CN115644245A - 一种灵芝-猴头菇复合酸奶及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种灵芝‑猴头菇复合酸奶及其制备方法和用途，主要涉及乳制品领域；包括脱脂奶粉10‑15％、蔗糖2‑10％、明胶0.1‑0.5％、发酵剂0.1‑0.5％、灵芝‑猴头菇复合发酵液15‑25％、水；其中，灵芝‑猴头菇复合发酵液由灵芝发酵液和猴头菇发酵液组成，百分比为占原料总质量的质量百分比；本发明具有制作简单、成本低且所需周期短的特点，可直接发酵所得，能够提高资源利用率。
Description
技术领域
本发明涉及乳制品领域，具体是一种灵芝-猴头菇复合酸奶及其制备方法和用途。
背景技术
作为人们公认的一种集营养与保健为一体的功能性食品，酸奶已经逐渐成为一种大众食品。随着对酸奶品种的不断创新和研究，酸奶的种类和风味更加丰富，其中功能性酸奶比一般酸奶的营养价值和研究价值更高，成为酸奶产品研发的新趋势。近年来国内外的研究表明，食药用真菌毒副作用小，在提高免疫功能、降血脂、抗肿瘤、抗氧化活性、降血糖、抗衰老等方面具有良好的疗效，因此含食药用真菌提取物的功能性酸奶的研制已成为一个热点。但采用传统子实体抽提物的方式制作酸奶时，存在着成本较高、周期长，且制作利用率较低的问题。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种灵芝-猴头菇复合酸奶及其制备方法和用途，具有制作简单、成本低且所需周期短的特点，可直接发酵所得，能够提高资源利用率。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种灵芝-猴头菇复合酸奶，包括脱脂奶粉10-15％、蔗糖2-10％、明胶0.1-0.5％、发酵剂0.1-0.5％、灵芝-猴头菇复合发酵液15-25％、水；其中，灵芝-猴头菇复合发酵液由灵芝发酵液和猴头菇发酵液组成，百分比为占原料总质量的质量百分比。
优选的，包括脱脂奶粉13％、蔗糖10％、明胶0.3％、发酵剂0.3％、灵芝-猴头菇复合发酵液20％；其中，灵芝-猴头菇复合发酵液中的灵芝发酵液：猴头菇发酵液＝3:1。
优选的，发酵剂中，植物乳杆菌∶保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌＝3∶1∶1。
一种灵芝-猴头菇复合酸奶的制作方法，包括步骤：
S1、制备灵芝菌丝体、猴头菇菌丝体和灵芝-猴头菇复合发酵液；
S2、通过单因素实验确定发酵时间、发酵剂接种量、蔗糖添加量和灵芝-猴头菇发酵液添加比例这四个因素的最适值范围；
S3、通过正交实验确定复合酸奶的发酵时间、发酵剂添加量、蔗糖添加量以及灵芝-猴头菇复合发酵液添加比例最佳发酵条件组合；
S4、蔗糖、明胶、脱脂奶粉按比例称量，加入一定体积的热水后，充分搅拌，使其溶解，水浴加热灭菌，冷却后接种发酵剂，加入灭菌的灵芝-猴头菇发酵液，发酵后，制得灵芝-猴头菇复合酸奶。
优选的，步骤S1包括：
S11、将灵芝、猴头菇保存菌种接种于斜面培养基活化后，转移至平板培养基中，直至菌丝体铺满平板为止；
S12、在灵芝平板菌种上挑取菌栓，接入已灭菌并冷却至室温的液体培养基中，置于振荡培养箱，在30℃，转速180rpm避光恒温振荡培养7天，抽滤，备用；
S13、在猴头菇平板菌种上挑取菌栓，接入已灭菌并冷却至室温的液体培养基中，置于振荡培养箱，在26℃，转速150rpm避光恒温振荡培养7天，抽滤，备用。
优选的，步骤S4中，发酵条件为：42℃保温发酵，转至4℃后发酵12h。
优选的，所述步骤S2、S3中，按照感官评分标准进行感官评分，取平均值为最终结果，包括灵芝-猴头菇复合酸奶理化性质、感官指标、微生物指标的测定；
理化性质测定：灵芝-猴头菇复合酸奶的酸度、持水力、pH、糖类含量和蛋白质含量；
感官指标测定：从样品酸奶的色泽、滋味和气味以及组织状态三个方面按照感官评分标准进行评分；
