、酵母膏5g、蛋白胨5g、琼脂粉10g，加水煮沸，定容到1000mL。121℃，灭菌30min。

2)制备固体发酵基培养基

按质量含量银杏叶91％、麸皮4％、硫酸铵5％，及终浓度为1.5mmol/L的Cu²⁺，1.4mmol/LCa²⁺，1.3mmol/LMn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺，1mmol/L的Mg²⁺，1.25mmol/L的Zn²⁺，水分含量100％，于121℃下灭菌30min。

3)菌种活化

将实验室中冰箱中原有的黑曲霉保藏菌种取出，接入斜面种子培养基中活化。孢子长满斜面后用无菌水制成孢子菌悬液，用显微镜直接计数法计数，看黑曲霉的菌活力是否达到10⁷-10⁸个/mL，如果没有达到则继续活化，直至黑曲霉的菌活力达到10⁷-10⁸个/mL。

4)固体发酵

根据实验所需配制固体发酵培养基，称取10g于250mL的锥形瓶中，于121℃下灭菌30min，冷却。待冷却后于无菌室中接入适量的斜面种子，于27℃的恒温培养箱中培养27h，既得发酵产物。

实施例2发酵培养基的优化

1)碳源种类的选择

在基础培养基中分别加入2％麸皮、玉米面、葡萄糖、蔗糖、稻草、稻糠、水溶性淀粉等不同的碳源种类，进行固体发酵。不同的碳源对黑曲霉固体发酵银杏叶产还原糖的量都有着不同的影响。不同的碳源对其产还原糖含量的影响如表1和图1所示。

表1碳源种类对产还原糖含量的影响

碳源种类	还原糖含量(mg/g)
		麸皮	8.754
葡萄糖	8.050
		蔗糖	8.153
可溶性淀粉	6.985
		玉米面	7.964
稻草	7.534
		稻糠	7.053

在基础培养基中分别加入2％麸皮、玉米面、葡萄糖、蔗糖、稻草、稻糠、水溶性淀粉发酵，由图1、表1可看出，当用麸皮、蔗糖、葡萄糖和玉米面作为碳源时，固体发酵产生的还原糖量较高，考虑到麸皮的成本最低，因此，确定固体发酵的较佳碳源为麸皮。

2)碳源含量的确定

在碳源种类确定为麸皮的情况下，在基础培养基中的加入1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％的麸皮，其他条件一样，进行发酵。当氮源不同时，对黑曲霉固体发酵所得到的还原糖的含量也是不同的，其影响如表2和图2所示。

表2C源含量对产还原糖含量的影响

C源含量(％)	还原糖含量(mg/g)
		1	7.500
2	7.981
		3	8.462
4	9.098
		5	8.737
6	8.101
		7	7.569

从表2和图2得知，在基础培养基中的加入1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％的麸皮，其他条件一样，进行发酵，在碳源含量在1％-4％之间，产还原糖含量逐渐升高，4％时达到最高，在4％-7％之间，产还原糖含量逐渐降低。固选择在培养基中加入4％的麸皮。

3)氮源的选择

在基础培养基中分别加入2％尿素、硫酸铵、氯化铵、柠檬三酸铵、乙酸铵、草酸铵等不同的氮源，对固体发酵银杏叶产还原糖有着显著的影响，如表3和图3所示。

表3N源种类对产还原糖含量的影响

N源种类	还原糖含量mg/g
		硫酸铵	8.703
尿素	8.170
		乙酸铵	7.603
草酸铵	7.414
		氯化铵	7.741
柠檬三酸铵	6.813

从表3和图3得知，在基础培养基中分别加入2％尿素、硫酸铵、氯化铵、柠檬三酸铵、乙酸铵、草酸铵，其他条件一样，进行发酵，硫酸铵作为氮源时，固体发酵产生的还原糖量最高，产还原糖含量为8.703mg/g，柠檬三酸铵做氮源，产还原糖含量最少。所以，确定固体发酵的氮源为硫酸铵。

4)氮源含量的确定

在氮源种类确定为麸皮的情况下，所加的氮源含量不同，对黑曲霉固体发酵所得到的还原糖的含量也是不同的如表4和图4所示。

表4N源含量对产还原糖含量的影响

N源含量(％)	还原糖含量(mg/g)
		1	7.414
2	8.084
		3	8.514
4	9.132
		5	10.077
6	9.321
		7	8.703

从表4和图4得知，在基础培养基中的加入1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％的硫酸铵，其他条件一样，进行发酵，在培养基中加入5％的硫酸铵，所产生的还原糖含量最多，为10.077mg/g。所以选择5％的硫酸铵作为氮源。

