KR20210117781A

KR20210117781A - 미세먼지에 의한 호흡기 손상을 예방 및 개선하는 손바닥선인장 조성물

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Publication number: KR20210117781A
Application number: KR1020200034482A
Authority: KR
Inventors: 박인재; 장민철; 김현정; 김봉균; 김진석; 김진성; 김승형
Original assignee: 주식회사 휴럼
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2021-09-29

Abstract

본 발명은 미세먼지를 원인으로 하여 발생하는 호흡기 손상을 예방하거나, 미세먼지를 원인으로 하여 손상된 호흡기를 개선하는 천연물인 손바닥선인장 조성물에 관한 것이다.
이러한 본 발명인 미세먼지에 의한 호흡기 손상을 예방 및 개선하는 손바닥선인장 조성물은 손바닥선인장 추출물을 유효성분으로 하여 미세먼지에 의한 호흡기 손상을 예방 및 개선하는 효능을 가지며, 상기 손바닥선인장 추출물은 열수추출법 또는 주정추출법으로 획득된다.

Description

미세먼지에 의한 호흡기 손상을 예방 및 개선하는 손바닥선인장 조성물{Prickly pear composition to prevent respiratory damage caused by fine dust and improve respiratory damage caused by fine dust}

본 발명은 미세먼지에 의한 호흡기 손상의 예방과 개선하기 위한 조성물에 관한 것이다.

상세하게는 미세먼지에 의한 호흡기 손상의 예방하고 개선 효능을 가지는 손바닥선인장으로부터 획득되는 조성물에 관한 것이다.

산업의 발달은 인간에게 많은 편리함을 주고 있는 반면, 다양한 부작용을 주고 있으며, 다양한 부작용 중의 하나인 환경오염의 심각성을 날로 심해지고 있는 실정이다.

산업의 발달에 의한 환경오염 또한 물의 오염, 토양의 오염, 기후 변화 및 대기의 오염 등 다양하게 나타나고 있다.

상기 환경오염 중 대기의 오염 또한 점점 심각해지고 있으며, 대기의 오염 중 미세먼지에 의한 피해 역시 예측하기 힘들정도로 심각해지고 있다.

많은 사람들이 미세먼지에 인한 호흡기 손상 및 질환에 대하여 불편함을 호소하고 있다.

본 발명에서는 미세먼지에 인한 호흡기 손상을 예방하고 개선하고자 손바닥선인장을 선택하여 이용하고 있다.

손바닥선인장은 일명 백년초라고 불리우며, 주성분이 88-95%의 물로 구성되어 있으며, 그외에 영양학적으로나 약리학적으로 인체에 유익한 탄수화물, 식이섬유, 비타민, Ca, Mg등의 무기질, 성인병의 원인이 되는 콜레스테롤이나 지방함량을 낮추어 주는 펙틴성분, 항암작용이 있는 페놀물질과 플라보노이드 성분 등을 함유하고 있다.

이러한 손바닥선인장의 영양학적 및 약리학적 작용효과는 민간요법을 통하여 널리 알려져 있다.

손바닥선인장은 해열진정, 인후통 완화, 기관지천식, 화상치료, 혈액순화촉진, 어혈제거, 당뇨, 콜레스테롤 억제는 물론 노화억제 및 변비예방, 장의 활성화, 항암작용, 이뇨작용 등에 필요한 성분을 많이 함유하고 있는 것으로 나타났다(중약대사전, 본초강목, 가정한방의학 등 참조)

손바닥선인장의 효능에 힘입어 다양한 기술이 연구 및 개발되고 있으며, 다양한 특허기술이 특허문헌으로 제공되고 있다.

특허등록 제10-0337472호인 손바닥선인장 열매엑기스를 함유한 건강식품음료조성물과, 특허등록 제10-0315330호인 손바닥선인장 열매분말 또는 농축액을 함유한 건강식품캡슐의 제조방법에서는 외피가 매우 견고하고 두꺼운 특성에 의하여 이용이 어려운 손바닥선인장 열매가 가지는 효능을 활용하고자 하는 기술이 제공되어 있다.

특허등록 제10-0586326호인 손바닥 선인장을 이용한 버섯균사체의 대량배양 및 그 버섯균사체에서는 버섯 균사체를 경제적으로 대량배양하며, 배양액 중 손바닥 선인장의 기능성을 함유하는 배양물을 제조하고, 그 배양물로부터 생리활성물질을 추출할 수 있게 하는 버섯 균사체의 배양방법을 제공하며, 배양된 균사체 및 배양액을 가공 식품, 기능성 식품 등의 원료로 이용하고자 하는 기술이 제공되어 있다.