微生物指标的测定：酵母菌含量不超过100CFU/mL，霉菌不超过30CFU/mL，大肠杆菌不超过90MPN/mL，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均不得检出。
一种灵芝-猴头菇复合酸奶的用途，用于保健食品。
对比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明的灵芝-猴头菇复合酸奶，通过灵芝发酵液、猴头菇发酵液与各辅料按适当比例制得，此法制得的酸奶为保健型酸奶，它以真菌胞外多糖为功能成分。而现有的真菌酸奶大多是以真菌的子实体及其浸出汁为原料，并且多以添加单种真菌的形式制取，但因所用真菌的形态、组分不同，致使其药理活性成分的含量不全，并且加工工艺复杂，成本过高。而利用液体发酵工艺生产真菌菌种，生产条件稳定，有利于机械化、自动化，菌丝体生长均匀一致，菌龄整齐，周期短，产量高，便于大规模工业化生产。
2、本发明以液体发酵生产灵芝和猴头菇的菌种，获得发酵液，并将灵芝和猴头菇的发酵液以一定比例或分别单独添加到酸奶中，制成凝固型功能酸奶产品，与普通酸奶相比，其营养价值更高、风味更独特。不但保留了普通酸奶的优点，而且优化了食药用真菌酸奶的制作工艺。
3、传统的食用菌类保健功能食品多以子实体为原料，采取的传统工艺生产周期长，工艺复杂，增加了生产成本，或因资源不足使产量受到限制。本发明制备的灵芝、猴头菇发酵液所需周期短，可直接发酵所得；发酵液与使用传统子实体抽提物的方式对比具有更高的资源利用率和市场开发价值。运用现代生物发酵技术，将灵芝和猴头菇的发酵液与脱脂乳加入乳酸菌一起发酵，将食药用真菌和酸奶的营养和保健功能融为一体，发挥两者的功效，开发成新的酸奶制品，对促进食品开发、满足人们不断提高的饮食要求有积极的作用。
附图说明
图1是灵芝-猴头菇复合酸奶的技术路线；
图2是苯酚-硫酸法绘制葡萄糖标准曲线；
图3是DNS比色法绘制葡萄糖标准曲线；
图4是DNS考马斯亮蓝法绘制蛋白标准曲线；
图5是灵芝-猴头菇复合酸奶单因素实验结果图；
图6是酸奶样品发酵前后总糖、还原糖和多糖含量测定结果图；
图7是酸奶样品发酵前后蛋白质含量测定结果图；
图8是酸奶样品中的乳酸菌总数的测定结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所限定的范围。
众所周知，酸奶中的乳酸菌对肠道菌群有平衡和改善的功能，能够降低血液中的胆固醇含量，预防心血管疾病，对胃病、便秘等也有一定的疗效。研究已知灵芝、猴头菇液体发酵提取物的添加均可促进乳酸菌增殖并可显著促进嗜热链球菌增殖生长，可增加酸奶中挥发性风味物质种类，有助于酸奶中风味的改善，使得酸奶中各类化合物分布更加分散、合理，改进其风味。通过液体发酵所得的发酵液中分别含有真菌的胞外多糖，利用这些特点可研制食药用真菌复合酸奶。
实施例1：本发明所述是一种灵芝-猴头菇复合酸奶，以灵芝发酵液、猴头菇发酵液、脱脂乳为主要原料制作而成，包括脱脂奶粉10-15％、蔗糖2-10％、明胶0.1-0.5％、发酵剂0.1-0.5％、灵芝-猴头菇复合发酵液15-25％、水；其中，灵芝-猴头菇复合发酵液由灵芝发酵液和猴头菇发酵液组成，百分比为占原料总质量的质量百分比。
通过单因素实验，分别确定灵芝-猴头菇复合酸奶中的发酵剂接种量、灵芝-猴头菇发酵液或灵芝-猴头菇菌丝粉添加比例、蔗糖添加量和发酵时间这四个因素的最适范围。采用四因素三水平的正交实验分别研究二种灵芝-猴头菇复合酸奶的最优方案，结果表明：灵芝-猴头菇发酵液复合酸奶的最优方案为发酵剂添加量0.3％，灵芝-猴头菇复合发酵液20％，灵芝-猴头菇复合发酵液添加比例3：1(灵芝发酵液：猴头菇发酵液)，蔗糖添加量10％，脱脂奶粉13％，明胶0.3％，发酵时间8h。产品组织细腻，质地均匀，具有自然发酵乳香和灵芝、猴头菇发酵液带有的淡淡清香。
