CN116490198A - 用于调节免疫稳态的包含多糖和多酚的基于芦荟的组合物 - Google Patents

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Abstract

公开了用于调节免疫稳态的所用组合物和方法，其包括富含一种或多种多糖的芦荟提取物；富含一种或多种多糖的茯苓提取物；和富含一种或多种多酚化合物的迷迭香提取物的组合。公开了通过调节HMGB1用于维持免疫稳态的组合物，其包含一种或多种多糖和一种或多种多酚化合物的组合。公开了用于治疗、管理、促进调节哺乳动物的免疫稳态的方法，所述方法包括给予0.01mg/kg至500mg/kg哺乳动物体重的有效量的组合物。

Description

用于调节免疫稳态的包含多糖和多酚的基于芦荟的组合物
该专利合作条约申请基于2020年7月9日提交并且题为“Aloe-BasedCompositions Comprising Polysaccharides and Polyphenols for Regulation ofHomeostasis of Immunity”的美国临时专利申请序列号：63049871，其是共同拥有的并且通过引用以其整体并入本文。
背景技术
库拉索芦荟(Aloe barbadensis)M.(芦荟(Aloe vera))，百合科成员，已经用作食品或局部凝胶以及民间药物达数世纪。芦荟最古老的医疗记录可以追溯到公元前2200年，因为已知芦荟植物具有强愈合能力。现今，充分证明的有益作用(例如伤口愈合加速、抗微生物作用、抗炎作用、皮肤保护、毛发生长刺激和免疫刺激性质等)使得芦荟成为营养品和化妆品中的重要成分，在配制为食品、饮料、膳食补充剂、皮肤护理产品等后具有许多应用(Wynn等人，2005；Djuv和Nilsen，2012；Shimpo等人，2002)。
在各种芦荟成分中，乙酰化多糖(ACP)被认为是最重要的活性组分之一。尽管在多糖的结构、化学和物理性质方面存在相当大的差异，据报道芦荟凝胶的主要多糖是乙酰化的甘露聚糖(乙酰吗喃，ACM或AP)，其由用O-乙酰基取代的β-1,4-连接的甘露糖的直链组成，分子量在3,000Da至2,000,000Da的范围内。据报道芦荟多糖具有强抗氧化能力。例如，当在DPPH、羟基和烷基自由基清除测定中测试时，已经报道来自库拉索芦荟凝胶的纯化的多糖的强抗氧化活性(Kang等人，2014)。类似地，在与芦荟植物年龄和功能相关的研究中，发现来自三年生芦荟叶提取物的多糖显示最强的自由基清除活性(72.19％)，在100mg/L的相同浓度下，经由DPPH测定，其显著高于合成抗氧化剂丁基化的羟基甲苯(70.52％)和α-生育酚(65.20％)(Hu等人，2003)。还发现从芦荟(A.vera)分离的多糖具有高抗氧化功效，如在小鼠中慢性醇诱导的肝毒性中氧化应激生物标志物丙二醛(MDA)的减少和体内肝非酶抗氧化剂GSH和酶抗氧化剂SOD的增加所证明的(Cui等人，2014)。
芦荟已经在临床上研究用于皮肤老化、皮肤保护、伤口愈合、牙龈炎、癌症治疗、糖尿病治疗、增强维生素C和维生素E的生物利用度、用于治疗糖尿病前期、肠易激综合征、肝保护、胃和口腔溃疡的治疗。没有进行许多免疫相关的人临床试验，尽管许多体外和体内研究显示来自芦荟叶提取物和来自芦荟多糖的免疫保护或刺激作用。芦荟多糖在紫外照射后降低皮肤细胞中的IL-10(Byeon等人，1998)，并且口服和局部给予芦荟凝胶和分子量在80-200KDa之间的纯化的多糖恢复动物的皮肤免疫功能，该功能被UV暴露所抑制(Qiu等人，2000，Im，2005)。口服给予芦荟多糖显著降低在正常小鼠静脉内注射白色念珠菌(C.albicans)后脾和肾中白色念珠菌的生长(Im，2010)。芦荟多糖也增加细胞因子的产生，包括在环磷酰胺治疗的小鼠的派尔集合淋巴结细胞中的IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IFN-γ和GM-CSF(Im，2014)。