특허공개 제10-2006-0062740호인 선인장의 유산균 발효물의 제조를 위한 신규한 유산균균주, 및 이를 이용한 선인장 발효물의 제조방법에서는 손바닥 선인장의 열매에서 분리한 신규한 유산균 균주를 제공하고, 상기 분리한 신규한 유산균 균주를 이용한 선인장의 유산균 발효물을 제공하고자 하는 기술이 제공되어 있다.

(KR) 특허등록 제10-0337472호 (KR) 특허등록 제10-0315330호 (KR) 특허등록 제10-0586326호 (KR) 특허공개 제10-2006-0062740호

본 발명은 손바닥선인장을 활용하여 미세먼지로부터 파생되는 호흡기 손상을 예방하거나 개선에 효과를 가지는 조성물을 제공하고자 한다.

즉, 본 발명은 미세먼지로부터 발생되는 호흡기 손상을 예방하는 효능과, 발생된 혼흡기 손상을 개선할 수 있는 효능을 가지는 천연물을 찾아 제공함으로써 미세먼지에 의하여 손상된 호흡기 손상으로부터 고통을 받지 않도록 천연물인 조성물을 제공하고자 한다.

이러한 본 발명의 목적은 손바닥선인장 추출물을 유효성분으로 하여 미세먼지에 의한 호흡기 손상을 예방 및 개선하는 효능을 가짐을 특징으로 하는 손바닥선인장 조성물로 해결될 수 있다.

상기 손바닥선인장 추출물은 열수추출법 또는 주정추출법으로 획득된다.

상기 손바닥선인장 추출물은 10brix로 농축한 후 동결건조시켜 분말형태로 제조되며, 2차 가공을 통하여 섭취가 용이할 수 있도록 한다.

이와 같이 이루어진 본 발명인 미세먼지에 의한 호흡기 손상을 예방 및 개선하는 손바닥선인장 조성물은 대기 중의 미세먼지 농도의 상승으로 사회적 문제점으로 발생하고 있는 호흡기 손상으로 유발될 수 있는 문제점을 해결할 수 있을 것이다.

즉, 본 발명인 미세먼지에 의한 호흡기 손상을 예방 및 개선하는 손바닥선인장 조성물은 미세먼지에 의하여 손상될 수 있는 호흡기 손상을 예방할 수 있을 것이며 또한, 손상된 호흡기를 개선시킬 수 있음으로써 미세먼지로 유발되는 호흡기 질환에 의한 사회적 문제점을 해결할 수 있을 것이다.

도 1은 MH-S 세포주에서 손바닥선인장의 ROS 생산량 변화를 나타냄.
도 2는 미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물에서 호중구의 총 세포 수에 대한 손바닥선인장 조성물의 영향을 나타냄.
도 3은 미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 WBC 세포수를 분석한 결과표.
도 4는 미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 폐세척액 (BALF)에서 염증사이토카인 CXCL-1 (A), IL-17 (B), MIP2 (C), TNF-a (D) ELISA로 측정 분석한 결과표
도 5는 미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 혈청 에서 기도저항인자(SDMA)와 ADMA(Asymmetric dimethylarginine) ELISA로 측정 분석한 결과표.
도 6은 미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 폐조직에서 기침 (cough)관련 유전자, 염증사이토카인 유전자 CXCL-1, COX-2, IL-6, MIP2, IL-5, MUC5AC, TRAC 발현을 QRT-PCR로 측정 분석한 결과표.
도 7은 미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 폐조직에서 신호전달 IRAK1 단백질 발현을 면역형광조직염색(IHF)으로 측정 분석한 결과표.
도 8은 폐세척액(BALF)와 폐조직(Lung)에서 염증활성 총 T 절대세포수(CD4⁺ absolute No.)와 활성 neutrophils 절대세포수(Gr-1⁺/CD11b⁺ absolute No.) 표.
도 9는 미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 폐조직(Lung)을 H&E 염색한 결과표.
도 10은 미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 기도 상피세포층을 Hematoxylin-eosin과 Periodic Acid Schiff(PAS) - Alcian Blue 염색을 실시한 후 광학 현미경으로 관찰한 결과표.
도 11은 미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 말초혈액 단핵세포(PBMC) 활성 neutrophils 절대세포수(CD4⁺ / CD8⁺,Gr-1⁺/CD11b⁺ absolute No.)와 T helper 절대세포수(CD4⁺ absolute No.)와 c/s T 절대세포수 (CD8⁺ absolute No.)의 결과표.
도 12는 미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 조직 (Lung)에서 총 leucocytes 절대세포수(lymphocytes, neutrophils, monocytes, eosinophils absolute No.)의 결과표.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 될 것이며, 본 명세서에 기재된 실시 예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명은 미세먼지를 원인으로 하여 발생하는 호흡기 손상을 예방하거나, 미세먼지를 원인으로 하여 손상된 호흡기를 개선하는 천연물인 손바닥선인장 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 천연물인 손바닥선인장 조성물은 열수추출법과 주정추출법을 사용하여 획득하였다.