优选的，发酵剂中，植物乳杆菌∶保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌＝3∶1∶1。
实施例2：一种灵芝-猴头菇复合酸奶的制作方法，包括步骤：
S1、制备灵芝菌丝体、猴头菇菌丝体和灵芝-猴头菇复合发酵液。
具体的，步骤S1包括：
S11、将灵芝、猴头菇保存菌种接种于斜面培养基活化后，转移至平板培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养8天左右，直至菌丝体铺满平板为止；
S12、在灵芝平板菌种上挑取3-4块黄豆大小的菌栓，接入已灭菌并冷却至室温的液体培养基中，置于振荡培养箱，在30℃，转速180rpm避光恒温振荡培养7天，抽滤，备用；
S13、在猴头菇平板菌种上挑取3-4块黄豆大小的菌栓，接入已灭菌并冷却至室温的液体培养基中，置于振荡培养箱，在26℃，转速150rpm避光恒温振荡培养7天，抽滤，备用。
具体的培养基配方和培养条件如下：
①平板菌种培养：灵芝PDA培养基配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，K2HPO4 3g/L，琼脂20g/L，MgSO4 1.5g/L，pH自然。猴头菇PDA培养基配方为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，酵母膏1g/L，KH2PO42g/L，MgSO41g/L，维生素B1 0.1g/L，pH6.5。将灵芝、猴头菇保存菌种接种于斜面培养基活化后，转移至平板培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养8天左右，直至菌丝体铺满平板为止。
②液体发酵培养：
灵芝发酵培养基：葡萄糖36g/L，蛋白胨4g/L，酵母浸粉0.2g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，维生素B1 0.05g/L，pH6.0。在无菌条件下，灵芝液体培养基接入活化的灵芝平板菌种3块，每块约0.5cm2，置于转速为180r/min、温度为30℃的恒温振荡器上培养7d。待培养液清亮，收集发酵液。抽滤得到发酵液，用8层纱布过滤后灭菌备用。
猴头菇发酵培养基：葡萄糖30g/L，可溶性淀粉20g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 1g/L，维生素B1 0.1g/L，初始pH为5.5。在无菌条件下，猴头菇液体培养基接入活化的猴头菇平板菌种3块，每块约0.5cm2，置于转速为150r/min、温度为25℃的恒温振荡器上培养7d。待培养液清亮，收集发酵液。抽滤得到发酵液，用8层纱布过滤后灭菌备用。
S2、通过单因素实验确定发酵时间、发酵剂接种量、蔗糖添加量和灵芝-猴头菇发酵液添加比例这四个因素的最适值范围。
S3、通过正交实验确定复合酸奶的发酵时间、发酵剂添加量、蔗糖添加量以及灵芝-猴头菇复合发酵液添加比例最佳发酵条件组合。
步骤S2、S3中，酸奶基础配方，按蔗糖6％,明胶0.3％，脱脂奶粉13％，95℃10min灭菌。冷却后接种发酵剂6％，8h保温发酵，转至4℃后熟。
步骤S2中，单因素实验，选取对酸奶发酵工艺有显著影响的4个因素，即乳酸菌(酸奶发酵剂)添加量(2％、4％、6％、8％、10％)、发酵液添加量(10％、15％、20％、25％、30％)、蔗糖添加量(2％、4％、6％、8％、10％)和发酵时间(7h、8h、9h、10h、11h)，通过单因素实验可以确定乳酸菌、发酵液、蔗糖和发酵时间四个因素的最适添加量。
步骤S3中，正交实验，根据单因素实验乳酸菌、发酵液、蔗糖和发酵时间四个因素最适添加量设计4因素3水平的正交实验，确定最优发酵工艺。