5)金属离子的选择

在发酵培养基中分别加入浓度均为1mmol/L的Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、K⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Hg²⁺等，其他条件相同，发酵测定还原糖含量。不同的金属离子发酵所产还原糖含量影响不同，如图5所示。

结果如图5所示，为Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺对发酵或多或少的又促进作用，其中Cu²⁺对发酵的促进作用最强；而K⁺、Hg²⁺则对其有抑制作用。固选择对发酵具有促进作用的Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺进行研究。

选用N＝8的PlackettBurman实验设计，对上述试验中七个促进因素进行研究如表5所示，每个因素取2个水平:低水平“-1”(1mmol/L)和高水平“+1”(1.5mmol/L)，评价指标为产还原糖含量。

表5因素水平表

经过Plackett-Burman软件分析数据，得：

又因为“-1”＝1mmol/L、高水平“+1”＝1.5mmol/L

Solutions：

综上所述，1.5mmol/LCu²⁺为实验最佳条件，而分析最佳条件为1.5mmol/L的Cu²⁺、1.4mmol/LCa²⁺、1.3mmol/LMn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺，1mmol/L的Mg²⁺，1.25mmol/L的Zn²⁺。做两者验证实验，得到实验最佳条件下还原糖含量为12.129mg/g，而分析最佳条件下还原糖含量为12.583mg/g，比实验最佳方案条件下高，所以在1.5mmol/L的Cu²⁺，1.4mmol/LCa²⁺，1.3mmol/LMn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺，1mmol/L的Mg²⁺，1.25mmol/L的Zn²⁺的条件下进行发酵，可获得较好的发酵结果。

实施例3发酵条件的优化

1)含水量的影响

将培养基的含水量分别调成60％、80％、100％、120％、140％、160％、180％，进行发酵。发酵培养基的含水量不同，固体发酵产还原糖含量就有所不同如图6所示。

将培养基的含水量分别调成60％、80％、100％、120％、140％、160％、180％，进行发酵。结果表明，当含水量在60％-140％中，产还原糖含量随着含水量增加而增加，当含水量为140％时达到最大，在140％-180％中，最随之增加而减少。固当含水量为140％时达到最大，产还原糖含量最高。

2)发酵温度的影响发酵时间的影响

分别在21、24、27、30、33、37℃的培养箱中进行发酵，得到的还原糖含量也有不同如图7所示。

别在21、24、27、30、33、37℃的培养箱中进行发酵，结果表明，在21-27℃的范围内，还原糖含量随着温度增加而增加，在27℃的达到最大值，在27℃之后则反之。所以，在27℃发酵，产还原糖含量最高。

3)发酵时间的影响

分别于第48h、60h、72h、84h、96h、108h，测定还原糖含量，结果如图8所示。随着温度的升高，还原糖含量增加，在27h时达到最高，随后则随着时间的延长，还原糖含量越来越少。所以，发酵时间为27h时，发酵产还原糖含量最高

4)培养基初始pH的影响

用磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲溶液将培养基的初始pH分别调成3、4、5、6、7、8，发酵后所得还原糖含量有所不同如图9所示。当初始pH为3-5时，还原糖含量随pH增加而增加，在初始pH在5-8时，还原糖含量最随之增加而减小。在4-7之间的增加幅度不大，而当初始pH为3或8时，还原糖含量明显减少。

5)装瓶量的影响

分别以每瓶6g、8g、10g、12g、14g、16g的固体基质量装瓶，测定还原糖含量。分别在锥形瓶中加入不同量的培养基对产还原糖含量也有影响如图10所示。

结果表明，当装瓶量在6-10g时，产还原糖含量不断增加，在当装瓶量在10g时产还原糖含量最高。当装瓶量大于10g，产还原糖含量逐渐减小。所以，在装瓶量为10g时，发酵产还原糖含量最高。

6)发酵条件的正交试验

根据上述单因素试验结果，以含水量、发酵温度、原始pH和发酵时间作为考察的四个因素，每个因素三水平如表6所示，以产生还原糖含量为指标，用L₉(3⁴)正交表安排实验。

表6因素水平表

水平	A温度(℃)	B pH	C时间(h)	D含水量(％)
					1	30	4	60	160
2	27	5	72	140
					3	24	6	84	120

上述实验对各单因素与产还原糖含量的关系单独进行了考察，并确定了最佳发酵，但是，通常情况下各因素之间影响是相互作用的。单独考察的结果并不一定与实际情况相符。所以为了筛选与实际情况更接近的最佳发酵条件，在单因素研究结果的基础之上，再进一步进行正交实验，结果见表7。