상기 손바닥선인장 추출물은 10brix로 농축한 후 동결건조시켜 분말형태로 제조될 수 있으며, 섭취가 용이하도록 캡슐, 음료 또는 식재료의 첨가물 등과 같은 다양한 형태로 2차 가공되어 제공될 수 있다.

손바닥선인장은 일명 백년초라고도 칭한다.

본 발명의 천연물인 손바닥선인장 조성물의 효능을 알아보고자 아래와 같은 방법으로 손바닥선인장 추출물을 제조하였다.

Ⅰ. 손바닥선인장 추출물 제조.

1. 손바닥선인장 열수추출물(OPI_W) 제조

손바닥선인장줄기를 세절하고 건조하였다. 건조된 손바닥선인장줄기 100g을 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 물 2L를 가한 후 95℃에서 5시간 동안 추출하였다. 추출액은 회수하여 여과하고 감압하에 10brix 정도로 농축하였다. 농축액은 동결건조시켜 분말 형태로 제조하였다. 동결건조시켜 분말화된 손바닥선인장줄기 열수추출물 32.64g을 얻었다.

2. 손바닥선인장 30% 주정추출물(OPI_30E) 제조

손바닥선인장줄기를 세절하고 건조하였다. 건조된 손바닥선인장줄기 100g을 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 30% 주정 2L를 가한 후 70℃에서 5시간 동안 추출하였다. 추출액은 회수하여 여과하고 감압하에 10brix 정도로 농축하였다. 농축액은 동결건조시켜 분말 형태로 제조하였다. 동결건조시켜 분말화된 손바닥선인장줄기 30% 주정추출물 20.84g을 얻었다.

3. 손바닥선인장 50% 주정추출물(OPI_50E) 제조

손바닥선인장줄기를 세절하고 건조하였다. 건조된 손바닥선인장줄기 100g을 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 50% 주정 2L를 가한 후 70℃에서 5시간 동안 추출하였다. 추출액은 회수하여 여과하고 감압하에 10brix 정도로 농축하였다. 농축액은 동결건조시켜 분말 형태로 제조하였다. 동결건조시켜 분말화된 손바닥선인장줄기 50% 주정추출물 24.16g을 얻었다.

4. 손바닥선인장 70% 주정추출물(OPI_70E) 제조

손바닥선인장줄기를 세절하고 건조하였다. 건조된 손바닥선인장줄기 100g을 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 70% 주정 2L를 가한 후 70℃에서 5시간 동안 추출하였다. 추출액은 회수하여 여과하고 감압하에 10brix 정도로 농축하였다. 농축액은 동결건조시켜 분말 형태로 제조하였다. 동결건조시켜 분말화된 손바닥선인장줄기 70% 주정추출물 21.34g을 얻었다.

Ⅱ. 손바닥선인장 추출물의 실험.

미세먼지로 유발된 폐손상 동물모델을 이용한 기능성인 손바닥선인장 추출물 [손바닥선인장 water추출물(OPI_WE), 30% EtOH추출물(OPI_30E), 50% EtOH추출물(OPI_50E), 70% EtOH추출물(OPI_70E)]의 호흡기 개선 효과 검증하고자 미세먼지로부터 독성유발된 동물모델을 이용하여 물질의 효력 확인하고, 기능성을 입증할 수 있는 실험 결과 확보고자 아래와 같은 방법으로 실험을 하였다.

1. 시험물질 : 손바닥선인장 추출물(OFI_W, OFI_30E, OFI_50E, OFI_70E)

2. 실험동물종 및 계통 : 7주령 수컷 Balb/c 마우스

3. 시험군 구성 정보 : 표 1

군	동물수	투여량 (mg/kg/day)	투여물질
정상군	8	-	-
음성대조군	8	-	미세먼지
양성대조군	8	3	미세먼지 + dexamethasone
OFI_W_200	8	200	미세먼지 + OFI_W_200
OFI_W_100	8	100	미세먼지 + OFI_W_100
OFI_30E_200	8	200	미세먼지 + OFI_30E_200
OFI_30E_100	8	100	미세먼지 + OFI_30E_100
OFI_50E_200	8	200	미세먼지 + OFI_50E_200
OFI_50E_100	8	100	미세먼지 + OFI_50E_100
OFI_70E_200	8	200	미세먼지 + OFI_70E_200
OFI_70E_100	8	100	미세먼지 + OFI_70E_100