优选的，所述步骤S2、S3中，按照感官评分标准进行感官评分，取平均值为最终结果，包括灵芝-猴头菇复合酸奶理化性质、感官指标、微生物指标的测定；
理化性质测定：灵芝-猴头菇复合酸奶的酸度、持水力、pH、糖类含量和蛋白质含量；
感官指标测定：从样品酸奶的色泽、滋味和气味以及组织状态三个方面按照感官评分标准进行评分；
微生物指标的测定：酵母菌含量不超过100CFU/mL，霉菌不超过30CFU/mL，大肠杆菌不超过90MPN/mL，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均不得检出。
S4、蔗糖，明胶，脱脂奶粉按比例称量，加入一定体积的热水，充分搅拌，使其溶解，95℃水浴加热10min灭菌，冷却至35-40℃后接种发酵剂，加入灭菌的灵芝-猴头菇发酵液，42℃保温发酵，转至4℃后发酵12h，制得灵芝-猴头菇复合酸奶。
注：发酵剂含植物乳杆菌∶保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌＝3∶1∶1；
灵芝-猴头菇发酵液总的添加量为20％，灵芝发酵液量：猴头菇发酵液量＝0∶1、1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、2∶3、3∶1、3∶2，即灵芝发酵液量：猴头菇发酵液量＝0％∶20％、20％∶0％、10％∶10％、6.7％∶13.3％、5％∶15％、13.3％∶6.7％、8％∶12％、15％∶5％、12％∶8％。
本发明对上述制备所得的酸奶样品进行活菌量、酸度、pH、持水力、糖类和蛋白质检测。结果表明，与未添加发酵液的酸奶样品相比，添加了灵芝-猴头菇发酵液的酸奶样品的乳酸菌总数显著地增加了。表明灵芝、猴头菇的发酵液和菌丝粉均对酸乳发酵过程中乳酸菌的生长有促进作用，这可能是因为发酵液、菌丝粉中不仅含有多糖，还含有乳酸菌生长所需的维生素、氨基酸、核苷酸、肽类等小分子化合物，这些是已知的酸乳发酵剂菌种的促生长因子。灵芝-猴头菇发酵液复合酸奶的pH值均在4.5左右，达到酸奶生产的最终pH值的要求。持水性较普通酸奶更好，因为添加的灵芝、猴头菇发酵液中含有大量的真菌多糖，电子扫描显微技术研究表明，菌体细胞通过丝状的多糖与周围的蛋白质凝块相连形成复杂而稳定的网络结构。这种网络结构的形成有利于改善发酵乳的流变特性，减少酸奶乳清析出。灵芝-猴头菇发酵液复合酸奶中总糖、还原糖含量减少，而多糖少部分降解为单糖，大部分得以保留。有研究表明在酸性条件下一部分多糖可降解为单糖，为乳酸菌提供发酵所需的碳源，促进乳酸菌增殖。发酵后的灵芝-猴头菇发酵液复合酸奶中蛋白质含量显著降低，蛋白质降解会产生氨基酸，对乳酸菌的增殖可能有促进作用。
实施例3：将灵芝-猴头菇复合酸奶用于保健食品。
实施例4：本发明的研究的技术路线见图1
一、单因素实验和正交实验
①单因素实验：
选取对酸奶发酵工艺有显著影响的4个因素，即发酵剂添加量(0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％)、灵芝-猴头菇发酵液或灵芝-猴头菇菌丝粉的添加比例(灵芝：猴头菇＝0∶1、1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、2∶3、3∶1、3∶2)、蔗糖添加量(2％、4％、6％、8％、10％)和发酵时间(8h、9h、10h、11h、12h)，通过单因素实验可以确定发酵剂接种量、灵芝-猴头菇发酵液、蔗糖添加量和发酵时间这四个因素的最适值。
②正交实验：
在单因素实验结果的基础上，以发酵剂接种量、灵芝-猴头菇发酵液或灵芝-猴头菇菌丝粉添加比例、蔗糖添加量和发酵时间为因素，设计4因素3水平的正交实验，确定灵芝-猴头菇复合酸奶的最优发酵工艺条件。
③感官评分标准
单因素实验和正交实验均按照感官评分标准进行感官评分，参照酸乳卫生标准发酵乳感官评鉴细则RHB 104—2020进行鉴评，满分为100分，取平均值为最终结果。
