KR20230035638A - 면역 항상성의 조절을 위한 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 알로에 기반 조성물 - Google Patents

면역 항상성의 조절을 위한 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 알로에 기반 조성물 Download PDF

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Abstract

하나 이상의 다당류가 풍부한 알로에 추출물; 하나 이상의 다당류가 풍부한 포리아 추출물; 및 하나 이상의 폴리페놀 화합물이 풍부한 로즈마리 추출물의 조합물을 포함하는 면역 항상성의 조절을 위해 사용된 조성물 및 방법이 개시된다. 하나 이상의 다당류 및 하나 이상의 폴리페놀 화합물의 조합물을 포함하는, HMGB1을 조절함으로써 면역 항상성을 유지하기 위한 조성물이 개시된다. 포유동물의 체중 kg 당 0.01 mg 내지 500 mg의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 항상성의 조절을 치료, 관리, 촉진하기 위한 방법이 개시된다.

Description

면역 항상성의 조절을 위한 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 알로에 기반 조성물
본 특허 협력 조약 출원은 2020년 7월 9일에 출원되고 명칭이 "Aloe-Based Compositions Comprising Polysaccharides and Polyphenols for Regulation of Homeostasis of Immunity"인 미국 가특허 출원 일련 번호: 63049871에 기초하고, 이는 그 전체가 참조로서 일반적으로 본원에 소유되고 포함된다.
백합과(Liliaceae)의 구성원인 알로에 바르바덴시스(Aloe barbadensis) M. (알로에 베라(Aloe vera))은 수세기 동안 민간 요법뿐만 아니라 식품 또는 국소 겔로 사용되어 왔다. 알로에에 대한 가장 오래된 의학적 기록은 알로에 식물이 큰 치유력을 갖는 것으로 알려져 있기 때문에 기원전 2200년으로 거슬러 올라갈 수 있다. 오늘날, 상처 치유 촉진, 항미생물 효과, 항염증 효과, 피부 보호, 모발 성장 자극, 및 면역 자극 특성 등과 같은 잘 문서화된 유리한 효과는 알로에 베라를 식품, 음료, 식이 보충제, 스킨 케어 제품 등으로 제형화한 후 많은 용도로 기능식품 및 화장품의 중요한 성분으로 만든다(Wynn et al., 2005; Djuv and Nilsen, 2012; Shimpo et al., 2002).
다양한 알로에 성분 중에서, 아세틸화 다당류(ACP)는 가장 중요한 활성 성분 중 하나로 고려된다. 다당류의 구조, 화학적 및 물리적 특성과 관련하여 상당한 차이가 있지만, 알로에 겔의 주요 다당류는 3,000 Da 내지 2,000,000 Da 범위의 분자량을 갖는 O-아세틸기로 치환된 β-1,4-연결된 만노스의 선형 사슬로 구성된 아세틸화 만난(아세만난, ACM 또는 AP)으로 보고된다. 알로에 다당류는 강력한 항산화 능력을 갖는 것으로 보고되었다. 예를 들어, DPPH, 하이드록실 및 알킬 라디칼 소거 검정에서 시험했을 때 알로에 바르바덴시스 겔로부터 정제된 다당류에 대해 강한 항산화 활성이 보고되었다(Kang et al., 2014). 유사하게, 알로에 식물 나이 및 기능-관련 연구에서, 3년된 알로에 잎 추출물의 다당류는 DPPH 검정을 통해 100 mg/L의 동일한 농도의 합성 항산화제 부틸화 하이드록시톨루엔(70.52%) 및 α-토코페롤(65.20%)의 활성보다 상당히 높은 가장 강력한 라디칼 소거 활성(72.19%)을 나타내는 것으로 밝혀졌다(Hu et al., 2003). A. 베라에서 분리된 다당류는 또한 산화 스트레스 바이오마커 말론디알데하이드(MDA)의 감소 및 마우스의 만성 알코올-유도된 간독성에서 간 비효소적 항산화제 GSH 및 효소적 항산화제 SOD의 생체 내 증가에 의해 입증된 바와 같이 높은 항산화 효능을 갖는 것으로 밝혀졌다(Cui et al., 2014).
알로에 베라는 피부 노화, 피부 보호, 상처 치유, 치은염, 암 치료, 당뇨병 치료, 비타민 C 및 비타민 E의 생체이용률 향상, 당뇨병전기의 치료, 과민성 대장 증후군, 간 보호, 위 및 구강 궤양의 치료를 위해 임상적으로 연구되었다. 많은 시험관 내 및 생체 내 연구가 알로에 베라 잎 추출물 및 알로에 다당류로부터 면역 보호 또는 자극 효과를 나타내었음에도 불구하고, 면역-관련 인간 임상 시험은 많이 수행되지 않았다. 알로에 다당류는 자외선 조사 후 피부 세포에서 IL-10을 감소시켰고(Byeon et al, 1998), 경구 및 국소 투여된 알로에 베라 겔 및 분자량이 80-200 KDa인 정제된 다당류는 UV 노출에 의해 억제된 동물의 피부 면역 기능을 회복시켰다(Qiu, et al. 2000, Im, 2005). 알로에 다당류의 경구 투여는 정상 마우스에서 C. 알비칸스(C. albicans)의 정맥 내 주사 후 비장 및 신장에서 C. 알비칸스의 성장을 유의하게 감소시켰다(Im, 2010). 알로에 다당류는 또한 엔독산-처리된 마우스로부터의 Peyer의 패치 세포에서 IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IFN-γ 및 GM-CSF를 포함하는 사이토카인 생산을 증가시켰다(Im, 2014). 세포 모델(Budai 2013)에서, 알로에 베라는 용량-의존적 방식으로 IL-8, TNFα, IL-6 및 IL-1β 사이토카인 생산을 현저하게 감소시켰다. 억제 효과는 일차 세포에서 실질적으로 더 두드러졌다. 알로에 베라는 LPS-유도된 일차 대식세포에서 pro-IL-1β, Nlrp3, 카스파제-1 및 P2X7 수용체의 발현을 억제하여 인플라마좀 활성화를 감소시켰다. 또한, NF-κB, p38, JNK 및 ERK와 같은 신호전달 경로의 LPS-유도된 활성화는 이들 세포에서 알로에 베라에 의해 억제되었다. 변형된 알로에 다당류(MAP)는 림프구의 증식 활성; 오브알부민(OVA)-특이적 T 세포 증식; 항체 생산; 및 세포독성 T 림프구의 세포 사멸 활성을 회복시킴으로써 마우스에서 만성 스트레스-유도된 면역억제를 회복시켰다(Lee 2016).
구멍장이버섯과(Polyporaceae)의 진균인 포리아 코코스 울프(Poria cocos Wolf)는 중국에서 복령(茯笭) 및 일본에서 마츠호도(matsuhodo)와 같은 일반명을 갖는 중국 적송 및 다른 침엽수의 뿌리에서 자라는 약용 버섯이며, 이는 또한 호엘렌(hoelen), 포리아, 투카호(tuckahoe), 또는 중국 뿌리로도 공지되어 있다. 이의 라틴 명명법은 여러번 개정되었으며, 현재 식물명으로서 울피포리아 엑텐사(Wolfiporia extensa)를 갖는다. 중국에서 음식 및 한의학(TCM)의 이중 사용 성분으로서의 복령은 오늘날에도 여전히 널리 사용되는 많은 고대 달임물과 처방에 포함되어 있다. 복령의 속성은 이뇨제, 진정제 및 튜닉(tunic)으로 정의된다. 복령의 전통적인 사용법은 메스꺼움, 구토, 설사, 식욕 부진, 및 위 궤양뿐만 아니라 불면증 및 기억상실증을 치료하는 것이다(Rios 2011; Feng et al. 2013). 항미생물, 항진균, 항산화, 신경보호, 항염증, 항혈관신생 및 항암 활성을 포함하는 많은 생물학적 활성이 상기 진균 및 진균 추출물에 대해 보고되었다.
복령의 주요 활성 성분은 41 KDa 내지 5 MDa의 분자량 범위를 갖는 건조된 진균 자실체의 주요 성분인 β-글루칸 형태의 포리아 코코스 다당류(PCP)이다. 글루코스, 푸코스, 아라비노스, 자일로스, 만노스 및 갈락토스는 β-(1→3)-연결된 글루코스 백본 및 β-(1→6)-연결된 글루코스 측쇄와 함께 PCP에서 검출된다. 포리아 코코스 다당류에 대한 다양한 생물학적 기능, 예를 들어, 항산화, 항고혈당, 복통 완화, 항염증, 항암 및 면역학적 조절이 보고되었다(Sun 2014). 다당류는 생체 내 및 시험관 내 모델 모두에서 상이한 암에 대해 항종양 활성을 갖는 것으로 보고되었다. 포리아 코코스 다당류는 혈관 평활근 세포(VSMC)에서 ox-LDL-유도된 염증 및 산화 스트레스를 감소시키는 것으로 나타났다. PCP는 감소된 활성 산소 종(ROS) 및 MDA 수준, 및 VSMC에서 증가된 SOD 활성에 의해 입증된 바와 같이 ox-LDL-유도된 산화 스트레스를 상당히 감소시켰다. PCP는 또한 VSMC 거품 세포 형성 및 세포 내 지질 축적을 실질적으로 억제하였다. 작용 메커니즘 연구는 PCP가 ERK1/2 신호전달 경로를 활성화하고, 세포질에서 핵으로의 Nrf2 전좌를 증가시키고, 헴 옥시게나제-1(HO-1) 발현을 증가시킬 수 있음을 시사하였고, 이는 죽상경화증 치료를 위한 치료제로서의 가능성을 나타낸다.
항암, 항염증 및 잠재적인 면역학적 기능에 대해 연구되고 있는 트리테르페노이드 역시 포리아 코코스의 활성 성분으로 확인되었다(Rios 2011; Li et al. 2011). 포리아에서 분리된 대부분의 트리테르펜은 라노스탄(Lanostane) 또는 세코라노스탄(secolanostane) 골격으로부터 유래된다. 포리아 코코스의 항염증 메커니즘은 완전히 이해되지 않았지만, 포스포리파제 A 효소의 억제는 여러 연구에 의해 확인되었다(Rios 2011; Giner-Larza et al. 2000). P. 코코스 에탄올 추출물의 항염증 메커니즘은 지질다당류(LPS)-자극된 RAW 264.7 대식세포에서 NF-κB 신호전달 경로의 불활성화에 의한 iNOS, COX-2, IL-1β 및 TNF-α의 억제를 통한 것으로 나타났다(Jeong et al. 2014). 포스포리파제 A2(PLA2)에 대한 포리아 코코스 추출물 및 라노스탄 트리테르펜의 억제 효과는 상이한 시험관 내 및 생체 내 모델에서 명확하게 입증되었다(Giner-Larza et al. 2000). 포리아 코코스 추출물은 경구 또는 비경구에 의해 제공된 PLA2-유도된 마우스 발 부종에 대해 활성이었다. 포리아 코코스로부터 분리된 2개의 라노스탄 트리테르페노이드, 파키믹산 및 데하이드로투물로스산은 데하이드로투물로스산에 대해 결정된 0.845 mM의 IC50 값을 가지며 뱀독에서 강한 포스포리파제 A2 억제제로서 확인되었다(Cuellar et al 1996). 파키믹산 및 하이드로투물로스산은 또한 각각 4.7 및 0.68 nmol/ear의 IC50 값을 가지며 테트라데카노일 포르볼 아세테이트(TPA)에 의해 유도된 급성 귀 부종을 억제하였다. 이 두 화합물은 카라기난과 아라키돈산-유도된 급성 부종에도 작용하였으며, 이는 항염증 치료제로서 이러한 트리테르페노이드의 가능성을 나타낸다(Cuellar et al 1997). 포리아 코코스로부터 분리된 다양한 트리테르펜은 TPA 또는 아라키돈산에 의해 유도된 귀 부종에 대한 유사한 억제에 대해 보고되었다(Giner, 2000; Yasukawa, 1998; Kaminaga, 1996).
포리아 코코스는 일반적으로 면역조절 전통 본초에 포함된다. 포리아 코코스 50% 에탄올 추출물은 시험관 내에서 용량-의존적 방식으로 인간 말초 혈액 단핵구에서 인터루킨(IL)-1β 및 IL-6의 분비를 증가시켰다. 추출물은 0.4 mg/mL로 6시간 처리 후 종양 괴사 인자(TNF)-α를 포함하는 사이토카인 수준을 증가시킬 수 있는 한편; 0.2 mg/mL로 처리 3시간 후에 형질전환 성장 인자(TGF)-β의 분비를 억제하였다(Yu and Tseng, 1996). 포리아 코코스 추출물은 활성화된 대식세포에 의해 면역 자극제(IL-1β, IL-6, TNF-α)의 분비를 향상시키면서 면역억제제(TGF-β)를 억제하기 때문에, 면역 자극제 역할을 할 수 있다. 포리아 코코스 다당류(PCP)의 잠재적 메커니즘은 T 세포의 활성화를 통할 수 있다. PCP는 동종반응성 뮤린 세포독성 T-림프구의 생체 내 유도에 대한 면역-애쥬번트 활성에 대해 시험되었다. 비장 세포 및 장간막 림프절 세포 내에서 증가된 세포독성 T-림프구(CTL) 활성은 25일 이상 지속되었다(Hamuro, 1978). PCP는 대식세포 포식작용, 흉선 지수 및 비장 지수(Zhang et al and Peng et al)를 상당히 개선하고 혈청에서 IgA, IgG 및 IgM의 수준을 증가시킬 수 있다. 한 연구는 또한 PCP의 면역조절 활성이 TLR4/TRAF6/NF-κB 신호전달을 통해 이루어질 수 있음을 보여주었고, 이는 시험관 내 RAW 264.7 대식세포 및 마우스의 생체 내 Lewis 폐 암종(LLC) 종양 둘 모두에서 입증되었다(Tian, 2019). 애쥬번트는 면역 반응을 부스팅하고 가속화하기 때문에 백신 접종 전략의 중요한 구성요소이다. PCP의 애쥬번트 활성은 광견병 백신 및 B형 간염 백신을 포함하는 상이한 백신으로 동물에서 보고되었으며, 이는 PCP가 비활성 백신을 부스팅하기 위한 우수한 애쥬번트 후보임을 나타낸다(Wu, 2016; Zhang, 2019).
로즈마리(샐비어 로즈마리누스(Salvia Rosmarinus), 로즈마리누스 오피시날리스(Rosmarinus officinalis))는 2미터 높이까지 자라는 나무 같은 다년생 본초이다. 잎은 톡 쏘는 향이 나는 솔잎과 비슷한 상록수이다. 이는 지중해 지역이 원산지이며 미국, 영국, 프랑스, 스페인, 포르투갈, 모로코, 중국 등을 포함한 전 세계 많은 국가에서 재배되는 꿀풀과(Lamiaceae)의 박하과의 구성원이다. 신선한 잎 및 말린 잎은 전통적인 지중해 요리에서 구운 고기와 같은 다양한 음식의 맛을 내기 위한 향신료로 자주 사용된다. 신선한 개화 윗부분 또는 줄기와 잎으로부터 증류에 의해 제조된 로즈마리 잎과 로즈마리 오일은 모두 알코올 음료, 냉동 유제품, 디저트, 제과류 및 육류 제품을 포함하는 식품 및 음료에 광범위하게 사용될 수 있다(Leung and Foster, 1996). 로즈마리는 수렴, 강장, 구풍, 항연축, 이담, 점액 용해, 진통 및 발한 특성으로 알려진 가장 오래된 약용 식물 중 하나이다. 수세기 동안, 로즈마리는 기억력과 정신적 명료성을 향상시키는 것으로 여겨진다. 이는 정신, 마음 및 신체를 자극하고, 젊어지게 하고, 고양시킬 수 있다(Zimmermann, 1980; Newall, 1996). 로즈마리 잎은 소화 불량 장애, 혈압 문제, 식욕 부진 및 류머티즘을 치료하도록 승인되었다(PDR for Herbal Medicines, 2nd Ed.). 이는 또한 소화 불량, 두통 및 편두통, 월경 불순, 피로, 현기증 및 기억력 저하에 대한 민간 요법으로 사용될 수 있다.
로즈마리는 소화 불량, 헛배 부름, 낙태 유도, 월경 증가, 통풍, 기침, 두통, 간 및 담낭 문제, 식욕 부진, 및 고혈압과 같은 심혈관 질환에 대해 경구 복용된다(Natural Medicines Comprehensive Database, 2010). 로즈마리는 전통적으로 류머티즘과 관련된 근육 및 관절 통증을 완화하는데 도움이 되는 동종요법제로서 한약에 사용된다(Leung and Foster, 1996; ESCOP 2003). 이는 근육 긴장과 류머티즘에 유리한, 순환을 개선하는데 도움이 될 수 있다. 로즈마리 아로마테라피는 또한 두통을 완화하고 스트레스를 줄이며 천식 및 기관지염 증상을 줄이는데 도움이 될 수 있다. 로즈마리는 항미생물, 항진균 및 항바이러스 활성에 대해 보고되었다(Newall, 1996). 분말로 만든 잎은 효과적인 천연 벼룩 및 진드기 퇴치제로 사용된다. 로즈마리 오일은 상당한 항박테리아, 항진균 및 항바이러스 특성도 나타내었다. 연구들은 로즈마리의 항산화 활성을 보고하였다(Al-Sereiti, 1999). 카페산, 로즈마린산 및 페놀 디테르펜 카르노스산 및 카르노솔은 로즈마리 추출물의 항산화 특성과 관련된 화합물이었다.
로즈마린산(RA)은 수용성 카페오일 페놀산 화합물이며, 카페산과 3-(3,4-디하이드록시페닐)락트산으로 구성된 에스테르이다. 로즈마린산은 주로 항산화, 항미생물, 항바이러스, 항암, 항아폽토시스 및 항염증 효과 등의 광범위한 생물학적 활성을 갖는 로즈마리 및 샐비어 종의 주요 성분 중 하나로 보고되었다. 14개의 샐비어 식물 종에서 강력한 항산화 활성은 로즈마린산 함량과 상관 관계가 있었다(Adimcilar, 2019). 로즈마린산 및 이의 두 대사산물인 카페산 및 3-(3,4-디하이드록시페닐)락트산은 모두 비-세포 및 세포 항산화 검정 둘 모두에서 양성 대조군인 케르세틴과 유사한 강력한 자유 라디칼 소거 활성을 나타내었다(Adomako-Bonsu, 2017).
로즈마린산(RA)의 항염증 효과는 관절염, 대장염, 천식 및 알레르기성 비염과 같은 일련의 염증성 질환에서 잠재적으로 사용되는 다양한 시험관 내 및 생체 내 모델에서 연구되었다(Amoah, 2016; Luo, 2020). RA는 IL-1β-유도된 래트 연골세포에서 IL-6 분비를 억제하고 ADAMTS-4 및 ADAMTS-5의 유전자 발현 및 단백질 수준을 억제하는 것으로 밝혀졌다(Hu, 2018). 이 연구에서, RA는 또한 ACAN 및 COL2 유전자 발현을 감소시켜 골관절염 치료에서의 사용을 유력하게 하였다. RA는 천식의 마우스 모델에서 오브알부민(Ova)-자극된 기도 염증을 억제하는 것으로 보고되었다(Liang, 2016). RA는 기관지폐포 세척액(BALF)에서 염증 세포 및 Th2 사이토카인을 유의하게 감소시키고, 총 IgE 및 Ova-특이적 IgE 농도를 감소시키고, 기도 과민반응을 현저하게 개선시켰다. RA로의 전처리는 폐 조직에서 AMCase, CCL11, CCR3, Ym2, 및 E-셀렉틴 mRNA 수준을 상당히 감소시키고 NF-kB 및 MAPK 활성화를 감소시킬 수 있었고, 이는 RA가 잠재적으로 ERK, JNK 및 p38 인산화의 억제 및 NF-kB의 불활성화를 통해 천식 치료를 위한 유망한 후보가 될 수 있음을 나타낸다. 경구 RA는 12-테트라데카노일포르볼 13-아세테이트(TPA)-자극된 마우스 귀 부종 모델(Osakabe, 2004)에서 효과적인 것으로 밝혀졌으며, 비강 세척액에서 호중구 및 호산구의 수를 현저하게 감소시켰다.
로즈마린산(RA)의 항패혈 효과는 배양된 RAW264.7 대식세포-유사 세포 및 광범위한 염증 매개체의 국소 및 전신 수준이 감소된 래트에서 맹장 결찰 및 천자에 의해 유도된 패혈증 모델(Jiang, 2009)에서 조사되었다. RA는 용량-의존적 방식으로 TNF-α, IL-6, 및 고-이동성 그룹 박스 1 단백질(HMGB-1)의 수준을 하향 조절하였다. RA의 항염증 메커니즘은 IκB 키나제 활성을 억제함으로써 NF-κB 경로의 조절을 통할 수 있다. RA는 결장암 HT-29 세포주 및 비악성 유방 상피 세포주 MCF10A 둘 모두에서 전염증성 유전자 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 유의한 하향 조절을 나타내었다(Scheckel, 2008). 일본 뇌염 바이러스에 감염된 마우스에서 RA의 항바이러스 효과가 보고되었고 RA-처리된 그룹에서 사망률이 감소하였다(Swarup, 2007). RA는 처리 없이 감염된 동물의 수준과 비교하여, 특히 IL-6 및 12, TNF-α, IFN-γ 및 MCP-1에서 바이러스 부하 및 전염증성 사이토카인 수준을 상당히 감소시킬 수 있다.
로즈마린산은 염증성 사이토카인 및 NF-κB 경로를 억제하여, 종양 미세환경에서 염증 신호전달을 감소시킴으로써 H22-이종이식 모델에서 간세포 암종(HCC)에 대한 항종양 효과를 입증하였다(Cao, 2016). RA는 CD4+/CD8+ T 세포의 비율과 IL-2 및 IFN-γ의 분비를 조절하고, IL-6, IL-10 및 STAT3의 발현을 감소시키고, Bax 및 카스파제-3을 상향 조절하고, 및 Bcl-2를 하향 조절함으로써 종양 성장을 효과적으로 억제하였다. 이러한 활성은 RA가 면역 반응의 조절 및 HCC 세포 아폽토시스의 유도에 관여함을 의미한다(Cao, 2019).
지질다당류(LPS)는 그람-음성 박테리아의 외막의 필수 구성요소이며 내독성 쇼크를 유발할 수 있는 일반화된 염증 과정의 시작에서 주요 기여 인자이다. 패혈증은 감염에 대한 숙주 반응의 조절 장애로 인해 생명을 위협하는 장기 기능장애로 이어져 장기 부전으로 이어질 수 있다. 이는 주로 대식세포/단핵구에 의해 매개되는 상태이며, TNF-α, IL-1, IL-6 및 IFN-γ와 같은 여러 초기 단계 사이토카인뿐만 아니라 HMGB1과 같은 후기 매개체의 과도한 생산에 기인한다. 고-이동성 그룹 박스 단백질 1(HMGB1)은 패혈증의 중요한 매개체이다. 이는 내인성 및 외인성 염증 신호에 대한 반응으로 활성화된 대식세포 및 단핵구로부터 방출된다(Wang et al., 1999). 면역 신호전달의 과활성은 사이토카인 폭풍으로 이어질 수 있으며, 이는 다발성 장기 부전 및 궁극적으로 사망을 초래할 수 있다. 생존한 환자는 HMGB1의 후기 및 지속적인 방출에 의해 유발될 수 있는 진행되는 염증 반응을 가질 수 있다(Gentile and Moldawer, 2014).
자극된 단핵 세포로부터 능동적으로 그리고 괴사 세포로부터 수동적으로 방출되면, HMGB1은 숙주 면역 반응을 활성화시키는 역할을 하는 얼라민(alarmin)(위험 신호)으로 작용한다. 이는 면역 세포의 감염 부위로의 이동을 촉진하는 케모카인으로 기능하고, 손상-관련 분자 패턴(DAMP)으로서 다른 면역 세포를 활성화시켜 전염증성 사이토카인을 분비함으로써 선천성 면역 반응의 활성화에 중요한 역할을 한다(Yang et al., 2001). 전염증성 사이토카인이 낮은 최적의 수준으로 생산될 때, 이들은 바이러스 또는 박테리아의 침입에 대한 보호 면역 반응을 생성할 것이다; 그러나, '사이토카인 폭풍'의 경우처럼 과잉 생산되면, 유해한 염증 반응을 매개하여 숙주에게 해를 끼친다. 대부분의 경우, 면역결핍 또는 손상된 면역을 갖는 근본적인 건강 상태를 갖는 대상체 및 노인에서, 사이토카인 폭풍은 급성 전신 염증 증후군을 유발하는 것으로 보인다; 생존한 사람들은 지속적인 염증, 면역억제 및/또는 이화작용 반응을 초래할 수 있는 염증의 지연된 매개를 일으킬 수 있다. HMGB1은 모든 염증 세포를 포함하는 수많은 세포 유형에 대한 화학유인제 역할을 하는 것 외에도, 염증 세포가 더 많은 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 대식세포 염증 단백질(MIP)을 분비하도록 하는데, 이는 '사이토카인 폭풍'에서의 참여를 시사한다(Bianchi and Manfredi, 2007). 중요한 연구는 또한 세포 외 HMGB1이 치명적인 염증 반응을 촉발하고 패혈증 및 급성 폐 손상의 진행을 촉진할 수 있다고 보고하였다(Entezari et al., 2014). 내독소 자극의 몇 분 이내에 분비되는 TNF-α 및 IL-1β와는 대조적으로, HMGB1은 시험관 내 및 생체 내 모두에서 수 시간 후에 분비되며, 이는 후기 단계의 염증 매개를 나타낸다. 실제로, 패혈증 발병 24시간 후 HMGB1-중화 항체를 투여했을 때, 치명적인 내독소혈증에 대한 보호를 제공하였는데, 이는 치명적인 패혈증의 후기 매개체로서 HMGB1의 핵심 역할을 나타낸다(Wang et al., 1999). 임상적으로, 지속적으로 높은 수준의 HMGB1과 패혈증 후기 단계의 대상체 또는 패혈증으로 사망한 대상체 간에 강한 연관성이 또한 확립되었다(Angus et al., 2007).
노화는 시간이 지남에 따라 몸과 마음의 기능에 영향을 미치는 복잡한 퇴행성 과정이며, 불량한 면역 반응은 노인에서 가장 많이 관찰되는 변화 중 하나이다. 노인에서 발생하는 면역 반응의 감소에 대한 근본적인 메커니즘을 이해하는 것이 완화의 주요 첫 번째 단계이다. D-갈락토스 유도된 흉선 손상 및 면역 노화 마우스 모델과 같은 화학적으로-유도된 가속화 노화 모델은 노화가 면역계에 미치는 영향을 연구하는데 선호되는 옵션이다. 화학적으로 유도된 동물 노화 모델에서, 동물은 노인에서 자주 관찰되는 면역 반응의 감소를 모방하는 면역노화를 나타낸다(Azman 2019). D-갈락토스 유도된 노화 모델은 항노화 연구에서 일반적으로 사용되고 잘 검증된 동물 모델 중 하나이다. 동물의 체내에서 정상 농도의 글루코스로 전환되는 동안, 고 농도의 D-갈락토스는 쉽게 알도스 및 하이드로퍼옥사이드로 전환되어, 산소 유래 자유 라디칼을 생성할 수 있다. 이는 또한 비효소적 당화를 통해 고급 당화 최종 생성물(AGE)을 생산하기 위해 단백질 및 펩티드의 유리 아민과 반응할 수 있다. 이 모델에서 이러한 활성 산소 종(ROS)의 축적 및 증가된 AGE는 정상적인 기관 및 면역계 항상성의 불균형을 초래할 것이며, 이는 후속적으로 산화 스트레스, 염증, 면역 반응 감소, 미토콘드리아 기능장애, 및 궁극적으로 노화 과정을 가속화하는 아폽토시스(예를 들어, 흉선 세포의)를 유발할 수 있다. 이러한 변화는 자연적으로 발생하는 노쇠 및 노화의 병리학적 특성 중 하나이다.
고려되는 주제는 면역 항상성의 조절을 위한 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 신규한 알로에-기반 조성물을 기술한다. 현재 고려되는 주제와 관련하여, 면역 항상성을 달성하는 것은 숙주 방어 메커니즘에 대한 2개의 개별 반응 트리거로부터 접근되었다. 단순화를 위해, 이러한 반응 트리거는 공격의 기원에 따라 내인성/내재 및 외인성/외적으로 분류되었다. 오염, 감염, 만성 질환 및 임의의 외부 침입에 대한 노출은 외인성 기원의 범주에 속하는 반면; 염증, 산화 스트레스, 스트레스 호르몬, 노화 및 이와 관련된 변화는 상기 고려되는 주제에서 내인성 기원으로 분류된다. 원인에 관계 없이, 임의의 개시된 내인성 및/또는 외인성 공격 트리거로부터의 회복, 보호 및/또는 예방은 항상성을 회복시키는 숙주 면역 반응의 능력에 의존한다.
일부 구현예에서, 고려되는 방법은 면역 반응을 최적화하거나 균형을 맞추고; 노화 및 면역 기관 노화 손상된 면역을 개선하고; 만성 염증 및 염증-손상된 면역을 예방하고; 인플루엔자 백신 접종 또는 COVID-19 백신 접종에 대한 건강한 면역 반응을 유지하도록 돕고; 바이러스 감염 및 박테리아 감염에 대한 건강한 면역 기능을 유지하도록 돕고; 대기 오염으로 인한 산화 스트레스 손상으로부터 포유동물의 면역계를 보호함으로써 면역 항상성을 유지하는 것을 포함한다.
현재 고려되는 주제에 기재된 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 알로에-기반 신규 조성물 UP360은 내인성 및 외인성 공격 시나리오 둘 모두를 다루는 것으로 나타났다. 지질다당류(LPS)-유도된 패혈증, LPS-유도된 급성 폐 손상, 과산소 및 미생물 감염된 마우스 모델 및 면역화 모델을 사용하여 외인성 영향을 모방한 반면, 면역화를 사용하거나 사용하지 않은 D-갈락토스-유도된 가속화 노화 모델을 사용하여 고려되는 조성물의 내인성 효과를 모방하였다. 두 경우 모두에서, 현재 고려되는 주제는 숙주의 면역 반응에서 통계적으로 유의한 개선을 보였으며, 이는 항상성을 회복하기 위한 신규한 조성물의 긍정적인 추진력을 시사한다. 고려되는 조성물의 효능은 HMGB1과 같은 주요 면역 및/또는 염증 반응 바이오마커에서 관찰된 변화, 및 면역노화와 관련된 변화에 기초하여 평가되었다. HMGB1을 조절함으로써, 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 알로에-기반 조성물 UP360은 생존율을 증가시키며 전염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6, CRP 및 CINC3의 현저한 완화를 나타내었고, 이는 면역 항상성을 회복, 조절 및 유지할 수 있는 면역 조절제로서의 용도를 나타낸다. 유사하게, 알로에-기반 조성물 UP360은 또한 선천성 및 적응 면역 반응의 자극에 의해 입증된 바와 같이 면역노화의 역전(증가된 IgA, 증가된 CD3+ T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, CD8+ 세포독성 T 세포, NKp46+ 자연 살해 세포, TCRγδ+ 감마 델타 T 세포, 및 CD4+ TCRγδ+ 헬퍼 감마 델타 T 세포), 항산화 능력의 증가(증가된 SOD 및 Nrf2) 및 노화-관련 손상으로부터 흉선과 같은 주요 면역 기관의 보존을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
다당류 및 폴리페놀을 포함하는 신규한 알로에-기반 조성물 UP360은 무작위 이중-맹검 플라시보 대조 인간 임상 시험과 같은 추가 범주에서 증가된 면역 감시 및/또는 강력한 반응을 위한 숙주 면역계의 프라이밍 및 활성화를 입증하였다. 구체적으로, TCRγδ+ 감마 델타 T 세포는 UP360을 매일 28일 보충한 후 대상체에서, 그리고 28일의 인플루엔자 백신 접종 면역 챌린지와 함께 총 56일 동안 보충제를 섭취한 대상체에서 증가하였다. 증가된 순환하는 TCRγδ+ 감마 델타 T 세포는 피부, 장 및 폐와 같이, 더 높은 비율의 TCRγδ+ 감마 델타 T 세포를 갖는 말초 조직에서 강화된 면역 감시를 시사한다. 현재 고려되는 주제에서 약용 식물로부터 이렇게 표준화되고 풍부화된 추출물을 조합시킨 장점은 또한 생체 내 LPS-유도된 패혈증 모델 및 시험관 내 LPS-챌린지된 대식세포에서 시험되었고, 예상치 못한 상승작용 효과가 고려되는 주제의 본문에 설명된 대로 발견되었다. 일반적으로, 면역계를 지렛대로 표현하고 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 알로에-기반 조성물을 중심점으로 표현하면, 면역 항상성은 지렛대의 한쪽에서 HMGB1 효과 및 다른 쪽에서 감마 델타 T-세포 반대 효과를 조절함으로써 달성되었다.
도 1은 티핑 포인트 - HMGB1을 이동시킴으로써 면역 기능의 항상성을 유지하는 알로에-기반 조성물(이 도면에서 UP 360)의 신규성을 보여준다.
도 2는 500 mg/kg의 UP360으로 처리된 LPS 유도된 래트로부터의 폐 조직의 H&E 염색을 보여준다. A=정상 대조군, B=비히클 대조군, C=소듐 부티레이트, D=UP360(500 mg/kg). 배율 100x.
주제의 개요
하나 이상의 다당류가 풍부한 알로에 추출물; 하나 이상의 다당류가 풍부한 포리아 추출물; 및 하나 이상의 폴리페놀 화합물이 풍부한 로즈마리 추출물의 조합물을 포함하는 면역 항상성의 조절을 위한 조성물이 개시된다.
하나 이상의 다당류 및 하나 이상의 폴리페놀 화합물의 조합물을 포함하는, HMGB1을 조절함으로써 면역 항상성을 유지하기 위한 조성물이 개시되며, 상기 조성물은 HMGB1 방출을 억제함으로써 HMGB1을 조절하거나 세포질 전좌를 차단하거나 소포 매개 방출을 차단함으로써 HMGB1 능동 또는 수동 방출을 표적화하는 것으로 그 작용을 방해하거나; 핵에서 분자 내 이황화 결합 형성을 억제하거나; 방출시 HMGB1을 직접 표적화하고 그 효과를 중화시키거나; Toll-유사 수용체(TLR)-2/4/7/9 및 고급 당화 최종 생성물(RAGE)에 대한 수용체와 같은 수용체를 인식하는 HMGB1 패턴을 차단하거나 이들의 신호 전달을 억제하거나; 물리화학적 미세환경을 변화시키고 HMGB1 테트라머의 형성을 방지하고 HMGB1의 TLR 및 RAGE에 대한 결합 친화성을 방해하거나; HMGB1의 클러스터 형성 또는 자가-결합을 방지한다.