表7正交实验设计与结果

表7结果说明：各因素对产还原糖含量的影响程度依次为：B>A>C>D，综合各因素k值和直接比较，B₁A₂C₂D₂为实验最佳条件，分析最佳条件为B₂A₂C₂D₂。做两者验证实验，得到实验最佳条件下还原糖含量为13.376mg/g，而分析最佳条件下还原糖含量为13.617mg/g，均比实验最佳方案条件下高，所以在含水量140％，发酵时间72h，发酵温度28℃，培养基初始pH为5，装瓶量10g的条件下进行发酵，可获得较好的发酵结果。

实施例4发酵产物黄酮含量测定

分别对未发酵的对照样和在含水量140％，发酵时间72h，发酵温度28℃，培养基初始pH为5，装瓶量10g的分析最佳条件下进行发酵所得到的发酵物中黄酮含量进行测定。

1)对照样品溶液制备

取干燥器中干燥48小时的槲皮素的对照品约2.8mg，山奈酚对照品约3mg和异鼠李素对照品约1.8mg，精密称量，置50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。

2)原料测定

分别称取干燥后的未发酵的对照样和发酵样各4.0g，加入75％的乙醇进行回流提取(三次)，用醇体积分别为6、3、3倍原料重量，每次回流时间为2h，过滤，合并回流提取液，用75％乙醇定容到50mL，取出10mL，加入甲醇：25％HCl＝4:1的溶液25mL，恒温水浴90-100℃回流水解30min，定容到50mL，0.45μm滤膜过滤后，注入高效液相色谱仪，进样，测定总黄酮含量。

计算公式：

式(3-1)

其中：R₁＝2.23、R₂＝2.63、R₃＝2.38

W₁＝槲皮素称重、W₂＝山奈素称重、W₃＝异鼠李素称重

W＝样品称重，H2O％为样品中的水分百分比。

根据上述公式以及对照样和样品在液相中的出峰情况计算，结果如下：

对照样中黄酮含量为2.74％，分析最佳中黄酮含量为1.84％在对照样中测得的黄酮含量大于在分析最佳发酵条件下发酵得到的固体发酵物中的黄酮含量，可见，在分析最佳的条件下发酵，银杏叶中的黄酮更多的转移出来，大大的提高了黄酮的利用率。

综上所述，优化发酵培养基实验中，以4％麸皮作为碳源，5％的(NH₄)₂SO₄作为氮源，1.5mmol/L的Cu²⁺、1.4mmol/LCa²⁺、1.3mmol/LMn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺，1mmol/L的Mg²⁺，1.25mmol/L的Zn²⁺做无机盐的培养基进行发酵，可获得较好的发酵结果。

优化发酵条件实验中，在含水量140％，发酵时间72h，发酵温度28℃，培养基初始pH为5，装瓶量10g的条件下进行发酵，可获得较好的发酵结果。

对优化条件后的发酵得到的固体发酵物中还原糖和黄酮含量进行测定，结果表明，固体发酵后，固体发酵物中还原糖含量增加，黄酮转移率提高，表明了优化了发酵培养基和发酵条件后发酵所得到的固体发酵物产品营养价值及生物活性都有了较大幅度的提高，从而为复合型、多功能型银杏叶生物饲料添加剂的深入研究和开发打下了基础。

Claims (6)

1.一种银杏叶生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）菌种活化

将黑曲霉菌种接入种子培养基中活化，孢子长满斜面后用无菌水制成孢子菌悬液；

2）固体发酵

称取固体发酵培养基于锥形瓶中，于121℃下灭菌30min，待冷却后于无菌室中接入活化的黑曲霉菌种，发酵培养；

3）制备饲料添加剂

对完成发酵后的物料进行干燥及粉碎处理，即得产品。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的种子培养基为：将葡萄糖20g、酵母膏5g、蛋白胨5g、琼脂粉10g加水煮沸，定容至1000mL，121℃，灭菌30min。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中活化条件为黑曲霉的菌活力为10⁷-10⁸个/mL。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的固体发酵培养基为：按质量含量银杏叶91%、麸皮4%、硫酸铵5%，及终浓度为1.5mmol/L的Cu²⁺，1.4mmol/LCa²⁺，1.3mmol/LMn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺，1mmol/L的Mg²⁺，1.25mmol/L的Zn²⁺，水分含量100%，于121℃下灭菌30min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中发酵培养的条件为：含水量140%，发酵时间27h，发酵温度27℃，固体发酵培养基初始pH为4~7，装瓶量10g。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的固体发酵培养基初始pH为5。