表1感官评分标准
Table.1 Evaluation standards of sensory
二、酸奶样品酸度、pH、持水力检测
以正交实验设计的最优方案来制备灵芝-猴头菇复合酸奶样品，并测定样品中乳酸菌总数、酸度、pH、持水力，确定酸奶样品是否均符合酸乳卫生标准。
①酸度的测定：在5mL样品中加水10mL，酚酞0.5mL，用0.1N NaOH滴定，出现粉红色为滴定终点，重复3次，公式为：
式中：c：NaOH浓度；w：酸奶样品质量；V：NaOH体积；V0：空白组NaOH体积
②pH的测定：取10mL的样品用pH计进行测定。
③持水力的测定：取大约20g酸奶置于50mL离心管中，精确称量并记录离心管的质量为W1，加入酸奶后的质量为W2，3500r/min离心(4℃)30min，弃去上清液，精确称量并记录质量W3，平行测定三次，公式为：
样品的持水力(％)＝(W3－W1)/(W2－W1)×100％
三、酸奶样品糖类和蛋白含量检测
①酸奶样品中总糖、还原糖和多糖的测定：苯酚-硫酸法测定样品中的总糖含量
苯酚-硫酸法测定总糖的标准曲线见图2：
标准曲线回归方程为：
y＝0.0078x+0.1917，R2＝0.9943
其中y：吸光度；x：葡萄糖浓度(μg/mL)
结果表明，无水葡萄糖在10-90μg/mL浓度范围内与吸光度成良好的线性关系。
②3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖含量
DNS比色法测定还原糖的标准曲线见图3：
标准曲线回归方程为：
y＝0.0006x-0.0106，R2＝0.9984
其中y：吸光度；x：葡萄糖浓度(μg/mL)
结果表明，无水葡萄糖在200-1000μg/mL浓度范围内与吸光度成良好的线性关系。
③样品中多糖含量的测定是通过总糖含量减去还原糖的含量得到的。
④酸奶样品中蛋白含量的检测
酸奶样品中的蛋白质含量的测定按照考马斯亮蓝法测定。实验原理是考马斯亮蓝G-250是一种蛋白染料，通过疏水作用与蛋白质相结合，产生蛋白质-染料复合物，最大吸收波长为595nm，在一定的浓度范围内，与蛋白质的含量成正比。具体操作按考马斯亮蓝蛋白试剂盒方法进行。
考马斯亮蓝法测定蛋白的标准曲线见图4：
标准曲线回归方程为：
y＝0.0027x+0.2169，R2＝0.9809
其中y：吸光度；x：蛋白标准(μg/mL)
结果表明，蛋白标准在25-500μg/mL浓度范围内与吸光度成良好的线性关系。
四、酸奶样品微生物指标检测
乳酸菌总数和致病菌数量依据国标GB 4789.2-2016进行测定。
表2酸奶微生物指标安全检测标准
Table 2 Safety testing standards for microbial indicators of yoghurt
微生物培养基配方如下：
MRS培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏粉5.0g/L，酵母膏粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，K2HPO42.0g/L，乙酸钠5.0g/L，琼脂15.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，Tween-80 1mL/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.2g/L，硫酸锰(MnSO4·4H2O)0.05g/L，pH 6.2。
孟加拉红培养基：蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，琼脂15.0g/L，孟加拉红0.033g/L，氯霉素0.1g/L。