포유동물의 체중 kg 당 0.01 mg 내지 500 mg의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 항상성의 조절을 치료, 관리, 촉진하기 위한 방법이 개시된다.
상세한 설명
적응 또는 선천성 면역의 임의의 구성요소를 조절, 억제 및 자극할 수 있는 천연 화합물은 면역조절제, 면역회복제, 면역증강제, 또는 생물학적 반응 개질제로 알려져 있다. 면역조절제는 일반적으로 임상 실습에서 면역애쥬번트, 면역자극제 및 면역억제제로 분류된다. 면역애쥬번트는 백신의 효능을 향상시키는 특정 면역 자극제이다. 면역계의 매개체 또는 구성요소를 활성화하거나 유도하는 제제를 면역자극제라고 한다. 자가면역, 암, 알레르기 및 감염에 대한 보호는 면역자극제에 의해 향상된다. 반면에, 면역억제제는 면역계를 억제하는 분자이며, 장기 이식 후와 같은 병리학적 면역 반응을 제어하는데 사용될 수 있다.
엄격한 면역 항상성을 유지하는 것은 외부 침습성 미생물, 바이러스, 진균, 오염 물질로부터의 방어, 죽은 세포 제거, 및 호흡기 및 위장 기능의 재건 및 재생을 시작하는 생리학적 기능에 필수적이다. 과자극된 면역 기능은 알레르기 반응 및 자가면역 파괴성 질환을 일으킬 수 있다. 노화, 산화 스트레스, 심리적 스트레스, 전신 염증, 및 당뇨병, 비만 및 대사 증후군과 같은 많은 만성 질환은 항상성 티핑 포인트를 이동시켜 면역 기능을 손상시킬 수 있다. 매일 균형 잡힌 영양, 운동, 스트레스 관리, 및 항산화, 항염증 및 면역 조절(특정 경우에 따라 면역 억제 및/또는 면역 자극) 천연 화합물 및 항바이러스, 항생제, 스테로이드 및 NTHE에 대한 처방 또는 OTC 약물로의 보충을 포함하는 건강한 생활 습관은 면역 기능의 균형을 유지하는 유익한 힘을 제공할 수 있다. 이러한 수단을 통해, 전신 및 만성 염증을 감소시킬 수 있다.
불행하게도, 과활성일 때, 건강한 수준에서 하향 나선형으로 면역 반응의 이동을 가속화하여 사이토카인 폭풍으로 이어질 수 있는 티핑 포인트 인자로서 중요한 역할을 하는 주요 생물학적, 생리학적 및 병리학적 경로 및 바이오마커가 있는지 이해하기 위한 지식과 관심은 훨씬 적다. 이러한 티핑 포인트를 찾는 것이 중요하다. 더 중요한 것은 티핑 포인트를 파괴적인 방향으로부터 멀리 이동시키고 면역 항상성을 회복시킬 수 있는 조성물로 만들 활성 화합물을 찾는 것이다. 본 발명자들은 HMGB1이 손상되고 파괴적인 면역 반응을 초래하는 코로나 바이러스 SARS-CoV-2, 박테리아 감염, 및 PM2.5 오염 물질과 같은 바이러스에 대한 생물학적 반응을 상승시키는 티핑 포인트 역할을 할 수 있는 바이오마커라고 믿는다. 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 알로에-기반 조성물은 HMGB1을 조절함으로써 티핑 포인트를 이동시켜 면역 항상성을 회복, 조절 및 유지할 수 있다(도 1).
HMGB1은 뉴클레오솜의 구조를 안정화시키고 DNA의 입체형태적 변화를 매개함으로써 전사를 조절하는 핵 단백질로 초기에 확인되었다. 핵에서의 역할과는 달리, 세포 외 HMGB1은 상당한 염증 반응을 유도한다. 수집된 증거는 기도에서 높은 수준의 세포 외 HMGB1의 축적이 폐 감염의 몇 가지 동물 모델에서 대식세포 기능의 손상을 통해 박테리아 및 바이러스 감염에 대한 숙주 방어 메커니즘을 직접 손상시킬 수 있음을 보여주었다. 장기간의 산화 스트레스에 노출된 동물 및 인간의 기도에서 핵 HMGB1 단백질의 수준은 압도적으로 높다(건강한 대조군에 비해 100배). 따라서, 기도에서 HMGB1의 수준을 감소시키고/거나 이들의 활성을 차단하는 것은 COVID-19 감염과 같은 사이토카인 폭풍에 의해 생성된 산화 스트레스에 노출된 증가하는 집단, 및 염증성 장애를 앓고 있는 사람들에게 중요한 치료 및 예방 전략을 제공할 수 있다.
하나 이상의 다당류가 풍부한 알로에 추출물; 하나 이상의 다당류가 풍부한 포리아 추출물; 및 하나 이상의 폴리페놀 화합물이 풍부한 로즈마리 추출물의 조합물을 포함하는 면역 항상성의 조절을 위한 조성물이 개시된다. 고려되는 구현예에서 그리고 본원에 상세히 제시되는 바와 같이, 조성물 내의 알로에 추출물, 또는 포리아 추출물 또는 로즈마리 추출물은 3:2:1(50%:33.3%:16.7%) 또는 1:1:1(33.3%:33.3%:33.3%) 또는 3:6:1(30%:60%:10%)의 알로에:포리아:로즈마리(APR)의 최적화된 중량비와 함께 1 중량% 내지 98 중량%의 각 추출물의 범위로 존재한다.
일부 구현예에서, 고려되는 폴리페놀 화합물은 로즈마린산, 컨쥬게이션된 카테킨, 예를 들어, EGCG, ECG, 에피갈로카테킨 등, 오록실린, 캄페롤(Kaempferol), 제니스테인, 케르세틴, 부테인(Butein), 루테올린(Luteolin), 크리신, 아피게닌(Apigenin), 커큐민, 레스베라트롤, 캡사이신, 글로메라토스 A, 6-쇼가올, 진저롤, 베르베린, 피페린(Piperine) 또는 이들의 조합을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나 이상의 다당류 및 하나 이상의 폴리페놀 화합물의 조합물을 포함하는, HMGB1을 조절함으로써 면역 항상성을 유지하기 위한 조성물이 개시되며, 상기 조성물은 HMGB1 방출을 억제함으로써 HMGB1을 조절하거나 세포질 전좌를 차단하거나 소포 매개 방출을 차단함으로써 HMGB1 능동 또는 수동 방출을 표적화하는 것으로 그 작용을 방해하거나; 핵에서 분자 내 이황화 결합 형성을 억제하거나; 방출시 HMGB1을 직접 표적화하고 그 효과를 중화시키거나; Toll-유사 수용체(TLR)-2/4/7/9 및 고급 당화 최종 생성물(RAGE)에 대한 수용체와 같은 수용체를 인식하는 HMGB1 패턴을 차단하거나 이들의 신호 전달을 억제하거나; 물리화학적 미세환경을 변화시키고 HMGB1 테트라머의 형성을 방지하고 HMGB1의 TLR 및 RAGE에 대한 결합 친화성을 방해하거나; HMGB1의 클러스터 형성 또는 자가-결합을 방지한다. 도 1은 티핑 포인트 - HMGB1를 이동시킴으로써 면역 기능의 항상성을 유지하는 알로에-기반 조성물(이 도면에서 UP 360)의 신규성을 보여준다.
포유동물의 체중 kg 당 0.01 mg 내지 500 mg의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 항상성의 조절을 치료, 관리, 촉진하기 위한 방법이 개시된다. 일부 구현예에서, 고려되는 조성물은 하나 이상의 다당류가 풍부한 알로에 추출물; 하나 이상의 다당류가 풍부한 포리아 추출물; 및 하나 이상의 폴리페놀 화합물이 풍부한 로즈마리 추출물의 조합물을 포함한다.
발표되고 진행 중인 연구는 세포 외 HMGB1의 축적을 약화시킬 수 있는 시약이 대기 오염 물질, 박테리아 및 바이러스 감염에 대한 선천성 면역을 향상시키고 개선된 대식세포 기능을 통해 염증 반응을 완화함으로써 호흡 기능을 개선하는데 효과적이라는 것을 입증하였다. 이 모델은 마우스를 COVID-19 환자 및 폐 감염에 대한 산소 요법 동안 일반적으로 사용되는 과산소에 노출시키고, 잠재적인 치료를 시험하여, 이것이 선천성 면역 및 호흡 기능을 개선하고 기도 및 순환에서 세포 외 HMGB1의 축적을 억제함으로써, 생존을 포함한 더 나은 임상 결과를 달성하기 위한 효과적인 도구로 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 현재 고려되는 주제는 이들 모델에서 HMGB1을 이동시킴으로써 선천성 면역을 개선하고 손상된 호흡 기능을 완화시킨 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 독특한 알로에-기반 조성물을 개시한다(실시예 12-17). 실시예 51에 상세히 설명된 바와 같이, 알로에-기반 조성물로의 보충은 기도에서 박테리아 부하를 상당히 감소시켰고, 과산소에 노출되고 슈도모나스 에어루기노사(pseudomonas aeruginosa)로 챌린지된 동물의 사망률을 감소시켰는데, 이는 과산소 및 미생물 감염의 효과를 상쇄하는데 있어서 이의 유리한 적용을 나타낸다.
고려되는 주제는 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 알로에-기반 조성물에 의해, 면역 반응에서 자연적인 후기 사건인 혈류로의 HMGB1의 분비를 표적화함으로써 면역 항상성을 조절한다. 시험관 내에서, 과산소 대식세포를 알로에-기반 조성물의 개별 구성요소로 처리하였고 HMGB1 분비가 감소된 것으로 나타났다(실시예 12). 산화 스트레스는 세포핵으로부터 HMGB1 방출의 가장 강력한 유도제 중 하나이기 때문에, 본 발명자들은 알로에 조성물 및 이의 개별 성분이 UVA 및 UVB에 의해 유도된 인간 각질형성 세포에서 활성 산소 종(ROS)을 감소시키고(실시예 13-14), 인간 섬유모세포에서 과산화수소-유도된 DNA 손상을 보호하였음을 입증하였다(실시예 15). 이러한 세포 검정은 자유 라디칼 생성의 억제 및 DNA 손상의 복구에 의해 HMGB1 수준을 감소시키는데 있어서 약용 식물로부터 추출된 이러한 생물활성 화합물의 통계적으로 유의한 영향을 나타내었으며, 이는 질병 병리학에 개시된 메커니즘을 포함하는 질환에 대한 향상된 결과를 위한 표준화된 제형을 제안한다. LPS 유도된 생존율 연구(실시예 20-22)에서 동물의 사망률을 유의하고 상승적으로 감소시키는 것 외에도, UP360은 또한 과산소 유도된 슈도모나스 에어로기노사 감염된 마우스에서 동물의 생존율을 유의하게 증가시키고 기도에서 박테리아 부하를 감소시켰다(실시예 51). HMGB1과 함께 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-10, CRP 및 CINC-3과 같은 주요 전염증성 사이토카인 및 케모카인(실시예 12-31)을 생체 내 검정으로부터 평가하였고, 면역 항상성에서, 티핑 포인트 HMGB1을 이동시킨 결과로 비히클-처리된 그룹과 비교하여, 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 알로에-기반 조성물 UP360으로 처리된 동물에서 이러한 바이오마커의 통계적으로 유의한 감소가 발견되었다.
객관적인 치료 및 반응 효과는 고려되는 주제의 본문(실시예 18-31, 51)에 기재된 바와 같이 다수의 생체 내 연구(예를 들어, LPS-유도된 패혈증 모델, 과산소 유도된 슈도모나스 에어루기노사 감염된 마우스 생존 모델 및 급성 폐 손상 모델)에서 평가되었다. 이러한 고려되는 주제의 실시예에 묘사된 데이터는 패혈증, 과산소 유도된 슈도모나스 에어루기노사 감염된 마우스 또는 급성 폐 손상 연구 대상체에서 알로에-기반 조성물의 경구 투여시 상당한 면역 항상성 효과를 나타내었다. 혈청, 기관지-폐포 세척(BAL) 및 폐 균질물로부터의 바이오마커 수준의 이러한 유의한 변화뿐만 아니라 BAL에서 총 단백질 감소는 티핑 포인트인 HMGB1을 이동시킴으로써 개선된 면역 항상성을 입증하였고, 이러한 결과는 나중에 조직학 검사에 의해 확인되었다. 알로에-기반 조성물로 처리된 동물에 대해 폐 손상 및 폐 부종의 전체 중증도의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다. 2개의 상이한 부류의 천연 활성 화합물, 면역 자극 다당류 및 면역 억제 폴리페놀을 함유하는 알로에-기반 식물 추출물을 제형화하는 장점을 LPS-유도된 패혈증 모델에서 평가했을 때 예상치 못한 상승작용 효과가 또한 관찰되었다(실시예 22). 현재 고려되는 주제로부터의 데이터는 다당류 및 폴리페놀로 구성된 알로에-기반 조성물이 티핑 포인트 - HMGB1을 이동시킴으로써 면역 항상성을 유지하는데 도움이 된다는 것을 나타내었다. 결과적으로, 알로에-기반 조성물은 패혈증 및/또는 호흡기 시스템의 급성 및/또는 만성 손상으로부터 호흡기 및 폐 기능을 보호하기 위해 균형 잡힌 면역 반응을 요구하는 대기 오염, 계절성 독감 및/또는 바이러스 및 박테리아 감염시에 사용될 수 있다.
종합적으로, 이 연구로부터의 데이터는 질병 병리학을 나타내는 주요 바이오마커에 의해 입증된 바와 같이(실시예 23-29), 알로에-기반 조성물(여기서, 이들 고려되는 조성물 중 하나가 본원에서 UP360으로 지칭될 수 있음)이 HMGB1을 상쇄시킴으로써 기관 내 LPS에 의해 유도된 급성 폐 손상의 상당한 완화를 유도하는 예상치 못한 상승적 활성을 갖는다는 것을 보여주었다. LPS를 폐에 직접 주입하는 것은 폐포 대식세포를 통해 상주 선천성 면역 반응을 활성화하여 상당한 양의 HMGB1을 방출시킴으로써, TNF-α, IL-1β 및 IL-6과 같은 일차 사이토카인뿐만 아니라 염증 단백질 CRP의 생산을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 사이토카인은 단독으로 또는 공동으로 심각한 폐 병리를 유발하여 질병 병리학에 해로운 일련의 사이토카인 및 케모카인의 활성화를 촉발할 수 있다. 예를 들어, 급성 염증 반응시, 화학주성 사이토카인 유도된 호중구 화학유인제(CINC-3)는 LPS-유도된 급성 폐 손상에서 폐로의 호중구 동원에 중요한 역할을 한다. 폐에서 급성 염증 반응에 관여하는 이러한 주요 사이토카인 및 화학주성 인자를 제어하기 위해, 면역 항상성의 주요 티핑 포인트인 HMGB1의 억제는 사이토카인 폭풍 중재 및 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)의 중증도를 완화시키는데 있어서 상당한 임상적 관련성을 갖는다.
간질 공간으로의 단백질 및/또는 섬유소 누출은 증가된 삼출물이 호흡기 질환 중증도의 지표인 폐 부종의 핵심 구성요소이다. 다당류 및 폴리페놀로 구성된 알로에-기반 조성물로의 처리는 기관지-폐포 세척(BAL)으로부터의 총 단백질을 감소시키며, 이는 폐 병리를 완화시키는데 있어서 이의 유의성을 나타낸다(실시예 28). 혈청, BAL 및 균질물로부터의 바이오마커의 이러한 유의한 변화는 알로에-기반 다당류 및 폴리페놀 조성물의 투여 전략이 조직병리학 평가에 의해 확인된 폐 손상 및 폐 부종의 전체적인 중증도의 통계적으로 유의한 감소를 초래하였음을 입증하였다. 여기에 묘사된 사이토카인 및 조직병리학 데이터에 기초하여, 알로에-기반 조성물, 이 경우 UP360은 사이토카인 폭풍 억제 및 급성 염증성 폐 손상 중증도의 완화를 유도하는 면역 항상성의 티핑 포인트를 조절하였다.
본 발명자들은 마우스를 D-갈락토스에 노출시켜 면역 노화 표현형을 유도하고, 다당류와 폴리페놀을 두 가지 농도로 포함하는 알로에-기반 조성물(UP360)로 이들을 처리한 다음, 인플루엔자 백신을 면역 챌린지로서 도입하고, 고려되는 알로에-기반 조성물이 면역 기관을 보호하고 면역계의 항상성을 유지하는지 여부를 결정하기 위해 여러 검정에서 면역 기능을 측정하였다(실시예 32). 정상 대조군 및 UP360 + D-gal 처리 그룹 둘 모두에 대한 흉선 지수는 D-gal 그룹보다 유의하게 높았으며, 이는 알로에-기반 조성물이 노화로부터 이 면역 기관을 보호하였음을 입증하였다(실시예 33 및 35). 정상 대조군만이 D-gal 그룹에 비해 유의하게 더 높은 비장 지수를 가졌지만, UP360 + D-gal-처리된 동물은 산화 스트레스로부터 비장을 보호하는 긍정적인 경향을 나타내었다(실시예 34).
본 발명자들은 면역된 그룹들 간에 체액성 면역의 유의한 변화를 발견하였다. UP360 + D-gal 그룹은 D-gal 그룹에 비해 증가된 혈청 IgA 항체를 가졌다(실시예 36). 혈청에서 IgA의 이러한 증가된 수준은 UP360 처리로 인해 점막이 더 높은 수준의 면역 보호를 달성하였음을 나타내었다.
상이한 그룹의 전혈에서 백혈구를 측정하고 세포 집단의 백분율로서 변화를 표현함에 있어서, 본 발명자들은 면역된 마우스 그룹들 간에 중요한 차이를 발견하였다(실시예 37-42). CD45+ 세포(모든 백혈구)는 임의의 다른 면역된 그룹보다 D-gal 그룹에서 더 높은 비율의 살아있는 세포를 구성하였다. CD3+ T 세포, CD45+ 헬퍼 T 세포, NKp46+ 자연 살해 세포, 및 TCRγδ+ 감마 델타 T 세포는 모두 면역된 D-gal 단독 그룹에 비해 면역된 UP360 + D-gal 그룹에서 증가하였다. 이러한 데이터는 다당류 및 폴리페놀로 구성된 알로에-기반 조성물 UP360이 면역 세포 집단의 확장을 돕고, 그 결과 면역 항상성의 중요한 매개체로서 더 높은 백분율의 선천성 및 적응 면역 세포를 발생시킴을 나타내었다.
전혈의 μL 당 총 세포로 표현시, 본 발명자들은 면역되지 않은 마우스 그룹들 간에 상당한 차이를 발견하였다(실시예 43-48). 400 mg/kg UP360 + D-gal 그룹은 면역-손상된 D-gal 단독 그룹보다 증가된 CD3+ T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, CD8+ 세포독성 T 세포, NKp46+ 자연 살해 세포, TCRγδ+ 감마 델타 T 세포, 및 CD4+ TCRγδ+ 헬퍼 감마 델타 T 세포를 가졌다. 이러한 데이터는 다당류 및 폴리페놀로 구성된 알로에-기반 조성물 UP360이 불활성화된 면역계를 프라이밍하고 면역 세포 집단의 확장을 야기하여, 면역되지 않은 마우스에서 면역 "준비"를 증가시켰음을 암시한다.
자연 살해 세포의 활성화 및 확장은 면역 항상성을 유지하기 위한 주요 면역조절 모드이다. 자연 살해 세포는 임의의 프라이밍 또는 사전 활성화 없이, 다양한 병리학적 챌린지; 대기 오염 물질; 바이러스, 미생물 및 진균 감염; 및 세포 산화 및 호르몬 고통에 빠르게 반응하는 것으로 알려진 선천성 면역계의 중요한 구성요소이다. 자연 살해 세포는 세포독성 효과기 메커니즘을 배치하기 위해 세포 표면 분자의 변화를 감지하기 위해 세포 완전성의 감시를 수행한다. 자연 살해(NK) 세포는 세포독성 림프구 및 면역조절 사이토카인의 생산자로 기능한다. 자극 후, NK 세포는 주로 인터페론-γ(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자(TNF)와 같은 다량의 사이토카인을 생산한다. 이러한 사이토카인 및 NK 세포에 의해 생산된 다른 것들은 초기 면역 반응 동안 직접적인 효과를 가지며, T 세포 및 B 세포를 통해 매개되는 후속 적응 면역 반응의 중요한 조절자이다. 다당류 및 폴리페놀로 구성된 고려되는 알로에-기반 조성물(UP360)의 경구 투여의 결과로서 현재 고려되는 주제(실시예 41 및 45)에서 NK 세포의 현저한 증가는 고려되는 주제가 선천성 면역 조절에 대해 유의한 영향을 갖는다는 명백한 표시이며, 이는 이의 즉각적이고 효과적인 면역 촉발 활성이 면역 항상성의 기초를 놓는데 관여함을 시사한다.
다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물의 인간 임상 시험은 또한 면역 챌린지 전 및 후에 처리된 집단에서 특정 면역 세포의 풍부화를 입증하였다(실시예 52). 건강한 중년의 대상체는 면역계가 인플루엔자 백신으로 챌린지되기 전 28일 동안 UP360 또는 플라시보로 매일 보충되었다. 이들은 추가 28일 동안 UP360을 계속 복용하였고, 기준선, 처리 28일 후, 및 처리 56일 후(백신 접종 28일 후)에 면역 세포 측정을 수행하였다. 감마 델타(γδ) T 세포 집단은 56일(백신 접종 28일 후)에 기준선 수준 및 28일 수준 둘 모두 이상으로 유의하게 증가하는 것으로 나타났다. UP360-처리된 그룹은 56일에 플라시보 그룹보다 유의하게 더 높은 순환하는 감마 델타(γδ) T 세포를 가졌고, 0일-56일 및 28일-56일에 감마 델타(γδ) T 세포 수의 변화는 플라시보 그룹보다 UP360-처리된 그룹에서 유의하게 더 높았다. 이 임상 시험 예비 데이터에서 가장 눈에 띄는 주요 결과는 아마도 이러한 감마 델타 T-세포에서 관찰된 변화였다. 보충 과정을 통해, 다당류 및 폴리페놀로 구성된 알로에-기반 조성물을 투여받은 대상체는 28일부터 56일까지 이동하는 이러한 T-세포 수준의 점진적인 증가를 나타내었으며, 여기서 알로에-기반 조성물은 투여 후 28일 및 56일에 TCRγδ+ 세포 집단의 퍼센트에서 각각 21.5% 및 24.5% 증가를 나타내었다. 대조적으로, 플라시보는 동일한 시간 프레임에서 이러한 세포 집단의 감소를 나타내었고, 여기서 투여 후 28일 및 56일에 TCRγδ+ 세포의 퍼센트에서 각각 10.5% 및 5.6% 감소가 관찰되었다. 플라시보와 비교하여, 다당류 및 폴리페놀로 구성된 알로에-기반 조성물을 수용한 대상체는 치료 투여 후 28일 및 56일에 TCRγδ+ 세포 집단의 퍼센트에서 각각 23.5% 및 38.9% 증가를 나타내었다. 이러한 발견은 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물이 병원체에 대한 1차 방어선에 중요한 세포 유형인 감마 델타(γδ) T 세포 집단을 강화시키는 능력을 가짐을 나타내었다.
주로, 현재 고려되는 주제의 면역 조절, 감시 및 항상성 활성은 면역 조절, 면역 감시 및 면역 항상성 촉진을 위해 알려진 감마 델타(γδ) T 세포(임상 및 전임상 연구 둘 모두에서)에서 관찰된 유도 수준에 의해 확인되었다. γδ T 세포는 장 및 폐를 포함하는 체내의 많은 진입 입구에 주로 존재하는 독특한 T 세포 서브집단이며, 발달 초기에 이동하고 상주 세포로서 지속된다. 이들의 전략적 해부학적 위치(위장 및 호흡기 시스템의 점막 내층)로 인해, γδ T 세포는 감염된 세포를 직접 죽이고, 다른 면역 세포를 동원하고, 포식작용을 활성화하고, 전신 구획에 병원체 또는 오염 물질의 전좌를 제한함에 있어서 선천성-유사 반응에 기초하여 1차 방어선을 제공한다. 이들 세포는 급속한 집단 확장을 겪고 이차 챌린지에 대한 병원체-특이적 보호를 제공하는 것으로 알려져 있다. 장 및 호흡기 트랙에서의 이상적인 위치는 또한 장 및 호흡기 상피 완전성을 유지하도록 돕는다. 일반적으로, γδ T-세포의 생리학적 역할은 세포 외 및 세포 내 병원체 또는 오염 물질에 대한 보호 면역, 감시, 선천성 및 적응 면역 반응의 조절, 조직 치유 및 상피 세포 유지, 및 생리적 기관 기능의 조절을 포함한다. γδ T-세포는 자연 살해(NK) 세포와 쌍방으로 일부 특성을 공유한다: 일반적으로 선천성 면역의 구성요소로 간주되고, 형질전환된/고통스런 세포를 인식하고, 항바이러스 보호에서 두드러진 역할을 하고, 다운스트림 적응 면역 반응을 촉진하고, 강력한 세포용해성 림프구이다. 또한, γδ T-세포는 항원 제시 세포의 역할을 맡는다(Ribot et al., 2021; Bonneville et al., 2010). 이렇게 빠르게 반응하는 면역 세포(γδ T-세포 및 NK 세포)는 현재 고려되는 주제에서 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360(실시예 42 및 48)을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물에 의해 유도되어, 조성물에 의해 생성된 면역 조절, 감시 및 항상성을 달성하는데 있어서 이러한 T-세포의 향상된 특성을 초래한다.
본 발명자들은 D-갈락토스 유도된 면역 노화 모델에서 항산화 경로를 조사하기 위해 항산화 효소 및 바이오마커를 조사하였다. D-gal 모델에 의해 유도된 노화 표현형은 고급 당화 최종 생성물의 증가를 기반으로 하며, 이는 노화된 동물에 존재하는 수준과 유사한 산화 스트레스 및 면역 기관 손상을 유발한다(Azman KF, 2019). 항산화 경로의 증가는 산화 스트레스의 해로운 영향에 대응할 것이다. 본 발명자들은 D-gal 단독과 비교하여 면역된 UP360(두 농도 모두) + D-gal 그룹으로부터의 마우스 혈청에서 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 효소(SOD)의 증가를 발견하였다(실시예 49). 이는 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물이 동물로 하여금 처리되지 않은 노화 동물보다 자유 라디칼을 더 잘 중화시킬 수 있도록 하는 항산화 경로를 강화시켰음을 나타낸다.
고려되는 주제에서, 본 발명자들은 또한 면역된 그룹의 동물의 비장에서 단백질 수준을 조사하였다. 비장은 면역계의 주요 기관 중 하나이다. 이는 높은 수준의 백혈구를 포함하고 혈액에서 면역 세포 유형의 수준을 제어한다. 본 발명자들은 염증 및 장기간의 산화 스트레스에 대한 반응으로 항산화 경로를 활성화시키는데 관여하는 전사 인자인 Nrf2를 측정하였고, Nrf2가 D-gal 단독에 비해 UP360 + D-gal 그룹으로부터의 비장 균질물에서 유의하게 증가하였음을 발견하였다(실시예 50).
전체적으로, D-갈락토스-유도된 면역 노화 모델에서, 본 발명자들은 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물로 처리된 동물에서 증가된 면역계 프라이밍 및 활성화를 나타내는 면역 세포 집단, 항산화 스트레스 경로, 및 면역 기관의 보호의 상당한 변화를 확인하였고, 이는 정상 마우스의 표현형으로의 복귀를 입증하였다. 면역된 UP360 + D-gal 그룹의 흉선 지수, 혈청 항체, T 세포, 및 자연 살해 세포, 및 항산화 인자는 D-gal 단독보다 높았으며, 이는 UP360-처리된 그룹의 면역계가 D-gal 그룹 단독보다 백신 접종에 더 잘 반응할 수 있음을 나타낸다. 면역되지 않은 UP360 + D-gal 그룹의 흉선 지수, T 세포, 및 자연 살해 세포는 D-gal 단독보다 높았다. 이러한 데이터는 챌린지되지 않은 면역계에서도, UP360이 면역계를 프라이밍하고 활성화시켜, 면역 세포의 확장을 유발함을 나타내었다. 이러한 발견은 활성 감염 동안 및 감염에 대해 면역계를 프라이밍하는 예방제로서 면역계의 항상성을 활성화하고 유지하는 것을 돕는 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물의 능력을 입증하였다.
알로에, 포리아 및 로즈마린산 추출물, 특히 특정 구성요소가 풍부한 추출물을 조합시킨 임계 값은 LPS 유도된 생존 연구 및 HMGB1 및 TNF-α 분비에 대한 LPS 챌린지된 대식세포로부터 얻은 데이터에 대해 일반적으로 사용되는 방정식(Colby의 방정식)을 사용하여 평가되고 확인되었다. Colby의 방법론을 사용하면, 관찰된 값이 예상 값보다 낮을 때(즉, 감소된 사망률, HMGB1 및 TNF-α의 분비) 2개 이상의 물질을 갖는 표준화된 제형은 예상치 못한 상승작용을 갖는 것으로 추정되며, 예상치 못한 억제 효과가 있다. 현재 고려되는 주제에서, 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물이 감소된 사망률에 대한 예상치 못한 상승작용 및 HMGB1 및 TNF-α의 분비에 대한 예상치 못한 억제 효과를 갖는 것을 확인하고자 하였다. 실시예 20에 예시된 바와 같이, 두 종말점 측정에 대해 이들 추출물의 조합으로부터 사망률 감소에서 예상치 못한 상승작용이 관찰되었다. 고려되는 조성물을 사용한 처리로 확인된 유리한 효과는 주어진 비율의 각각의 구성요소에 대해 관찰된 예상 효과를 초과하였다. 알로에-기반 조성물만이 LPS 챌린지 6일 후 사망률 감소에 대한 통계적 유의성을 달성하였다. 실제로, 처리 36시간 후에, 알로에-기반 조성물에 대해 동물 사망이 관찰되지 않은 반면, 단독으로 투여된 각 구성요소(즉, 알로에, 포리아 및 로즈마린산)에 대해서는 사망한 동물이 거의 없었다. 이 사실은 LPS 챌린지된 대식세포로부터의 HMGB1 및 TNF-α의 최저 분비가 개별 구성요소보다 알로에-기반 조성물에 대해 관찰되었다는 점에서 사실이다(실시예 16 및 17). 상기 고려되는 주제의 배경에서 상세히 설명된 바와 같이, 개별적으로, 이러한 약용 식물의 유익한 용도에 관한 보고가 있지만, 본 발명자들이 아는 한, 이러한 약용 식물을 함께 제형화하여 패혈 동물의 감소된 사망률 및 대식세포로부터 HMGB1 및 TNF-α의 억제된 분비와 같은 예상치 못한 결과를 갖는 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물을 생성시킨 것은 이번이 처음이다. 다른 유리한 선천성 및 적응 면역 반응, 특히 인간 임상 연구에서 관찰되고 이 고려된 주제에서 문서화된 감마 델타 T-세포의 증가와 함께 상기 결과는 균형 잡힌 자극 및/또는 억제 활성에 필요한 숙주 면역 반응의 방향을 안내하여, 전체적인 면역 항상성을 초래하는 다당류 및 폴리페놀 조성물에 대한 고유한 정체성을 제공한다.
상기 및 하기 설명에서, 본 발명의 개시의 다양한 구현예의 완전한 이해를 제공하기 위해 특정한 특이적 세부사항이 제시된다. 그러나, 당업자는 고려되는 주제가 이러한 세부사항 없이 실시될 수 있음을 이해할 것이다.
본 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 달리 지시되지 않는 한 인용된 범위 내의 임의의 정수의 값 및, 적절한 경우, 이의 분율(예를 들어, 정수의 10분의 1 및 100분의 1)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 다당류 서브유닛, 크기 또는 두께와 같은 임의의 물리적 특징과 관련하여 본원에 인용된 임의의 수치 범위는 달리 지시되지 않는 한 인용된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어 "약" 및 "필수적 요소로 하여 구성되는(consisting essentially of)"은 달리 지시되지 않는 한 지시된 범위, 값 또는 구조의 ± 20%를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "하나"는 열거된 성분 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안의 사용(예를 들어, "및/또는")은 대안의 어느 하나, 둘 모두, 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐, 용어 "-들을 포함하다(comprise)" 및 이의 변형, 예를 들어, "-을 포함하다(comprises)" 및 "포함하는"뿐만 아니라 "-을 포함하다(include)" 및 "갖는다" 및 이의 변형과 같은 동의어는 개방적이고 포괄적인 의미로 해석되어야 하며, 즉, "포함하나 이에 제한되지 않는"과 같이 해석되어야 한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "일 구현예" 또는 "구현예"에 대한 언급은 구현예와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조, 조성물, 또는 특성이 본 발명의 고려되는 주제의 적어도 하나의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 위치에서 어구 "일 구현예에서" 또는 "구현예에서"의 출현은 반드시 모두 동일한 구현예를 지칭하는 것은 아니다.
용어 "프로드러그"는 또한 이러한 프로드러그가 포유동물 대상체에게 투여될 때 생체 내에서 본 발명의 개시의 활성 화합물을 방출하는 임의의 공유 결합된 담체를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 개시의 화합물의 프로드러그는 일상적인 조작에서 또는 생체 내에서 변형이 본 발명의 개시의 모 화합물로 절단되는 방식으로 본 발명의 개시의 화합물에 존재하는 작용기를 변형시킴으로써 제조될 수 있다. 프로드러그는 본 발명의 개시의 화합물을 포함하며, 여기서 하이드록시, 아미노 또는 머캅토 기는 본 발명의 개시의 화합물의 프로드러그가 포유동물 대상체에게 투여될 때, 절단되어 유리 하이드록시, 유리 아미노 또는 유리 머캅토 기를 각각 형성하는 임의의 기에 결합된다. 프로드러그의 예는 본 발명의 개시의 화합물에서 알코올의 아세테이트, 포르메이트 및 벤조에이트 유도체 또는 아민 작용기의 아미드 유도체 등을 포함한다.
"안정한 화합물" 및 "안정한 구조"는 반응 혼합물로부터 유용한 정도의 순도까지의 분리, 및 효과적인 치료제로의 제형화를 견디기에 충분히 강건한 화합물을 나타내는 것을 의미한다.