在细胞模型(Budai 2013)中，芦荟以剂量依赖性方式显著降低IL-8、TNFα、IL-6和IL-1β细胞因子的产生。抑制作用在原代细胞中实质上更显著。芦荟抑制LPS诱导的原代巨噬细胞中IL-1β前体、Nlrp3、半胱氨酸蛋白酶-1和P2X7受体的表达，减少炎性体激活。此外，LPS诱导的信号转导途径(如NF-κB、p38、JNK和ERK)的激活在这些细胞中被芦荟抑制。改性芦荟多糖(MAP)通过恢复淋巴细胞的增殖活性来恢复小鼠的长期应激诱导的免疫抑制；卵清蛋白(OVA)-特异性T细胞增殖；抗体产生；和细胞毒性T淋巴细胞的细胞杀伤活性(Lee 2016)。
茯苓(Poria cocos Wolf)，一种多孔菌科的真菌，是生长在中国红松树和其它针叶树的根上的药用蘑菇，其通用名为例如中国的茯苓和日本的马氏松木，并且也称为茯苓(hoelen)、茯苓(poria)、茯苓(tuckahoe)或中国树根。其拉丁命名法已经修订了几次，以Wolfiporia extensa作为当前的植物学名称。茯苓在中国作为食品和传统中药(TCM)中的两用成分，其被包括在许多古代煎剂和配方中，这些煎剂和配方甚至在今天仍被广泛使用。茯苓的性质定义为利尿、镇静和被膜(tunic)。茯苓的传统用法是用于治疗恶心、呕吐、腹泻、食欲不振和胃溃疡以及失眠和健忘(Rios 2011；Feng等人，2013)。已经报道了这种真菌和真菌提取物的许多生物活性，包括抗微生物、抗真菌、抗氧化、神经保护、抗炎、抗血管生成和抗癌活性。
茯苓的主要活性成分是β-葡聚糖形式的茯苓(Poria cocos)多糖(PCP)，β-葡聚糖是干燥的真菌子实体的主要组分，其分子量在41KDa至5MDa的范围内。在PCP中检测到葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖，具有β-(1→3)-连接的葡萄糖主链和β-(1→6)-连接的葡萄糖侧链。已经报道了茯苓多糖的可变生物学功能，例如抗氧化、抗高血糖、胃痛缓解、抗炎、抗癌和免疫调节(Sun 2014)。据报道，多糖在体内和体外模型两者中都具有针对不同癌症的抗肿瘤活性。茯苓多糖已显示降低血管平滑肌细胞(VSMC)中ox-LDL诱导的炎症和氧化应激。PCP显著减弱ox-LDL诱导的氧化应激，如通过降低VSMC中的活性氧物质(ROS)和MDA水平，以及增加SOD活性所证明的。PCP也实质上抑制VSMC泡沫细胞形成和细胞内脂质积累。作用机制研究表明PCP可能激活ERK1/2信号转导途径，增加Nrf2从细胞质到细胞核的易位，并增加血红素加氧酶-1(HO-1)表达，具有作为用于治疗动脉粥样硬化的治疗剂的潜力。
三萜类化合物，其正被研究用于抗癌、抗炎和潜在的免疫功能，也被鉴定为茯苓中的活性组分(Ríos 2011；Li等人，2011)。大部分从茯苓中分离的三萜烯衍生自羊毛甾烷或开环羊毛甾烷骨架。尽管茯苓的抗炎机制尚未完全了解，但磷脂酶A酶的抑制已通过若干研究证实(Ríos 2011；Giner-Larza等人，2000)。显示茯苓乙醇提取物的抗炎机制是通过脂多糖(LPS)-刺激的RAW 264.7巨噬细胞中NF-κB信号转导途径的失活来抑制iNOS、COX-2、IL-1β和TNF-α(Jeong等人，2014)。茯苓提取物和羊毛甾烷三萜烯对磷脂酶A2(PLA2)的抑制作用已经在不同的体外和体内模型中清楚地证明(Giner-Larza等人，2000)。茯苓提取物对通过口服或肠胃外给药的PLA2诱导的小鼠爪水肿具有活性。从茯苓中分离的两种羊毛甾烷三萜类物(茯苓酸和去氢土莫酸)被鉴定为来自蛇毒的强磷脂酶A2抑制剂，去氢土莫酸测定的IC50值为0.845mM(Cuéllar等人，1996)。茯苓酸和氢土莫酸也抑制由十四酰佛波醇乙酸酯(TPA)诱导的急性耳水肿，IC50值分别为4.7和0.68nmol/耳。这两种化合物也作用于角叉菜胶和花生四烯酸诱导的急性水肿，指示这些三萜类物作为抗炎治疗剂的潜力(Cuéllar等人，1997)。据报道，来自茯苓的各种分离的三萜烯对TPA或花生四烯酸诱导的耳水肿有相似的抑制(Giner,2000；Yasukawa,1998；Kaminaga,1996)。