4. 투여

4-1. 투여경로 : 표 2

미세먼지 복합물	Intra-nasaltracheal injection
손바닥선인장 추출물	경구투여
양성대조군	i.p

4-2.투여횟수 및 기간

- 천연물인 손바닥선인장 추출물 소재 : 1회/일, 11일간 투여

- 미세먼지 : 3일 간격으로 3회 주입(손바닥선인장 추출물 투여 3일, 6일, 9일 후)

- 부검 : 3차 미세먼지복합물 주입 3일 후

5. 실험방법

5-1. 호흡기 손상 동물 모델 제작

호흡기 손상 미세먼지 복합물(Coal, Fly ash, DEP(Diesel Exhaust Particle))을 aluminium hydroxide(Alum)에 희석시켜 Intra-Nazal-Tracheal(INT) injection 방법을 이용하여 3일 간격으로 3회(약물투여 3일 후, 6일 후, 9일 후 intra-nasaltracheal injection) 기도를 통해 폐로 직접 주입하는 동물모델을 제작하고, 최종 미세먼지 주입 3일 후 sacrified 시행하였다.

5-2. 혈액에서 PBMCs 분리 및 세포수 측정

실험종료 후 3ml 주사기에 50 I.U 헤파린(APU8AF, 중외제약) 20㎕를 넣어 놓고, 마우스를 에틸에테르(ethyl ether)로 마취한 다음 심장천자법으로 800~1000㎕를 채혈하였다. 혈액 2ml는 CBC분석으로 사용하고, 채혈된 혈액 500㎕를 9.5ml의 ACK 용액에 넣고, 5분 동안 방치한 후 적혈구를 용해시키기고, 1200rpm에서 5분간 원심분리하여 PBMCs를 분리하고, 0.04% trypan blue로 염색한 후 총세포수(/ml)를 측정하였다.

분리한 혈청 중 호흡량 대체 바이오마커(ADMA, SDMA) ELISA 측정에 사용하였다.

5-3. 기관지 폐포세척액(BAL fluid; BALF) 분리 및 총세포수 측정

실험종료 후 해부하여 폐포 세척액(BALF)으로부터 세포를 분리하기 위해 FBS-free/DMEM 배양액 1㎖을 넣은 주사기를 기관지(trachea)에 주입시키고, 끈으로 묶어 고정한 후 3회 순환시켜 분리하고, ACK 용액을 37℃에서 5분 동안 처리하여 적혈구를 용해시키고 다시, FBS-free/DMEM 배양액으로 세척한 다음 0.04% 트리판블루(trypan blue)로 염색한 후 총세포수를 측정하였다.

또한, BAL cell cytospin 후 Diff-Quik Stain으로 호중구(neutrophils)의 증가를 확인하였다. BALF에서 ELISA로 염증성 protein(IL-17, TNF-a, CXCL-1, MIP-2 등) 발현정도와 염증성 cytokine 수준 ELISA 측정하고, 유세포형광분석기(flow cytometry)를 사용하여 FACS(CD3, CD19, CD4, CD8, CD69, CD11b, Gr-1, Neutrophils) 분석을 실시하였다.

5-4. 폐(Lung) 세포 분리 및 총세포수 측정

실험종료 후 폐포세척액(BALF)을 분리하지 않은 마우스에서 폐를 적출하여 폐조직을 잘게 절편한 후 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함되지 않은 3㎖ DMEM 배지에 넣고, 1㎎/㎖의 collagenase IV(C5138, Sigma)를 가하여 37℃ shaking 배양기에서 30분 동안 4회 이상 조직을 분해(digestion)하여 폐세포를 분리하였다. 분리된 폐세포는 배지로 세척한 후 cell strainer(352350, FALCON)에 통과시켜 세포이외의 분해되지 않은 조직이나 불순물을 제거하였다. 이들 세포들로부터 ACK 용액(10-548E, LONZA)을 37℃에서 5분 동안 처리하여 적혈구를 용해시키기고 다시, 배양액으로 세척한 후 0.04% trypan blue(15250061, Invitrogen)로 염색한 후 총 폐세포수를 측정하였다.

폐조직세포에서 유세초형광분석기(flow cytometry)를 사용하여 FACS(CD3, CD19, CD4, CD8, CD69, CD11b, Gr-1, Neutrophils) 분석을 실시하고, 염증유전자를 발현을 real-time quantitative PCR을 실시하였다.