"바이오마커(들)" 또는 "마커(들)" 성분(들) 또는 화합물(들)은 고려되는 조성물(들)의 품질, 일관성, 온전성, 안정성, 및/또는 생물학적 기능을 제어하는데 이용되는 개시된 식물(들), 식물 추출물(들), 또는 2-3개의 식물 추출물을 갖는 조합된 조성물(들) 내의 하나 또는 다수의 고유한 화학적 성분(들) 또는 화합물(들)을 나타내는 것을 의미한다.
"포유동물"은 인간, 및 실험용 동물 또는 가정용 애완동물(예를 들어, 고양이, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 토끼)과 같은 가축 및 야생 동물과 같은 비-가축 둘 모두 등을 포함한다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는 후속하여 설명되는 요소, 구성요소, 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있고, 설명이 요소, 구성요소, 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, "선택적으로 치환된 아릴"은 아릴 라디칼이 치환될 수 있거나 치환되지 않을 수 있고, 설명이 치환된 아릴 라디칼 및 치환을 갖지 않는 아릴 라디칼 둘 모두를 포함함을 의미한다.
"약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"는 인간 또는 가축에 사용하도록 허용되는 미국 식품의약국에 의해 승인된 임의의 애쥬번트, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향미 증진제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정화제, 등장제, 용매, 비히클, 또는 유화제를 포함한다.
"약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염"은 산 및 염기 부가염 둘 모두를 포함한다. "약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 산 부가염"은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않지는 않은 유리 염기의 생물학적 효과 및 특성을 보유하고, 무기산, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등, 및 유기산, 예를 들어, 아세트산, 2,2-디클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 캄포르산, 캄포르-10-설폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 탄산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-디설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티스산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루탐산, 글루타르산, 2-옥소-글루타르산, 글리세로인산, 글리콜산, 히푸르산, 이소부티르산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 뮤신산, 나프탈렌-1,5-디설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 프로피온산, 피로글루탐산, 피루브산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 세박산, 스테아르산, 숙신산, 타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔설폰산, 트리플루오로아세트산, 운데실렌산 등과 함께 형성되는 염을 지칭한다.
"약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염기 부가염"은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않지는 않은 유리산의 생물학적 효과 및 특성을 보유하는 염을 지칭한다. 이러한 염은 무기 염기 또는 유기 염기를 유리산에 첨가하여 제조된다. 무기 염기로부터 유래된 염은 소듐, 포타슘, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 무기 염은 암모늄, 소듐, 포타슘, 칼슘, 또는 마그네슘 염이다. 유기 염기로부터 유래된 염은 1차, 2차 및 3차 아민, 천연 발생 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 사이클릭 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예를 들어, 암모니아, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 디에탄올아민, 에탄올아민, 데아놀, 2-디메틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 디사이클로헥실아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 프로카인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 베네타민, 벤자틴, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 트리에탄올아민, 트로메타민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민 수지 등의 염을 포함한다. 특히 유용한 유기 염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 트리메틸아민, 디사이클로헥실아민, 콜린 및 카페인이다.
종종 결정화는 본 발명의 개시의 화합물의 용매화물을 생성한다. 본원에서 사용되는 용어 "용매화물"은 하나 이상의 분자의 용매와 함께 본 개시의 화합물의 하나 이상의 분자를 포함하는 응집체를 지칭한다. 용매는 물일 수 있고, 이 경우 용매화물은 수화물일 수 있다. 대안적으로, 용매는 유기 용매일 수 있다. 따라서, 본 발명의 고려되는 주제의 화합물은 일수화물, 이수화물, 반수화물, 세스퀴하이드레이트, 삼수화물, 사수화물 등 뿐만 아니라, 상응하는 용매화된 형태를 포함하는 수화물로서 존재할 수 있다. 본 발명의 개시의 화합물은 진정한 용매화물일 수 있는 반면, 다른 경우에, 본 발명의 개시의 화합물은 단지 우발적 물을 보유하거나 물과 일부 우발적 용매의 혼합물일 수 있다.
"약학적 조성물" 또는 "기능식품적 조성물"은 포유동물, 예를 들어, 인간으로의 생물학적 활성 화합물의 전달을 위해 당 분야에서 일반적으로 허용되는 매질 및 본 발명의 개시의 화합물의 제형을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 개시의 약학적 조성물은 독립형 조성물로서, 또는 처방약, 처방전 없이 살 수 있는(OTC) 약, 식물 약물, 본초 약물, 천연 약, 동종요법제, 또는 정부 기관에 의해 검토되고 승인된 임의의 다른 형태의 건강 관리 제품에서의 구성요소로서 제형화되거나 사용될 수 있다. 본 발명의 개시의 예시적인 기능식품적 조성물은 독립형 조성물로서, 또는 식품, 기능성 식품, 음료, 바, 식품 향미제, 의료 식품, 식이 보충제, 또는 본초 제품에서 영양성 또는 생물활성 구성요소로서 제형화되거나 사용될 수 있다. 당 분야에서 일반적으로 허용되는 매질은 이를 위한 모든 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
본원에서 사용되는 "~에 대해 풍부화된(enriched for)"은 추출 또는 다른 제조 전 식물 물질 또는 다른 공급원의 중량에서 발견된 하나 이상의 활성 화합물의 양과 비교하여 하나 이상의 활성 화합물의 적어도 2배 내지 약 1000배의 증가를 갖는 식물 추출물 또는 다른 제조물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 추출 또는 다른 제조 전 식물 물질 또는 다른 공급원의 중량은 건조 중량, 습윤 중량, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 고려되는 구현예에서, 다당류는 용매 침전, 한외여과, 효소 분해, 실리카 겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피, XAD, HP20, LH20, C-18, 알루미나 옥사이드, 폴리아미드, CG161, 및 크기 배제 컬럼 수지에 의해 개별적으로 및/또는 조합하여 풍부화된다. 일부 고려되는 구현예에서, 하나 이상의 폴리페놀은 용매 분배, 침전, 증류, 증발, 한외여과, 실리카 겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피, XAD, HP20, LH20, C-18, 알루미나 옥사이드, 폴리아미드, 크기 배제 컬럼 및 CG161 수지에 의해 개별적으로 및/또는 조합하여 풍부화된다.
본원에서 사용되는 "주요 활성 성분" 또는 "주요 활성 구성요소"는 식물 추출물 또는 다른 제조물에서 발견되거나 식물 추출물 또는 다른 제조물에서 풍부화된 하나 이상의 활성 화합물을 지칭하며, 이는 적어도 하나의 생물학적 활성을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 풍부화된 추출물의 주요 활성 성분은 그 추출물에서 풍부화된 하나 이상의 활성 화합물일 것이다. 일반적으로, 하나 이상의 주요 활성 구성요소는 다른 추출물 구성요소와 비교하여 하나 이상의 측정 가능한 생물학적 활성 또는 효과의 대부분(즉, 50%, 30% 또는 20% 또는 10% 초과)을 직접적으로 또는 간접적으로 부여할 것이다. 특정 구현예에서, 주요 활성 성분은 추출물의 중량 백분율을 기준으로 미량 구성요소(예를 들어, 추출물에 함유된 구성요소의 50%, 25%, 또는 10% 또는 5% 또는 1% 미만)일 수 있지만, 여전히 대부분의 요망되는 생물학적 활성을 제공할 수 있다. 주요 활성 성분을 함유하는 본 발명의 개시의 임의의 조성물은 또한 풍부화된 조성물의 약학적 또는 기능식품적 활성에 기여할 수 있거나 기여하지 않을 수 있지만 주요 활성 성분의 수준에는 기여하지 않을 수 있는 미량의 활성 성분을 함유할 수 있으며, 미량의 활성 구성요소 단독으로는 주요 활성 성분의 부재하에서 효과적이지 않을 수 있다.
"유효량" 또는 "치료적 유효량"은 포유동물, 예를 들어, 인간에게 투여될 때 (1) 선천성 면역을 자극하고; (2) 적응 면역을 향상시키고, 특히 CD3+, CD4+, CD8+, NKp46+ 자연 살해 세포, TCRγδ+ 감마 델타 T 세포, 및 CD4+ TCRγδ+ 헬퍼 감마 델타 T 세포를 증가시키고; (3) 만성 전신 염증 및 산화 스트레스를 억제하고; (4) HMGB1 유도된 사이토카인 폭풍 손상으로부터 면역 및 폐 세포를 보호하고; (5) 산화 스트레스를 감소시키고 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 효소(SOD) 및 Nrf2를 증가시키는 강력한 항산화제로서의 기능을 제공하고; (6) 선천성 및 적응 면역 반응의 항상성을 유지하고; (7) 체액성 및 세포-매개 면역 반응에서 대식세포의 식세포 지수를 향상시키고; (8) NF-kB, NFAT 및 STAT3과 같은 전사 인자의 활성화를 억제하고; (9) 림프구 활성화 및 전염증성 사이토카인 유전자 및 단백질 발현(IL-2, iNOS, TNF-α, COX-2 및 IFN-γ)을 억제하고; (10) HMGB1, IL-1β, IL-6 및 TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인의 수준을 감소시키고; (11) HMGB1, COX-2, NOS-2 및 NF-κB의 유전자 및/또는 단백질 발현을 하향 조절하고; (12) 포스포리파제 A2 및 TXA2 합성 효소, COX1, COX2, 5-LOX, 12-LOX, 13-LOX 활성을 억제함으로써 에이코사노이드 생성을 억제하고; (13) Th1 및 Th17 세포의 반응을 감소시키고; (14) 감소된 호중구 화학주성으로 이어지는 ICAM 및 VCAM의 발현을 감소시키고; (15) MAPK 인산화, 부착 분자 발현, 신호 변환기 및 전사 활성화제 3(STAT-3)을 억제하고; (16) 전사 인자 NRF2 및 헴 옥시게나제-1(HO-1) 유도를 활성화하고; 세포 핵으로부터 HMGB1의 전좌를 억제하고; HMGB1 단량체의 이량체 및 삼량체의 형성을 감소시키는 것 중 어느 하나 이상을 포함하는, 개선된 면역 기능으로 이어지는 면역 항상성의 티핑 포인트를 이동시키기에 충분한 본 발명의 개시의 화합물 또는 조성물의 양을 지칭한다.
다당류 및 폴리페놀을 포함하는 현재 고려되는 주제에 의한 HMGB1의 조절은 HMGB1 방출을 억제하고/거나 그 작용을 방해할 수 있다. 알로에-기반 조성물의 HMGB1 조절 효과는 a) 세포질 전좌를 차단하고/거나 소포 매개 방출을 차단함으로써 HMGB1 능동 및/또는 수동 방출을 표적화하고/거나; 핵에서 분자 내 이황화 결합 형성을 억제하거나 b) 방출시 HMGB1을 직접 표적화하고 그 효과를 중화시키거나 c) Toll-유사 수용체(TLR)-2/4/7/9 및 고급 당화 최종 생성물(RAGE)에 대한 수용체와 같은 수용체를 인식하는 HMGB1 패턴을 차단하고/거나 이들의 신호 전달을 억제한 결과일 수 있다. 감염, 염증 및 세포 사멸에서 산화 스트레스-매개 HMGB1 방출의 억제는 1) 활성화된 면역 세포에서 HMGB1의 CRM1-매개 핵 유출; 2) 괴사에서 PARP1-매개 HMGB1 방출; 3) 아폽토시스에서 카스파제3/7-매개 HMGB1 방출; 4) 자가포식에서 ATG5-매개 HMGB1 방출; 5) 파이롭토시스에서 PKR-매개 HMGB1 방출; 및 6) 네토시스에서 PAD4-매개 HMGB1 방출을 표적화할 수 있다. 알로에-기반 조성물의 효과는 또한 이온 강도(이온 강도의 증가는 HMGB1 테트라머의 강도를 감소시킨다), pH(가장 높은 자가-결합 속도, pH 4.8), 금속 이온, 특히 아연(저 용량 Zn2+의 포함은 HMGB1 테트라머 형성을 촉진한다), 및 산화환원 환경(세포 외 환경을 모방하는 보다 산화된 조건에서, HMGB1은 주로 테트라머로 존재하는 반면, 더 환원된 조건, 예를 들어, 세포 내 환경에서는, 더 많은 이량체 종이 존재한다)와 같은 특정 물리화학적 인자를 표적화함으로써 달성될 수 있는 HMGB1의 클러스터 형성 또는 자가-결합의 방지로부터 발생할 수 있다. 물리화학적 미세환경을 변화시킴으로써, 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 알로에-기반 조성물은 HMGB1 테트라머의 형성을 방지하고 HMGB1의 TLR 및 RAGE에 대한 결합 친화성을 방해한다.
면역 기능 및 폐 구조적 완전성 및 기능과 관련된 "바이오마커"는 본 개시에서 비제한적인 예로 UP360을 사용한 2 내지 3개의 식물 추출물의 다양한 조합의 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 면역 항상성의 조절을 위한 고려되는 알로에-기반 조성물을 조절하였고, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-17, GM-CSF, G-CSF, CCL2/3/5, IP-10, CXCL10, CRP, HMGB1, INF-α/β/γ, NF-κB, PDGF-BB, MIP-1α, D-이량체, 앤지오텐신 II, 심장 트로포닌, VEGF, PDGF, 알부민, Nrf2, SOD, MDA, iNOS, COX1, COX2, LO5, LO12, LO13을 포함하나 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "바이러스"는 고 병원성 조류 인플루엔자(H5N1 바이러스 균주 A), 인플루엔자 A(H1N1), A, B, C 및 D형 간염 바이러스; SARS-CoV, SARS-CoV-2(COVID-19) MERS-CoV(MERS), 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), 엔테로바이러스 A71(EV71)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"치료적 유효량"을 구성하는 본 발명의 개시의 화합물, 추출물 또는 조성물의 양은 생물활성 화합물, 또는 치료되는 질환 및 이의 중증도에 대한 바이오마커, 투여 방식, 치료 기간, 또는 치료될 대상체의 연령에 따라 달라질 것이나, 당업자는 자신의 지식 및 본 발명의 개시를 고려하여 일상적으로 결정할 수 있다. 특정 구현예에서, "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 포유동물의 체중에 대한 다당류 및 폴리페놀의 양(즉, 0.005 mg/kg, 0.01 mg/kg, 또는 0.1 mg/kg, 또는 1 mg/kg, 또는 5 mg/kg, 또는 10 mg/kg, 또는 20 mg/kg, 또는 50 mg/kg, 또는 100 mg/kg, 또는 200 mg/kg, 또는 500 mg/kg)으로 표시될 수 있다. 인간 등가 1일 투여량은 동물 및 인간의 총 신체 면적 및 체중의 차이를 고려하여 FDA 가이드라인을 이용함으로써 동물 연구에서 "유효량" 또는 "치료적 유효량"으로부터 외삽될 수 있다.
본원에서 사용되는 "식이 보충제"는 항상성, 균형, 자연 상태 또는 생물학적 과정과 관련된 특정 상태, 또는 구조적 및 기능적 완전성, 균형이 맞지 않거나 손상되거나 억제되거나 과자극된 생물학적 기능 또는 표현형 상태(즉, 질병을 진단, 치료, 완화, 치유 또는 예방하는데 사용되지 않음)를 개선, 촉진, 증가, 관리, 제어, 유지, 최적화, 수정, 감소, 억제 또는 예방하는 제품이다. 예를 들어, 면역과 관련하여, 식이 보충제는 백신의 효능을 향상시키고, 대식세포의 포식작용 활성을 향상시키고, NK 세포의 자연 살해 활성을 개선하고, 전염증성 사이토카인의 생성 수준을 조절하고, 염증 및 조직 손상을 완화하고, 항체의 반응 및 생산을 유도하고, 항체 의존성 세포의 세포독성을 향상시키고, T-세포 증식을 자극하고, 면역억제 조절 T-세포의 생성을 촉진하고, HMGB1 유도된 사이토카인 폭풍 손상으로부터 면역 및 폐 세포를 보호하고, 산화 스트레스로부터 기관 및/또는 조직을 보호하는 면역 자극제에 특이적인 면역애쥬번트로서, 적응 및 선천성 면역의 임의의 구성요소를 조절, 유지, 관리, 균형 유지, 억제 또는 자극하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 식이 보충제는 식품, 기능성 식품, 의료 식품, 영양소, 영양 제품의 특정 범주이며 약물이 아니다.
본원에서 사용되는 "치료하는" 또는 "치료"는 관심 질병 또는 질환을 갖는 포유동물, 예를 들어, 인간에서 관심 질병 또는 질환의 치료를 지칭하고, (i) 특히, 포유동물이 질환에 걸리기 쉬우나 아직 걸리지 않은 것으로 진단된 경우 이러한 포유동물에서 질병 또는 질환이 발생하는 것을 예방하거나; (ii) 질병 또는 질환을 억제하고, 즉, 이의 발달을 저지하거나; (iii) 질병 또는 질환을 경감시키거나 변형시키고, 즉, 질병 또는 질환의 퇴행을 유발하거나; (iv) 기저 질병 또는 질환을 다루지 않고 질병 또는 질환으로 인한 증상을 완화(예를 들어, 기침 및 열 완화, 통증 경감, 염증 감소, 폐 부종 감소, 폐렴 완화)시키거나; (v) 면역 항상성 조절의 균형을 맞추거나 질병 또는 질환의 표현형을 변화시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "질병" 및 "질환"은 상호교환적으로 사용될 수 있거나 특정 질병 또는 질환이 공지된 원인 인자를 갖지 않을 수 있다는 점에서(따라서 병인은 아직 밝혀지지 않았음) 상이할 수 있으며, 따라서 아직 질병으로 인식되지는 않았지만 바람직하지 않은 질환 또는 증후군으로서만 인식되며, 여기서 더 많거나 더 적은 특정 세트의 증상이 임상의에 의해 확인되었다. 질병 또는 질환은 바이러스 감염(SARS, COVID-19, 메르스, 간염, 인플루엔자) 또는 미생물 감염과 같은 급성일 수 있으며; 대기 오염 및 흡연에 노출됨으로 인한 폐 손상과 같은 만성일 수 있다. 항상성 불균형으로 인한 손상된 면역 기능은 질병 또는 질환을 유발할 수 있거나, 포유동물을 감염성 질환, 세포의 돌연변이에 더 민감하게 만들 수 있거나, 바이러스 또는 미생물로부터의 감염 또는 대기 오염 물질과 직간접적으로 관련된 더 많은 이차 기관 및 조직 손상을 초래할 수 있다.
본원에서 사용되는 "통계적 유의성"은 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산될 때 0.05 이하의 p 값을 지칭하고, 측정되는 특정 사건 또는 결과가 우연히 발생했을 가능성이 없음을 나타낸다.
투여 목적을 위해, 본 발명의 고려되는 주제의 화합물은 미가공 성분으로서 투여될 수 있거나 약학적 또는 기능식품적 조성물로서 제형화될 수 있다. 본 발명의 개시의 약학적 또는 기능식품적 조성물은 본 발명의 고려되는 주제에 설명된 구조의 화합물 및 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 본원에 설명된 구조의 화합물은 관심 특정 질병 또는 질환을 치료하기에 효과적인 양으로, 즉, 일반적으로 선천성 또는 적응 면역 또는 면역 항상성 또는 본원에 설명된 임의의 다른 관련 징후를 촉진하기에 충분한 양으로 조성물에 존재하며, 일반적으로 환자에게 허용되는 독성 및/또는 안전성 프로파일을 갖는다.
본 발명의 개시의 화합물 또는 조성물, 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염의 투여는 순수한 형태로 또는 적절한 약학적 또는 기능식품적 조성물로, 유사한 유용성을 제공하기 위해 제제의 임의의 허용되는 투여 방식을 통해 수행될 수 있다. 본 발명의 개시의 약학적 또는 기능식품적 조성물은 본 발명의 개시의 화합물을 적절한 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합함으로써 제조될 수 있고, 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태, 예를 들어, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연질 겔, 고무질, 연고, 용액, 음료, 좌제, 주사제, 흡입제, 겔, 크림, 로션, 팅크제, 사쉐, 즉석 음료, 마스크, 미소구체, 및 에어로졸의 제조물로 제형화될 수 있다. 이러한 약학적 또는 기능식품적 조*물을 투여하는 통상적인 경로는 경구, 국소, 경피, 흡입, 비경구, 설하, 협측, 직장, 질, 또는 비강 내를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 비경구는 피하 주사, 정맥 내, 근육 내, 흉골 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 고려되는 구현예에서, 조성물의 투여는 경구 투여, 국소 투여, 좌제 투여, 정맥 내 투여, 피내 투여, 위내 투여, 근육 내 투여, 복강 내 투여, 및 정맥 내 투여를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 개시의 약학적 또는 기능식품적 조성물은 환자에게 조성물을 투여할 때 그 안에 함유된 활성 성분이 생체이용 가능해지도록 제형화된다. 대상체 또는 환자 또는 포유동물에게 투여될 조성물은 하나 이상의 투여 단위의 형태를 취하고, 여기서, 예를 들어, 정제는 단일 투여 단위일 수 있고, 에어로졸 형태의 본 발명의 개시의 2-3개의 식물 추출물의 화합물 또는 추출물 또는 조성물의 용기는 복수의 투여 단위를 보유할 수 있다. 이러한 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 자명할 것이다; 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)]을 참조한다. 투여되는 조성물은, 임의의 경우에, 본 발명의 고려되는 주제의 교시에 따라 관심 질병 또는 질환의 치료를 위해 치료적 유효량의 본 발명의 개시의 화합물 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염을 함유할 것이다.
본 발명의 개시의 약학적 또는 기능식품적 조성물의 조성물에서, 활성제, 애쥬번트, 부형제 또는 담체는 칸나비스 사티바(Cannabis sativa) 오일 또는 추출물, 또는 CBD 또는 THC, 강황 추출물 또는 커큐민(curcumin), 테르미날리아(terminalia) 추출물, 버드나무 수피 추출물, 악마의 발톱(Devil's claw) 뿌리 추출물, 카이엔 페퍼(Cayenne Pepper) 추출물 또는 캡사이신, 산초(Prickly Ash) 수피 추출물, 필로덴드론(philodendra) 수피 추출물, 홉 추출물, 보스웰리아(Boswellia) 추출물, 로즈 힙(rose hips) 추출물, 녹차 추출물, 소포라 추출물, 박하 또는 페퍼민트 추출물, 생강 또는 흑생강 추출물, 녹차 또는 포도씨 폴리페놀, 오메가-3 및/또는 오메가-6 지방산, 크릴 오일, 감마-리놀렌산, 감귤 바이오플라보노이드, 아세롤라 농축액, 아스타잔틴, 미국 인삼, 아시아 인삼, 엘더베리(elderberry), 마늘 추출물, 마늘 오일, 에키네시아(echinacea) 추출물, 아가베 넥타(agave nectar), 유칼립투스 오일, 아스코르브산, 피크노제놀, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 비타민 B, 비타민 A, L-리신, 칼슘, 망간, 아연, 무기질 아미노산 킬레이트(들), 아미노산(들), 붕소 및 붕소 글리시네이트, 실리카, 프로바이오틱스, 장뇌, 멘톨, 칼슘-기반 염, 실리카, 히스티딘, 구리 글루코네이트, CMC, 베타-사이클로덱스트린, 셀룰로스, 덱스트로스, 식염수, 물, 오일, 상어 및 소 연골 중 하나 이상으로부터 선택된다.
본 발명의 개시의 약학적 또는 기능식품적 조성물은 고체 또는 액체의 형태일 수 있다. 일 양태에서, 담체(들)는 미립자이므로, 조성물은, 예를 들어, 정제 또는 분말 형태이다. 담체(들)는 액체일 수 있고, 조성물은, 예를 들어, 경구 시럽, 주사 가능한 액체 또는, 예를 들어, 흡입 투여에 유용한 에어로졸이다.
경구 투여를 위해 의도될 때, 약학적 또는 기능식품적 조성물은 고체 또는 액체 형태이고, 반고체, 반액체, 현탁액 및 겔 형태는 고체 또는 액체로서 본원에서 고려되는 형태 내에 포함된다.
경구 투여용 고체 조성물로서, 약학적 또는 기능식품적 조성물은 분말, 과립, 압축 정제, 알약, 캡슐, 츄잉 검, 고무질, 연질 겔, 사쉐, 웨이퍼, 바 등의 형태로 제형화될 수 있다. 이러한 고체 조성물은 전형적으로 하나 이상의 불활성 희석제 또는 식용 담체를 함유할 것이다. 또한, 하기 중 하나 이상이 존재할 수 있다: 결합제, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 사이클로덱스트린, 미세결정질 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어, 전분, 락토스 또는 덱스트린, 붕해제, 예를 들어, 알긴산, 소듐 알기네이트, 프리모겔(Primogel), 옥수수 전분 등; 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로텍스(Sterotex); 활택제, 예를 들어, 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예를 들어, 수크로스 또는 사카린; 향미제, 예를 들어, 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향미제; 및 착색제.
약학적 또는 기능식품적 조성물이 캡슐, 예를 들어, 젤라틴 캡슐의 형태인 경우, 이는 상기 유형의 물질 이외에, 폴리에틸렌 글리콜 또는 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다.
약학적 또는 기능식품적 조성물은 액체, 예를 들어, 엘릭서, 팅크제, 시럽, 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 액체는 두 가지 예로서, 경구 투여 또는 주사에 의한 전달을 위한 것일 수 있다. 경구 투여를 위해 의도되는 경우, 유용한 조성물은 본 발명의 화합물 이외에, 하나 이상의 감미제, 보존제, 유화제, 염료/착색제 및 향미 증진제를 함유한다. 주사에 의해 투여되도록 의도된 조성물에서, 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충제, 안정화제 및 등장화제 중 하나 이상이 포함될 수 있다.
본 발명의 개시의 액체 약학적 또는 기능식품적 조성물은, 이들이 용액, 현탁액 또는 다른 유사한 형태이건 간에, 하기 애쥬번트 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어, 주사용수, 염수 용액, 예를 들어, 생리식염수, 링거액, 등장성 소듐 클로라이드, 고정 오일, 예를 들어, 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노 또는 디글리세리드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항박테리아제, 예를 들어, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트제, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성 조절용 제제, 예를 들어, 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스. 비경구 제조물은 앰풀, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회 용량 바이알에 포함될 수 있다. 생리학적 염수는 일반적으로 유용한 애쥬번트이다. 주사 가능한 약학적 또는 기능식품적 조성물은 멸균된다.
비경구 또는 경구 투여용으로 의도된 본 발명의 개시의 액체 약학적 또는 기능식품적 조성물은 적합한 투여량이 획득되도록 하는 양의 본 발명의 개시의 화합물을 함유해야 한다.
본 발명의 개시의 약학적 또는 기능식품적 조성물은 국소 투여용으로 의도될 수 있고, 이 경우 담체는 적합하게는 용액, 에멀젼, 크림, 로션, 연고, 또는 겔 베이스를 포함할 수 있다. 베이스는, 예를 들어, 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 바셀린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀랍, 광유, 희석제, 예를 들어, 물 및 알코올, 및 유화제 및 안정화제. 증점제는 국소 투여를 위한 약학적 또는 기능식품적 조성물에 존재할 수 있다. 경피 투여를 위해 의도된 경우, 조성물은 경피 패치 또는 이온삼투 장치를 포함할 수 있다.
본 발명의 개시의 약학적 또는 기능식품적 조성물은, 예를 들어, 직장에서 용융되어 약물을 방출할 좌제의 형태로 직장 투여를 위해 의도될 수 있다. 직장 투여용 조성물은 적합한 비자극성 부형제로서 유지성 베이스를 함유할 수 있다. 이러한 베이스는 라놀린, 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
본 발명의 개시의 약학적 또는 기능식품적 조성물은 고체 또는 액체 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키는 다양한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 활성 성분 주위에 코팅 쉘을 형성하는 물질을 포함할 수 있다. 코팅 쉘을 형성하는 물질은 전형적으로 불활성이고, 예를 들어, 당, 셸락, 및 다른 장용 코팅제로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 젤라틴 캡슐에 포함될 수 있다.
고체 또는 액체 형태의 본 발명의 개시의 약학적 또는 기능식품적 조성물은 본 발명의 개시의 화합물에 결합하여 화합물의 전달을 돕는 제제를 포함할 수 있다. 이러한 능력으로 작용할 수 있는 적합한 제제는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 단백질 또는 리포솜을 포함한다.
고체 또는 액체 형태의 본 발명의 개시의 약학적 또는 기능식품적 조성물은, 예를 들어, 생체이용률을 개선시키기 위해 입자의 크기를 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 부형제의 존재 또는 부재하에, 조성물에서 분말, 과립, 입자, 미소구체 등의 크기는 크기 및 벌크 밀도를 개선시키기 위해 매크로(예를 들어, 눈에 가시적이거나 적어도 100 μm 크기), 마이크로(예를 들어, 크기가 약 100 μm 내지 약 100 nm의 범위일 수 있음), 나노(예를 들어, 크기가 100 nm 이하일 수 있음), 및 이들 사이의 임의의 크기 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본 발명의 개시의 약학적 또는 기능식품적 조성물은 에어로졸로서 투여될 수 있는 투여 단위로 구성될 수 있다. 용어 에어로졸은 콜로이드 성질의 것에서 가압 패키지로 구성된 시스템에 이르는 다양한 시스템을 나타내기 위해 사용된다. 전달은 액화 또는 압축 가스에 의해 또는 활성 성분을 분배하는 적합한 펌프 시스템에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명의 개시의 화합물의 에어로졸은 활성 성분(들)을 전달하기 위해 단일 상, 2상, 또는 3상 시스템으로 전달될 수 있다. 에어로졸의 전달은 함께 키트를 형성할 수 있는 필요한 용기, 활성제, 밸브, 서브컨테이너 등을 포함한다. 당업자는 과도한 실험 없이 가장 적절한 에어로졸(들)을 결정할 수 있다.
본 발명의 개시의 약학적 또는 기능식품적 조성물은 약학 또는 기능식품 분야에 널리 공지된 방법론에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사에 의해 투여되도록 의도된 약학적 또는 기능식품적 조성물은 본 발명의 개시의 화합물을 멸균수, 증류수, 탈이온수와 조합하여 용액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 균질한 용액 또는 현탁액의 형성을 용이하게 하기 위해 계면활성제가 첨가될 수 있다. 계면활성제는 수성 전달 시스템에서 화합물의 용해 또는 균질한 현탁을 용이하게 하기 위해 본 발명의 개시의 화합물과 비공유적으로 상호작용하는 화합물이다.
본 발명의 개시의 화합물, 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염은 치료적 유효량으로 투여되며, 이는 사용되는 특정 화합물의 활성; 화합물의 대사 안정성 및 작용 길이; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 및 식이; 투여 방식 및 시간; 배설 속도; 약물 조합; 특정 장애 또는 질환의 중증도; 및 요법을 받는 대상체를 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 개시의 화합물, 또는 이의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 유도체는 또한 음식, 물 및 하나 이상의 다른 치료제의 투여와 동시에, 투여 전 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 이러한 조합 요법은 본 발명의 개시의 2-3개의 식물 추출물을 갖는 화합물 또는 추출물 또는 조성물 및 하나 이상의 추가 활성제를 함유하는 단일 약학적 또는 기능식품적 투여 제형의 투여 뿐만 아니라 본 발명의 개시의 2-3개의 식물 추출물을 갖는 화합물 또는 추출물 또는 조성물 및 자체의 별도의 약학적 또는 기능식품적 투여 제형의 각각의 활성제의 투여를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 개시의 2-3개의 식물 추출물을 갖는 화합물 또는 추출물 또는 조성물 및 또 다른 활성제는 정제 또는 캡슐과 같은 단일 경구 투여 조성물로 환자에게 함께 투여될 수 있거나, 각각의 제제는 별도의 경구 투여 제형으로 투여될 수 있다. 별도의 투여 제형이 사용되는 경우, 본 발명의 개시의 화합물 및 하나 이상의 추가 활성제는 본질적으로 동시에, 즉, 동시에, 또는 별도로 시차를 두고, 즉, 순차적으로 투여될 수 있으며; 조합 요법은 이러한 모든 요법을 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명의 설명에서, 도시된 화학식의 치환기 또는 변수의 조합은 이러한 기여가 안정한 화합물을 생성하는 경우에만 허용되는 것으로 이해된다.
또한 당업자는 본원에 설명된 공정에서 중간체 화합물의 작용기가 적합한 보호기에 의해 보호될 필요가 있을 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 작용기는 하이드록시, 아미노, 머캅토 및 카르복실산을 포함한다. 하이드록시에 적합한 보호기는 트리알킬실릴 또는 디아릴알킬실릴(예를 들어, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴 또는 트리메틸실릴), 테트라하이드로피라닐, 벤질 등을 포함한다. 아미노, 아미디노 및 구아니디노에 적합한 보호기는 t-부톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐 등을 포함한다. 머캅토에 적합한 보호기는 -C(O)-R"(여기서, R"은 알킬, 아릴 또는 아릴알킬임), p-메톡시벤질, 트리틸 등을 포함한다. 카르복실산에 적합한 보호기는 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 에스테르를 포함한다. 보호기는 당업자에게 공지되어 있고 본원에 설명된 바와 같은 표준 기술에 따라 첨가 또는 제거될 수 있다. 보호기의 사용은 문헌[Green, T.W. and P.G.M. Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 3rd Ed., Wiley]에 상세히 설명되어 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 보호기는 또한 왕(Wang) 수지, 링크(Rink) 수지 또는 2-클로로트리틸-클로라이드 수지와 같은 중합체 수지일 수 있다.
또한, 당업자는 본 발명의 고려되는 주제의 화합물의 이러한 보호된 유도체가 그 자체로 약리학적 활성을 갖지 않을 수 있지만, 이들은 포유동물에 투여된 후 신체에서 대사되어 약리학적으로 활성인 본 발명의 개시의 화합물을 형성할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 이러한 유도체는 "프로드러그"로 설명될 수 있다. 본 발명의 고려되는 주제의 화합물의 모든 프로드러그는 본 발명의 개시의 범위 내에 포함된다.
또한, 유리 염기 또는 산 형태로 존재하는 본 발명의 개시의 모든 화합물 또는 추출물은 당업자에게 공지된 방법에 의해 적절한 무기 또는 유기 염기 또는 산으로 처리함으로써 이들의 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 염으로 전환될 수 있다. 본 발명의 개시의 화합물의 염은 표준 기술에 의해 이들의 유리 염기 또는 산 형태로 전환될 수 있다.