茯苓通常包括在免疫调节传统草本植物中。茯苓50％乙醇提取物以剂量依赖性方式增加体外人外周血单核细胞中白介素(IL)-1β和IL-6的分泌。该提取物在以0.4mg/mL治疗6小时后，可以增加细胞因子水平，包括肿瘤坏死因子(TNF)-α；而在以0.2mg/mL治疗3小时后抑制转化生长因子(TGF)-β的分泌(Yu和Tseng，1996)。由于茯苓提取物增强活化的巨噬细胞对免疫刺激子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的分泌，同时抑制免疫抑制子(TGF-β)，它可以用作免疫刺激剂。茯苓多糖(PCP)的潜在机制可能经由激活T细胞。测试PCP对同种异体反应性鼠细胞毒性T淋巴细胞的体内诱导的免疫活性。脾细胞和肠系膜淋巴结细胞内增强的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性持续超过25天(Hamuro，1978)。PCP能显著改进巨噬细胞吞噬、胸腺指数和脾指数(Zhang等人和Peng等人)，并增加血清中IgA、IgG和IgM的水平。研究还显示PCP的免疫调节活性可以经由TLR4/TRAF6/NF-κB信号转导，在体外RAW 264.7巨噬细胞中和在体内小鼠Lewis肺癌(LLC)肿瘤中都得到证明(Tian，2019)。佐剂是疫苗接种策略的重要组分，因为它们增强和加速免疫应答。已经报道了PCP在动物的不同疫苗(包括狂犬病疫苗和乙型肝炎疫苗)中的佐剂活性，指示PCP是用于增强失活疫苗的优良佐剂候选物(Wu，2016；Zhang，2019)。
迷迭香(鼠尾草迷迭香(Salvia Rosmarinus)、迷迭香(Rosmarinusofficinalis))是一种木本、多年生草本植物，生长高达两米。叶常绿，类似于具有辛辣气味的松针。它是唇形科薄荷的成员，原产于地中海地区，并在全世界许多国家(包括美国、英国、法国、西班牙、葡萄牙、摩洛哥、中国等)栽培。新鲜和干燥的叶经常用于传统的地中海菜肴，作为香料来调味各种食物(例如烤肉)。通过蒸馏从新鲜开花的顶部或茎和叶制备的迷迭香叶和迷迭香油两者都可以广泛用于食物和饮料，包括酒精饮料、冷冻乳制品、甜点、焙烤食品和肉制品(Leung和Foster，1996)。迷迭香由于其收敛、滋补、驱风、解痉、利胆、粘液溶解、止痛和发汗性质而成为最古老的已知药用植物之一。在几个世纪，相信迷迭香能增强记忆力和精神上的清晰度。其能够刺激、恢复和提升精神、意愿和身体(Zimmermann，1980；Newall，1996)。迷迭香叶被批准用于治疗消化不良、血压问题、食欲不振和风湿病(PDR forHerbal Medicines，第2版)。其还可以用作民间药，用于消化病、头痛和偏头痛、月经问题、疲倦乏力、头晕和记忆力差。
迷迭香口服用于消化不良、胃肠气胀、人工流产、月经增加、痛风、咳嗽、头痛、肝和胆囊问题、食欲不振，以及用于心血管病况例如高血压(Natural MedicinesComprehensive Database，2010)。迷迭香传统上在草药中用作顺势疗法以帮助缓解与风湿病有关的肌肉和关节疼痛(Leung和Foster，1996；ESCOP 2003)。它可以帮助改进循环，这有益于肌肉紧张和风湿病。迷迭香芳香疗法还可以缓解头痛、降低压力和帮助减轻哮喘和支气管炎症状。据报道迷迭香具有抗微生物、抗真菌和抗病毒活性(Newall，1996)。粉末状叶用作有效的天然跳蚤和蜱虫的驱虫剂。迷迭香油也显示显著的抗菌、抗真菌和抗病毒性质。研究报道了迷迭香的抗氧化活性(Al-Sereiti，1999)。咖啡酸、迷迭香酸和酚二萜、鼠尾草酸和鼠尾草酚是与迷迭香提取物的抗氧化性质相关的化合物。