5-5. 유세포(FACS) 분석

분리한 PBMCs, BAL, 그리고 폐세포들을 5 x 10⁵세포를 조정한 후 4℃에서 면역 형광염색(immunofluorescence staining)을 실시하였다. 각각에 PE-anti-CD3e(553064, BD Pharmingen, San Diego, CA), FITC-anti-CD8(553031, BD Pharmingen), PE-anti-CD4(553047, BD Pharmingen), PE-anti-Gr-1,(553128, BD Pharmingen), FITC-anti-CD69,(55732, BD Pharmingen), FITC-anti-CD11b (553310, BD Pharmingen), PE-anti-neutrophils (ab53453, Abcam), 그리고 PE-anti-Gr-1 (560453, BD Pharmingen)을 넣고 30 분간 얼음에서 반응시켰다.

반응 후 3회 이상 인산완충 생리식염수로 수세한 후 flow cytometer의 Cell Quest 프로그램(643274, BD Biosciences, San Diego, CA)을 이용하여 CD4⁺CD8⁺ & CD4⁺CD69⁺, CD11b⁺Gr-1⁺, 그리고 Gr-1⁺Neutrophil⁺세포빈도를 백분율(%)로 분석한 후 총세포수(total cells)를 적용하여 각 조직에서의 절대 총세포수(absolute number)를 산출하였다.

5-6. ELISA 측정

마우스에서 분리한 BALF 및 혈청에서 TNF-a, CXCL-1, MIP-2, IL-17(R&D system, USA) 수준을 ELISA 측정을 enzyme-linked immuno-sorbent assay로 측정하였다. 각각 항체(antibody)를 coating 완충용액(291195, R&D system)에 희석하여 microwell에 coating한 후 4℃에서 overnight한다. 각 well을 3회 washing 완충용액으로 세척한 후에 혈청(10배 희석)을 100㎕씩 분주하였다. 1시간 동안 실온에서 방치한 후 2회 washing 완충용액으로 세척한 다음 antibody Avidin-HRP conjugeted (R&D system) 100㎕를 처리하고, 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. TMB 기질을 100㎕씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 후 50㎕의 stop 용액을 처리한 후 ELISA leader(Emax, Molecular Devices) 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean±error로 기록하였고, 유의성 검증은 student's T-test 분석방법을 이용하여 결정하였다.

상기 데이타는 측정된 개개 최종 포인트(point)에 대한 각 그룹간의 통계학적 유의성있는 분산을 결정하기 위하여 일원분산 분석법(one-way ANOVA)을 이용하여 분석하였으며, 각 군간의 통계적 유의성은 비모수적 검정법(nonparametric Mann-Whitney test) 및 다중분석 비교법(Dunnett’multiple comparison test; IBM SPSS statistics version 19.0 statistic software, Inc, IBM, USA)을 이용하였다.

대조군(COPD-control)간의 상이성은 자명할 것이다.

6. 실험결과

6-1. MH-S세포주에서 손바닥선인장 추출물의 ROS 생산량 변화분석(도 1 참조)

10μg/ml의 Coal, Fly ash를 처리한 마우스 MH-S세포주에서 손바닥선인장 물 추출물(OFI_W), 30% 에탄올 추출물(OFI_30E), 50% 에탄올 추출물(OFI_50E), 70% 에탄올 추출물(OFI_70E)은 대조군에 비하여 농도의존적으로 ROS 생산량 감소되었다.

6-2. 미세먼지복합물로 유발된 폐손상 동물모델을 이용한 손바닥선인장의 호흡기 개선 효과 검증

6-2-1. 기관지 폐포세척액 (BAL fluid; BALF), 폐 (Lung) 세포 분리 및 총세포수 측정(도 2 참조).

미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 폐세척액 (BALF)에서 BAL세포수는 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)이 유의성 있게 증가하였고(p<0.001), 양성대조군(p<0.001), CFD_OFI_W_200mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_W_100mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_30E_200mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_30E_100mg/kg, CFD_OFI_50E_200mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_50E_100mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_70E_200mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_70E_100mg/kg(p<0.001) 투여군이 대조군(CFD_CTL)에 비하여 감소를 보였다. 폐조직(Lung)에서 폐세포수는 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)이 유의성 있게 증가하였고(p<0.01), 투여군에서 통계학적으로 유의하지는 않지만 감소를 보였다. 특히 CFD_OFI_50E 투여군과 CFD_OFI_70E_ 투여군에서 감소경향을 보였다. BAL에서 cytospin에 의한 호중구(neutrophils)세포수를 분석한 결과 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)이 현저하게 유의성 있는 증가를 나타내었다(p<0.001). CFD_OFI_30E_200mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_30E_100mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_50E_200mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_50E_100mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_70E_200mg/kg(p<0.01) 투여군이 대조군(CFD_CTL)에 비교하여 유의성 있게 감소하였다.