고려되는 화합물, 의약 조성물 및 조성물은 적어도 하나의 활성 성분을 포함하거나 이를 추가로 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 생물활성 성분은 식물 분말 또는 식물 추출물 등을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
임의의 전술한 구현예에서, 추출물 또는 화합물의 혼합물을 포함하는 조성물은 특정 중량비로 혼합될 수 있다. 예를 들어, 다당류를 함유하는 알로에 잎 겔 분말 및 로즈마린산을 함유하는 로즈마리 추출물은 각각 1:2 중량비로 블렌딩될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 개시의 2개의 추출물 또는 화합물의 비(중량 기준)는 약 0.5:5 내지 약 5:0.5의 범위이다. 2개 초과의 추출물 또는 화합물(예를 들어, 3개, 4개, 5개)이 사용될 때 유사한 범위가 적용된다. 실시예 10에서 입증된 예시적인 비는 0.5:1, 0.5:2, 0.5:3, 0.5:4, 0.5:5, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 2:1, 2:2, 2:3, 2:4, 2:5, 3:1, 3:2, 3:3, 3:4, 3:5, 4:1, 4:2, 4:3, 4:4, 4:5, 5:1, 5:2, 5:3, 5:4, 5:5, 1:0.5, 2:0.5, 3:0.5, 4:0.5, 또는 5:0.5를 포함한다. 특정 구현예에서, 알로에, 및/또는 포리아, 및/또는 로즈마리의 개시된 개별 추출물은 각각 1:1:1, 2:1:1, 3:1:1, 4:1:1, 5:1:1, 1:2:1, 1:3:1, 1:4:1, 1:5:1, 1:1:2, 1:1:3, 1:1:4, 1:1:5, 1:2:3, 1:2:4, 1:2:5, 1:2:6, 1:2:6, 1:2:8, 1:2:9 또는 1:2:10 등의 중량비로 실시예 9 및 10에서 입증된 3개의 개별 추출물을 갖는 조성물로 블렌딩된다. 추가 구현예에서, 알로에, 포리아 및 로즈마리의 개시된 개별 추출물은 비제한적인 예로서 알로에:포리아:로즈마리의 3:6:1 또는 1:1:1 또는 3:2:1의 블렌딩 비로 UP360으로 불리는 고려되는 조성물로 조합되었다.
추가 구현예에서, 비제한적인 예로, 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 UP360을 사용한 2 내지 3개의 이들 추출물의 상이한 조합의 알로에, 포리아 및 로즈마리의 개별 추출물의 이러한 조합물은 인지된 생물학적 기능의 장점/단점 및 예상치 못한 상승작용/길항작용 및 면역 기능의 항상성의 효과적인 조정에 대한 시험관 내, 및/또는 생체 외 및/또는 생체 내 모델에서 평가되었고 사이토카인 폭풍, 산화 스트레스 및 패혈증으로 인한 장기 손상을 완화시킨다. 알로에, 또는 포리아, 또는 차가버섯 또는 로즈마리의 개별 추출물의 특정 블렌딩 비를 갖는 최상의 조성물은 각 추출물의 다양한 화학 성분 및 각 추출물에서 상이한 유형의 생물활성 화합물로부터의 상이한 작용 메커니즘으로 인한 시험관 내, 및/또는 생체 외 및/또는 생체 내 모델에서 측정시 예상치 못한 상승작용, 및 생물학적 산출물을 최대화하기 위한 조성물 내의 천연 화합물의 ADME의 잠재적인 향상에 기반하여 선택되었다.
임의의 전술한 구현예에서, 추출물 또는 화합물의 혼합물을 포함하는 조성물은 특정 백분율 수준 또는 비율로 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 알로에 전체 잎 또는 내부 잎 겔 분말(실시예 3 및 4) 및/또는 로즈마리 추출물(실시예 6)을 포함하는 조성물은 0.1% 내지 49.9% 또는 약 2% 내지 약 40% 또는 약 0.5% 내지 약 10%의 다당류, 0.1% 내지 99.9% 또는 약 1% 내지 약 10% 또는 약 5% 내지 약 50%의 로즈마린산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 알로에 베라 겔 분말(실시예 3 및 4) 또는 포리아 수성 추출물(실시예 5) 및 로즈마리 추출물(실시예 6)을 포함하는 조성물은 약 0.01% 내지 약 99.9%의 다당류를 포함할 수 있거나 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 90%의 로즈마린산을 포함할 수 있다.
특정 예(실시예 9)에서, 본 발명의 개시의 조성물은 약학적으로 또는 기능식품적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가로 포함하도록 제형화될 수 있고, 여기서 약학적 또는 기능식품적 제형은 약 0.05 중량 퍼센트(wt%), 또는 0.5 중량 퍼센트(wt%), 또는 5%, 또는 25% 내지 약 95 wt%의 추출물 혼합물의 활성 또는 주요 활성 성분을 포함한다. 추가 구현예(실시예 9)에서, 약학적 또는 기능식품적 제형은 약 0.05 중량%(wt%) 내지 약 90wt%의 다당류, 약 0.5wt% 내지 약 80wt%의 로즈마린산, 약 0.5wt% 내지 약 75wt%의 총 폴리페놀, 약 0.5wt% 내지 약 70wt%, 약 0.5wt% 내지 약 50wt%, 약 1.0wt% 내지 약 40wt%, 약 1.0wt% 내지 약 20wt%, 약 1.0wt% 내지 약 10wt%, 약 3.0wt% 내지 약 9.0wt%, 약 5.0 wt% 내지 약 10wt%, 약 3.0wt% 내지 약 6wt%의 추출물 혼합물 내의 주요 활성 성분 등을 포함한다. 임의의 상기 언급된 제형에서, 본 발명의 개시의 조성물은 정제, 경질 캡슐, 연질 겔 캡슐, 분말, 또는 과립으로서 제형화된다.
개시된 화합물의 제제가 또한 본원에서 고려된다. 이러한 생성물은, 예를 들어, 주로 효소적 과정으로 인한 투여된 화합물의 산화, 환원, 가수분해, 아미드화, 에스테르화 등으로부터 발생할 수 있다. 따라서, 고려되는 화합물은 고려되는 화합물 또는 조성물을 이의 대사 생성물을 생성하기에 충분한 기간 동안 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 공정에 의해 생산된 것들이다. 이러한 생성물은 전형적으로 본 발명의 개시의 방사성 표지되거나 방사성 표지되지 않은 화합물을 동물, 예를 들어, 래트, 마우스, 기니피그, 개, 고양이, 돼지, 양, 말, 원숭이, 또는 인간에게 검출가능한 용량으로 투여하여 대사가 발생하기에 충분한 시간을 허용한 후, 소변, 혈액 또는 다른 생물학적 샘플로부터 이의 전환 생성물을 분리함으로써 확인된다.
고려되는 화합물, 의약 조성물 및 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 또는 기능식품적으로 또는 미용적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하거나 이를 추가로 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 본원에서 사용되는 어구 "약학적으로 또는 기능식품적으로 또는 미용적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"는 인간 또는 가축에 사용하도록 허용되는 미국 식품의약국에 의해 승인된 임의의 애쥬번트, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향미 증진제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정화제, 등장제, 용매, 또는 유화제를 포함한다. 고려되는 화합물, 의약 조성물 및 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 또는 기능식품적으로 또는 미용적으로 허용되는 염을 포함하거나 이를 추가로 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 본원에서 사용되는 어구 "약학적으로 또는 기능식품적으로 또는 미용적으로 허용되는 염"은 산 부가염 및 염기 부가염 둘 모두를 포함한다.
천연 면역 억제제는 면역계를 억제하고, 만성 전신 염증 및 산화 스트레스를 억제하고, HMGB1 유도된 사이토카인 폭풍 손상으로부터 면역 및 폐 세포를 보호하고, 산화 스트레스를 감소시키고 NF-kb를 감소시키는 강력한 항산화제를 제공하고, 전염증성 경로(COX/LOX 및 사이토카인 - IL-1, IL-6, TNF-a)를 감소시켜, 현재 고려되는 주제에서 입증된 바와 같이 면역 기능의 항상성을 달성하기 위해 생리학적 및/또는 병리학적 면역 반응을 제어하는데 사용될 수 있는 분자이다. 상기에 예시된 이러한 페놀 천연 화합물은 로즈마린산, 캄페롤, 제니스테인, 케르세틴, 부테인, 루테올린, 크리신, 아피게닌, 커큐민, 레스베라트롤, 캡사이신, 글로메라토스 A, 6-쇼가올, 진저롤, 진저론, 베르베린, 피페린, 에피갈로카테킨, 콜히친, 리코린을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
로즈마린산은 다음 중 적어도 하나로부터 유래, 획득 또는 선택되는 것으로 고려된다 - 단독이거나 로즈마리누스 오피시날리스, 멜리사 오피시날리스(Melissa officinalis), 모모르디카 발사미나(Momordica balsamina), 멘타 피페리타(Mentha piperita), 페릴라 프루테센스(Perilla frutescens), 샐비어 오피시날리스(Salvia officinalis), 튜크리움 스코로도니아(Teucrium scorodonia), 사니쿨라 유로파에아(Sanicula europaea), 콜레우스 블루메이(Coleus blumei), 티무스 종(Thymus spp.), 힙티스 베르티실라타(Hyptis verticillata), 리토스퍼뭄 에리트로리존(Lithospermum erythrorhizon) 및 붕어마름 안토세로스 아그레스티스(hornwort Anthoceros agrestis) 또는 이들의 조합의 모든 식물 부분 중 하나와 조합됨.
상기 면역 억제 천연 페놀 화합물을 함유하는 식물 종은 파이퍼 롱굼 린(Piper longum Linn), 콥티스 치넨시스 프란치(Coptis chinensis Franch), 안젤리카 시넨시스 (Oliv.) 디엘스(Angelica sinensis (Oliv.) Diels), 소포라 플라베센스 아이트(Sophora flavescens Ait), 톡시코덴드론 베르니시플룸(Toxicodendron vernicifluum), 글리시리자 글라브라(Glycyrrhiza glabra), 커큐마 롱가(Curcuma longa), 샐비어 로즈마리누스, 로즈마리누스 오피시날리스, 진지베르 오피시날리스(Zingiber officinalis), 폴리갈라 테누이폴리아(Polygala tenuifolia), 휴물루스 루풀루스(Humulus lupulus), 로니세라 자포니카(Lonicera Japonica), 샐비어 오피시날리스 L., 센텔라 아시아티카(Centella asiatica), 보스웰리아 카르테리(Boswellia carteri), 멘타 롱기폴리아(Mentha longifolia), 피세아 크라시폴리아(Picea crassifolia), 시트러스 노빌리스 로우르(Citrus nobilis Lour), 시트러스 아우란티움(Citrus aurantium) L. 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) L. 퓨라리아 미리피카(Pueraria mirifica), 퓨라리아 로바타(Pueraria lobata), 글리신 맥스(Glycine max), 리코리스 라디에이트(Lycoris radiate), 콜치쿰 아우툼네일(Colchicum autumnale), 캅시쿰 종(Capsicum species), 팔로피아 자포니카(Fallopia japonica)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 많은 페놀 화합물은 차, 토마토, 십자화과 식물, 포도, 블루베리, 엘더베리, 라즈베리, 크랜베리, 멀베리, 사과, 칠리 페퍼 등과 같은 다양한 과일 및 식물에서도 발견될 수 있다.
천연 다당류는 만난, 아세틸 만난, 갈락토만난, 글루칸, 베타-글루칸(예를 들어, 포리아 추출물로부터의 것), α-1,6 및 α-1,4 글루칸, 푸코이단, 프루칸 및 펙틴을 포함하나 이에 제한되지 않는 면역 억제 폐놀 천연 화합물과 함께 제형화됨으로써 선천성 면역을 자극하고, 적응 면역, 특히 CD3+, CD4+, CD8+, NKp46+ 자연 살해 세포, TCRγδ+ 감마 델타 T-세포, 및 CD4+ TCRγδ+ 헬퍼 감마 델타 T-세포를 향상시키고, HMGB1 유도된 사이토카인 폭풍 손상으로부터 면역 및 폐 세포를 보호하고, 선천성 및 적응 면역 반응의 항상성을 유지한다.
상기 면역 자극 천연 다당류 화합물을 함유하는 식물 종은 알로에 베라, 알로에 바르바덴스, 알로에 페록스(Aloe ferox), 알로에 아보레센스(Aloe arborescens), 아스트라갈루스 멤브라나세우스(Astragalus membranaceus), 가노더마 루시둠(Ganoderma lucidum), 호르데움 불가레(Hordeum vulgare), 아가리쿠스 (A. 블라제이) 서브루페센스(Agaricus (A. blazei) subrufescens), 에키나시아 푸르푸레아(Echinacea purpurea), 에키나시아 앙구스티폴리아(Echinacea angustifolia), 아코니툼 나펠루스(Aconitum Napellus)(몽크스후드(Monkshood)), 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra), 포리아 코코스 울프(Poria cocos Wolf), 울피포리아 엑텐사(Wolfiporia extensa), 위다니아 솜니페라(Withania somnifera), 부플류룸 팔카툼(Bupleurum falcatum), 라딕스 부플류리(Radix Bupleuri), 라딕스 글리시리자(Radix Glycyrrhiza), 프룩투스 포르시티에(Fructus Forsythiae), 파낙스 킨케폴리움(Panax quinquefolium), 파낙스 진셍 C. A. 메이어(Panax ginseng C. A. Meyer), 한국 홍삼, 렌티눌라 에도데스(Lentinula edodes)(표고버섯), 이노노투스 오블리쿠스(Inonotus obliquus)(차가버섯), 렌티눌라 에도데스, 리시움 바르바룸(Lycium barbarum), 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus)(자실체), 트라메테스 베르시컬러(Trametes versicolor)(자실체), 시아몹시스 테트라고놀로부스(Cyamopsis tetragonolobus), 시아몹시스 테트라고놀로부스(구아 검), 트라메테스 베르시컬러, 클라도시폰 오카무라누스 토키다(Cladosiphon okamuranus Tokida), 운다리아 피나티피다(Undaria pinnatifida)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 많은 다당류 화합물은 다양한 과일 및 식물, 예를 들어, 버섯, 해조류, 효모, 갈조류, 아가베 넥타, 갈조류, 발효 섬유, 시리얼, 해삼, 용설란, 아티초크, 아스파라거스, 부추, 마늘, 양파, 호밀, 보리 커널, 밀, 배, 사과, 구아바, 마르멜로, 자두, 구스베리, 오렌지 및 기타 감귤류 과일에서도 발견될 수 있다.
아세틸화 다당류는 식물 세포벽 중합체의 일부이다. 아세틸화 다당류는 일반 다당류에 비해 더 높은 항산화제, 더 나은 면역 조절 특성을 갖는 것으로 보고되었다. O-아세틸화의 정도는 종, 부분, 및 발달 상태에 따라 달라질 수 있다. 일부 천연 다당류의 아세틸 함량은 이들의 생물활성에서 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었지만, O-아세틸화 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 다당류 및/또는 페놀 화합물 또는 추출물은 식물 및/또는 해양 공급원, 예를 들어, 실시예 1 내지 8 및 달리 본 출원 전반에 걸쳐 포함된 식물로부터 분리될 수 있다. 화합물의 분리에 적합한 식물 부분은 잎, 수피, 트렁크, 트렁크 수피, 줄기, 줄기 수피, 잔가지, 괴경, 뿌리, 뿌리줄기, 뿌리 수피, 수피 표면, 어린 새싹, 종자, 열매, 자실체, 수술군(androecium), 암술군(gynoecium), 꽃받침, 수술, 꽃잎, 약편, 심피(암술), 꽃, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 관련된 구현예에서, 화합물 또는 추출물은 식물 공급원으로부터 분리되고, 전체적으로 합성되고, 식물 또는 진균 조직, 줄기 세포 및 트랜스제닉 미생물로 생합성되고, 언급된 치환기 중 임의의 것을 함유하도록 합성적으로 변형된다. 이와 관련하여, 식물로부터 분리된 화합물의 합성 변형은 당 분야에 공지되어 있고 충분히 당업자의 지식 범위 내에 있는 임의의 수의 기술을 이용하여 달성될 수 있다.
고려되는 주제의 다른 구현예는 본 개시에서 비제한적인 예로 UP360을 사용한 2 내지 3개의 식물 추출물의 다양한 조합의 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 면역 항상성의 조절을 위한 알로에-기반 조성물의 사용 방법에 관한 것이며, 이는 비제한적으로 면역 반응을 최적화하고/거나 균형을 맞추고; 바이러스 감염 및 박테리아 감염에 대한 건강한 면역 기능을 유지하도록 돕고; 대기 오염 및 흡연으로 인한 산화 스트레스 손상으로부터 면역계를 보호하고; 바이러스 감염, 박테리아 감염 및 대기 오염으로부터 정상적인 건강한 폐 기능을 보호하고; 건강한 염증 반응을 지지하고; 감염에 대한 사이토카인 및 사이토카인 반응의 건강한 수준을 유지하고; IL-10과 같은 항염증성 사이토카인을 상승 및 유지하고; 산화 반응을 제어하고 산화 스트레스를 완화시키고; 폐 정화 및 해독 능력을 유지하고; 폐 구조적 완전성 및 산소 교환 능력을 보호하고; 호흡 통로를 유지하고 폐포의 산소 흡수 능력을 향상시키고; 산화 스트레스가 폐 손상을 일으키는 것을 완화시키고; 폐의 미세순환을 촉진하고 정상적인 응고 기능을 보호하고; 백혈구의 활성 및 수를 증가시켜, 자연 살해(NK) 세포 기능을 향상시키고; T 및 B 림프구의 수를 증가시키고; CD3+, CD4+ NKp46+ 자연 살해 세포, TCRγδ+ 감마 델타 T-세포, 및 CD4+ TCRγδ+ 헬퍼 감마 델타 T 세포 및 CD8+ 세포 수를 증가시키고; 대식세포 식세포 활성을 보호 및 촉진하고; 정상 항체 생산을 지지하고/거나 촉진하고; 호흡 기관에서 건강한 폐 미생물총 및/또는 공생 시스템을 유지하고; 몸살, 인후통, 기침, 경미한 인후 및 기관지 자극, 코막힘, 동울혈, 부비동압, 콧물, 재채기, 후각 상실, 미각 상실, 근육통, 두통, 발열 및 오한을 비제한적으로 포함하는 감기/독감-유사 증상을 완화하고/거나 감소시키고; 가래(점액)를 무르게 하고 기관지 분비물을 묽게 하여 기침을 더 생산적으로 만드는 것을 돕고; 기관지 자극의 중증도를 감소시키고; 바이러스 감염, 미생물 감염 및 대기 오염으로 인한 폐 손상 및/또는 부종 및/또는 염증성 세포 침윤의 중증도를 감소시키고; 감기/독감 또는 오염 시즌 동안 기관지 시스템 및 편안한 호흡을 지원하고; 폐 섬유증을 예방 및/또는 치료하고; 감기/독감의 기간 및/또는 중증도를 감소시키고; 호흡기 시스템의 바이러스 및 박테리아 감염의 중증도 및/또는 기간을 감소시키고; 바이러스, 미생물 및 대기 오염 물질로 인한 호흡기 감염을 예방 및/또는 치료 및/또는 치유하고; 호흡기 감염의 진행을 관리 및/또는 치료 및/또는 예방, 및/또는 역전시키고; 폐 및 전체 호흡기 시스템의 회복 및 재생 기능을 촉진 및 강화하고 회춘시키는 것 등을 포함한다.
실시예
실시예 1. 유기 및 수성 추출물의 제조
각 식물의 건조 분쇄된 식물 분말(20 g)을 100 mL 스테인레스 강 튜브에 넣고, 80℃ 및 1500 psi에서 ASE 300 자동 추출기를 사용하여 유기 용매 혼합물(1:1의 비의 메틸렌 클로라이드/메탄올)로 2회 추출하였다. 추출 용액을 자동으로 여과하고 수집한 다음, 새로운 용매로 플러싱하고 질소 가스로 퍼징하여 건조시킨 후 50℃에서 수성 추출로 전환하였다. 합친 유기 추출물 용액을 회전 증발기로 증발시켜 미정제 유기 추출물(OE)을 수득하였다. 바이오매스를 공기 건조시키고 DI 수로 1회 추출하였다. 수용액을 여과시키고, 동결 건조시켜, 수성 추출물(AE)을 제공하였다.
메탄올 추출물(ME) 또는 에탄올 추출물(EE), 에탄올:H2O(7:3) 추출물, 에탄올:H2O(1:1) 추출물, 에탄올:H2O(3:7) 추출물 및 물 추출물 각각을 제공하기 위해 동일한 절차를 사용하나, 유기 용매 혼합물을 메탄올 또는 에탄올로 대체하여 유사한 결과가 획득되었다.
실시예 2. 알로에 베라 잎 겔 분말의 샘플 제조
알로에 베라 식물의 신선한 잎을 세척하고, 외부 껍질을 제거하였다. 잎 겔의 삼출물을 셀룰로스 효소로 처리하고, 활성탄을 통해 여과하였다. 여과액을 저압 증발에 의해 농축하고, 동결-건조, 확산 건조 또는 Qmatrix® 공정에 의해 건조 전력으로 탈수시켰다. 알로에 베라 잎 겔 분말은 8% 이상의 다당류를 갖는 200:1 내지 100:1의 비의 동결건조물의 형태로 생성되었다.
실시예 3. 에탄올 침전 방법에 의한 알로에 다당류의 제조
알로에 잎 겔 분말을 40 g/L의 농도로 물에 용해시키고, 에틸 알코올을 자기 교반 바로 일정하게 교반하면서 용액에 천천히 첨가하여 용액을 최대 80% 에탄올로 만들었다. 침전물을 2500 rpm에서 원심분리기에 의해 상청액으로부터 분리하고, Speedvac에 의해 건조시켰다. 총 1 kg의 알로에 잎 겔 분말(로트 WM 180141)을 처리하여 379 g의 침전물을 제공할 수 있었다. 침전물 및 상청액을 HPLC 분석과 함께 크기 배제 컬럼(SEC) 크로마토그래피를 위해 제공하였으며, 상청액에서 10K 초과의 다당류가 검출되지 않았고 침전물이 10 KD보다 큰 분자량을 갖는 40.5%의 다당류를 함유하는 것으로 나타났다(표 1).
표 1. 알로에 침전물 및 상청액의 다당류 함량
Figure pct00001
실시예 4. 한외여과에 의한 3개의 알로에 다당류 분획의 제조
379 g의 알로에 침전물을 20 g/L의 농도로 물에 용해시켰다. 수용액을 시간당 0.5-10 L의 유량으로 한외여과(Jinan Bona Biotechnology의 BONA-GM-18)에 적용시켜, 분자량이 각각 1 KD, 5 KD, 50 KD, 300 KD 및 500 KD인 다당류를 여과하기 위해 상이한 기공 크기를 갖는 유기 한외여과 막을 순차적으로 통과시켰다. 3개의 다당류 분획: >500 kD(45.7 g), 50-500 kD(30.1 g) 및 5-50 KD(19.8g)를 수집하고 냉동 건조 동결건조기로 건조시켰다. 분자량 분포 및 다당류 순도는 SEC HPLC 및 NMR 방법으로 분석되었다.
실시예 5. 포리아 코코스 추출물의 제조
건조 분쇄된 식물 포리아 코코스 스클레로티움 분말(20 g)을 100 mL 스테인레스 강 튜브에 넣고, 80℃ 및 1500 psi에서 ASE 300 자동 추출기를 사용하여 유기 용매 혼합물(1:1의 비의 메틸렌 클로라이드/메탄올)로 2회 추출하였다. 추출 용액을 자동으로 여과하고 수집한 다음, 새로운 용매로 플러싱하고 질소 가스로 퍼징하여 건조시킨 후 50℃에서 수성 추출로 전환하였다. 합친 유기 추출물 용액을 회전 증발기로 증발시켜 미정제 유기 추출물(OE) 0.82 g(4.10% 수율)을 수득하였다. 바이오매스를 공기-건조시키고 물로 1회 추출하였다. 수용액을 여과하고 동결-건조하여 수성 추출물(AE) 0.51 g(2.55% 수율)을 제공하였다.
건조 분쇄된 식물 포리아 코코스 스클레로티움 분말(20 g)을 100 ml 스테인리스 강 튜브에 넣고, 80℃ 및 1500 psi에서 ASE 300 자동 추출기를 사용하여 에탄올로 2회 추출하였다. 추출 용액을 자동으로 여과하고 수집한 다음, 새로운 용매로 플러싱하고 질소 가스로 퍼징하여 건조시킨 후 50℃에서 수성 추출로 전환하였다. 합친 유기 추출물 용액을 회전 증발기로 증발시켜 미정제 에탄올 추출물 0.3893 g(1.95% 수율)을 수득하였다. 바이오매스를 공기 건조시키고 물로 1회 추출하였다. 수용액을 여과하고 동결-건조하여 수성 추출물(AE) 0.3581 g(1.79% 수율)을 제공하였다.
메탄올 추출물(ME) 또는 에탄올 추출물(EE), 에탄올:H2O(7:3) 추출물, 에탄올:H2O(1:1) 추출물, 에탄올:H2O(3:7) 추출물 및 물 추출물 각각을 제공하기 위해 동일한 절차를 이용하나, 유기 용매를 메탄올 또는 에탄올로 대체하여 유사한 결과가 획득되었다.
포리아 코코스의 건조 분쇄된 자실체 분말을 물로 추출하여 15 대 1의 추출 수율로 로트# 210317을 갖는 포리아 물 추출물을 수득하였다. 포리아 추출물의 다당류는 글루코스에 대해 490 nm의 UV 파장을 갖는 페놀-황산 방법을 사용하는 비색법에 의해 결정되었다. 포리아 추출물의 총 트리테르페노이드는 올레아놀산에 대해 548 nm의 UV 파장에서 바닐린-황산 방법에 의해 정량화되었다. 비색법에 의해 10-40% 범위의 다당류 함량을 갖는 상이한 포리아 추출물에 대한 활성제 함량(표 2).
표 2. 포리아 코코스 추출물의 활성제 함량
Figure pct00002
표 3. SEC HPLC 분석에 기반한 포리아 다당류의 분자량 분포
Figure pct00003
다당류를 갖는 포리아 추출물 샘플을 20 mg/mL 농도로 제조하고, 9.9 KDa 내지 2,285 KDa의 분자량 범위의 일련의 덱스트란 분자량 표준을 사용하여 RI 검출기에 의해 검출된 0.7 mg/min의 유속에서 100 mM NaCl 용액의 등용매 용리를 사용하여 50℃에서 PolySep-SEC-P5000 컬럼(Phenomenex OOH-3145KO, 30 x 0.78 cm,)을 사용한 크기-배제 크로마토그래피(SEC) HPLC에 의해 분석하였다. 다당류는 각 분자량 컷오프(적절한 경우 표준 교정에서 미리 계산됨)에 따라 표적 피크에 수직 커서로 통합된다. 다당류 분포 및 총 다당류 함량은 표 3에 나타낸 바와 같이 각 샘플에 대해 계산되었다.
주로 5-2000 KDa 범위의, 5 KDa를 초과하는 분자량을 갖는 총 다당류 함량은 이 SEC-HPLC 방법에 의해 포리아 추출물 L784에서 33.05%로 계산되었다. 포리아 다당류 함량은 이 SEC-HPLC 방법에 의해 5%-40% 범위에서 다양하다.
실시예 6. 로즈마리 추출물의 제조
건조 분쇄된 식물 로즈마리누스 오피시날리스 공중 부분 분말(20 g)을 100 mL 스테인레스 강 튜브에 넣고, 80℃ 및 1500 psi에서 ASE 300 자동 추출기를 사용하여 유기 용매 혼합물(1:1의 비의 메틸렌 클로라이드/메탄올)로 2회 추출하였다. 추출 용액을 자동으로 여과하고 수집한 다음, 새로운 용매로 플러싱하고 질소 가스로 퍼징하여 건조시킨 후 50℃에서 수성 추출로 전환하였다. 합친 유기 추출물 용액을 회전 증발기로 증발시켜 미정제 유기 추출물(OE) 2.19 g(10.95% 수율)을 수득하였다. 바이오매스를 공기 건조시키고 물로 1회 추출하였다. 수용액을 여과하고 동결-건조하여 수성 추출물(AE) 1.26 g(6.31% 수율)을 제공하였다.
건조된 로즈마리 잎을 에탄올/물로 추출하고 여과액을 농축시켰다. 상부 액체를 분리하고 진공에 의해 추가로 건조시키고 컬럼에 의해 풍부화시켜 5-95% 범위의 로즈마린산 함량을 갖는 로즈마리 추출물을 수득하였다.
메탄올 추출물(ME) 또는 에탄올 추출물(EE), 에탄올:H2O(7:3) 추출물, 에탄올:H2O(1:1) 추출물, 에탄올:H2O(3:7) 추출물 및 물 추출물 각각을 제공하기 위해 동일한 절차를 사용하나, 유기 용매 혼합물을 메탄올 또는 에탄올로 대체하여 유사한 결과가 획득되었다.
건조된 로즈마리 잎을 에탄올 및 물의 혼합 용매로 추출하고 에틸 아세테이트로 추가로 추출하여 100:1의 추출 비로 약 30%의 로즈마린산을 갖는 로즈마린산-풍부화된 로즈마리 추출물을 수득하였다. 로즈마린산 추출물은 10-90% 범위의 함량으로 HPLC에 의해 검출되고 정량화되었다(표 4).
표 4. 로즈마리 추출물의 활성제 함량
Figure pct00004
실시예 7. 차가버섯 추출물의 제조
건조 분쇄된 식물 차가버섯(이노노투스 오블리쿠스)(20 g)을 100 mL 스테인레스 강 튜브에 넣고, 80℃ 및 =1500 psi에서 ASE 300 자동 추출기를 사용하여 유기 용매 혼합물(1:1의 비의 메틸렌 클로라이드/메탄올)로 2회 추출하였다. 추출 용액을 자동으로 여과하고 수집한 다음, 새로운 용매로 플러싱하고 질소 가스로 퍼징하여 건조시킨 후 50℃에서 수성 추출로 전환하였다. 합친 유기 추출물 용액을 회전 증발기로 증발시켜 미정제 유기 추출물(OE)을 생성시켰다. 바이오매스를 공기-건조시키고 물로 1회 추출하였다. 수용액을 여과시키고, 동결 건조시켜, 수성 추출물(AE)을 제공하였다.
분쇄 건조된 차가버섯(이노노투스 오블리쿠스) 분말을 물로 추출하여 다당류 함량이 5-95%의 범위인 4:1의 비의 물 추출물을 수득하였다. 메탄올 추출물(ME) 또는 에탄올 추출물(EE), 에탄올:H2O(7:3) 추출물, 에탄올:H2O(1:1) 추출물, 에탄올:H2O(3:7) 추출물 및 물 추출물 각각을 제공하기 위해 동일한 절차를 사용하나, 유기 용매를 메탄올 또는 에탄올로 대체하여 유사한 결과가 획득되었다.
실시예 8. 아스트라갈루스 멤브라나세우스 추출물의 제조
건조 분쇄된 식물 아스트라갈루스 멤브라나세우스 뿌리 분말(20 g)을 100 mL 스테인레스 강 튜브에 넣고, 80℃ 및 1500 psi에서 ASE 300 자동 추출기를 사용하여 유기 용매 혼합물(1:1의 비의 메틸렌 클로라이드/메탄올)로 2회 추출하였다. 추출 용액을 자동으로 여과하고 수집한 다음, 새로운 용매로 플러싱하고 질소 가스로 퍼징하여 건조시킨 후 50℃에서 수성 추출로 전환하였다. 합친 유기 추출물 용액을 회전 증발기로 증발시켜 미정제 유기 추출물(OE) 1.68 g(8.42% 수율)을 수득하였다. 바이오매스를 공기-건조시키고 물로 1회 추출하였다. 수용액을 여과하고 동결-건조하여 수성 추출물(AE) 2.93 g(14.68% 수율)을 제공하였다.
분쇄 건조된 아스트라갈루스 멤브라나세우스 뿌리 분말을 1:8 비의 물로 2회 추출하여 10% 이상의 다당류를 갖는 4 대 1의 추출 수율로 물 추출물을 수득하였다. 메탄올 추출물(ME) 또는 에탄올 추출물(EE), 에탄올:H2O(7:3) 추출물, 에탄올:H2O(1:1) 추출물, 에탄올:H2O(3:7) 추출물 및 물 추출물 각각을 제공하기 위해 동일한 절차를 사용하나, 유기 용매 혼합물을 메탄올 또는 에탄올로 대체하여 유사한 결과가 획득되었다.
실시예 9. 알로에-기반 조성물 UP360 및 다른 조합물의 제조
상기 실시예에서 입증된 바와 같이, 알로에 베라 잎 겔 분말은 10% 이상의 다당류를 갖는 200:1의 비의 동결건조물의 형태로 생성되었다. 20% 이상의 다당류를 갖는 포리아 코코스 추출물은 물 추출에 의해 제조되었다. 로즈마리 잎 추출물은 30% 이상의 로즈마린산을 제공하기 위해 에탄올/물 추출에 의해 제조되었다. 3개의 성분을 3:6:1의 중량비로 블렌딩하여, 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물의 최종 조합물을 수득하였다. 3개의 성분을 YUCHENGTECH 10L Lab 건조 분말 믹서를 사용하여 1시간 동안 혼합함으로써 실시예 5에 기재된 SEC-HPLC 방법에 의해 12.07%로 결정된 다당류 함량(>5KDa)을 갖는, 로트# APR-05012020-1 및 APR-05012020-2(표 5)를 갖는 UP360의 2개 배치가 생성되었다.
알로에 베라 내부 겔 분말, 포리아 코코스 추출물, 및 로즈마리 잎 추출물을 1:1:1의 중량비로 블렌딩하여 로트# UP0319를 갖는 조합 조성물 UP360을 수득하였다.
알로에 베라 내부 겔 분말, 포리아 코코스 추출물, 로즈마리 잎 추출물 및 부형제 - Litesse®(Gillco)를 3:2:1:4의 중량비로 블렌딩하여 SEC-HPLC 방법에 의해 11.01%로 결정된 다당류 함량(>5KDa)을 갖는, 로트# UP360-APR-09012020(4.011 kg)을 갖는 조성물 UP360의 또 다른 조합을 수득하였다(표 6).
알로에 베라 내부 겔 분말, 포리아 코코스 추출물, 로즈마리 잎 추출물 및 부형제 - Litesse®(Gillco)를 3:3:1:3의 중량비로 블렌딩하여 로트# UP360-Lit-1을 갖는 조성물 UP360의 또 다른 조합을 수득하였다. 다당류 함량(>5KDa)은 SEC-HPLC 방법에 의해 16.73%로 결정되었다(표 6).