SS琼脂培养基：牛肉膏粉5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，乳糖10.0g/L，琼脂15.0g/L，三号胆盐3.5g/L，中性红0.025g/L，硫代硫酸钠8.5g/L，柠檬酸铁1.0g/L，柠檬酸钠8.5g/L，煌绿0.00033g/L。
实施例5：灵芝-猴头菇复合酸奶单因素实验
灵芝-猴头菇复合酸奶按13％的脱脂奶粉，6％的蔗糖，0.3％的明胶，0.3％的发酵剂和20％发酵液的基础配方配制，42℃保温发酵10h，转至4℃后发酵12h。
发酵剂添加量分别为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％，灵芝-猴头菇发酵液添加比例为0∶1、1∶0、1∶1、2∶1、3∶1、1：2、3∶2、1∶3、2：3(发酵液总的添加量为20％)，蔗糖添加量为2％、4％、6％、8％、10％，发酵时间为8h、9h、10h、11h、12h时，通过单因素实验可以确定发酵剂添加量、灵芝-猴头菇发酵液添加比例、蔗糖添加量和发酵时间四个因素的最适范围，实验结果见图5，其中A是发酵剂添加量对酸奶感官指标的影响；B是灵芝-猴头菇发酵液添加比例对酸奶感官指标的影响，C是蔗糖添加量对酸奶感官指标的影响，D是发酵时间对酸奶感官指标的影响，感官指标指酸奶品鉴人员的感官评分平均值。
由图5(A)可知，发酵剂的添加量为0.3％时，灵芝-猴头菇发酵液复合酸奶的感官评价最佳，组织状态较好，风味最佳，乳酸菌的添加量为0.1％和0.5％时，凝乳不均匀，质地粗糙，因此确定0.2％、0.3％、0.4％为正交实验设计中发酵剂添加量的3个水平；
由图5(B)可知，灵芝-猴头菇发酵液添加比例为3：1、3：2、1：3时酸奶的感官指标较高，酸奶组织状态较好，除有自然的发酵滋味和气味外，还含有发酵液特有的菌香，无异味，酸甜比适中。而其他添加比例的酸奶异味较大，没有良好的酸奶风味。因此，确定灵芝-猴头菇发酵液添加比例为3：1、3：2、1：3为正交实验设计的中灵芝-猴头菇发酵液添加比例的3个水平；
由图5(C)可知，蔗糖添加量为8％时，酸奶组织较细腻，质地均匀，酸甜适中，而蔗糖添加量为2％、4％时，酸奶过酸。因此，确定6％、8％、10％为正交实验设计中蔗糖添加量的3个水平；
由图5(D)可知，发酵时间为10h时可以使酸奶的组织状态达到最佳，乳清析出量较少，发酵时间为8h和9h时比11h、12h时的感官评价更高且差异明显。因此，确定8h、9h、10h为正交实验设计中发酵时间的3个水平。
实施例6：正交实验设计与结果
根据单因素实验确定的蔗糖添加量、灵芝-猴头菇发酵液添加比例、蔗糖添加量、发酵时间和发酵剂添加量四个因素的最适范围，设计四因素三水平L9(43)的正交实验。
表3灵芝-猴头菇复合酸奶正交实验设计因素和水平
Table 3 Design factors and level of orthogonal experimental design ofcompound yogurt with Ganoderma lucidum-Hericium erinaceus fermentation broth
表4灵芝-猴头菇复合酸奶正交实验结果
Table 4 The orthogonal experimental results of compound yogurt withGanoderma lucidum-Hericium erinaceus fermentation broth
表5方差分析表
Table 5 Analysis of variancetable
注：*p＜0.05