6-2-2. 혈액에서 혈구세포 분석(도 3 참조)

미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 WBC세포수를 분석한 결과 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)이 WBC세포수가 감소하였다.

양성대조군(Dexamethasone, 3㎎/㎏)은 대조군(CFD_CTL)에 비하여 유의성 있게 증가되었다(p<0.01). CFD_OFI_30E_100mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_50E_200mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_50E_100mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_70E_200mg/kg(p<0.01)투여군에서 유의적으로 증가양상을 보였다.

WBC differential 세포수를 분석한 결과 정상군 (Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)이 유의성 있게 임파구(lymphocyte) 세포수의 증가를 나타내었고(p<0.001), 그리고 호중구(neutrophils) 세포수의 증가를 나타내었다(p<0.001).

호중구(neutrophils) 세포수는 대조군(CFD_CTL)군에 비하여 모든 투여군에서 감소를 보였다.

6-2-3. 기관지 폐포세척액(BAL fluid; BALF)에서 ELISA 측정분석(도 4 참조)

미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 폐세척액(BALF)에서 염증사이토카인 CXCL-1(A), IL-17(B), TNF-a(C), MIP2(D), ELISA로 측정 분석하였다. 그 결과, CXCL-1의 경우 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)이 유의성 있게 염증사이토카인 생산량이 증가를 나타냈고(p<0.001), 양성대조군 (Dexamethasone, 3㎎/㎏)(p<0.01)과 CFD_OFI_W_200mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_W_100mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_30E_200mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_30E_100mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_50E_200mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_50E_100mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_70E_200mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_70E_100mg/kg(p<0.01) 투여군에서 유의성 있게 감소되었다.

IL-17의 경우 CFD_OFI_W_200mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_W_100mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_50E_200mg/kg(p<0.05)투여군에서 유의성 있게 감소되었다.

MIP2의 경우도 CFD_OFI_W_200mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_W_100mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_30E_200mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_30E_100mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_50E_200mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_50E_100mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_70E_200mg/kg(p<0.05) 투여군에서 유의성 있게 감소되었다.

TNF-a의 경우도 양성대조군(Dexamethasone, 3㎎/㎏)(p<0.05)과 CFD_OFI_W_200mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_W_100mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_30E_200mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_30E_100mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_70E_200mg/kg(p<0.01) 투여군에서 유의성 있게 감소되었다.

6-2-4. 기관지 폐기능 지표 (SDMA)와 기침 (cough)관련 유전자 분석(도 5 참조).

미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 혈청(serum)에서 기도저항인자(SDMA, symmetric dimethylarginine)와 ADMA(Asymmetric dimethylarginine) ELISA로 측정 분석하였다. 그 결과, 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군 (CFD_CTL)이 SDMA 수준을 유의성 있게 증가를 나타냈다(p<0.001).

양성대조군(Dexamethasone, 3㎎/㎏)(p<0.01)과 CFD_OFI_W_200mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_W_100mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_30E_200mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_30E_100mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_50E_200mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_50E_100mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_70E_200mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_70E_100mg/kg(p<0.001) 투여군에서 유의성 있게 감소되었다.

정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)이 ADMA 수준을 유의성 있게 증가를 나타냈다(p<0.01). CFD_OFI_W_100mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_30E_100mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_50E_200mg/kg(p<0.01) 투여군에서 유의성 있게 감소되었다.

6-2-5. 생쥐폐조직에서 염증사이토카인 유전자 발현(QRT-PCR) 분석(도 6 참조).

미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 폐조직에서 기침(cough)관련 유전자, 염증사이토카인 유전자 CXCL-1(A), COX-2(B), IL-6(C), MIP2(D), IL-5(E), MUC5AC(F), TRAC(G) 발현을 QRT-PCR로 측정 분석하였다. 그 결과 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)이 염증사이토카인 유전자 발현을 유의성 있게 증가를 나타내었다. 특히, FD_OFI_50E_200mg/kg 투여군이 CXCL-1, COX-2, IL-6, MIP2, IL-5 유전자 발현에서 유의성 있는 결과를 공통적으로 감소를 나타냈다. MUC5AC, TRAC mRNA 발현에서는 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CSE_CTL)이 유의한 증가(p<0.01)를 보였으며, MUC5AC의 경우 CFD_OFI_30E_100mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_50E_200mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_50E_100mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_70E_200mg/kg(p<0.01) 투여군에서 유의성 있게 감소되었다.