표 5. UP360 로트#APR-05012020-1 및 APR-05012020-2에 대한 블렌딩 기록.
Figure pct00005
표 6: SEC HPLC에 의해 결정된 UP360에서 다당류의 분자량 분포
Figure pct00006
실시예 10. 조합물 1 및 조합물 2의 제조
조합물 1은 1:1:1의 각 개별 성분의 중량비의 알로에 베라 잎 겔 분말(L0765, 10% 다당류), 포리아 코코스 추출물(L0761, 20% 다당류) 및 로즈마리 추출물(L0762, 30% 로즈마린산)의 혼합물이다.
조합물 2는 1:1 중량비의 차가버섯(이노노투스 오블리쿠스) 추출물(L0762, 30% 다당류) 및 아스트라갈루스 멤브라나세우스 추출물(L0759, 아스트라갈로시드 > 0.3%, 다당류 > 10%)의 혼합물이다. 조합물 2는 차가버섯(이노노투스 오블리쿠스) 추출물 및 및 아스트라갈루스 멤브라나세우스 추출물을 1:99 내지 99:1의 비로 혼합하여 제조될 수 있다.
실시예 11. 다당류-풍부화된 샘플과 α-아밀로스의 효소 반응 및 크기 배제 크로마토그래피에 의한 포리아 코코스 추출물, 알로에 베라 겔 분말 및 UP360의 다당류 정량화
pH 값이 6.87인 NaH2PO4·H2O 및 Na2HPO4·7H2O의 10 mL 완충 용액 중 200 mg 식물 추출물을 200 μL α-아밀라제 효소 용액(2 mg/mL)으로 실온에서 밤새 처리하였다. 반응 혼합물을 SpeedVac에서 건조시키고 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다.
다당류를 갖는 샘플을 20 mg/mL 농도로 제조하고, 9.9 KDa 내지 2,285 KDa의 분자량 범위의 일련의 덱스트란 분자량 표준을 사용하여 RI 검출기에 의해 검출된 0.7 mg/min의 유속에서 100 mM NaCl 용액의 등용매 용리를 사용하여 50℃에서 PolySep-SEC-P5000 컬럼(Phenomenex OOH-3145KO, 30 x 0.78 cm,)을 사용한 크기-배제 크로마토그래피 HPLC에 의해 분석하였다. 다당류는 각 분자량 컷오프(적절한 경우 표준 교정에서 미리 계산됨)에 따라 표적 피크에 수직 커서로 통합된다. 다당류 분포 및 총 다당류 함량은 각 샘플에 대해 계산되었다.
포리아 다당류는 이 효소에 내성이 있었고, 아밀라제 효소 처리 전후에 33.50%에서 30.04%로 매우 약간 변화하였다. 반응 전후에 최종 UP360 조성물(APR-09012020)의 다당류에 대해서도 동일하다. 한편 주로 알파-타입 다당류로 구성된 말토덱스트린은 아밀라제에 의해 거의 완전히 분해되며, 반응 전 64.1% 중 처리 후 다당류(>5Ka)는 0.97%에 불과했다.
표 7. α-아밀라제 가수분해 전후에 포리아 추출물, UP360 및 말토덱스트린에서 HPLC 방법에 의한 다당류 정량화
Figure pct00007
실시예 12. 기능장애 대식세포로부터 과산소-유도된 HMGB1 방출의 억제
과산소 조건에서 배양된 대식세포는 산화 스트레스를 경험하여, HMGB1을 세포 배양 배지로 분비한다. 배양된 대식세포의 세포 외 HMGB1 축적을 감소시키는데 있어서 알로에-기반 조성물 및 이의 구성요소의 효능을 결정하기 위해, RAW 264.7 세포를 25 μg/mL 농도의 시험 물질의 존재 또는 부재하에 21% O2(실내 공기(RA)) 또는 95% O2에 24시간 동안 노출시켰다. 세포 배양 상청액의 HMGB1 수준은 단일 농도의 시험 물질에서 이중으로 ELISA에 의해 결정되었다. 데이터는 이중으로 검정된 한 실험의 평균 ± SEM으로 표현된다. 비히클만을 사용하여 과산소 하에 처리된 대식세포와 비교하여 *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001. 대조군 세포는 과산소-손상된 대식세포 기능 및 산화-스트레스-유도된 HMGB1 방출을 약화시키는 양성 대조군으로서 소듐 살리실레이트(SS)로 처리되었다.
표 8. RAW 264.7 세포에서 항-HMGB1 효과
Figure pct00008
실시예 13. 과산소-유도된 기능장애 대식세포 포식작용 검정
연구에 따르면 배양된 대식세포에서 HMGB1의 세포 외 축적 수준은 식세포 능력과 상관 관계가 있다. RAW 264.7 세포는 실내 공기(21% O2)에 남아 있거나 시험 물질 또는 이의 비히클의 존재하에 24시간 동안 95% O2에 노출되었다. 세포 생존력은 MTT 검정에 의해 결정되었다. 각 값은 삼중으로 4개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다. *, T24(21% O2; 0 μg/ml) 대조군과 비교하여 P≤0.05.
표 9. 배양된 RAW 264.7 세포에서 MTT 검정
Figure pct00009
표 10. 배양된 RAW 264.7 세포에서 포식작용 검정
Figure pct00010
RAW 264.7 세포는 실내 공기(21% O2)에 남아 있거나 시험 물질의 존재하에 24시간 동안 95% O2에 노출되었다. 이어서, 세포를 FITC-표지된 라텍스 미니-비드와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 각각 액틴 세포골격 및 핵을 시각화하기 위해 팔로이딘 및 DAPI로 염색하였다. 식세포 활성의 정량화를 위해, 그룹당 적어도 200개 세포를 계수하고 세포당 비드의 수를 21% O2(0 μg/ml) 대조군에 비해 증가 퍼센트로 나타내었다. 각 값은 이중으로 각 그룹에 대한 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다. *, 21% O2(0 μg/ml) 대조군과 비교하여 P≤0.05.
순수한 로즈마린산(실시예 6), 차가버섯의 수성 추출물(실시예 7) 및 2개의 조성물(실시예 10)을 시험하고 결과를 표 9 및 10에 요약하였다.
실시예 14. HaCaT 세포에서 UVA 및 UVB 유도된 ROS 검정
HaCaT 세포(인간 불멸 각질형성 세포)를 96-웰 조직 배양 플레이트에 8,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하고 25 μg/mL의 시험 물질로 24시간 동안 처리하였다. 위양성을 제거하기 위해 세포독성을 평가하였다(CCK > 80% 생존력). DCFH-DA(형광 프로브)를 세포에 첨가하여 ROS 생성을 검출하고 25분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 자외선 필터가 있는 태양광 시뮬레이터(Sol-UV-6 Solar Simulator) 하에서 UV 조사에 10분 동안 노출시킨 후, 형광 값을 멀티모드 리더에 의해 488 nm(여기) 및 525 nm(방출)에서 측정하였다. 비타민 C는 40 μg/mL로 처리된 양성 대조군으로 사용되었으며 ROS 생성을 43% 감소시킨다. 25 μg/mL에서, 로즈마린산은 UV에 노출된 HaCaT 세포의 수준과 비교하여 ROS 생성을 24%만큼 감소시켰다. 유기 추출물(OE)은 50 μg/mL에서 시험되는 반면, 수성 추출물은 100 μg/mL에서 시험되었다. 이 검정에서 분획 또는 순수한 화합물은 25 μg/mL로 시험되었다.
표 11. HaCaT 세포에서 UV-ROS 생성에 대한 억제
Figure pct00011
실시예 15. 30% 과산화수소 검정에 의해 유도된 인간 섬유모세포의 DNA 손상
HSF 세포(인간 섬유모세포)를 96-웰 조직 배양 플레이트에 시딩하고 시험 물질과 함께 37℃ 및 5% CO2 및 95% 공기에서 인큐베이션하였다. 처리된 HSF 세포를 1 mM 농도의 H2O2와 4시간 동안 인큐베이션함으로써 DNA 손상을 입힌 다음, DNA 이중 가닥 파손의 마커인 인산화된 히스톤인 γH2AX에 대해 면역염색하였다. DAPI를 사용하여 세포 핵을 염색하였다. 사진을 Image Xpress로 촬영하고 Meta Xpress로 분석하였다. γH2AX 염색 생성의 정량화에 의해 평가된 바와 같이, DNA 손상을 70% 감소시키는 양성 대조군으로서 카테킨(100 μg/ml)을 사용하였다. 로즈마린산은 25 μg/mL에서 DNA 손상을 24%만큼 감소시켰다.
실시예 16: 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 알로에-기반 조성물(UP360)은 LPS 챌린지된 대식세포에서 HMGB1 및 TNF의 용량 상관적인 억제를 나타내었다
100만 개의 RAW264.7 마우스 대식세포-유사 세포를 1 μg/mL 지질다당류(LPS)(대조군 제외)와 함께 60 mm 디쉬에서 혈청-비함유 배지에 플레이팅하였다. 실시예 9에서 제조된 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 UP360 조성물을 UP360-125, 250 및 500 μg/mL의 농도로 이중으로 첨가하였다. 배지를 흡인하고 10,000 MWCO 필터에서 원심분리하여 농축하기 전에 세포를 24시간 동안 처리하였다. 배지를 SDS-PAGE에서 진행시키고 HMGB1 및 TNF-α에 대한 블롯팅을 위해 PVDF 막으로 옮겼다. 블롯을 Ponceau S로 염색하고 밀도계를 총 단백질 양으로 정규화하였다.
알로에-기반 조성물-UP360은 LPS 챌린지된 대식세포에서 HMGB1 및 TNF-α의 용량 상관적인 유의한 억제를 나타내었다. 웨스턴 블롯 반-정량 데이터로부터, 대식세포가 LPS로 챌린지되었을 때, 비히클 대조군의 경우, HMGB1 및 TNF-α에 대해 상대 밴드 강도가 각각 1.1 ± 0.17 및 9.8 ± 0.33인 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, LPS-챌린지된 대식세포를 UP360으로 처리하면 HMGB1 밴드 강도의 수준이 125, 250 및 500 μg/mL 농도에 대해 각각 0.48 ± 0.02, 0.27 ± 0.01 및 0.17 ± 0.01로 감소하였다. 유사하게, 유의하게 감소된 TNF-α의 분비, 즉, UP360의 250 및 500 μg/mL 농도에 대해 각각 0.54 ± 0.01 및 0.37 ± 0.01이 발견되었다.
대식세포를 처리하지 않거나(대조군), LPS(비히클)로만 처리하거나, LPS 및 지시된 농도(좌측)의 추출물 또는 조성물로 24시간 동안 이중으로 처리한 후 배지를 수집하고 10,000 MWCO 필터에 농축시켰다. 농축된 배지를 SDS-PAGE에서 진행시키고 지시된 단백질(상부)에 대해 블롯팅하였다. 밀도계를 블롯에 대해 수행하고, 총 Ponceau 염색에 대해 정규화하고, 단백질 발현을 대조군과 비교하여 계산하였다.
표 12: 대조군에 비해 Ponceau S 염색에 대해 정규화된 UP360 웨스턴 블롯으로부터의 HMGB1 및 TNF-α의 반-정량화:
Figure pct00012
실시예 17: 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 알로에-기반 조성물(UP360)은 HMGB1 및 TNF-α의 예상치 못한 상승적 억제 활성을 나타내었다
100만 개의 RAW264.7 마우스 대식세포-유사 세포를 1 μg/mL 지질다당류(LPS)(대조군 제외)와 함께 60 mm 디쉬에서 혈청-비함유 배지에 플레이팅하였다. 실시예 9에서 UP360을 제조하기 위해 사용된 식물 추출물을 다음 농도로 이중으로 첨가하였다: 알로에 잎 겔 분말 - 37.5, 75, 및 150 μg/mL, 포리아 추출물 - 75, 150, 및 300 μg/mL, 및 로즈마리 추출물 - 12.5, 25, 및 50 μg/mL. 알로에, 포리아 및 로즈마리의 3개 농도는 상기 실시예에서 125, 250 및 500 μg/mL UP360의 농도와 동일하였다. 배지를 흡인하고 10,000 MWCO 필터에서 원심분리하여 농축하기 전에 세포를 24시간 동안 처리하였다. 배지를 SDS-PAGE에서 진행시키고 HMGB1 및 TNF-α에 대한 블롯팅을 위해 PVDF 막으로 옮겼다. 블롯을 Ponceau S로 염색하고 밀도계를 총 단백질 양으로 정규화하였다.
밤새 LPS-챌린지된 대식세포로부터의 상청액을 이용하여 Colby의 방법을 사용하여 특정 비율로 함께 제형화될 때 알로에, 포리아 및 RA로부터의 추출물의 가능한 예상치 못한 억제 효과를 평가하였다. 상기 방법에서, 특정 종말점 측정의 관찰된 값이 가설로 계산된 예상 값보다 큰 경우 2개 이상의 물질을 갖는 제형은 예상치 못한 상승작용을 갖는 것으로 추정된다. 예상 값과 관찰된 값이 같으면, 가산적 효과가 있다. 그러나, 관찰된 값이 예상 값보다 낮으면, 예상치 못한 억제 효과가 있다. 현재 시나리오에서, 원하는 의미있는 항염증 결과를 달성하기 위해 이 검정에서 모니터링된 두 염증 마커(HMGB1 및 TNF-α) 모두의 감소된 수준을 갖도록 의도되었다.
표 13: 대조군에 비해 Ponceau S 염색에 대해 정규화된 알로에, 포리아 및 로즈마리 웨스턴 블롯의 반-정량화:
Figure pct00013
표 14. HGMB1 및 TNF-α의 감소에서 알로에-기반 조성물(UP360)의 예상치 못한 상승작용
Figure pct00014
Figure pct00015
대식세포를 처리하지 않거나(대조군), LPS(비히클)로만 처리하거나, LPS 및 지시된 농도(좌측)의 추출물 또는 조성물로 24시간 동안 이중으로 처리한 후 배지를 수집하고 10,000 MWCO 필터에 농축시켰다. 농축된 배지를 SDS-PAGE에서 진행시키고 지시된 단백질(상부)에 대해 블롯팅하였다. 밀도계를 블롯에 대해 수행하고, 총 Ponceau 염색에 대해 정규화하고, 단백질 발현을 대조군과 비교하여 계산하였다.
표에 기록된 바와 같이, 본 발명자들은 HMGB1 및 TNF-α 둘 모두의 수준이 유의하게 감소하였음을 관찰하였고, 이는 UP360을 생성하는 이러한 약용 식물 물질을 조합한 예상치 못한 억제 효과를 나타낸다. 추출물이 125, 250 및 500 μg/mL UP360의 용량을 구성할 개별 농도로 인큐베이션되었을 때, 표준화된 조성물 UP360에 대한 억제 효과는 관찰된 TNF-α 값이 예상 값보다 높았던 125 μg/mL를 제외하고 두 마커 모두의 경우에 각 투여량에 대해 이론적으로 계산된 예상 값보다 컸다. 이들 값은 125, 250 및 500 μg/mL에서 각각 HMGB1에 대해 0.48 vs 2.38, 0.27 vs 2.01 및 0.17 vs 2.43 그리고 TNF에 대해 6.6 vs 3.05, 0.54 vs 2.97 및 0.37 vs 2.73이었다. 이와 같이, 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물 처리의 유리한 예상치 못한 억제 효과는 배지로의 HMGB1 및 TNF-α의 분비를 감소시키기 위한 예상된 결과를 초과하였다.
실시예 18. 동물 및 수용
CD-1 마우스는 USDA 승인 공급업체에서 구입하였다. 8주령의 수컷 CD-1 마우스를 Charles River Laboratories, Inc.(Wilmington, MA)에서 구입하였다. 도착시 동물을 순응시켰고 11주령에 연구에 사용하였다. 연구 당시 동물의 평균 체중은 33.6 ± 2.4 g이었다. 이들은 12시간의 명암 주기로 온도-제어된 방(71-72℉)에 수용되었고, 사료와 물은 자유롭게 제공되었다.
동물은 폴리프로필렌 마우스 케이지당 3-5마리로 수용되었고 꼬리에 특징적으로 번호를 매겨 개별적으로 식별하였다. 각 케이지는 와이어 바 뚜껑 및 여과 마우스 탑(filtered mouse top)(Allentown, NJ)으로 덮었다. 프로젝트 번호, 시험 물품, 용량 수준, 그룹, 동물 번호 및 성별을 나타내는 케이지 카드로 개별 케이지를 식별하였다. Harlan T7087 소프트 콥(soft cob) 깔짚을 사용하였고, 적어도 매주 2회 교체하였다. 마우스에게 신선한 물과 Harlan(Harlan Teklad, 370W, Kent, WA)의 설치류 사료 # T2018을 자유롭게 제공하였다.
실시예 19: 외인성 공격 트리거 반응으로서 지질다당류(LPS) 유도된 패혈증 모델
이 모델은 종말점 측정으로 동물의 생존율/사망률을 사용하였다(Wang et al., 1999). 외인성 공격 트리거인 LPS는 그람-음성 박테리아의 외막의 필수 구성요소이며 내독성 쇼크를 유발할 수 있는 일반화된 염증 과정의 시작에서 주요 기여 인자이다. 이는 TNF, IL-1, IL-6 및 감마 인터페론과 같은 여러 초기 단계 사이토카인 및 후기 매개체 HMGB1의 과잉 생산에 기인하는 대식세포/단핵구에 의해 주로 매개되는 상태이다. 인산염 완충 식염수(PBS; Lifeline, 로트# 07641)에 용해된 LPS(25 mg/kg)의 중앙 치사량 투여 후, 동물은 내독소혈증을 일으키고, HMGB1은 8시간에 혈청에서 검출되고 LPS 후 16 내지 32시간에 최고 및 정점지속 수준에 도달할 것이다. 치료하지 않으면, 마우스는 24시간 이내에 죽기 시작한다. 현재 연구에서, 본 발명자들은 LPS 주사 후 4일 동안 마우스를 모니터링하였다. LPS + 소듐 부티레이트(SB; Aldrich, St. Louis, MO; 로트# MKCG7272), LPS + 비히클(0.5% CMC; Spectrum, New Brunswick, NJ; 로트# 1IJ0127) 및 LPS + UP360(실시예 9에서 제조된 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 알로에-기반 조성물)의 생존율/사망률을 비교하였다. 연구에는 다음 그룹이 포함되었다.
표 15. 처리 그룹의 상세 설명
Figure pct00016
이 모델에서, 마우스는 10 mL/kg PBS 부피를 갖는 25 mg/kg의 LPS(E. 콜리(E. coli), 055:B5; Sigma, St. Louis, MO; 로트# 081275)의 치사량 복강 내 주사 전 1주일(7일) 동안 실시예 9에 예시된 UP360으로 전처리되었다. 동물은 매시간 관찰되었다. 소듐 부티레이트가 HMGB1 방출의 억제를 통해 마우스에서 LPS-유도된 손상을 개선했다는 사실을 감안하여, 본 발명자들은 이 화합물을 본 연구를 위한 양성 대조군으로 선택하였다(Li et al., 2018).
실시예 20: 알로에-기반 조성물(UP360)은 치사량의 독소 하에서 동물 생존율을 개선시켰다
LPS의 복강 내 주사 3시간 후, 마우스는 내독소혈증의 초기 징후를 나타내기 시작하였다. 마우스의 탐색적 거동은 점진적으로 감소하였고 헝클어진 털(털세움), 움직임 감소, 무기력 및 설사가 동반되었다. 이러한 징후 및 증상은 모든 처리 그룹에서 나타나는 것처럼 보였지만, 중증도의 크기는 비히클-처리된 그룹에서 더 두드러졌다.
비히클-처리된 2마리 마우스 및 양성 대조군 소듐 부티레이트(SB) 그룹의 1마리 마우스가 LPS 주사 24시간 후에 사망한 것으로 밝혀졌다. 표 16에 나타낸 바와 같이, 이들 그룹에 대한 생존율을 결정하였고 각각 62.5% 및 75%로 밝혀졌다. 알로에-기반 조성물(UP360)로 처리된 마우스는 LPS 주사 24시간 후 100% 생존율을 가졌다. LPS 주사 34시간 후, 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물, 소듐 부티레이트(SB) 및 비히클로 처리된 마우스에 대해 각각 87.5%, 62.5% 및 50%의 생존율이 관찰되었다. 아마도 알로에-기반 조성물(UP360)-처리된 마우스에 대한 가장 유의한 관찰은 LPS 주사 48시간 후에 관찰되었다. 이 시점에, 비히클-처리된 마우스의 생존율은 12.5%에 불과한 반면, 알로에-기반 조성물(UP360)-처리된 마우스는 62.5%의 생존율을 나타내었다. 양성 대조군 - SB의 경우에도, 이 시점에 동물의 절반이 사망하였다. 3일째 날(LPS 주사 72시간 후)에, 그룹의 생존율은 UP360, 소듐 부티레이트 및 비히클에 대해 각각 62.5%, 50% 및 12.5%였다.
비히클 대조군의 모든 마우스는 LPS 주사 82시간 후에 사망하였고, 이 그룹의 생존율은 0%였다. 한편, 알로에-기반 조성물(UP360) 및 양성 대조군 소듐 부티레이트(SB)로 처리된 마우스는 62.5% 및 50%의 생존율을 나타내었고 LPS 주사 후 96시간 및 120시간 동안 동일하게 유지되었다. 이러한 생존율은 알로에-기반 조성물(UP360) 및 양성 대조군 둘 모두에 대해 통계적으로 유의하였다(표 16). 이러한 그룹의 생존 동물은 웰빙이 점진적으로 개선되었다. 마우스는 신체적으로 더 좋아 보였고 점차 정상적인 거동을 보이기 시작하였다. 이러한 데이터는 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물이 패혈증시 갑작스러운 사이토카인 및 HMGB1의 급증을 극복하기 위한 예방 및/또는 중재 식이 보충제로서 가능하게 사용될 수 있음을 시사한다.
표 16: 알로에-기반 조성물(UP360)은 LPS 유도된 내독소혈증 및 패혈증으로부터 62.5%의 생존율을 제공하였다
Figure pct00017
실시예 21: LPS-유도된 패혈증 모델에서 알로에-기반 조성물(UP360) 및 이의 구성요소의 비교
알로에, 포리아 및 로즈마린산(RA)을 조합하여 실시예-9에서 입증된 특정 비율로 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 UP360을 생성하는 장점은 지질다당류(LPS)-유도된 내독소혈증에서 평가되었다. 수컷 CD-1 마우스(n=13)를 LPS 주사 전 7일 동안 실시예 9에서 UP360을 제조하기 위해 사용된 각각 150 mg/kg, 300 mg/kg 및 50 mg/kg의 알로에, 포리아 및 로즈마린산(RA)으로 처리하였다. 8일째 날에, 10 mL/kg의 PBS에 용해된 25 mg/kg LPS를 마우스에 복강 내 주사하였다. UP360-처리된 그룹의 마우스는 500 mg/kg의 일일 용량의 UP360을 수용하였다. 모든 마우스는 연구 기간 동안 매일 각각의 치료를 계속 받았다. LPS(25 mg/kg)의 중앙 치사량 i.p. 투여 후, 동물은 몇 시간 내에 패혈증이 발생할 것으로 예상된다. 치료하지 않으면, 마우스는 24시간 이내에 죽기 시작한다. 동물은 매시간 관찰되었다. 현재 연구에서, 본 발명자들은 LPS 주사 후 6일 동안 마우스를 모니터링하였다. LPS + 소듐 부티레이트(SB), LPS + 비히클(0.5% CMC), LPS + UP360, LPS + 알로에, LPS + 포리아 및 LPS + 로즈마린산의 생존율을 비교하였다. 정상 대조군 동물은 PBS만을 복강 내 수용하였고 담체 비히클 0.5% CMC만을 위내투여하였다. 소듐 부티레이트(SB)가 HMGB1 방출의 억제를 통해 마우스에서 LPS-유도된 손상을 개선했다는 사실을 감안하여, 본 발명자들은 이 화합물을 본 연구를 위한 양성 대조군으로 선택하였다(Li et al., 2018).
다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물의 생존율 및 사망률은 Colby의 방정식(Colby, 1967)을 사용하여 잠재적인 첨가제, 길항제 또는 조합시 상승 효과를 밝히기 위해 제형에 나타나는 개별 추출물의 투여량과 비교되었다. 이러한 식물 추출물의 블렌딩이 예상치 못한 상승작용을 갖기 위해서는 관찰된 억제가 계산된 값보다 커야 한다.
LPS의 복강 내 주사 몇 시간 후, 마우스는 패혈증의 초기 징후를 나타내기 시작하였다. 마우스의 탐색적 거동은 점진적으로 감소하였고 헝클어진 털(털세움), 움직임 감소, 무기력, 설사, 및 일부의 경우 눈꺼풀 감김과 함께 떨림이 동반되었다. 이러한 징후 및 증상은 모든 처리 그룹에서 나타났지만, 중증도는 비히클 처리 그룹에서 더 심각하였다.
표 17, 18, 및 19에 나타낸 바와 같이, 모델 유도 후 처음 36시간 동안 알로에-기반 조성물(UP360)로 처리된 마우스에서 사망은 관찰되지 않았다. 알로에-기반 조성물(UP360)로의 처리는 처음 36시간 동안 100% 생존율을 나타내었다. 반면,
표 17: LPS 유도된 패혈증에서 생존 및 사망의 시간 경과
Figure pct00018
표 18: 알로에-기반 조성물 UP360으로 처리된 LPS-유도된 패혈증 마우스의 생존율
Figure pct00019
표 19: 알로에-기반 조성물 UP360으로 처리된 LPS-유도된 패혈증 마우스의 사망률
Figure pct00020
알로에, 포리아 및 로즈마린산과 같은 구성요소-처리된 마우스는 각각 69.2%, 76.9% 및 69.2%의 생존율을 경험하였다. 이 시간 프레임(주사 후 36시간 - hpi)에서, 비히클 그룹은 53.8%의 생존율을 나타내었다. 각 그룹에 대한 가장 높은 사망률은 LPS 후 2일째 날(48hpi)에 관찰되었다.
LPS 48시간 후에 알로에, 포리아 및 로즈마린산-처리된 마우스에서 각각 61.5%, 46.2% 및 61.5%의 사망률이 관찰되었다. 알로에-기반 조성물(UP360) 그룹의 마우스는 단지 15.4%의 사망률을 경험하였다. 비히클-처리된 마우스는 LPS 48시간 후에 84.6%의 사망률을 나타내었고 나머지 연구 기간 동안 동일하게 유지되었다. 3일째 날(LPS 주사 72시간 후)에, 처리 그룹의 생존율은 알로에 조성물(UP360), 알로에, 포리아 및 로즈마린산에 대해 각각 76.9%, 30.8%, 46.2% 및 38.5%였다. 양성 대조군은 이 시간 프레임에서 38.5%의 생존율을 보였다.
6일째 날의 끝(144hpi)에, 알로에-기반 조성물(UP360)은 69.2%의 생존율을 보인 반면, 알로에, 포리아 및 RA 그룹의 마우스는 각각 23.1%, 46.2% 및 38.5%의 생존율을 나타내었다(표 17, 18, 19). 알로에-기반 조성물에 대해 관찰된 생존율은 비히클-처리된 그룹에 비해 통계적으로 유의하게 증가하였다. SB 그룹은 30.8%의 생존율로 연구를 마쳤다. 그룹의 생존 동물은 웰빙이 점진적으로 개선되었다. 마우스는 신체적으로 더 좋아 보였고 점차 정상적인 탐색적 거동을 보이기 시작하였다.
실시예 22: 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 알로에-기반 조성물(UP360)에 대해 사망률 감소에 있어서 예상치 못한 상승작용이 관찰되었다
상기 LPS-유도된 생존 연구는 Colby의 방법을 사용하여 특정 비율로 함께 제형화될 때 알로에, 포리아 및 로즈마린산(RA)으로부터의 추출물의 가능한 상승작용 또는 예상치 못한 효과를 평가하기 위해 이용되었다. 마우스에게 500 mg/kg의 용량의 알로에-기반 조성물(UP360)을 제공했을 때, 사망률은 분석된 각 시점에서 이론적으로 계산된 예상 값보다 낮았다(표 20). 예를 들어, LPS 주사 24시간 및 60시간 후에 예상되는 사망률은 각각 33.9% 및 94.5%였지만, 알로에-기반 조성물(UP360)에 대해 실제 관찰된 사망률은 각각 0% 및 15.4%였다. 이러한 발견은 알로에, 포리아 및 RA로부터의 이러한 3개의 표준화된 추출물을 3:6:1의 특정 비로 제형화하는 것이 알로에, 포리아 또는 RA 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 패혈증시 연구 대상체의 수명을 연장함에 있어서 훨씬 더 큰 이점을 가짐을 시사한다.
표 20: 알로에-기반 조성물 UP360에 대해 사망률 감소에 있어서 예상치 못한 상승작용이 관찰되었다
Figure pct00021
연구 대상체의 95.9%가 관찰 기간의 끝에 사망할 것으로 예상되었으나, 알로에-기반 조성물(UP360)에 대한 실제 사망률은 30.8%로 밝혀졌다.
이와 같이, 알로에, 포리아 및 RA 추출물을 조합시킨 장점은 상기 LPS-유도된 생존 연구에서 Colby의 방정식을 사용하여 평가되고 확인되었다. 상기 방법에서, 특정 종말점 측정의 관찰된 값이 가설로 계산된 예상 값보다 큰 경우 2개 이상의 물질을 갖는 제형은 예상치 못한 상승작용을 갖는 것으로 추정된다. LPS 주사 24, 36, 48, 60, 72, 96, 120 및 144시간 후에 이들 약용 식물의 사망률 값을 사용하여 계산된 효능 값을 결정하고 지정된 시점에 알로에-기반 조성물(UP360)의 관찰된 사망률 값과 비교하였다. 현재 연구에서, 본 발명자들은 알로에, 포리아 및 RA 추출물의 조합의 결과로 예상치 못한 상승작용을 발견하였다. 알로에-기반 조성물(UP360) 처리의 유리한 효과는 단독으로 제공된 추출물과 비교하여 사망률에 대한 예상 결과를 초과하였다. 관찰 기간의 끝에, 알로에-기반 조성물(UP360)의 사망률은 30.8%인 반면, 각 알로에, 포리아 및 RA 추출물 처리 그룹의 사망률은 각각 76.9%, 53.9% 및 61.5%였으며, 이는 사이토카인 폭풍을 보호하고 이에 따라 패혈증시 환자의 사망률을 감소시키는데 있어서 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 이러한 식물 추출물의 예상치 못한 상승적 활성을 시사한다(표 20).
실시예 23: 래트에서 지질다당류(LPS)-유도된 급성 염증성 폐 손상을 완화시키는 것에 대한 알로에-기반 조성물(UP360)의 효능 - 외인성 공격 트리거 반응으로서
이 연구는 500 mg/kg 및 250 mg/kg으로 경구 투여된 LPS-유도된 급성 폐 손상을 완화시키는데 있어서 실시예 9에서 제조된 알로에-기반 조성물(UP360)의 직접적인 영향을 평가하도록 설계되었다. 급성 폐 손상은 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)에서 볼 수 있는 바와 같이 미만성 폐 손상을 초래하는 폐포 상피 세포 및 모세관 내피 세포 손상을 특징으로 하는 임상 증후군이다. 이 연구에서, 본 발명자들은 LPS에 의한 모델 유도 전에 래트를 시험 물질로 7일 동안 경구 처리하였다. 8일째 날에, 경구 처리 1시간 후, LPS를 0.1 mL/100 g PBS에 용해된 10 mg/kg으로 각 래트에 기관 내(i.t.) 주입하였다. 정상 대조군 래트는 동일한 부피의 i.t. PBS만을 수용하였다.
표 21. 연구 그룹
Figure pct00022
LPS는 전신 및 폐 반응을 유도하여, 호중구 및 대식세포를 포함하는 전염증성 세포 및 IL-1, IL-8, IL-6, MIP-2/CINC-3 및 TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인을 축적시키는 것으로 알려져 있다. 이는 폐 간질 및 폐포 부종, 및 HMGB1이 대식세포 및 단핵구에 의해 능동적으로 분비되고/거나 괴사성 세포로부터 수동적으로 방출되는 상피 세포 손상을 야기한다.
본 발명자들은 래트에게 기관 내 LPS 투여 24시간 후에 생존 동물을 희생시켰다. 부검시, 1.5 mL PBS를 우엽에 기관 내 주사함에 의해 기관지폐포 세척(BAL)을 수집한 후 적어도 3회 부드럽게 흡인하였다. 회수된 유체를 풀링하고, 4℃에서 10분 동안 1500 rpm으로 원심분리하고, 사이토카인(예를 들어, IL-6) 및 폐 단백질 수준을 측정하는데 사용하였다. MIP-2/CINC-3 단백질 분석을 위해 각 래트로부터 조직 균질화를 위해 이 동일한 우엽을 수집하였다. 좌엽을 포르말린으로 고정하고 인증된 병리학자의 분석을 위해 조직병리학 평가를 위해 Nationwide Histology에 제출하였다. 부검시 수집된 혈청을 사용하여 TNF-α 및 IL-1β와 같은 사이토카인을 측정하였다. 10 mg/kg의 LPS의 기관 내 주입 후, 모든 동물은 챌린지 후 24시간 동안 생존하였다. 여기서, 본 발명자들은 급성 폐 감염의 병리학에 관여하는 것으로 여겨지는 주요 사이토카인 및 화학유인제 및 다음 실시예에서 조직병리학 분석으로부터의 데이터를 수집하였다.
실시예 24: 알로에-기반 조성물(UP360)은 혈청 TNF-α의 용량-상관적인 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다
실시예 23의 희석되지 않은 래트 혈청 중 TNF-α의 존재는 다음과 같이 R&D Systems의 래트 TNF-α Quantikine ELISA 키트(제품#: RTA00)를 사용하여 측정되었다: 희석되지 않은 혈청을 TNF-α 항체로 코팅된 마이크로플레이트에 첨가하였다. 실온에서 2시간 후, 혈청 중 TNF-α를 플레이트에 결합시키고 플레이트를 완전히 세척하였다. 효소-컨쥬게이션된 TNF-α 항체를 플레이트에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 결합시켰다. 세척을 반복하고, 효소 기질을 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 현상한 후, 정지 용액을 첨가하고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. TNF-α의 농도는 TNF-α 표준 곡선의 흡광도 판독 값에 기초하여 계산되었다.