由表3-5直观分析可以看出，四个因素的极差值B＞A＞D＞C，因素主次顺序为灵芝-猴头菇发酵液添加比例＞蔗糖添加量＞发酵剂添加量＞发酵时间。最佳发酵条件为A3B1C1D2，即蔗糖添加量10％，灵芝-猴头菇发酵液添加比例3：1(灵芝：猴头菇)，发酵时间8h，发酵剂接种量0.3％。由表5方差分析可知灵芝-猴头菇复合发酵液添加比例对灵芝-猴头菇复合酸奶的影响显著，其他因素不显著，与直观分析结果一致。灵芝-猴头菇发酵液中含有的灵芝、猴头菇多糖和灵芝三萜类化合物等活性成分能促进乳酸菌增殖并可显著促进嗜热链球菌增殖生长，可增加酸奶中挥发性风味物质种类，有助于酸奶风味的改善，使酸奶中各类化合物分布更加分散、合理，从而促进其代谢产物和相关酶的合成，对酸奶品质有很大影响，可影响其色泽，乳清析出量以及组织状态和口感。
实施例7：酸奶样品发酵前后总糖、还原糖、多糖含量的测定
根据总糖和还原糖的标准曲线回归方程分别计算灵芝-猴头菇复合酸奶样品和对照酸奶在发酵前和发酵后的总糖、还原糖及多糖含量，结果见图6，图6中A、B分别为不含发酵液的酸奶和灵芝-猴头菇复合酸奶发酵前后总糖、还原糖和多糖的含量变化。
实验结果表明，发酵前灵芝-猴头菇复合酸奶的总糖、多糖数量高于不添加发酵液的酸奶，其中添加灵芝-猴头菇复合发酵液的酸奶样品中的总糖、多糖数量较多。与发酵前相比，酸奶发酵后的总糖、还原糖和多糖的含量较发酵前均有所下降，其中各组酸奶样品中多糖的含量在发酵前后变化较小。在酸奶发酵过程中，乳酸菌不能利用多糖，因此发酵过程中多糖含量变化不大。多糖含量＝总糖含量－还原糖含量。因此总糖含量的下降主要是由于还原糖的降低，乳酸菌属于化能异氧型微生物，能够利用碳源分解代谢，在酸奶发酵过程中，乳酸菌通过自身生长代谢利用酸奶中的葡萄糖、乳糖等还原糖转化为乳酸。一部分多糖在酸性条件下可降解为单糖，被乳酸菌用来发酵。
发酵前，添加发酵液的酸奶中的多糖含量，高于未添加发酵液的对照酸奶的多糖含量。这主要是因为添加的灵芝、猴头菇发酵液中含有大量的多糖。灵芝多糖和猴头菇多糖可以清除胆固醇，起到降血脂的作用。而且具有改善酸奶的品质的特性，如增加酸奶的黏度、流变性、防止乳清析出、增强凝乳强度，从而改善产品的组织状态和口感。而且可以促进乳酸菌增殖，补充酸奶的营养保健功能。因此灵芝-猴头菇复合酸奶比普通酸奶具有更高的营养价值和保健功效。
实施例8：酸奶样品发酵前后蛋白质含量的测定
用考马斯亮蓝试剂盒分别测定发酵前后对照酸奶、灵芝-猴头菇复合酸奶中的蛋白质含量，结果见图7。
注：与未添加的酸奶样品相比，*p＜0.05。
如图7所示，各组酸奶样品的蛋白含量均符合GB 19302-2010《食品安全国家标准发酵乳》中对发酵乳制品蛋白质>2.3％的要求。在发酵前，与不含发酵液的对照酸奶样品相比，添加发酵液的酸奶样品中的蛋白质含量均显著地增大。活性乳酸菌是酸奶的核心成分，能分泌多种酶。乳酸菌的蛋白酶水解系统对于乳酸菌在乳中的生长是必需的，酸奶在发酵过程中乳酸菌分泌蛋白酶和肽酶，降解酪蛋白和多肽，产生小分子肽和氨基酸，这些小分子肽和氨基酸具有重要生理活性作用。添加灵芝和猴头菇的、发酵液后，促进乳酸菌的繁殖，使得蛋白酶分泌增加，从而使蛋白质降解程度更高。发酵后的蛋白含量明显比发酵前的蛋白含量低，氨基酸含量增加，更有利于人体的吸收。
实施例9：酸奶样品微生物指标的测定
(1)酸奶样品乳酸菌总数的测定，如图8所示，其中，与未添加发酵液的酸奶样品相比，*p＜0.05。
乳酸菌活菌数量直接影响着酸奶的发酵程度和营养价值的高低。如图8所示，两组样品的乳酸菌的活菌数均在109CFU/mL以上，乳酸菌数量均达到GB19302-2010《食品安全国家标准发酵乳》中乳酸菌数≥1.0×106CFU/mL的要求。与未添加发酵液的酸奶样品相比，添加了灵芝、猴头菇发酵液的酸奶样品的乳酸菌总数显著地增加了。表明灵芝、猴头菇的发酵液对酸乳发酵过程中乳酸菌的生长有促进作用，这可能是因为发酵液中不仅含有多糖，还含有乳酸菌生长所需的维生素、氨基酸、核苷酸、肽类等小分子化合物，这些是已知的酸乳发酵剂菌种的促生长因子。
(2)酸奶样品致病菌的测定
表6酸奶样品中致病菌的检测结果
Table 6 Testing results of pathogenic bacteria in yogurt samples.