6-2-6. 폐조직에서 신호전달 IRAK1 단백질 발현 (IHF) 분석(도 7 참조).

미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 폐조직에서 신호전달 IRAK1 단백질 발현을 면역형광조직염색(IHF, Immune histology fluorescent)으로 측정 분석하였다. 그 결과, 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)에서 현저하게 IRAK1 단백질 발현(TNF-α, CXCL-2)이 증가를 보였다. TNF-α 단백질 발현도는 CFD_OFI_50E_200mg/kg, CFD_OFI_70E_200mg/kg투여군이 현저한 감소를 보였고, CXCL-2 단백질 발현도 또한 CFD_OFI_50E_200mg/kg, CFD_OFI_70E_200mg/kg투여군이 통계학적으로 유의한 감소를 나타내었다.

6-2-7. BAL, 폐세포에서 유세포 (FACS) 형광분석(도 8 참조).

미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 폐세척액(BALF)와 폐조직(Lung)에서 염증활성 총 T 절대세포수(CD4⁺ absolute No.)와 활성 neutrophils 절대세포수(Gr-1⁺/CD11b⁺ absolute No.)는 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)이 유의성 있게 증가하였고, CFD_OFI_W 투여군, CFD_OFI_30E 투여군, CFD_OFI_50E 투여군, CFD_OFI_70E 투여군에서 농도의존적으로 유의하게 대조군 (CFD_CTL)에 비하여 감소하였다.

6-2-8. 폐조직(Lung tissue) 검사 분석(도 9 참조).

미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 폐조직(Lung)을 H&E 염색한 결과에서 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)에서 기관지(brochia) 주변에 coal fly ash와 DEP의 침착이 증가를 나타내었다. 기도의 두께는 크게 증가를 보였으며, airway 주변에 염증면역세포의 침윤과 과립구세포 (neutrophils, eosinophils), 그리고 활성화된 대식세포들로 인하여 염증이 심화되어 폐포세포 파괴를 진행되어 있다.

폐포세포 파괴 정도는 콜라겐 침착(collagen deposition)으로 관찰하기 위하여 Masson Trichrome(M-T) 염색으로 structure 부분의 tracheol과 alveolar, 그리고 세포 부분의 inflammatory와 blood 세포의 침윤정도를 관찰 하였다. 그리고 대조군(CFD_CTL)에서는 기관지(airway) 주변에 점액질을 분비하는 goblet cell(PAS 염색)가 많이 분포함. 양성대조군(Dexa. 3㎎/㎏)과 CFD_OFI_W_200mg/kg, CFD_OFI_W_100mg/kg, CFD_OFI_30E_200mg/kg, CFD_OFI_30E_100mg/kg, CFD_OFI_50E_200mg/kg, CFD_OFI_50E_100mg/kg, CFD_OFI_70E_200mg/kg, CFD_OFI_70E_100mg/kg를 처리한 실험군은 대조군(CFD_CTL)에 비하여 기관지(brochia) 주변에 미세먼지 복합물의 침착이 뚜렷하게 감소하였으며, 기도의 두께는 정상군에 가깝게 감소를 나타내어 airway주변에 염증면역세포의 침윤과 과립구세포(neutrophils, eosinophils), 그리고 활성화된 대식세포들이 크게 감소를 나타내었다. 콜라겐 침착(collagen deposition)은 Masson Trichrome(M-T) 염색으로 structure 부분의 tracheol과 alveolar, 기관지(airway) 주변에 점액질을 분비하는 goblet cell, 그리고 세포 부분의 inflammatory와 blood 세포의 침윤정도도 정상군에 가깝게 억제되었다. 폐조직 검사에서 폐포세포 파괴에 의한 콜라겐 침착(collagen deposition), structure 부분의 tracheol과 alveolar, 그리고 Cell 부분의 inflammatory와 blood 세포의 침윤정도, 그리고 PAS 염색에 의한 goblet 세포의 침착정도는 CFD_OFI_W_100mg/kg, CFD_OFI_30E_200mg/kg, CFD_OFI_50E_200mg/kg, CFD_OFI_50E_100mg/kg, CFD_OFI_70E_200mg/kg 투여군이 대조군에 비하여 육안상으로 눈에 띄게 개선됨을 보였다.

6-2-9. 기도 조직 (trachea) 검사 분석(도 10 참조)

미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 기도 상피세포층을 Hematoxylin-eosin과 Periodic Acid Schiff(PAS) -Alcian Blue 염색을 실시한 후 광학 현미경으로 관찰하였다.