표 22에 나타낸 바와 같이, LPS로 챌린지된 비히클-처리된 래트에서 혈청 TNF-α의 통계적으로 유의한 급증이 관찰되었다. 이러한 증가는 래트를 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물로 처리했을 때 상당히 감소하였다. 500 mg/kg 및 250 mg/kg의 알로에-기반 조성물(UP360)로 경구 처리된 래트에 대해 통계적으로 유의하고 용량-상관적인 감소가 관찰되었다. 혈청 TNF-α 수준의 이러한 감소를 비히클 대조군에 대해 계산하였고, 500 mg/kg 및 250 mg/kg의 알로에-기반 조성물(UP360)로 처리된 그룹에 대해 각각 91.9% 및 73.6%인 것으로 밝혀졌다. 양성 대조군인 소듐 부티레이트(SB)는 혈청 TNF-α 수준의 통계적으로 유의한(67.9%) 감소를 나타내었다.
표 22: 혈청 TNF-α 수준에 대한 알로에-기반 조성물(UP360)의 효과.
Figure pct00023
실시예 25: 알로에-기반 조성물(UP360)은 혈청 IL-1β의 용량-상관적인 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다
실시예 23의 희석되지 않은 래트 혈청 중 IL-1β의 존재는 다음과 같이 R&D Systems의 래트 IL-1β Quantikine ELISA 키트(제품#: RLB00)를 사용하여 측정되었다: 희석되지 않은 혈청을 IL-1β 항체로 코팅된 마이크로플레이트에 첨가하였다. 실온에서 2시간 후, 혈청 중 IL-1β를 플레이트에 결합시키고 플레이트를 완전히 세척하였다. 효소-컨쥬게이션된 IL-1β 항체를 플레이트에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 결합시켰다. 세척을 반복하고, 효소 기질을 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 현상한 후, 정지 용액을 첨가하고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. IL-1β의 농도는 IL-1β 표준 곡선의 흡광도 판독 값에 기초하여 계산되었다.
여기서 다시, 용량-상관적이고 통계적으로 유의한 IL-1β의 감소는 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물로 처리된 래트에서 관찰되었다. 비히클로 처리된 LPS-유도된 급성 폐 손상 래트에서 IL-1β의 혈청 수준의 통계적으로 유의한 증가가 관찰되었다. 알로에-기반 조성물(UP360)로 처리된 래트는 500 mg/kg 및 250 mg/kg의 경구 투여량으로 투여될 때 각각 80.0% 및 63.0%의 IL-1β 수준의 감소를 나타내었다(표 23). 소듐 부티레이트(SB) 그룹은 혈청 IL-1β의 65.3% 감소를 나타내었다. 입증된 혈청 IL-1β 감소는 알로에-기반 조성물(UP360) 및 소듐 부티레이트(SB) 그룹 둘 모두에서 통계적으로 유의하였다.
표 23: 혈청 IL-1β 수준에 대한 알로에-기반 조성물(UP360)의 효과.
Figure pct00024
실시예 26: 알로에-기반 조성물(UP360)은 기관지-폐포 세척(BAL)에서 용량-상관적이고 통계적으로 유의한 IL-6 수준 감소를 나타내었다
실시예 23의 희석되지 않은 래트 기관지-폐포 세척(BAL) 중 IL-6의 존재는 다음과 같이 R&D Systems의 래트 IL-6 Quantikine ELISA 키트(제품#: R6000B)를 사용하여 측정되었다: 희석되지 않은 BAL을 IL-6 항체로 코팅된 마이크로플레이트에 첨가하였다. 실온에서 2시간 후, BAL 중 IL-6을 플레이트에 결합시키고 플레이트를 완전히 세척하였다. 효소-컨쥬게이션된 IL-6 항체를 플레이트에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 결합시켰다. 세척을 반복하고, 효소 기질을 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 현상한 후, 정지 용액을 첨가하고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. IL-6의 농도는 IL-6 표준 곡선의 흡광도 판독 값에 기초하여 계산되었다.
상기 TNF-α 및 IL-1β 데이터와 일치하여, 알로에-기반 조성물(실시예 9에서 제조된 UP360)은 BAL IL-6의 수준에서 용량-상관적인 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다. 더 높은 용량(500 mg/kg)은 BAL IL-6 수준의 82.0% 감소를 초래하였고, 더 낮은 용량(250 mg/kg)은 BAL IL-6 수준의 51.0% 감소를 나타내었다(표 24). 감소는 비히클-처리된 급성 폐 손상 래트와 비교할 때 고 용량의 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물에 대해 통계적으로 유의하였다. 알로에-기반 조성물(UP360)의 저 용량에 대해서도 강한 경향이 관찰되었다(즉, p=0.087). 소듐 부티레이트(SB) 그룹은 비히클-처리된 질병 모델에 비해 BAL IL-6의 통계적으로 유의하지 않은 37.7% 감소를 나타내었다.
표 24: BAL IL-6 수준에 대한 알로에-기반 조성물(UP360)의 효과.
Figure pct00025
실시예 27: 알로에-기반 조성물(UP360) 처리는 CINC-3에서 통계적으로 유의한 감소를 생성하였다
CINC-3/대식세포 염증성 단백질 2(MIP-2)는 케모카인으로 알려진 화학주성 사이토카인 패밀리에 속한다. MIP-2는 CXC 케모카인 패밀리에 속하며, CXCL2로 명명되고 CXCR1 및 CXCR2의 결합을 통해 작용한다. 이는 주로 대식세포, 단핵구 및 상피 세포에 의해 생성되며, 염증의 근원에 대한 화학주성 및 호중구의 활성화를 담당한다.
실시예 23으로부터의 50 μL의 각 래트 폐 균질물 샘플(비히클, 소듐 부티레이트(SB), UP360 저 용량, UP360 고 용량의 경우 그룹당 10개, 대조군의 경우 그룹당 7개) 및 50 μL의 검정 희석제 완충액을 모노클로날 CINC-3 항체로 코팅된 96-웰 마이크로플레이트의 웰에 첨가하고 2시간 동안 결합시켰다. 효소-결합된 폴리클로날 CINC-3을 첨가하기 전에 플레이트를 5회 세척하고 2시간 동안 결합시켰다. 기질 용액을 웰에 첨가하기 전에 웰을 5회 더 세척하고, 광으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 효소 반응을 개시하였다. 효소 반응은 청색 염료를 생성하였고 정지 용액을 첨가함에 따라 황색으로 변했다. 각 웰의 흡광도를 450 nm에서 판독하고(580 nm 보정) CINC-3의 표준 곡선과 비교하여 각 래트 폐 균질물 샘플에서 CINC-3의 양을 대략적으로 계산하였다.
500 mg/kg의 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360(실시예 9에서 제조된 UP360)을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물의 일일 경구 치료는 LPS-유도된 급성 폐 손상에서 사이토카인 유도된 호중구 화학유인제의 통계적으로 유의한 감소를 야기하였다(표 25). PBS만을 기관 내 수용한 정상 대조군 래트에서 CINC-3의 수준은 거의 0이었다. 대조적으로, 담체 비히클으로 처리된 기관 내 LPS-유도된 급성 폐 손상 래트는 563.7 ± 172.9 pg/mL의 CINC-3의 평균 폐 균질물 수준을 나타내었다. 이 수준은 500 mg/kg 알로에-기반 조성물(UP360)로 처리된 래트의 경우 280.92 ± 137.84 pg/mL의 평균 값으로 감소되었다. 500 mg/kg의 알로에-기반 조성물(UP360)로 처리된 래트에 대한 CINC-3 수준의 이러한 50.2% 감소는 비히클-처리된 질병 모델과 비교할 때 통계적으로 유의하였다. 더 낮은 용량의 알로에-기반 조성물(UP360)은 비히클 대조군과 비교할 때 CINC3 수준의 중간(즉, 27.6%) 감소를 초래하였다. 소듐 부티레이트(SB) 그룹만이 비히클-처리된 래트와 비교하여 폐 균질물 CINC-3 수준이 약간(즉, 17.7%) 감소하였다.
표 25: 폐 균질물 MIP-2/CINC-3 활성 수준에 대한 알로에-기반 조성물(UP360)의 효과
Figure pct00026
실시예 28: 알로에-기반 조성물(UP360)은 기관지-폐포 세척(BAL)에서 총 단백질을 감소시켰다
실시예 23으로부터의 기관지-폐포 세척(BAL) 샘플 중 총 단백질의 양을 다음과 같이 ThermoFisher Scientific의 Pierce BCA 단백질 검정 키트(제품#: 23225)를 사용하여 측정하였다: BAL을 1:5로 희석하고, 마이크로플레이트에서 바이신코닌산(BCA) 시약과 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 흡광도는 580 nm에서 판독되었고, BAL의 단백질 농도는 소 혈청 알부민 표준 곡선의 흡광도 판독 값에 기초하여 계산되었다.
정상 대조군 래트에 비해 비히클로 처리된 LPS-유도된 급성 폐 손상 래트에서 BAL로부터의 폐 총 단백질 수준의 3배 증가가 발견되었다. 500 mg/kg 및 250 mg/kg의 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360(실시예 9에서 제조된 UP360)을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물로 1주일 동안 래트의 매일 경구 처리는 비히클-처리된 LPS-유도된 급성 폐 손상 래트와 비교할 때 BAL 총 단백질의 함량의 각각 40.1%(p=0.12 vs 비히클) 및 38.3%(p=0.17) 감소를 초래하였다(표 26). 양성 대조군 소듐 부티레이트(SB) 그룹은 비히클-처리된 LPS-유도된 급성 폐 손상 래트에 비해 BAL 총 단백질 수준의 30.2%(p=0.27) 감소를 가졌다.
표 26: BAL 단백질 수준에 대한 알로에-기반 조성물(UP360)의 효과.
Figure pct00027
실시예 29: 알로에-기반 조성물(UP360)은 기관지-폐포 세척(BAL)에서 C 반응성 단백질의 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다
1:1,000 희석된 래트 BAL에서 C 반응성 단백질(CRP)의 존재는 다음과 같이 Abcam의 C 반응성 단백질(PTX1) 래트 ELISA 키트(제품#: ab108827)를 사용하여 측정되었다: 1:1,000 희석된 BAL을 CRP 항체로 코팅된 마이크로플레이트에 첨가하였다. 실온에서 플레이트 진탕기에서 2시간 후, BAL 중 CRP를 플레이트에 결합시키고 플레이트를 완전히 세척하였다. 비오티닐화된 C 반응성 단백질 항체를 플레이트에 첨가하고 실온에서 플레이트 진탕기에서 1시간 동안 결합시켰다. 세척을 반복하고, 스트렙타비딘-퍼옥시다제 컨쥬게이트를 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세척을 반복하고, 색소원 기질을 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 현상한 후, 정지 용액을 첨가하고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. CRP의 농도는 CRP 표준 곡선의 흡광도 판독 값에 기초하여 계산되었다.
정상 대조군 래트에 비해 비히클로 처리된 LPS-유도된 급성 폐 손상 래트에서 BAL CRP 수준의 통계적으로 유의한 5.6배 증가가 관찰되었다. 500 mg/kg의 실시예 9에서 제조된 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물로 1주일 동안 래트의 경구 처리는 비히클-처리된 질병 모델에 비해 BAL CRP의 수준을 38.2%만큼 감소시켰다(p=0.06)(표 27). 양성 대조군 소듐 부티레이트(SB) 및 저 용량의 UP360 그룹은 비히클-처리된 질병 래트에 비해 CRP 수준의 최소 변화를 초래하였다.
표 27: BAL CRP 수준에 대한 알로에-기반 조성물(UP360)의 효과
Figure pct00028
실시예 30: 알로에-기반 조성물(UP360)은 기관지-폐포 세척에서 IL-10의 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다
실시예 23의 희석되지 않은 기관지-폐포 세척(BAL) 샘플 중 IL-10의 존재는 다음과 같이 R&D Systems의 래트 IL-10 Quantikine ELISA 키트(제품#: R1000)를 사용하여 측정되었다: 희석되지 않은 BAL을 IL-10 항체로 코팅된 마이크로플레이트에 첨가하였다. 실온에서 2시간 후, 혈청 중 IL-10을 플레이트에 결합시키고 플레이트를 완전히 세척하였다. 효소-컨쥬게이션된 IL-10 항체를 플레이트에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 결합시켰다. 세척을 반복하고, 효소 기질을 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 현상한 후, 정지 용액을 첨가하고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. IL-10의 농도는 IL-10 표준 곡선의 흡광도 판독 값에 기초하여 계산되었다.
항염증성 IL-10 수준은 유도 전 7일 동안 500 mg/kg 및 250 mg/kg의 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360(실시예 9에서 제조된 UP360)을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물의 매일 경구 처리 후 LPS의 기관 내 점적 24시간 후에 희생된 질병 래트의 BAL에서 측정되었다. 종종, IL-10의 수준은 감염 또는 손상 시점에 감염의 중증도 및 숙주에 의한 염증 반응 요구에 상응한다. 표 28에 나타낸 바와 같이, IL-10의 수준은 비히클-처리된 래트에 대해 유의하게 증가(즉, 정상 대조군 래트에 비해 80배)된 것으로 밝혀졌으며, 이는 급성 폐 손상의 높은 중증도를 나타낸다. 대조적으로, 다당류 및 폴리페놀(UP360) 그룹을 포함하고, 일부 경우에, 이로 구성된 알로에-기반 조성물의 래트는 BAL에서 IL-10의 용량-상관적인 감소를 나타내었다. 이러한 감소는 500 mg/kg 및 250 mg/kg의 알로에-기반 조성물(UP360)에 대해 각각 73.2% 및 41.0%로 계산되고 결정되었다. 감소는 알로에-기반 조성물(UP360)의 고 용량(500 mg/kg)에 대해 p ≤ 0.05로 통계적으로 유의하였다. 적어도 이 특정 모델의 경우, 알로에-기반 조성물(UP360) 처리의 결과로서 항염증성 사이토카인의 감소는 질병 중증도의 완화로 인해 숙주에 의한 염증 반응에 약화 효과가 있을 수 있다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 이 가설을 강화함으로써, 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 경우에, 이로 구성된 알로에-기반 조성물(UP360)은 강력한 염증 반응을 발생시키는 IL-1β, IL-6 및 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 통계적으로 유의한 감소를 야기하여, IL-10과 같은 항염증성 사이토카인의 필요성을 숙주에 대해 덜 중요하게 만든다. 실제로, IL-10의 수준은 정상 대조군의 경우 거의 0이었고, 이는 항염증성 사이토카인의 유도가 급성 폐 손상의 존재 및/또는 중증도에 기초함을 시사한다.
표 28: BAL IL-10 수준에 대한 알로에-기반 조성물(UP360)의 효과
Figure pct00029
실시예 31. 알로에-기반 조성물(UP360)은 폐 부종 및 전체 폐 손상 중증도를 감소시켰다
실시예 23에서 기관 내 LPS의 결과로서 폐 손상의 중증도는 H&E 염색된 폐 조직을 사용하여 평가되었다. 폐의 좌엽은 조직병리학 분석에 사용되었다. 하기 표 29 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 비히클-처리된 그룹의 래트는 폐 손상(3.5배 증가), 폐 부종(2.5배 증가) 및 다형핵(PMN/PMC) 세포 침윤(2.4배 증가)의 중증도에서 통계적으로 유의한 증가를 나타내었다. 500 mg/kg의 고 용량의 알로에-기반 조성물(실시예 9에서 제조된 UP360)로 1주일 동안 래트의 매일 경구 처리는 비히클-처리된 LPS-유도된 급성 폐 손상 래트와 비교할 때 전체 폐 손상 중증도에서 통계적으로 유의한 37.9% 감소를 초래하였다(표 29, 도 2). 유사하게, 비히클-처리된 래트와 비교할 때 고 용량의 알로에-기반 조성물(UP360)에 대해 강력하고 통계적으로 유의한 폐 부종의 감소(37% 감소)가 관찰되었다. 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 경우에, 이로 구성된 고 용량의 알로에-기반 조성물(UP360)로 처리된 래트에 대해 PMN 침윤 감소의 긍정적인 경향이 또한 관찰되었다. 양성 대조군인 소듐 부티레이트(SB) 그룹은 비히클-처리된 질병 래트에 비해 조직병리학 평가의 최소 변화를 초래하였다.
표 29: 래트에서 급성 폐 손상으로부터 알로에-기반 조성물(UP360)에 대한 조직병리학 데이터
Figure pct00030
*P≤0.05; **P≤0.001; ***P≤0.00001; SB-소듐 부티레이트; PMN-다형핵 세포
a 전체 중증도: Norm, mim-약간, mod, 심함, ext. 심함. 국소, m-국소, 지역, reg. ext 융합, 미만성, 점수 0-4. b 급성 삼출성 변화: alv, duct & bronch, alv wall & Int 부종, 울혈, 출혈 perivasc, alv sac, 부종, fibr exud, hemorr alv sac, alv duct thicken dt Hyal 막 유형 I 손실, 아폽토틱 세포, 특정 파라미터 점수 0-4. c 염증성 침윤 단계: Neutr, 기타 다형체 MNC 주로 histiocyt & 대식세포. BALT alv, 간질, alv-duct, bronchiole 확산, 패치 세포 consol, 특정 파라미터 점수 0-4.
실시예 32: 내인성 및 외인성 공격 트리거 반응으로서 D-갈락토스-유도된 가속화 면역노화 노화 모델
D-갈락토스의 전신 투여는 노화된 마우스와 유사하게 챌린지시에 면역 반응에 영향을 미치는 가속화된 면역 세포 노화를 유도한다. 이러한 현상은 노인의 면역 반응 프로파일을 모방하는 것으로 추정된다. 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 신규한 고려되는 주제(실시예 9에서 제조된 UP360)는 면역-자극 효과를 입증하기 위해 이 실험적으로 노화된 마우스 모델에서 시험되었다. 목적으로-사육된 CD-1 마우스(12주령)를 구입하여 2주 순응 후 가속화된 노화 연구에 사용하였다. 마우스를 4개의 면역된 그룹 및 3개의 면역되지 않은 그룹에 무작위로 할당하였다. 면역된 그룹은 G1 = 정상 대조군 + 비히클(0.5% CMC), G2 = D-갈락토스 + 비히클, G3 = D-갈락토스 + UP360 400 mg/kg 및 G4 = D-갈락토스 + UP360 200 mg/kg을 포함하였다. 면역되지 않은 처리 그룹은 G1 = 정상 대조군 + 비히클(0.5% CMC), G2 = D-갈락토스 + 비히클 및 G3 = D-갈락토스 + UP360 400 mg/kg을 포함하였다. 면역된 세트에 대해 각 처리 그룹에 10마리의 동물이 할당된 반면, 면역되지 않은 세트에 대해 각 그룹에 8마리의 동물이 포함되었다.
마우스에게 500 mg/kg의 D-갈락토스를 9주 동안 매일 피하 주사하여 노화를 유도하였다. 유도 4주차에, 0.5% CMC에 현탁된 2개 용량의 UP360(200 mg/kg-저 용량 및 400 mg/kg-고 용량)의 경구 처리가 시작되었다. 400 mg/kg의 UP360의 한 추가 그룹은 면역되지 않은 마우스에 대한 대조군으로서의 사용을 위해 포함되었다. 7주차에, 면역되지 않은 그룹의 마우스를 제외한 각 마우스에 3 μg의 Fluarix 4가 IM(GSK의 2020-2021 인플루엔자 시즌 백신)을 주사하였다. 이는 0.5 mL 단일 인간 용량당 60 μg 헤마글루티닌-HA를 함유하였다. 백신은 단일 용량의 면역화를 위해 H1N1, H3N2, B-빅토리아 계통 및 B-야마가타 계통과 같은 15 μg의 4개의 인플루엔자 균주 각각을 함유하도록 제형화되었다.
4주 내지 9주 동안 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 경우에, 이로 구성된 UP360의 매일 경구 위내투여를 수행하였다. 부검시(즉, 면역화 14일 후), 전혈(1 mL)을 수집하고 분취하였고 - 유세포 분석 면역 패널의 경우 110 μL(얼음 위에서 Flow Contract Site Laboratory, Bothell, WA에 전달됨), 혈청을 항체 ELISA 및 효소 검정(Unigen, Tacoma WA)을 위해 나머지 혈액으로부터 분리하고(약 400 μL 혈청 수율), 60 μL을 사이토카인 분석을 위해 2개의 튜브에 넣어 Fedex를 통해 Sirona DX, Portland, OR로 운송하였다. 각 동물에 대한 흉선 및 비장의 중량을 측정하여 흉선 및 비장 지수를 결정하였다. 흉선 및 비장의 대표적인 이미지를 각 그룹에서 촬영하였다. 부검시 비장은 드라이 아이스에 보관되었고 추후 사용을 위해 -80℃로 옮겼다. 파라포름알데하이드 및 수크로스-고정된 흉선은 노화 관련 β-갈락토시다제 염색 및 분석을 위해 Nationwide histology으로 보내졌다.
실시예 33: UP360은 흉선 지수를 통계적으로 유의하게 증가시켰다
마우스에게 D-갈락토스를 반복적으로 피하 투여하면 정상적인 노화 과정에서 발생하는 변화와 유사한 불량한 면역 반응이 생성된다. 흉선은 D-gal에 만성적으로 노출되면 영향을 받는 가장 중요한 면역 기관 중 하나이다. 흉선 지수는 신체의 면역 기능의 강도를 나타내는 좋은 지표이다. 더 높은 흉선 지수는 더 강한 비특이적 면역 반응에 상응한다. 면역된 마우스에서, 비히클로 처리된 D-gal 마우스는 정상 대조군 마우스에 비해 흉선 지수의 유의한 감소(54.5%)를 나타내었다. 흉선 지수의 이러한 감소는 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 UP360의 두 투여량 모두에 의해 역전되었다. 400 mg/kg 및 200 mg/kg의 UP360으로 경구 처리된 마우스는 비히클-처리된 D-gal 그룹과 비교하여 각각 52.9% 및 50.6%의 흉선 지수의 증가를 나타내었다. 이러한 역전은 UP360의 두 용량 모두에 대해 비히클 처리된 D-gal 마우스와 비교하여 통계적으로 유의하였다. 유사하게, 400 mg/kg의 UP360으로 처리된 면역되지 않은 마우스는 또한 흉선 지수에서 통계적으로 유의한 증가를 나타내었다. 이러한 증가는 비히클 처리된 D-gal 마우스와 비교할 때 26.9%인 것으로 밝혀졌다. 이 연구에서 관찰한 바로는, 면역화 상태에 관계없이, UP360 보충은 연령-관련 흉선 퇴화로부터 마우스를 보호하는 것으로 보였다.
표 30: 흉선 보호를 위한 생체 내 처리 그룹
Figure pct00031
실시예 34: UP360 보충은 건강한 비장 지수의 회복 경향을 보여주었다
비장은 면역계의 또 다른 중요한 기관이며, 그 지수는 건강한 면역 기능에 필수적이다. 500 mg/kg의 D-갈락토스 주사는 본 연구에서 면역된 마우스의 비장 지수를 통계적으로 유의하게 25.4% 감소시켰다. 면역되지 않은 마우스는 비장 지수의 16.3% 감소를 나타내었다.
면역되고 면역되지 않은 그룹에서 400 mg/kg 및 면역된 그룹에서 200 mg/kg의 UP360으로 경구 처리된 마우스에 대해 비장 지수의 최소 내지 중간 증가가 관찰되었다. 이러한 개선은 통계적 유의성에 도달하지 못했지만, UP360 처리는 비장 지수의 증가에 의해 입증된 바와 같이 조직 위축을 억제하는 경향을 나타내었다.
표 31: 비장 보호를 위한 생체 내 처리 그룹
Figure pct00032
실시예 35: UP360 보충은 연령-관련 흉선 퇴화로부터 마우스를 보호하였다
부검시, 흉선을 각 마우스로부터 절개하고, 미리 냉각된 파라포름알데하이드에 24시간 동안 고정한 후 추가로 24시간 동안 30% 수크로스 용액으로 옮겼다. 이어서, 고정된 조직을 액체 질소에서 스냅 동결시키고 분석을 위해 드라이 아이스에 포장된 상태로 Nationwide histology로 운송하였다. 조직을 동결방지제에서 급속 동결시키고 10-마이크론 두께로 Superfrost Plus 슬라이드에 상에서 절개하였다. 이어서, 조직을 PBS에서 세정하고 Cell Signaling Technologies의 β-갈락토시다제 염색 키트에 대한 프로토콜을 따랐다. 대비를 위해 밝은 에오신 대조염색을 추가하고 슬라이드를 비수성 장착 매질로 장착하였다. 이어서, 노화 세포를 사분면에서 계수하여 양성 세포의 전체 백분율을 결정하였다. cellSens Standard 1.9 소프트웨어로 동작하는 Olympus DP26 카메라가 구비된 Olympus BH2, Nikon Eclipse 800 현미경을 세포 계수 및 이미징에 사용하였다.
SA-β-gal 염색은 각 흉선에서 노화 세포를 검출하여 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 UP360의 면역 기관 보호 효과를 평가하였다. SA-β-Gal 양성 세포는 청색으로 염색되고(고 노화-특이적 β-갈락토시다제를 발현함) 피질과 수질 전체에 무작위로 산재되어 있는 것으로 밝혀졌다. 더 낮은 용량의 UP360 흉선 조직학에 대해 관찰된 변화는 흉선 지수 데이터와 일치하였다. 표 32에 나타낸 바와 같이, UP360(200 mg/kg)으로 처리된 면역된 마우스는 비히클-처리된 D-gal 마우스와 비교할 때 노화 세포의 비율에서 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다. 이러한 발견은 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 신규한 조성물 UP360의 면역 세포 및/또는 기관 보호 능력을 추가로 확인하였다. D-gal의 피하 투여는 정상 대조군 마우스에 비해 노화 세포를 157.8% 증가시킨 반면, 200 mg/kg의 UP360으로 처리된 마우스는 비히클-처리된 D-gal 마우스의 것과 비교하여 노화 세포를 42.7% 감소시켰다.
표 32: 노화 세포의 변화에 대한 생체 내 처리 그룹
Figure pct00033
실시예 36: 알로에-기반 조성물 UP360은 D-gal-유도된 혈청 IgA를 증가시켰다
연구의 끝에 혈청을 수집하고 IgG를 포함하는 체액성 면역의 마커에 대해 평가하였다. 면역된 대조군은 IgA 항체 수준에 대해 면역되지 않은 대조군과 유의하게 다르지 않았다. D-gal + 200 mg/kg UP360 그룹은 D-gal 그룹보다 높은 경향을 보인 반면(p = 0.06), D-gal + 400 mg/kg UP360 그룹은 D-gal 그룹보다 유의하게 더 높은 혈청 IgA를 가졌다.
표 33: UP360으로 처리된 D-gal 유도된 마우스 혈청에서 IgA 항체
Figure pct00034
실시예 37: CD45+ 세포(백혈구)에 대한 알로에-기반 조성물 UP360의 효과
연구가 시작된지 9주 후에, 전체 마우스 혈액을 수집하여 일반적으로 백혈구의 집단, 및 구체적으로 면역 세포의 서브집단을 평가하였다. 데이터는 특정 마커에 대해 양성인 세포의 백분율로서, 및 혈액 μL 당 세포로서(Alvarez DF)(Vera EJ), 두 가지 방법을 사용하여 분석되었다. D-gal-처리된 마우스는 높은 수준의 CD45+ 세포(백혈구)를 가졌기 때문에, CD45+ 세포의 백분율로 보고된 결과는 혈액 μL 당 세포로서 보고된 결과와 다른 결과를 강조하였다. 두 데이터 세트 모두는 면역 부스터로서 UP360의 성능에 대해 알려준다.
표 34: 전체 마우스 혈액에서 CD45+ 세포 백혈구
Figure pct00035
적혈구를 전혈에서 제거한 후, 7-아미노-액티노마이신 D를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하고 CD45를 사용하여 백혈구를 표시하였다. 표 34는 각 그룹의 살아있는 세포 집단 중 CD45+ 세포(백혈구)의 양을 보여준다. 면역된 대조군은 면역되지 않은 대조군과 비교하여 백혈구의 백분율이 현저히 감소하였고, 이는 인플루엔자 백신 접종시 다른 세포 유형의 확장을 잠재적으로 입증한다. 면역된 대조군과 비교하여, D-gal 그룹은 살아있는 세포 집단에 대한 혈액 내 백혈구의 백분율이 상당히 높았고, 이는 200 mg/kg UP360 + D-gal 그룹(UP360 저)에서 대조군 수준으로 감소되었다.
실시예 38: 전혈에서 CD3+ T-세포에 대한 알로에-기반 조성물의 효과(림프구 집단의 %)
CD3+ CD45+ 세포는 T 세포 집단이다. 모든 백혈구(CD45+ 세포)의 백분율로 표현하면, 인플루엔자 백신 접종 2주 후, 면역되지 않은 대조군과 비교하여 면역된 대조군 동물에서 순환하는 T 세포의 감소 경향이 있음을 발견하였다(p=0.07). 400 mg/kg UP360 + D-gal로 처리된 면역된 동물은 D-gal 그룹보다 상당히 더 높은 백분율의 순환하는 T 세포를 가졌는데, 이는 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 UP360이 인플루엔자 백신 접종에 대한 반응으로 CD3+ T 세포 확장 또는 분화를 증가시켰음을 나타낸다.
표 35: 전체 마우스 혈액에서 CD3+ T 세포
Figure pct00036
실시예 39: 전혈에서 CD4+ 헬퍼 T-세포에 대한 알로에-기반 조성물의 효과(림프구 집단의 %)
CD45+ CD3+ CD4+ 세포는 항원-제시 세포에서 항원을 인식하고 세포 분열 및 사이토카인 분비에 반응하는 세포인 헬퍼 T 세포이다. 모든 백혈구(CD45+ 세포)의 백분율로 표현하면, 인플루엔자 백신 접종 2주 후, 200 및 400 mg/kg UP360 + D-gal로 처리된 면역된 동물은 D-gal 그룹보다 상당히 더 높은 백분율의 순환하는 헬퍼 T 세포를 가졌음이 발견되었는데, 이는 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 UP360이 인플루엔자 백신 접종에 대한 반응으로 헬퍼 T 세포 확장 또는 분화를 증가시켰음을 나타낸다.
표 36: 전체 마우스 혈액에서 CD3+ CD4+ 헬퍼 T 세포.
Figure pct00037
실시예 40: 전혈에서 CD8+ 세포독성 T-세포에 대한 알로에-기반 조성물의 효과(림프구 집단의 %)
CD45+ CD3+ CD8+ 세포는 감염된 세포를 죽이기 위해 세포 분열 및 아폽토시스-촉진 효소의 분비와 함께 면역 챌린지에 반응하는 세포인 세포독성 T 세포이다. 모든 백혈구(CD45+ 세포)의 백분율로 표현하면, 인플루엔자 백신 접종 2주 후, 200 및 400 mg/kg UP360 + D-Gal로 처리된 면역된 동물은 D-gal 그룹보다 더 높은 백분율의 순환하는 세포독성 T 세포를 향한 경향, 및 면역되지 않은 대조군보다 면역된 대조군 및 면역되지 않은 D-gal 그룹에서 상당히 더 낮은 백분율의 순환하는 세포독성 T 세포를 가졌음이 발견되었다.
표 37: 전체 마우스 혈액에서 CD3+ CD8+ 세포독성 T 세포.
Figure pct00038
실시예 41: 전혈에서 NKp46+ 자연 살해 세포에 대한 알로에-기반 조성물의 효과(림프구 집단의 %)
본 발명자들은 백혈구 집단에서 자연 살해 세포의 백분율을 확인하기 위해 2개의 상이한 자연 살해 세포 마커로서 마우스 CD49b 및 NKp46을 사용하였다. 자연 살해 세포는 선천성 면역계에 관여한다. 활성화되면, 이들은 사이토카인 및 과립을 분비하여 면역 세포를 동원하고 병원체에 감염된 세포에서 세포 사멸을 직접 유발하므로, 병원체에 대한 즉각적인 면역 반응에 중요하며 전신 감염 초기에 활성화된다. CD49b는 대부분의 자연 살해 세포, 및 또한 자연 살해 T(NKT) 세포일 수 있는 T 세포의 서브세트에 특이적으로 존재하는 인테그린이다. NKp46은 자연 살해 세포에만 존재하고 NKT 세포를 표시하지 않는 자연 세포독성 수용체이다. NK는 일반적으로 CD45+ CD3- CD49b+ NKp46+이기 때문에(Goh W)(Narni-Mancinelli E), NKT 및 NK-유사 T 세포는 또한 이들의 CD3 발현에 기초하여 제외된다.
모든 백혈구(CD45+ 세포)의 백분율로 표현하면, 인플루엔자 백신 접종 2주 후, 어떤 그룹에서도 CD3- CD49b+ 집단에 유의한 차이가 없음을 발견하였다. 그러나, 본 발명자들이 CD3- NKp46+ 집단을 살펴봤을 때, D-gal로 처리된 면역된 동물은 면역된 대조군보다 상당히 더 낮은 백분율의 자연 살해 세포를 가졌고, 면역된 200 및 400 mg/kg UP360 + D-gal-처리된 그룹 둘 모두는 면역된 D-gal 그룹보다 상당히 더 높은 백분율의 순환하는 자연 살해 세포를 가졌다. 면역되지 않은 400 mg/kg UP360 + D-gal 그룹은 또한 면역되지 않은 D-gal 그룹보다 상당히 더 높은 백분율의 순환하는 자연 살해 세포를 가졌다.
표 38: 전체 마우스 혈액에서 CD3- NKp46+ 자연 살해 세포.
Figure pct00039
이러한 결과는 2개의 자연 살해 세포 마커가 크게 다른 결과를 제공했기 때문에 혼란스러웠다. 자연 살해 세포 마커는 마우스 균주에 따라 크게 다르다. NKp46은 대부분의 마우스 균주에서 자연 살해 세포에 매우 특이적인 마커이고, CD49b는 다른 세포 유형을 표시할 수 있기 때문에, NKp46이 더 신뢰할 수 있다. 그러나, 말초 혈액(Angelo LS)에서 인간 NK 수에 더 가깝게 정렬되는 CD49b에 비해, CD45+ 세포 중 NK 세포의 백분율은 NKp46에 대해 높다. 말초 마우스 혈액의 NK 세포는 인간과 유사할 수 있거나, NKp46에 대해 검출된 만큼 높을 수 있다.
실시예 42: 전혈에서 TCRγδ+ 감마 델타 T-세포에 대한 알로에-기반 조성물의 효과(림프구 집단의 %)
CD45+ CD3+ TCRγδ+ 세포는 감마 델타 T 세포이며, 다양한 활성을 갖고 선천성 및 적응 면역 반응 모두에 영향을 미칠 수 있는 작은 T 세포 집단이다. 이들은 점막에 국한되어 병원체에 대한 1차 방어선을 유발하고 적응성 면역 반응을 증가시키는데 도움이 된다.