灵芝-猴头菇复合酸奶样品，酵母菌数量未超过100个，霉菌数量未超过30个，大肠杆菌未超过90个，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌均未检出，符合GB 19302-2010《食品安全国家标准发酵乳》中对发酵乳制品微生物指标的要求。
Claims (8)
1.一种灵芝-猴头菇复合酸奶，其特征在于：包括脱脂奶粉10-15％、蔗糖2-10％、明胶0.1-0.5％、发酵剂0.1-0.5％、灵芝-猴头菇复合发酵液15-25％、水；其中，灵芝-猴头菇复合发酵液由灵芝发酵液和猴头菇发酵液组成，百分比为占原料总质量的质量百分比。
2.根据权利要求1所述的一种灵芝-猴头菇复合酸奶，其特征在于：包括脱脂奶粉13％、蔗糖10％、明胶0.3％、发酵剂0.3％、灵芝-猴头菇复合发酵液20％；其中，灵芝-猴头菇复合发酵液中的灵芝发酵液：猴头菇发酵液＝3:1。
3.根据权利要求1所述的一种灵芝-猴头菇复合酸奶，其特征在于：发酵剂中，植物乳杆菌∶保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌＝3∶1∶1。
4.一种灵芝-猴头菇复合酸奶的制作方法，其特征在于：包括步骤：
S1、制备灵芝菌丝体、猴头菇菌丝体和灵芝-猴头菇复合发酵液；
S2、通过单因素实验确定发酵时间、发酵剂接种量、蔗糖添加量和灵芝-猴头菇发酵液添加比例这四个因素的最适值范围；
S3、通过正交实验确定复合酸奶的发酵时间、发酵剂添加量、蔗糖添加量以及灵芝-猴头菇复合发酵液添加比例最佳发酵条件组合；
S4、蔗糖、明胶、脱脂奶粉按比例称量，加入一定体积的热水后，充分搅拌，使其溶解，水浴加热灭菌，冷却后接种发酵剂，加入灭菌的灵芝-猴头菇发酵液，发酵后，制得灵芝-猴头菇复合酸奶。
5.根据权利要求4所述的一种灵芝-猴头菇复合酸奶的制作方法，其特征在于：步骤S1包括：
S11、将灵芝、猴头菇保存菌种接种于斜面培养基活化后，转移至平板培养基中，直至菌丝体铺满平板为止；
S12、在灵芝平板菌种上挑取菌栓，接入已灭菌并冷却至室温的液体培养基中，置于振荡培养箱，在30℃，转速180rpm避光恒温振荡培养7天，抽滤，备用；
S13、在猴头菇平板菌种上挑取菌栓，接入已灭菌并冷却至室温的液体培养基中，置于振荡培养箱，在26℃，转速150rpm避光恒温振荡培养7天，抽滤，备用。
6.根据权利要求4所述的一种灵芝-猴头菇复合酸奶的制作方法，其特征在于：步骤S4中，发酵条件为：42℃保温发酵，转至4℃后发酵12h。
7.根据权利要求4所述的一种灵芝-猴头菇复合酸奶的制作方法，其特征在于：所述步骤S2、S3中，按照感官评分标准进行感官评分，取平均值为最终结果，包括灵芝-猴头菇复合酸奶理化性质、感官指标、微生物指标的测定；
理化性质测定：灵芝-猴头菇复合酸奶的酸度、持水力、pH、糖类含量和蛋白质含量；
感官指标测定：从样品酸奶的色泽、滋味和气味以及组织状态三个方面按照感官评分标准进行评分；
微生物指标的测定：酵母菌含量不超过100CFU/mL，霉菌不超过30CFU/mL，大肠杆菌不超过90MPN/mL，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均不得检出。
8.一种灵芝-猴头菇复合酸奶的用途，其特征在于：用于保健食品。
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