그 결과 대조군(CFD_CTL)에서 배상세포 내 검은 보라색으로 염색된 뮤신(점액)의 양이 증가되어 있음에 비하여 CFD_OFI_W_200mg/kg, CFD_OFI_W_100mg/kg, CFD_OFI_30E_200mg/kg, CFD_OFI_30E_100mg/kg, CFD_OFI_50E_200mg/kg, CFD_OFI_50E_100mg/kg, CFD_OFI_70E_200mg/kg, CFD_OFI_70E_100mg/kg 투여군에서는 배상세포 내에 검은 보라색으로 염색된 뮤신의 양이 감소하는 경향을 보였다.

따라서 미세먼지 복합물로 유발된 기도 상피 배상세포 내의 점액 함유량 증가를 억제하는 경향을 나타냄을 확인할 수 있었다.

6-2-10. PBMCs에서 유세포 (FACS) 형광분석(도 11 참조)

미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 말초혈액 단핵세포(PBMC) 활성 neutrophils 절대세포수(CD4⁺ / CD8⁺,Gr-1⁺/CD11b⁺ absolute No.)와 T helper 절대세포수(CD4⁺ absolute No.)와 c/s T 절대세포수(CD8⁺ absolute No.)는 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)이 유의성 있는 결과를 나타내었다. CFD_OFI_50E_100mg/kg 투여군이 통계학적인 유의적인 감소를 보였으며, Gr-1⁺/CD11b⁺의 결과에서는 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)이 유의성 있는 증가를 나타내었고(p<0.001), 양성대조군(p<0.001), CFD_OFI_W_200mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_W_100mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_30E_200mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_30E_100mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_50E_200mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_50E_100mg/kg(p<0.001) 투여군이 대조군(CFD_CTL)에 비하여 감소를 보였다.

6-2-11. 폐조직에서 총 leucocytes 절대세포수 FACS 분석(도 12 참조).

미세먼지 복합물로 유도한 호흡기 손상모델 동물실험 종료 후 폐조직(Lung)에서 총 leucocytes 절대세포수(lymphocytes, neutrophils, monocytes, eosinophils absolute No.)는 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)이 통계학적으로 유의하게 증가하였다.

neutrophils의 세포수는 CFD_OFI_30E_100mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_50E_200mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_50E_100mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_70E_200mg/kg(p<0.001), CFD_OFI_70E_100mg/kg(p<0.001) 투여군이 대조군(CFD_CTL)에 비하여 감소를 보였다.

eosinophils의 세포수는 투여군에서 전체적으로 감소한 양상을 보였으나, 특히 CFD_OFI_70E_200mg/kg(p<0.05) 투여군에서 유의한 감소를 나타냈다.

미세먼지 동물모델실험 종료 후 폐조직(Lung)에서 활성 neutrophils 절대세포수(Gr-1⁺/CD11b⁺ absolute No.)와 T helper 절대세포수(CD4⁺ absolute No.)와 c/s T 절대세포수(CD8⁺ absolute No.)는 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)이 증가하였고, CFD_OFI_50E_200mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_50E_100mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_70E_200mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_70E_100mg/kg(p<0.01) 투여군이 대조군(CFD_CTL)에 비하여 감소를 보였다. T helper 절대세포수(CD4⁺ absolute No.)와 c/s T 절대세포수(CD69⁺ absolute No.)는 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)이 증가하였다.

Gr-1⁺/CD11b⁺의 결과에서는 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(CFD_CTL)이 유의성 있는 증가를 나타내었고(p<0.001), 양성대조군(p<0.001), CFD_OFI_W_200mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_30E_200mg/kg(p<0.05), CFD_OFI_30E_100mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_50E_200mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_50E_100mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_70E_200mg/kg(p<0.01), CFD_OFI_70E_100mg/kg(p<0.05) 투여군이 대조군(CFD_CTL)에 비하여 감소를 보였다.

Claims

손바닥선인장 추출물을 유효성분으로 하여 미세먼지에 의한 호흡기 손상을 예방 및 개선하는 효능을 가짐을 특징으로 하는 미세먼지에 의한 호흡기 손상을 예방 및 개선하는 손바닥선인장 조성물.
제1항에 있어서,
상기 손바닥선인장 추출물은 열수추출법 또는 주정추출법으로 획득됨을 특징으로 하는 미세먼지에 의한 호흡기 손상을 예방 및 개선하는 손바닥선인장 조성물.
제2항에 있어서,
상기 손바닥선인장 추출물은 10brix로 농축한 후 동결건조시켜 분말형태로 제조됨을 특징으로 하는 미세먼지에 의한 호흡기 손상을 예방 및 개선하는 손바닥선인장 조성물.