표 39: 전체 마우스 혈액에서 CD3+ TCRγδ+ 감마 델타 T 세포
Figure pct00040
모든 T 세포(CD3+ 세포)의 백분율로 표현하면, 인플루엔자 백신 접종 2주 후, 200 mg/kg UP360 + D-gal로 처리된 면역된 동물은 D-gal 그룹보다 상당히 더 높은 백분율의 순환하는 감마 델타 T 세포를 가졌고, 400 mg/kg UP360 + D-gal 그룹은 D-gal보다 더 높은 백분율의 순환하는 감마 델타 T 세포를 향한 경향을 가졌다. 이는 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 UP360으로 처리된 그룹이 점막에서 마주친 병원체에 대한 면역 반응을 더 잘 수행할 수 있음을 나타낼 수 있다.
실시예 43: 전혈에서 CD45+ 림프구에 대한 알로에-기반 조성물의 효과(세포/μL)
본 발명자들은 또한 전혈의 μL 당 세포로서 면역되지 않은 마우스 및 인플루엔자-백신 접종된 마우스 그룹으로부터의 전혈의 세포 집단을 분석하였다. 이러한 데이터는 이들 마커에 대해 양성인 세포의 백분율당 표현된 데이터를 혼동시킬 수 있는 CD45+ 세포 및 CD3+ 세포의 차이를 고려하지 않고 면역 세포 집단을 나타낸다. 일반적으로, 이러한 방식으로 데이터를 분석하여 얻은 유의한 차이는 면역된 그룹 대신에 면역되지 않은 마우스 그룹에 속한다는 것을 발견하였다.
표 40: 전체 마우스 혈액에서 CD45+ 백혈구
Figure pct00041
혈액 μL 당 CD45+ 세포는 면역되지 않은 마우스 그룹 및 면역된 마우스 그룹 간에 유의한 차이가 없었지만, 면역되지 않은 D-gal 단독보다 면역되지 않은 400 mg/kg UP360+ D-gal 그룹에서 더 많은 수의 CD45+ 세포가 있었다.
실시예 44: 전혈에서 CD3+ T 세포, CD4+ 헬퍼 T 및 CD8+ 세포독성 T 세포에 대한 알로에-기반 조성물의 효과(세포/μL)
D-gal 면역되지 않은 그룹과 비교하여, 면역되지 않은 400 mg/kg UP360 + D-gal 그룹은 전혈의 μL 당 상당히 더 높은 CD3+ 세포를 가졌다. CD3+ CD4+ 헬퍼 T 세포 및 CD3+ CD8+ 세포독성 T 세포에 대해서도 동일한 증가가 관찰되었다. 이러한 발견은 D-gal 단독 그룹에 비해 UP360 + D-gal 면역되지 않은 그룹에서 일반적으로 더 높은 수준의 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포 및 T 세포를 나타내며, 이는 UP360-처리된 그룹에서 더 나은 면역 감시 및 "준비"를 나타낼 수 있다.
표 41: 전체 마우스 혈액에서 CD3+ T 세포
Figure pct00042
표 42: 전체 마우스 혈액에서 CD3+ CD4+ 헬퍼 T 세포
Figure pct00043
표 43: 전체 마우스 혈액에서 CD3+ CD8+ 세포독성 T 세포
Figure pct00044
실시예 45: 전혈에서 CD49b+ 자연 살해 세포에 대한 알로에-기반 조성물의 효과(세포/μL)
자연 살해 세포를 검출하기 위해 사용된 2개의 마커는 유사한 결과를 제공하였는데, 이는 CD49b+ NK 세포의 증가를 향한 경향 및 면역되지 않은 D-gal 단독에 비해 면역되지 않은 400 mg/kg U360+ D-gal 그룹에서 NKp46+ NK 세포의 현저한 증가를 나타내었다. 각 마커에 대한 세포 수는 이전에 분석된 CD45+ 세포의 백분율 변화와 유사하게 크게 달라졌다. 두 마커 모두는 면역되지 않은 D-gal 단독과 비교하여 면역되지 않은 UP360 + D-gal 그룹에서 NK 세포의 풍부화를 나타내었고, 이는 UP360-처리된 그룹에서 면역 감시 및 면역 "준비"의 또 다른 표시일 수 있다.
표 44: 전체 마우스 혈액에서 CD3- CD49b+ 자연 살해 세포
Figure pct00045
표 45: 전체 마우스 혈액에서 CD3- NKp46+ 자연 살해 세포
Figure pct00046
실시예 46: 전혈에서 Ly6C+ 과립구에 대한 알로에-기반 조성물의 효과(세포/μL)
μL 당 CD3- Ly6C+ 과립구는 처리 그룹과 D-gal 그룹 간에 유의한 차이가 없었다. 면역되지 않은 대조군과 비교하여 면역되지 않은 D-gal 그룹 및 면역되지 않은 400 mg/kg UP360 + D-gal 그룹에서 과립구가 현저하게 증가하였고, 면역된 D-gal 및 대조군과 비교하여 면역된 UP360 + D-gal 그룹에서 μL 당 과립구 수가 감소하는 경향이 있었다. 면역되지 않은 400 mg/kg UP360 + D-gal 그룹과 비교하여 면역된 400 mg/kg UP360 + D-gal 그룹에서 과립구의 통계적으로 유의한 감소가 있었다.
표 46: 전체 마우스 혈액에서 CD3- Ly6C+ 과립구
Figure pct00047
실시예 47: 전혈에서 B220+ B 세포에 대한 알로에-기반 조성물의 효과(세포/μL)
CD3- B220+ B 세포는 전혈 μL 당 세포로 나타낸 바와 같이 치료 그룹 간에 유의한 차이가 없었으나, 면역되지 않은 D-gal 단독과 비교하여 면역되지 않은 400 mg/kg UP360 + D-gal 그룹에서 B 세포가 증가하는 경향이 있었다.
표 47: 전체 마우스 혈액에서 CD3- B220+ B 세포
Figure pct00048
실시예 48: 전혈에서 TCRγδ+ 감마 델타 T 세포, CD4+ TCRγδ+ 감마 델타 헬퍼 T 세포, CD8+ TCRγδ+ 감마 델타 세포독성 T 세포에 대한 알로에-기반 조성물의 효과(세포/μL)
전혈 μL 당 CD3+ TCRγδ+ 감마 델타 T 세포는 면역되지 않은 D-gal 단독에 비해 면역되지 않은 400 mg/kg UP360+ D-gal 그룹에서 증가하였다. 이는 CD3+ CD4+ TCRγδ+ 헬퍼 감마 델타 T 세포 집단에 대해서도 발견되었다. CD3+ CD8+ TCRγδ+ 세포독성 감마 델타 T 세포 집단에서는 유의한 차이가 없었다. 이러한 발견은 점막의 T 세포 집단에서 면역 감시 및 면역 "준비"의 증가를 나타내었다.
표 48: 전체 마우스 혈액에서 CD3+ TCRγδ+ 감마 델타 T 세포
Figure pct00049
표 49: 전체 마우스 혈액에서 CD3+ CD4+ TCRγδ+ 감마 델타 헬퍼 T 세포
Figure pct00050
표 50: 전혈에서 CD8+ TCRγδ+ 감마 델타 세포독성 T 세포(세포/μL)
Figure pct00051
실시예 49: 알로에-기반 조성물은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)를 상당히 증가시켰다
D-gal이 노화 표현형을 유발하는 메커니즘은 자유 라디칼, 특히 고급 당화 최종 생성물의 생성을 통한 것이다. 본 발명자들은 UP360이 마우스 모델(Azman KF)의 이러한 양태에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 항산화 효소 농도 및 자유 라디칼 수준을 측정하고자 하였다.
표 51: 마우스 혈청 샘플의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 함량
Figure pct00052
슈퍼옥사이드 디스뮤타제는 산소 라디칼을 중화시켜 세포 구조, 단백질 및 핵산에 대한 산화 손상을 방지한다. 활성 산소 종은 면역 신호전달(Ighodaro OM)을 위한 이차 메신저로 사용된다. 항산화 효소의 발현 증가는 과잉 활성 산소 종을 중화시키는 능력을 나타낸다. 본 발명자들은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 효소 수준에 대해 면역된 마우스 혈청 샘플을 시험하였고 UP360 + D-Gal 그룹이 D-Gal 그룹보다 상당히 더 높은 수준의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제를 가졌음을 발견하였다.
실시예 50: Nrf2의 단백질 발현에 대한 알로에-기반 조성물의 효과
Nrf2는 산화 스트레스 조건에서 활성화되고 항산화 반응에 관여하여 상향 조절되는 전사 인자이다. 장기간의 면역계 활성화 또는 산화 스트레스는 Nrf2의 상향 조절을 유발한다. 비장 균질물을 SDS-PAGE에서 진행시키고, 옮기고, 언급된 단백질에 대해 블롯팅하였다. 밴드 강도는 밀도계에 의해 측정되고 β-액틴 로딩 대조군에 대해 각 관심 단백질에 대해 정규화되었다. 각 관심 단백질의 반-정량화를 각 그룹에 대해 비교하였고, 면역된 200 mg/kg UP360 + D-gal 및 400 mg/kg UP360 + D-gal 그룹이 D-gal 단독보다 유의하게 더 높은 Nrf2를 가졌음을 발견하였는데, 이는 UP360 그룹에서 항산화 경로 활성화의 증가를 나타낸다.
표 52: 대조군과 비교하여 β-액틴으로 정규화된 면역된 마우스 비장 균질물의 Nrf2 단백질 수준
Figure pct00053
실시예 51: 산화 스트레스 및 폐 감염 유도된 마우스 사망률 및 급성 염증성 폐 손상의 완화에 대한 알로에-기반 조성물(UP360)의 효과
실시예 9에서 제조된 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물의 사망률에 대한 효과는 과산소 및 미생물(슈도모나스 에어루기노사(PA)) 감염 유도된 마우스를 사용하여 평가되었다.
유도 전 1주일 동안 마우스를 순응시켰다. UP360이 동물 사망률을 감소시키고 생존을 증가시킬 수 있는지를 조사하기 위해, 마우스를 7일 동안 UP360으로 처리한 후 과산소(72시간 동안 >90% 산소)에 노출시키고 PA로 접종하기 전에 이렇게 3일 동안 계속하였다. 박테리아 접종 후 48시간 동안 마우스를 관찰하였다. 과산소에 대한 사전 노출은 마우스가 실온(RA, 표 53)에 남아 있는 것과 비교하여 상당히 더 높은 사망률(O2)을 발생시켰다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 PA 접종 전 48시간 동안 과산소에 노출된 마우스에서 PA 접종 24시간 후 실질적인 사망이 있음을 예기치 않게 발견하였다. 실온(RA)에 남아 있고 동일한 양의 PA를 수용한 마우스의 9%의 사망률과 비교하여, PA 접종 전 2일 동안 과산소로 처리된 마우스에서 64%의 사망률이 관찰되었다. 반면, 2일 동안 과산소에 노출되기 전 7일 동안 레스베라트롤(RES) 및 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 UP360으로 예방적으로 처리되고 그 후 PA 접종된 마우스는 접종 24시간 후에 각각 27% 및 31%의 사망률을 가졌다. 이러한 결과는 UP360이 동물 사망률을 감소시키는데 있어서 개선된 이점을 제공함을 시사한다. 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물에 대해 관찰된 이러한 생존 데이터는 UP360 보충이 동물의 사망률의 통계적으로 유의한 감소를 초래한 실시예 20-22에서의 LPS 유도된 생존 연구에 기록된 데이터와 일치한다.
표 53: PA-감염된 마우스에서 과산소-유도된 사망률에 대한 UP360의 효과
Figure pct00054
과산소 및 PA 유도된 동물의 사망률을 감소시키는데 있어서 알로에-기반 조성물의 유리한 효과를 확인한 후, 박테리아 감염에 의해 유도된 산화 스트레스-악화 급성 폐 손상을 시행하였다. 마우스를 1주일 동안 순응시켰다. 과산소 노출 전 7일 동안 UP360(500 mg/kg) 및 레스베라트롤(50 mg/kg)을 경구 투여하여 동물을 처리하였다. 매일 시험 물질의 경구 투여를 유지하면서 마우스를 > 99% O2에 48시간 동안 노출시켰다. 비강 내 흡인을 통해 PA(5 x 108 CFU)를 마우스에 접종하고, 여전히 시험 물질의 매일 처리를 유지하였다. 접종 후 마우스를 21% O2로 되돌렸다. 기관지폐포 세척(BAL)을 수확하고, 감염 24시간 후 혈액 샘플 및 폐 조직을 수집하였다. BAL에서 총 단백질 함량을 측정하고 BAL 및 폐에서 생존 가능한 박테리아의 수를 결정하였다. TNF-α, IL-1, IL-6, CRP, IL-8, IL-10, HMGB-1, MPO, MIP-2, NF-kappaB, Nrf2, 대식세포 수, 호중구 수, 조직학에서의 질병 중증도와 같은 표 54에 나열된 바이오마커를 결정하기 위해 검정을 실행하였다.
표 54에 나타낸 바와 같이, 알로에-기반 조성물은 과산소 및 미생물 감염된 마우스에서 기도의 박테리아 제거에 대한 통계적으로 유의한 효과를 나타내었다. 과산소에 대한 노출이 박테리아 감염에 대한 숙주 방어를 손상시켜, 기도에 더 높은 박테리아 부하를 초래할 수 있다는 것이 이전에 밝혀진 바 있다(Patel et al., 2013). 표 54의 결과는 실내 공기(RA)에 남아 있는 마우스에 비해 과산소(O2)에 대한 마우스의 사전 노출에 의해 기도의 박테리아 부하가 상당히 증가되었음을 나타낸다. 레스베라트롤로 처리된 마우스에서 폐 손상이 현저히 감소된 것에 상응하게, 기도 박테리아 부하는 이들 마우스(RES)에서 상당히 낮았다.
표 54: 알로에-기반 조성물은 과산소 및 미생물 감염된 마우스에서 기도의 박테리아 제거에 통계적으로 유의한 효과를 나타내었다
Figure pct00055
표 55: BAL, 혈청 및 폐 균질물로부터의 바이오마커에 대한 검정 우선 순위
Figure pct00056
유사하게, UP360으로 처리된 마우스는 과산소에 노출되고 비히클 단독으로 처리된 마우스에 비해 기도에 상당히 적은 양의 박테리아 부하를 가졌다. 기도에서 박테리아 부하의 차이는 과산소 및 비히클 대조군(O2)으로 처리된 마우스의 것과 비교하여 통계적으로 유의하였다. 이러한 결과는 UP360이 실제로 기도에서 박테리아 부하를 감소시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 52: 인간 임상 시험에서 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 알로에-기반 조성물의 평가
프로토콜: 건강한 성인의 면역 기능을 지원하는 제품을 조사하기 위한 무작위, 삼중-맹검, 플라시보-대조, 병렬 임상 시험. 이 연구의 목적은 건강한 성인에서 면역 기능을 지원하는데 있어서 실시예 9에서 제조된 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 경우에, 이로 구성된 연구용 제품(IP) UP360의 효능을 조사하는 것이었다.
무작위, 삼중-맹검, 플라시보-대조, 병렬 연구에서, 백신 접종 전 28일 및 접종 후 28일에 건강한 성인 집단에서 면역 기능을 지원하는 것에 대한 연구용 제품의 효능을 평가하였다. 이 연구에는 인플루엔자 백신을 접종받지 않았으나 기꺼이 접종하였고, 독감 백신 접종의 구두 이력을 제공하기로 동의하였으며, 식이, 약물, 보충제, 운동 및 수면을 유지할 수 있는 능력에 따라 연구 기간을 통틀어 가능한 한 현재 생활 습관을 유지하고 새로운 보충제 복용을 피하는데 동의하였고, 자격이 있는 조사자(QI)가 평가한 병력 및 실험실 결과에 의해 결정시, 건강하며, 연구와 관련된 설문지 및 일기를 작성하고 모든 클리닉 방문을 완료할 의향이 있고, 연구 참여에 대한 자발적인 서면 동의서를 제공한 40세에서 80세 사이의 남성 및 여성이 포함되었다.
다음 대상체는 제외되었다: 1. 연구 기간 동안 임신했거나 수유 중이거나 임신할 계획인 여성. 2. UP360, 플라시보 또는 인플루엔자 백신의 활성 또는 비활성 성분에 대해 알려진 알레르기가 있는 참가자. 3. 2020년 9월부터 기준선 이전 또는 28일 백신 접종 전에 독감에 걸린 백신 접종하지 않은 참가자. 4. 참가자는 기준선 전 또는 28일 백신 접종 전에 COVID-19 진단을 자가 보고한다. 5. COVID-19 백신을 접종한 참가자. 6. 기준선으로부터 4주 이내에 면역억제제 또는 면역자극제와 같은 처방된 면역조절제(코르티코스테로이드 포함)의 현재 사용. 7. 약효세척의 의향이 없는 한, 면역계를 부스팅하거나 조절하는 것과 관련된 식이 보충제 또는 한약의 현재 사용.
연구 그룹 참가자 수
UP360 + 독감 백신 N = 25
플라시보 + 독감 백신 N = 25
전체 N = 50
연구 대상체는 최대 56일 동안 연구에 참여할 것으로 예상되었다. 대상체는 사전 동의를 위해 방문 1(스크리닝, -45일 내지 -4일) 및 적격성 및 무작위화의 확인을 위해 방문 2(기준선, 0일)에 연구에 참석하였다.
연구에 대한 일차 및 이차 효능 및 안전성 종말점을 방문 2(0일), 방문 3(28일) 및 방문 4(56일)에 평가하였다. 스크리닝 방문시 인구학적 정보 및 병력을 기록하였다. 연구 대상체는 인플루엔자 백신 접종(28일)에 이르기까지 매일 UP360을 복용한 다음, 추가 4주 동안 매일 UP360을 계속 복용하였다(56일까지).
일차 연구 결과는 28일 및 56일에 혈액 중 림프구 집단(CD3+, CD4+, CD8+, CD45+, TCRγδ+, CD3- CD16+ 56+) 및 면역글로불린(IgG, IgM 및 IgA)에 의해 평가된 바와 같이 기준선으로부터 면역 파라미터의 변화에서 UP360과 플라시보 간의 차이였다.
통계 분석을 수행하고 평균, 중앙값, 표준 편차, 최소값, 최대값, 인구학적 특징에 대한 비율(범주형인 경우) 및 결과 측정값을 포함하는 요약 통계를 전체 샘플에 대해 연구 그룹별로 얻었다. 분산 분석(ANOVA)은 정규성 가정이 충족될 때 두 처리 그룹(UP360 및 플라시보) 간의 연속 변수의 평균 차이를 조사하기 위해 사용되었고, 정규성 가정이 충족되지 않을 때 Kruskal-Wallis 검정을 사용하였다. 카이-제곱 및 Fisher 정확 검정(세포의 개수가 5개 미만인 경우)을 적절하게 사용하여 범주형 변수의 차이를 조사하였다. 분산의 반복 측정 분석(선형 혼합 모델)을 사용하여 시간 경과에 따른 처리 그룹 간의 결과의 평균 값 차이를 조사하였다. 기준선 값은 각 모델에서 공변량으로 포함되었다. 분산의 반복 측정 분석(선형 혼합 모델)을 사용하여 시간 경과에 따른 두 치료 그룹 간의 결과 변화의 평균 값 차이를 조사하였다(기준선에서 28일, 56일 및 28일부터 56일). 기준선 값은 각 모델에서 공변량으로 포함되었다. LMM의 쌍별 통계적 유의성(그룹 간 및 그룹 내). Bonferroni 조정은 쌍별 비교를 위해 사용되었다. 통계적 유의성은 p-값 ≤ 0.05로 정의된다. 통계적 분석 시스템 소프트웨어 버전 9.4(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 사용하여 분석을 수행하였다.
예비 임상 데이터 보고서에서 일차 종말점(TCRγδ+ 및 CD45+ 세포)에 대해 통계적으로 유의한 결과가 관찰되었다. 표 56에 나타낸 바와 같이, 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물을 수용한 대상체는 플라시보를 수용한 대상체와 비교하여 여러 시점에 감마 델타 T-세포 퍼센트 세포 집단의 통계적으로 유의한 증가를 나타내었다. 플라시보 그룹의 대상체는 TCRγδ+ 세포의 퍼센트에서 10.5 및 5.6% 감소를 나타내었지만, 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물은 투여 후 28일 및 56일에 TCRγδ+ 세포 집단의 백분율에서 각각 21.5% 및 24.5% 증가를 나타내었다. 플라시보와 비교하여, 알로에-기반 조성물을 수용한 대상체는 치료 투여 후 28일 및 56일에 TCRγδ+ 세포 집단의 퍼센트에서 각각 23.5% 및 38.9%(P≤0.001) 증가를 나타내었다. 0 내지 56일(p = 0.0002) 및 28 내지 56일(p < 0.0108)에 관찰된 TCRγδ+ 세포 집단의 퍼센트 변화에서 이러한 증가는 플라시보와 비교하여 실시예 9에서 제조된 알로에-기반 조성물(UP360)에 대해 통계적으로 유의하였다. 유사하게, 동일한 시간틀 동안의 이러한 변화는 그룹 내 알로에-기반 조성물에 대해 통계적으로 유의하였다.
표 56: UP360 vs 플라시보에서 TCRγδ+ 세포 %의 변화
Figure pct00057
표 57. UP360 vs 플라시보에서 CD45+ 세포 %의 변화
Figure pct00058
전임상 데이터를 반영하면, 다당류 및 폴리페놀을 포함하고, 일부 구현예에서, 이로 구성된 UP360을 포함하는 고려되는 알로에-기반 조성물은 감마 델타 T-세포의 통계적으로 유의한 유도를 나타내었다. 상기 논의에서 설명된 이러한 독특한 T-세포 서브집단의 특성에 기초하여, 이러한 데이터는 면역 조절, 감시 및 항상성에서 알로에-기반 조성물의 주요 활성이 이들 세포의 유도의 결과임을 분명히 보여주었다.
알로에-기반 조성물로 보충한 결과 CD45+ 세포 수준에서 유사하지만 역전된 패턴이 관찰되었다. 표 57에 나타낸 바와 같이, 56일에 CD45+ 세포 %는 플라시보를 수용한 참가자에 비해 UP360을 수용한 참가자의 경우에 평균 3.761 더 낮았다(p=0.0066). 0일부터 56일까지 CD45+ 세포 %의 변화는 플라시보를 투여받은 참가자에 비해 UP360을 수용한 참가자의 경우에 평균 3.811 더 낮았다(p=0.0175). 유사하게, 28일부터 56일까지 CD45+ 세포 %의 변화는 플라시보를 투여받은 참가자에 비해 UP360을 수용한 참가자의 경우에 평균 3.220 더 낮았다(p=0.0442).
이차 결과는 28일 및 56일에 UP360과 플라시보 간의 차이였다: 1. 확인된 COVID-19 감염 수; 2. 확인된 독감 사례의 수; 3. QoL 설문지에서 COVID-19 영향에 의해 평가된 삶의 질에 대한 COVID-19의 영향; 4. 처방전 없이 살 수 있는 감기 및 독감 약물 사용. 56일에 UP360과 플라시보 간의 차이: 1. COVID-19로 인한 입원 횟수; 2. 독감으로 인한 입원 횟수.
기준선에서 28일 및 56일의 측정까지의 UP360과 플라시보 간의 변화 차이: 1. 적혈구 침강 속도(ESR) 및 C-반응성 단백질(CRP); 2. 혈액학 파라미터: 감별에 의한 백혈구(WBC) 수(호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구), 망상적혈구 수, 적혈구(RBC) 수, 헤모글로빈, 헤마토크릿, 혈소판 수, RBC 지수(평균 적혈구 부피(MCV), 평균 적혈구 헤모글로빈(MCH), 평균 적혈구 헤모글로빈 농도(MCHC) 및 적혈구 분포 폭(RDW)); 3. 보체 C3 및 C4 단백질; 4. 수정된 위스콘신 상부 호흡기 증상 조사(WURSS)-24 일일 증상 점수에 대해 곡선하 면적(AUC)으로 측정된 평균 전반적 중증도 지수. 5. WURSS-24 일일 중증도 증상 점수에 대해 AUC에 의해 측정된 평균 증상 중증도 점수; 6. 수정된 WURSS-24 설문지에 의해 평가된 건강 일수("오늘 얼마나 아파요?"라는 질문에 대해 0(아프지 않음)으로 점수가 매겨진 일수로 정의됨); 7. 수정된 WURSS-24 설문지에 의해 평가된 병가 일수("오늘 얼마나 아파요?"라는 질문에 대해 1부터 7(아픔) 사이의 숫자로 점수가 매겨진 일수로 정의됨); 8. 수정된 WURSS-24 설문지에 의해 평가된 일반적인 상기도 감염(UTRI) 증상의 빈도; 9. 수정된 WURSS-24 설문지에 의해 평가된 일반적인 UTRI 증상의 기간; 10. 수정된 WURSS-24 설문지에 의해 평가된 일반적인 UTRI 증상의 중증도; 11. 활력 및 삶의 질(QoL) 설문지에 의해 평가된 활력 및 삶의 질.
고려되는 방법은 건강한 건강한 염증 반응을 지지하고; 감염에 대한 보체 C3 및 C4 단백질, 사이토카인 및 사이토카인 반응의 건강한 수준을 유지하고; TNF-α, IL-1β, IL-6, GM-CSF; IFN-α; IFN-γ; IL-1α; IL-1RA; IL-2; IL-4; IL-5; IL-7; IL-9; IL-10; IL-12 p70; IL-13; IL-15; IL17A; IL-18; IL-21; IL-22; IL-23; IL-27; IL-31; TNF-β/LTA, CRP, 및 CINC3을 완화, 조절 및 유지하기 위한 방법을 추가로 포함한다.
기준선으로부터 28일 및 56일에 UP360과 플라시보 간의 변화의 차이를 분석하기 위해 추후 분석을 위해 샘플을 수집하고 저장하였다:
1. 사이토카인(GM-CSF; IFN-α; IFN-γ; IL-1α; IL-1β; IL-1RA; IL-2; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-9; IL-10; IL-12 p70; IL-13; IL-15; IL17A; IL-18; IL-21; IL-22; IL-23; IL-27; IL-31; TNF-α; TNF-β/LTA 150)
2. 고-이동성 그룹 박스 1(HMGB1) 단백질, 핵 인자 카파 B(NF-κB), 핵 인자 적혈구 2-관련 인자 2(Nrf-2)
3. 8-이소-프로스타글란딘 F2α, 카탈라제(CAT), 글루타티온 퍼옥시다제(GSH-Px), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 말론디알데하이드(MDA) 및 고급 당화 최종-생성물(AGE)에 의해 평가된 산화 스트레스
4. 특정 바이러스 균주에 대한 헤마글루티닌 억제(HI) 역가
효능 분석과 함께, 안전성 평가가 수행된다. 1. 임상 화학 파라미터: 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 알칼리성 포스파타제(ALP), 총 빌리루빈, 크레아티닌, 전해질(Na+, K+, Cl-), 추정된 사구체 여과율(eGFR), 글루코스; 2. 응급 상황 전 및 응급 상황 후 부작용 발생률; 3. 활력 징후(혈압(BP) 및 심박수(HR))
실시예 53: UP360의 신속한 면역 조절 효과에 대한 임상 개념 증명 연구.
이 임상 개념 증명 연구의 목표는 실시예 9에서 제조된 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 신규한 기능식품적 블렌드 UP360의 급성 면역 효과를 플라시보와 비교하는 것이다. 이 데이터는 면역 관련 효과를 확인하는데 중요하다.
이 임상 개념 증명 연구는 면역 세포 활성화, 세포 트래피킹, 및 전염증성 및 항염증성 사이토카인, 항바이러스 펩티드 및 회복 성장 인자에 대한 사이토카인 변화의 평가를 통해 시험 제품 소비의 급성 효과를 문서화하는 것을 목표로 한다.
면역 세포 트래피킹 및 감시에 대한 데이터가 수집된다. 시험은 미생물 침입자를 찾아 제거하려고 시도하고, 면역 세포 유형 간에 효과적으로 협력하기 위해 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 신규한 조성물의 소비가 면역계의 각성도를 급격하게 변화시키는지를 보여준다.
이 임상 연구를 위해, 인간 대상체는 확립된 플라시보-대조, 무작위, 이중-맹검, 교차 연구 설계에 따라 시험된다. 특히, 연구 설계는 림프구 트래피킹, 특히 줄기 세포 서브세트의 변화에 대한 면역 조절 제품에 대한 이전의 임상 연구에서 사용되었다. 대상체는 투여 전 활성제 또는 플라시보로 무작위화되고, 기준선 샘플이 수집되고, 연구용 제품의 섭취 후 혈액 샘플이 투여 1, 2, 3시간 후에 수집된다. 대상체는 7일 약효세척 후에 클리닉으로 돌아와 교차 방식으로 반대 제품을 복용할 것이며, 연구 절차가 반복된다.
본 발명자들이 평가하는 시험 파라미터는 사람들의 대사, 개인의 일주기 리듬, 및 기타 정상적인 생리학적 파라미터와 관련이 있기 때문에 몇 시간 동안이라도 일정하게 유지되지 않는다. 따라서, 이러한 성격의 연구는 각 개인에 대한 시험일 사이의 변화에 대한 대상체-내 분석을 허용하는 플라시보 시험일을 포함해야 한다. 이는 이러한 유형의 파일럿 연구로부터의 데이터 분석을 매우 강화한다. 플라시보 시험일이 없는 경우, 변화가 제품 섭취와 관련된 것으로 해석될 수 없기 때문에 데이터는 결정적이지 않은 것으로 간주된다.
일차 결과 측정: 면역 감시: 생체 내 면역 세포의 트래피킹 및 활성화. 이 연구는 면역 감시 및 면역 각성도에 의한 신속한 면역 지원을 보여주기 위해 설계되었다.
이 연구를 위해, 성별에 관계 없이 12명의 건강한 대상체가 IRB-승인된 서면 동의 후 등록되었다. 이러한 성격의 연구에 대한 포함/제외 프로파일은 사소하지 않으며, 각 잠재적 연구 참가자는 등록 전에 신중하게 평가된다. 연구를 위한 초기 클리닉 방문 동안 예상되는 스트레스와 우려를 최소화하기 위해, 각 연구 참가자는 시설에서 이전 연구에 참여했거나 임상 연구일 전에 연구 절차를 거치는 방문에 참석해야 한다.
이 연구는 건강한 성인을 포함한다; 18-75세(포함); BMI 18.0 내지 34.9(포함); 다음을 포함하는 연구 절차 준수 의향이 있음: 연구 기간 동안 일관된 식이 및 생활 습관 유지, 클리닉 방문일에 일관된 아침 식사 습관 유지, 연구 방문 아침에 운동 및 영양 보충제를 금함, 클리닉 방문 전 적어도 1시간 동안 커피, 차 및 청량 음료를 마시지 않음; 클리닉 방문 동안, 음악, 사탕, 껌, 컴퓨터/휴대폰 사용을 금함.
다음 기준을 충족하는 대상체는 제외된다: 이전의 주요 위장 수술(시험 제품의 흡수가 변경될 수 있음)(이전에 충수 및 담낭 제거를 포함하는 문제가 되지 않는 경미한 수술); 매일 항염증제 복용; 현재 강렬한 스트레스가 많은 사건/생활 변화를 겪고 있음; 현재 집중적인 운동 훈련 중임(예를 들어, 마라톤 선수); 지난 12개월 동안 암; 지난 12개월 동안 화학요법; 현재 면역억제제로 치료 중임; 자가면역 장애, 예를 들어, 전신성 홍반성 루푸스, 용혈성 빈혈로 진단됨; 연구 중 또는 연구 시작 전 4주 이내에 헌혈; 지난 12주 이내에 코르티손 주사를 맞았음; 지난 달에 예방 접종; 현재 항불안제, 수면제 또는 항우울제 처방약을 복용 중임; 진행 중인 급성 감염(치아, 부비동, 귀 등을 포함); 이 시험 동안 실험용 제품 또는 생활 습관 변화와 관련된 다른 임상 시험 연구에 참여함; 비정상적인 수면 일상(예: 야간 작업 근무, 야근이 잦은 불규칙한 일상, 공부, 파티); 연구 기간 동안 지속적인 보충제 섭취를 꺼림; 가임 여성: 임신, 수유 중 또는 임신을 시도하는 여성; 활성 시험 제품 또는 플라시보의 성분과 관련된 알려진 식품 알레르기. 처방약은 사례별로 평가된다.
소비성 시험 제품: 실시예 9에서 제조된 다당류 및 폴리페놀을 포함하는 시험 제품 활성 UP360 및 플라시보가 제공된다. 각 클리닉 당일, 기준선 채혈 직후, 클리닉 직원의 앞에서 활성 시험 제품 UP360 또는 플라시보의 단일 용량이 대상체에게 제공된다. 대상체는 소화 기능을 자극하기 위해 물과 약간의 부드러운 소다 크래커와 함께 캡슐을 소비한다.
제안된 임상 연구 절차의 설명: 면역 활성화 사건을 모니터링하기 위한 임상 시험에서, 본 발명자들은 장내 면역 세포의 활성화로 출발한 뒤, 사이토카인 수준의 전신 변화, 면역 세포 트래피킹에 대한 변화(향상된 면역 감시) 이후에 전신 조직의 면역 감시, 및 아마도 활성화된 면역 세포가 다시 혈액 순환으로 재진입하는 일련의 사건을 예상한다.
혈액 샘플은 제품 소비 후 발생하는 면역 사건에 대한 편리한 창을 제공한다. 본 발명자들은 초기 장 활성화에서 일어날 수 있는 사건에 대한 편리한 창을 가지고 있지 않지만, 이것이 시험관 내 사건과 같다고 생각한다. 본 발명자들은 조직에 대한 창을 가지고 있지 않으므로 면역 세포가 혈액에서 조직으로 이동한 후 미생물 침입자를 청소하고 선천성 및 적응 유형의 면역 반응을 수행하는 다운스트림 사건을 모니터링할 수 없다. 따라서, 본 발명자들은 혈액 샘플의 일부를 취하여 미생물 모방체로 면역 세포를 생체 외(체외) 챌린지함으로써 이를 모방한다.
설명된 검사는 혈액 순환에서 보이는 면역 세포의 유형 및 활성화 상태의 급격한 변화를 모니터링하는 것을 목표로 한다. 혈액 내 면역 세포 수의 증가 대 감소는 혈류 안팎으로의 세포 트래피킹의 척도이다.
본 발명자들은 동일한 시험 제품을 소비한 후 대부분의 연구 참가자에서 관찰된 임의의 체계적인 변화가 면역 활성화 사건이 유도되었음을 시사하는 미묘한 사건을 찾고 있다. 이는 제품이 면역 인식을 증가시켰다는 좋은 표시이다.
면역 감시에서 면역 세포는 조직 안팎으로 이동하며 이는 순환하는 혈액에서 세포 수를 측정함으로써 측정될 수 있다. 면역 각성도에서 본 발명자들은 순환하는 혈액의 기능을 위한 특정 세포를 측정한다.
면역 세포 트래피킹 및 면역 각성도 상태
이 분석을 통해 본 발명자들은 시험 제품의 소비가 순환에서 세포 수의 급격한 변화를 유도하고/거나 생체 내에서 세포를 활성화하는지를 검출할 수 있다. 새로 채취한 혈액 샘플은 면역 세포 수 및 활성화 상태의 변화를 시험하는데 사용된다. 각 채혈로부터의 세포는 삼중으로 검정된다.
세포는 T 세포 마커 CD3 및 CD56 및 CD57 마커뿐만 아니라 2개의 활성화 마커 CD69 및 인터루킨-2 수용체 CD25로 염색된다. 이는 연구의 각 시점에 혈액 순환에서 다음 유형의 면역 세포의 수를 분석할 수 있다: CD3-음성, CD56-양성 NK 세포; CD3+ CD56+ NKT 세포; CD3+ CD56- T 림프구; CD3-CD56- 비-NK, 비-T 림프구; CD3- CD57+ NK 세포; CD3- CD56+ CD57+ NK 세포; 단핵구(전방/측면 산란 프로파일로 식별됨).
분석 동안, 상기 열거된 세포 집단의 표면에서 활성화 분자 CD69 및 성장 인자 수용체 CD25에 대한 발현 수준이 결정된다.
참고: 면역 감시는 NK 및 T 세포를 포함하는 림프구 서브세트의 지속적인 재순환을 포함한다. 트래피킹은 뚜렷한 일주기 리듬을 나타내며 사람의 대사 상태의 영향을 받는다. 면역 감시에 대한 소비성 면역 조절 제품의 급성 효과를 비교할 때, 주어진 사람의 대사 상태를 설명하기 위해 플라시보 대조 시험일을 갖는 것이 중요하다.
더 많은 유세포 분석 패널을 추가하는 것이 가능하다. 예산 옵션은 다음을 포함한다. 추가 패널은 감마-델타(γδ) T 세포(γδTCR+ CD5- CD8-)의 수에 대한 추가 패널을 포함한다: CD3/γδ T 세포 수용체; CD5; CD56 - γδ T 세포에 대해 + 또는 -일 수 있음; CD69, CD25.
B 및 T 림프구 서브세트의 수, 및 CD45 아이소형 발현에 대한 추가 패널: CD4 T 세포 서브세트, CD8 T 세포 서브세트, CD19 B 림프구, CD45RA - 나이브 T 및 B 세포에서 발현됨, CD45R0 - 활성화 및 기억 T 및 B 세포에서 발현됨.
참고 문헌
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065

Claims (49)

  1. 하나 이상의 다당류가 풍부한 알로에(Aloe) 추출물; 하나 이상의 다당류가 풍부한 포리아(Poria) 추출물; 및 하나 이상의 폴리페놀 화합물이 풍부한 로즈마리(Rosemary) 추출물의 조합물을 포함하는 면역 항상성의 조절을 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 조성물 내의 알로에 추출물, 또는 포리아 추출물 또는 로즈마리 추출물이 3:2:1(50%:33.3%:16.7%) 또는 1:1:1(33.3%:33.3%:33.3%) 또는 3:6:1(30%:60%:10%)의 알로에:포리아:로즈마리(APR)의 최적화된 중량비와 함께 1 중량% 내지 98 중량%의 각 추출물의 범위로 존재하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 알로에 추출물이 알로에 베라(Aloe vera) 또는 알로에 바르바덴스(Aloe barbadense)의 전체 잎 겔 또는 내부 잎 겔이고, 포리아 추출물이 포리아 코코스(Poria cocos) 또는 울피포리아 엑텐사(Wolfiporia extensa)의 버섯 또는 자실체로부터의 것이고, 로즈마리 추출물이 로즈마리누스 오피시날리스(Rosmarinus officinalis)의 잎으로부터의 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 알로에 추출물이 0.01% 내지 99.9%의 다당류를 포함하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 포리아 추출물이 0.01% 내지 99.9%의 다당류를 포함하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 로즈마리 추출물이 0.01% 내지 99.9%의 로즈마린산을 포함하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 알로에 추출물로부터의 하나 이상의 다당류가 아세틸화 다당류 또는 아세만난 또는 이들의 임의의 조합인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 포리아 추출물로부터의 하나 이상의 다당류가 베타-글루칸 또는 이들의 조합인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 하나 이상의 다당류가 알로에 베라, 알로에 바르바덴스, 알로에 페록스(Aloe ferox), 알로에 아보레센스(Aloe arborescens), 아스트라갈루스 멤브라나세우스(Astragalus membranaceus), 가노더마 루시둠(Ganoderma lucidum), 호르데움 불가레(Hordeum vulgare), 아가리쿠스 (A. 블라제이) 서브루페센스(Agaricus (A. blazei) subrufescens), 에키나시아 푸르푸레아(Echinacea purpurea), 에키나시아 앙구스티폴리아(Echinacea angustifolia), 아코니툼 나펠루스(Aconitum Napellus)(몽크스후드(Monkshood)), 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra), 포리아 코코스 울프(Poria cocos Wolf), 울피포리아 엑텐사(Wolfiporia extensa), 위다니아 솜니페라(Withania somnifera), 부플류룸 팔카툼(Bupleurum falcatum), 글리시리자 종(Glycyrrhiza spp), 파낙스 킨케폴리움(Panax quinquefolium), 파낙스 진셍 C. A. 메이어(Panax ginseng C. A. Meyer), 한국 홍삼, 렌티눌라 에도데스(Lentinula edodes)(표고버섯), 이노노투스 오블리쿠스(Inonotus obliquus)(차가버섯), 렌티눌라 에도데스, 리시움 바르바룸(Lycium barbarum), 리시움 치넨스(Lycium chinense), 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus)(자실체), 트라메테스 베르시컬러(Trametes versicolor)(자실체), 시아몹시스 테트라고놀로부스(Cyamopsis tetragonolobus), 시아몹시스 테트라고놀로부스(구아 검), 트라메테스 베르시컬러, 클라도시폰 오카무라누스 토키다(Cladosiphon okamuranus Tokida), 운다리아 피나티피다(Undaria pinnatifida), 버섯, 해조류, 효모, 갈조류, 아가베 넥타(Agave Nectar), 갈조류, 발효 섬유, 시리얼, 해삼, 용설란, 아티초크, 아스파라거스, 부추, 마늘, 양파, 호밀, 보리 커널, 밀, 배, 사과, 구아바, 마르멜로, 자두, 구스베리, 오렌지 및 기타 감귤류 과일, 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 식물 종으로부터 풍부화되는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 폴리페놀 화합물이 멜리사 오피시날리스(Melissa officinalis), 모모르디카 발사미나(Momordica balsamina), 멘타 피페리타(Mentha piperita), 페릴라 프루테센스(Perilla frutescens), 샐비어 오피시날리스(Salvia officinalis), 튜크리움 스코로도니아(Teucrium scorodonia), 사니쿨라 유로파에아(Sanicula europaea), 콜레우스 블루메이(Coleus blumei), 티무스 종(Thymus spp.), 힙티스 베르티실라타(Hyptis verticillata), 리토스퍼뭄 에리트로리존(Lithospermum erythrorhizon), 붕어마름 안토세로스 아그레스티스(hornwort Anthoceros agrestis), 파이퍼 롱굼 린(Piper longum Linn), 콥티스 치넨시스 프란치(Coptis chinensis Franch), 안젤리카 시넨시스 (Oliv.) 디엘스(Angelica sinensis (Oliv.) Diels), 톡시코덴드론 베르니시플룸(Toxicodendron vernicifluum), 글리시리자 글라브라(Glycyrrhiza glabra), 글리시리자 우라렌시스(Glycyrrhiza uralensis), 커큐마 롱가(Curcuma longa), 샐비어 로즈마리누스(Salvia Rosmarinus), 로즈마리누스 오피시날리스(Rosmarinus officinalis), 진지베르 오피시날리스(Zingiber officinalis), 폴리갈라 테누이폴리아(Polygala tenuifolia), 휴물루스 루풀루스(Humulus lupulus), 로니세라 자포니카(Lonicera Japonica), 샐비어 오피시날리스 L., 센텔라 아시아티카(Centella asiatica), 보스웰리아 카르테리(Boswellia carteri), 멘타 롱기폴리아(Mentha longifolia), 피세아 크라시폴리아(Picea crassifolia), 시트러스 노빌리스 로우르(Citrus nobilis Lour), 시트러스 아우란티움(Citrus aurantium) L. 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis) L. 퓨라리아 미리피카(Pueraria mirifica), 퓨라리아 로바타(Pueraria lobata), 글리신 맥스(Glycine max), 캅시쿰 종(Capsicum species), 팔로피아 자포니카(Fallopia japonica), 차, 토마토, 십자화과 식물, 포도, 블루베리, 라즈베리, 멀베리, 사과, 칠리 페퍼, 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 식물 종으로부터 풍부화되는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 폴리페놀 화합물이 로즈마린산, 컨쥬게이션된 카테킨, 예를 들어, EGCG, ECG, 에피갈로카테킨, 오록실린, 캄페롤(Kaempferol), 제니스테인, 케르세틴, 부테인(Butein), 루테올린(Luteolin), 크리신, 아피게닌(Apigenin), 커큐민, 레스베라트롤, 캡사이신, 글로메라토스 A, 6-쇼가올, 진저롤, 베르베린, 피페린(Piperine) 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 다당류 및 폴리페놀이 잎, 수피, 트렁크, 트렁크 수피, 줄기, 줄기 수피, 잔가지, 괴경, 뿌리, 뿌리줄기, 뿌리 수피, 수피 표면, 어린 새싹, 종자, 열매, 자실체, 버섯, 수술군(androecium), 암술군(gynoecium), 꽃받침, 수술, 꽃잎, 약편, 심피(암술), 꽃, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 식물 부분 또는 진균으로부터 풍부화되는 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 조성물 내의 알로에 추출물, 포리아 추출물 및 로즈마리 추출물이 CO2의 초임계 유체, 물, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 알코올, 물-혼합 용매 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 적합한 용매로 추출되는 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 다당류가 용매 침전, 한외여과, 효소 분해, 실리카 겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피, XAD, HP20, LH20, C-18, 알루미나 옥사이드, 폴리아미드, CG161, 및 크기 배제 컬럼 수지에 의해 개별적으로 및/또는 조합하여 풍부화되는 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 하나 이상의 폴리페놀이 용매 분배, 침전, 증류, 증발, 한외여과, 실리카 겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피, XAD, HP20, LH20, C-18, 알루미나 옥사이드, 폴리아미드, 크기 배제 컬럼 및 CG161 수지에 의해 개별적으로 및/또는 조합하여 풍부화되는 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 조성물이 약학적 또는 기능식품적으로 허용되는 활성제, 애쥬번트, 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가로 포함하고, 상기 약학적 또는 기능식품적 제형이 약 0.1 중량%(wt%) 내지 약 99.9 wt%의 활성 화합물을 포함하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 활성제, 애쥬번트, 부형제 또는 담체가 칸나비스 사티바(Cannabis sativa) 오일 또는 CBD/THC, 강황 추출물 또는 커큐민(curcumin), 테르미날리아(terminalia) 추출물, 버드나무 수피 추출물, 악마의 발톱(Devil's claw) 뿌리 추출물, 카이엔 페퍼(Cayenne Pepper) 추출물 또는 캡사이신, 산초(Prickly Ash) 수피 추출물, 필로덴드론(philodendra) 수피 추출물, 홉 추출물, 보스웰리아(Boswellia) 추출물, 로즈 힙(rose hips) 추출물, 녹차 추출물, 소포라(Sophora) 추출물, 박하 또는 페퍼민트 추출물, 생강 또는 흑생강 추출물, 녹차 또는 포도씨 폴리페놀, 오메가-3 또는 오메가-6 지방산, 어유, 크릴 오일, 감마-리놀렌산, 감귤 바이오플라보노이드, 아세롤라(Acerola) 농축액, 아스타잔틴, 피크노제놀, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 비타민 B, 비타민 A, L-리신, 칼슘, 망간, 아연, 무기질 아미노산 킬레이트(들), 아미노산(들), 붕소 및 붕소 글리시네이트, 실리카, 프로바이오틱스, 장뇌, 멘톨, 칼슘-기반 염, 실리카, 히스티딘, 구리 글루코네이트, CMC, 말토덱스트린, 베타-사이클로덱스트린, 셀룰로스, 덱스트로스, 식염수, 물, 오일, 상어 및 소 연골, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 조성물이 정제, 경질 캡슐, 연질 겔 캡슐, 분말, 또는 과립, 압축 정제, 알약, 고무질, 츄잉 검, 사쉐, 웨이퍼, 바, 또는 액체 형태, 팅크제, 에어리얼 스프레드, 반고체, 반액체, 용액, 에멀젼, 크림, 로션, 연고, 겔 베이스 등의 형태로 제형화되는 조성물.
  19. 포유동물의 체중 kg 당 0.01 mg 내지 500 mg의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 항상성의 조절을 치료, 관리, 촉진하기 위한 방법.
  20. 제19항에 있어서, 조성물이 하나 이상의 다당류가 풍부한 알로에 추출물; 하나 이상의 다당류가 풍부한 포리아 추출물; 및 하나 이상의 폴리페놀 화합물이 풍부한 로즈마리 추출물의 조합물을 포함하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 조성물의 투여가 경구 투여, 국소 투여, 좌제 투여, 정맥 내 투여, 피내 투여, 위내 투여, 근육 내 투여, 복강 내 투여, 및 정맥 내 투여를 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
  22. 제19항에 있어서, 면역 반응을 최적화하거나 균형을 맞추고; 노화 및 면역 기관 노화 손상된 면역을 개선하고; 만성 염증 및 염증-손상된 면역을 예방하고; 인플루엔자 백신 접종 또는 COVID-19 백신 접종에 대한 건강한 면역 반응을 유지하도록 돕고; 바이러스 감염 및 박테리아 감염에 대한 건강한 면역 기능을 유지하도록 돕고; 대기 오염으로 인한 산화 스트레스 손상으로부터 포유동물의 면역계를 보호함으로써 면역 항상성을 유지하는 것을 포함하는 방법.
  23. 제19항에 있어서, HMGB1을 내인성 또는 외인성 반응 공격 트리거로서 조절하고 숙주 면역 반응을 이동시켜 HMGB1 방출을 억제함으로써 항상성을 회복시키거나 세포질 전좌를 차단하거나 소포 매개 방출을 차단함으로써 HMGB1 능동 또는 수동 방출을 표적화하는 것으로 그 작용을 방해하거나; 핵에서 분자 내 이황화 결합 형성을 억제하거나; 방출시 HMGB1을 직접 표적화하고 그 효과를 중화시키거나; Toll-유사 수용체(TLR)-2/4/7/9 및 고급 당화 최종 생성물(RAGE)에 대한 수용체와 같은 수용체를 인식하는 HMGB1 패턴을 차단하거나 이들의 신호 전달을 억제하거나; 물리화학적 미세환경을 변화시키고 HMGB1 테트라머의 형성을 방지하고 HMGB1의 TLR 및 RAGE에 대한 결합 친화성을 방해하여, HMGB1의 클러스터 형성 또는 자가-결합을 방지하기 위한 방법을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제19항에 있어서, 건강한 염증 반응을 지지하거나; 감염에 대한 보체 C3 및 C4 단백질, 사이토카인 및 사이토카인 반응의 건강한 수준을 유지하거나; TNF-α, IL-1β, IL-6, GM-CSF; IFN-α; IFN-γ; IL-1α; IL-1RA; IL-2; IL-4; IL-5; IL-7; IL-9; IL-10; IL-12 p70; IL-13; IL-15; IL17A; IL-18; IL-21; IL-22; IL-23; IL-27; IL-31; TNF-β/LTA, CRP, 및 CINC3을 완화, 조절 및 유지하기 위한 방법을 추가로 포함하는 방법 .
  25. 제19항에 있어서, 산화 반응을 제어하고 산화 스트레스를 완화시키고; 카탈라제(CAT), 글루타티온 퍼옥시다제(GSH-Px), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 및 Nrf2를 증가시켜 항산화 능력을 증가시키고; 말론디알데하이드(MDA), 8-이소-프로스타글란딘 F2α 및 고급 당화 최종-생성물(AGE)을 감소시키거나 유지시키고; 활성 산소 종을 중화하고; UV 및 화학적 산화 스트레스가 포유동물의 DNA 손상을 유발하는 것을 방지하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  26. 제19항에 있어서, 선천성 면역을 개선하고; 적응 면역을 개선하고; 백혈구의 활성 및 수를 증가시켜, 자연 살해(NK) 세포 기능을 향상시키고; T 및 B 림프구, 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구의 수를 증가, 조절, 유지하고; CD3+, CD3- CD56+ NK 세포, CD3+ CD56+ NKT 세포, CD3+ CD56- T 림프구, CD3- CD56- 비-NK, 비-T 림프구, CD3- CD57+ NK 세포, CD3- CD56+ CD57+ NK 세포, CD4+ NKp46+ 자연 살해 세포, TCRγδ+ 감마 델타 T 세포, 및 CD4+ TCRγδ+ 헬퍼 감마 델타 T 세포 및 CD8+ 세포 수를 증가시키고; CD45+ 세포, CD45RA 나이브 T 및 B 세포, 활성화된 CD45R0 및 기억 T 및 B 세포를 조절하고; 대식세포 식세포 활성을 보호 및 촉진하고; 포유동물의 특정 바이러스 균주에 대한 정상 항체 IgG, IgM, IgA 생산, 헤마글루티닌 억제(HI) 역가를 지지하거나 촉진하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  27. 제19항에 있어서, 호흡 기관에서 건강한 폐 미생물총 또는 공생 시스템을 유지하고; 폐 정화 및 해독 능력을 유지하고; 폐 구조적 완전성 및 산소 교환 능력을 보호하고; 호흡 통로를 유지하고 폐포의 산소 흡수 능력을 향상시키고; 바이러스 감염, 박테리아 감염, 흡연 및 대기 오염으로부터 정상적인 건강한 폐 기능을 보호하고; 산화 스트레스가 폐 손상을 일으키는 것을 완화시키고; 폐의 미세순환을 촉진하고 포유동물의 정상적인 응고 기능을 보호하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  28. 제19항에 있어서, 몸살, 인후통, 기침, 경미한 인후 및 기관지 자극, 코막힘, 동울혈, 부비동압, 콧물, 재채기, 후각 상실, 미각 상실, 근육통, 두통, 발열 및 오한을 포함하는 감기/독감-유사 증상을 완화 또는 감소시키고; 가래(점액)를 무르게 하고 기관지 분비물을 묽게 하여 기침을 더 생산적으로 만드는 것을 돕고; 기관지 자극의 중증도를 감소시키고; 바이러스 감염, 미생물 감염 및 대기 오염으로 인한 폐 손상 또는 부종 또는 염증성 세포 침윤의 중증도를 감소시키고; 감기/독감 또는 오염 시즌 동안 기관지 시스템 및 편안한 호흡을 지원하고; 폐 섬유증을 예방 또는 치료하고; 감기/독감의 기간 또는 중증도를 감소시키고; 호흡기 시스템의 바이러스 및 박테리아 감염의 중증도 또는 기간을 감소시키고; 바이러스, 미생물 및 대기 오염 물질로 인한 호흡기 감염을 예방, 치료 또는 치유하고; 호흡기 감염의 진행을 관리하거나 치료하거나 예방하거나 역전시키고; 폐렴의 진행을 관리하거나 치료하거나 예방하거나 역전시키고, 포유동물의 폐 및 전체 호흡기 시스템의 회복 및 재생 기능을 촉진 및 강화하고 회춘시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  29. 하나 이상의 다당류 및 하나 이상의 폴리페놀 화합물의 조합물을 포함하는, HMGB1을 조절함으로써 면역 항상성을 유지하기 위한 조성물로서, 상기 조성물이 HMGB1 방출을 억제함으로써 HMGB1을 조절하거나 세포질 전좌를 차단하거나 소포 매개 방출을 차단함으로써 HMGB1 능동 또는 수동 방출을 표적화하는 것으로 그 작용을 방해하거나; 핵에서 분자 내 이황화 결합 형성을 억제하거나; 방출시 HMGB1을 직접 표적화하고 그 효과를 중화시키거나; Toll-유사 수용체(TLR)-2/4/7/9 및 고급 당화 최종 생성물(RAGE)에 대한 수용체와 같은 수용체를 인식하는 HMGB1 패턴을 차단하거나 이들의 신호 전달을 억제하거나; 물리화학적 미세환경을 변화시키고 HMGB1 테트라머의 형성을 방지하고 HMGB1의 TLR 및 RAGE에 대한 결합 친화성을 방해하거나; HMGB1의 클러스터 형성 또는 자가-결합을 방지하는 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 조성물 내의 다당류 및 페놀 화합물이 1 중량%:99 중량% 및 99 중량%:1 중량%의 각 유형의 화합물의 범위로 존재하는 조성물.
  31. 제29항에 있어서, 하나 이상의 다당류가 알로에 베라, 알로에 바르바덴스, 알로에 페록스, 알로에 아보레센스, 아스트라갈루스 멤브라나세우스, 가노더마 루시둠, 호르데움 불가레, 아가리쿠스 (A. 블라제이) 서브루페센스, 에키나시아 푸르푸레아, 에키나시아 앙구스티폴리아, 아코니툼 나펠루스(몽크스후드), 삼부쿠스 니그라, 포리아 코코스 울프, 울피포리아 엑텐사, 위다니아 솜니페라, 부플류룸 팔카툼, 글리시리자 종, 파낙스 킨케폴리움, 파낙스 진셍 C. A. 메이어, 한국 홍삼, 렌티눌라 에도데스(표고버섯), 이노노투스 오블리쿠스(차가버섯), 렌티눌라 에도데스, 리시움 바르바룸, 리시움 치넨스, 펠리누스 린테우스(자실체), 트라메테스 베르시컬러(자실체), 시아몹시스 테트라고놀로부스, 시아몹시스 테트라고놀로부스(구아 검), 트라메테스 베르시컬러, 클라도시폰 오카무라누스 토키다, 운다리아 피나티피다, 버섯, 해조류, 효모, 갈조류, 아가베 넥타, 갈조류, 발효 섬유, 시리얼, 해삼, 용설란, 아티초크, 아스파라거스, 부추, 마늘, 양파, 호밀, 보리 커널, 밀, 배, 사과, 구아바, 마르멜로, 자두, 구스베리, 오렌지 및 기타 감귤류 과일, 또는 이들의 조합을 포함하는 식물 종으로부터 풍부화되는 조성물.
  32. 제29항에 있어서, 폴리페놀 화합물이 멜리사 오피시날리스, 모모르디카 발사미나, 멘타 피페리타, 페릴라 프루테센스, 샐비어 오피시날리스, 튜크리움 스코로도니아, 사니쿨라 유로파에아, 콜레우스 블루메이, 티무스 종, 힙티스 베르티실라타, 리토스퍼뭄 에리트로리존, 붕어마름 안토세로스 아그레스티스, 파이퍼 롱굼 린, 콥티스 치넨시스 프란치, 안젤리카 시넨시스 (Oliv.) 디엘스, 톡시코덴드론 베르니시플룸, 글리시리자 글라브라, 글리시리자 우라렌시스, 커큐마 롱가, 샐비어 로즈마리누스, 로즈마리누스 오피시날리스, 진지베르 오피시날리스, 폴리갈라 테누이폴리아, 모루스 알바(Morus alba), 휴물루스 루풀루스, 로니세라 자포니카, 샐비어 오피시날리스 L., 센텔라 아시아티카, 보스웰리아 카르테리, 멘타 롱기폴리아, 피세아 크라시폴리아, 시트러스 노빌리스 로우르, 시트러스 아우란티움 L. 카멜리아 시넨시스 L. 퓨라리아 미리피카, 퓨라리아 로바타, 글리신 맥스, 캅시쿰 종, 팔로피아 자포니카, 차, 토마토, 십자화과 식물, 포도, 블루베리, 라즈베리, 멀베리, 사과, 칠리 페퍼, 또는 이들의 조합을 포함하는 식물 종으로부터 풍부화되는 조성물.
  33. 제29항에 있어서, 폴리페놀 화합물이 로즈마린산, 컨쥬게이션된 카테킨, 예를 들어, EGCG, ECG, 에피갈로카테킨 등, 오록실린, 캄페롤, 제니스테인, 케르세틴, 부테인, 루테올린, 크리신, 아피게닌, 커큐민, 레스베라트롤, 캡사이신, 글로메라토스 A, 6-쇼가올, 진저롤, 베르베린, 피페린, 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
  34. 제29항에 있어서, 다당류 및 폴리페놀 화합물이 잎, 수피, 트렁크, 트렁크 수피, 줄기, 줄기 수피, 잔가지, 괴경, 뿌리, 뿌리줄기, 뿌리 수피, 수피 표면, 어린 새싹, 종자, 열매, 자실체, 버섯, 수술군, 암술군, 꽃받침, 수술, 꽃잎, 약편, 심피(암술), 꽃, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 식물 부분 또는 진균으로부터 풍부화되는 조성물.
  35. 제29항에 있어서, 조성물 내의 다당류 및 폴리페놀 화합물이 CO2의 초임계 유체, 물, 메탄올, 에탄올, 알코올, 물-혼합 용매 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 적합한 용매를 사용하여 바이오매스로부터 추출되는 조성물.
  36. 제92항에 있어서, 다당류가 용매 침전, 한외여과, 효소 분해, 실리카 겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피, XAD, HP20, LH20, C-18, 알루미나 옥사이드, 폴리아미드, 크기 배제 컬럼, 및 CG161 수지에 의해 개별적으로 또는 조합하여 풍부화되는 조성물.
  37. 제29항에 있어서, 하나 이상의 폴리페놀 화합물이 용매 분배, 침전, 한외여과, 증류, 증발, 실리카 겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피, XAD, HP20, LH20, C-18, 알루미나 옥사이드, 폴리아미드, 및 CG161 수지에 의해 개별적으로 또는 조합하여 풍부화되는 조성물.
  38. 제29항에 있어서, 조성물이 약학적 또는 기능식품적으로 허용되는 활성제, 애쥬번트, 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가로 포함하고, 상기 약학적 또는 기능식품적 제형이 약 0.1 중량%(wt%) 내지 약 99.9 wt%의 활성 화합물을 포함하는 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 활성제, 애쥬번트, 부형제 또는 담체가 칸나비스 사티바 오일 또는 CBD/THC, 강황 추출물 또는 커큐민, 테르미날리아 추출물, 버드나무 수피 추출물, 악마의 발톱 뿌리 추출물, 카이엔 페퍼 추출물 또는 캡사이신, 산초 수피 추출물, 필로덴드론 수피 추출물, 홉 추출물, 보스웰리아 추출물, 로즈 힙 추출물, 녹차 추출물, 소포라 추출물, 박하 또는 페퍼민트 추출물, 생강 또는 흑생강 추출물, 녹차 또는 포도씨 폴리페놀, 오메가-3 또는 오메가-6 지방산, 크릴 오일, 감마-리놀렌산, 감귤 바이오플라보노이드, 아세롤라 농축액, 아스타잔틴, 피크노제놀, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 비타민 B, 비타민 A, L-리신, 칼슘, 망간, 아연, 무기질 아미노산 킬레이트(들), 아미노산(들), 붕소 및 붕소 글리시네이트, 실리카, 프로바이오틱스, 장뇌, 멘톨, 칼슘-기반 염, 실리카, 히스티딘, 구리 글루코네이트, CMC, 말토덱스트린, 베타-사이클로덱스트린, 셀룰로스, 덱스트로스, 식염수, 물, 오일, 상어 및 소 연골, 또는 이들의 조합 중 하나 이상으로부터 선택되는 조성물.
  40. 제29항에 있어서, 조성물이 정제, 경질 캡슐, 연질 겔 캡슐, 분말, 또는 과립, 압축 정제, 알약, 고무질, 츄잉 검, 사쉐, 웨이퍼, 바, 또는 액체 형태, 팅크제, 에어리얼 스프레드, 반고체, 반액체, 용액, 에멀젼, 크림, 로션, 연고, 또는 겔 베이스로 제형화되는 조성물.
  41. 제29항에 있어서, 조성물이 경구 투여, 국소 투여, 좌제 투여, 정맥 내 투여, 피내 투여, 위내 투여, 근육 내 투여, 복강 내 투여, 및 정맥 내 투여를 포함하는 투여 경로를 갖는 조성물.
  42. 포유동물의 체중 kg 당 0.01 mg 내지 500 mg의 양의 제29항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 항상성의 조절을 치료, 관리, 촉진하기 위한 방법.
  43. 포유동물의 체중 kg 당 0.01 mg 내지 500 mg의 양의 제29항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 최적화하거나 균형을 맞추고; 바이러스 감염 및 박테리아 감염에 대한 건강한 면역 기능을 유지하도록 돕고; 대기 오염으로 인한 산화 스트레스 손상으로부터 면역계를 보호하고; 바이러스 감염, 박테리아 감염 및 대기 오염으로부터 정상적인 건강한 폐 기능을 보호함으로써 면역 항상성을 유지하기 위한 방법.
  44. 포유동물의 체중 kg 당 0.01 mg 내지 500 mg의 양의 제29항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, HMGB1을 내인성 또는 외인성 반응 공격 트리거로서 조절하고 숙주 면역 반응을 이동시켜 항상성을 회복시키기 위한 방법.
  45. 포유동물의 체중 kg 당 0.01 mg 내지 500 mg의 양의 제29항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 건강한 염증 반응을 지지하고; 감염에 대한 보체 C3 및 C4 단백질, 사이토카인 및 사이토카인 반응의 건강한 수준을 유지하고; TNF-α, IL-1β, IL-6, GM-CSF; IFN-α; IFN-γ; IL-1α; IL-1RA; IL-2; IL-4; IL-5; IL-7; IL-9; IL-10; IL-12 p70; IL-13; IL-15; IL17A; IL-18; IL-21; IL-22; IL-23; IL-27; IL-31; TNF-β/LTA, CRP, 및 CINC3을 완화, 조절 및 유지하기 위한 방법.
  46. 포유동물의 체중 kg 당 0.01 mg 내지 500 mg의 양의 제29항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 산화 반응을 제어하고 산화 스트레스를 완화시키고; 카탈라제(CAT), 글루타티온 퍼옥시다제(GSH-Px), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 및 Nrf2를 증가시켜 항산화 능력을 증가시키고; 말론디알데하이드(MDA), 8-이소-프로스타글란딘 F2α 및 고급 당화 최종-생성물(AGE)을 감소시키거나 유지시키고; 활성 산소 종을 중화하고; UV 및 화학적 산화 스트레스가 DNA 손상을 유발하는 것을 방지하는 방법.
  47. 포유동물의 체중 kg 당 0.01 mg 내지 500 mg의 양의 제29항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 선천성 면역을 개선하고; 적응 면역을 개선하고; 백혈구의 활성 및 수를 증가시켜, 자연 살해(NK) 세포 기능을 향상시키고; T 및 B 림프구, 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구의 수를 증가, 조절, 유지하고; CD3+, CD3- CD56+ NK 세포, CD3+ CD56+ NKT 세포, CD3+ CD56- T 림프구, CD3- CD56- 비-NK, 비-T 림프구, CD3- CD57+ NK 세포, CD3- CD56+ CD57+ NK 세포, CD4+ NKp46+ 자연 살해 세포, TCRγδ+ 감마 델타 T 세포, 및 CD4+ TCRγδ+ 헬퍼 감마 델타 T 세포 및 CD8+ 세포 수를 증가시키고; CD45+ 세포, CD45RA 나이브 T 및 B 세포, 활성화된 CD45R0 및 기억 T 및 B 세포를 조절하고; 대식세포 식세포 활성을 보호 및 촉진하고; 특정 바이러스 균주에 대한 정상 항체 IgG, IgM, IgA 생산, 헤마글루티닌 억제(HI) 역가를 지지하거나 촉진하기 위한 방법.
  48. 포유동물의 체중 kg 당 0.01 mg 내지 500 mg의 양의 제29항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 호흡 기관에서 건강한 폐 미생물총 또는 공생 시스템을 유지하고; 폐 정화 및 해독 능력을 유지하고; 폐 구조적 완전성 및 산소 교환 능력을 보호하고; 호흡 통로를 유지하고 폐포의 산소 흡수 능력을 향상시키고; 산화 스트레스가 폐 손상을 일으키는 것을 완화시키고; 폐의 미세순환을 촉진하고 정상적인 응고 기능을 보호하는 방법.
  49. 포유동물의 체중 kg 당 0.01 mg 내지 500 mg의 양의 제29항의 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 몸살, 인후통, 기침, 경미한 인후 및 기관지 자극, 코막힘, 동울혈, 부비동압, 콧물, 재채기, 후각 상실, 미각 상실, 근육통, 두통, 발열 및 오한을 포함하는 감기 또는 독감-유사 증상을 완화 또는 감소시키고; 가래(점액)를 무르게 하고 기관지 분비물을 묽게 하여 기침을 더 생산적으로 만드는 것을 돕고; 기관지 자극의 중증도를 감소시키고; 바이러스 감염, 미생물 감염 및 대기 오염으로 인한 폐 손상 또는 부종 또는 염증성 세포 침윤의 중증도를 감소시키고; 감기/독감 또는 오염 시즌 동안 기관지 시스템 및 편안한 호흡을 지원하고; 폐 섬유증을 예방 또는 치료하고; 감기/독감의 기간 또는 중증도를 감소시키고; 호흡기 시스템의 바이러스 및 박테리아 감염의 중증도 또는 기간을 감소시키고; 바이러스, 미생물 및 대기 오염 물질로 인한 호흡기 감염을 예방, 치료 또는 치유하고; 호흡기 감염의 진행을 관리하거나 치료하거나 예방하거나 역전시키고; 폐렴의 진행을 관리하거나 치료하거나 예방하거나 역전시키고, 포유동물의 폐 및 전체 호흡기 시스템의 회복 및 재생 기능을 촉진 및 강화하고 회춘시키는 방법.
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