迷迭香酸(RA)是水溶性咖啡酰基酚酸化合物，是由咖啡酸和3-(3,4-二羟基苯基)乳酸组成的酯。已经报道迷迭香酸是迷迭香和鼠尾草(Salvia)物种的主要组分之一，具有广泛的生物活性，主要是抗氧化、抗微生物、抗病毒、抗癌、抗凋亡和抗炎作用等。14种鼠尾草植物物种中的强抗氧化活性与迷迭香酸含量相关(Adimcilar，2019)。迷迭香酸及其两种代谢物(咖啡酸和3-(3,4-二羟基苯基)乳酸)在非细胞和细胞抗氧化剂测定两者中均显示与阳性对照(槲皮素)相当的有效自由基清除活性(Adomako-Bonsu，2017)。
迷迭香酸(RA)的抗炎作用已经在不同的体外和体内模型中进行了研究，其在一系列炎性疾病(如关节炎、结肠炎、哮喘和过敏性鼻炎)中具有潜在的用途(Amah，2016；Luo，2020)。发现RA抑制IL-1β诱导的大鼠软骨细胞中的IL-6分泌，并且抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5的基因表达和蛋白水平(Hu，2018)。在该研究中，RA还降低ACAN和COL2基因表达，这增强其在治疗骨关节炎中的用途。据报道RA在哮喘的小鼠模型中抑制卵清蛋白(Ova)刺激的气道炎症(Liang，2016)。RA显著减少支气管肺泡灌洗液(BALF)中的炎性细胞和Th2细胞因子，降低总IgE和Ova特异性IgE浓度，并显著改进气道高反应性。用RA预治疗可以显著降低肺组织中AMCase、CCL11、CCR3、Ym2和E-选择素mRNA水平，并降低NF-kB和MAPK激活，指示RA可能是治疗哮喘的有希望的候选物，这可能通过抑制ERK、JNK和p38磷酸化和通过NF-kB的失活。发现口服RA在12-十四酰佛波醇13-乙酸酯(TPA)刺激的小鼠耳水肿模型中有效(Osakabe，2004)，显著减少鼻灌洗液中嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的数量。
在培养的RAW264.7巨噬细胞样细胞中和在大鼠盲肠结扎和穿刺诱导的脓毒症模型中研究迷迭香酸(RA)的防腐作用(Jiang，2009)，所述大鼠具有降低的局部和全身水平的广谱炎性介质。RA以剂量依赖性方式下调TNF-α、IL-6和高迁移率组盒1蛋白(HMGB-1)的水平。RA的抗炎机制可能是经由通过抑制IκB激酶活性来调节NF-κB途径。RA在结肠癌HT-29细胞系和非恶性乳腺上皮细胞系MCF10A两者中均显示促炎基因环加氧酶-2(COX-2)的显著下调(Scheckel，2008)。报道了在感染日本脑炎病毒的小鼠中RA的抗病毒作用，RA治疗组的死亡率降低(Swarup，2007)。与未治疗的感染动物的水平相比，RA可以显著降低病毒载量和促炎细胞因子水平，特别是IL-6和12、TNF-α、IFN-γ和MCP-1。
迷迭香酸已在H22异种移植模型中通过抑制炎性细胞因子和NF-κB途径、减少肿瘤微环境中的炎性信号转导而证明对肝细胞癌(HCC)的抗肿瘤作用(Cao，2016)。RA通过调节CD4+/CD8+T细胞的比率以及IL-2和IFN-γ的分泌、降低IL-6、IL-10和STAT3的表达、上调Bax和半胱氨酸蛋白酶-3和下调Bcl-2而有效抑制肿瘤生长。这些活性指示RA对免疫应答的调节和HCC细胞凋亡的诱导(Cao，2019)。
脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌外膜的完整组分，并且是引发可能导致内毒素休克的全身炎性过程的主要贡献因素。脓毒症可能导致威胁生命的器官功能障碍，由宿主对感染的反应失调引起并导致器官衰竭。它是主要由巨噬细胞/单核细胞介导的状态，并且归因于若干种早期细胞因子(例如TNF-α、IL-1、IL-6和IFN-γ)以及晚期介质(例如HMGB1)的过量产生。高迁移率组盒蛋白1(HMGB1)是脓毒症的关键介质。它响应于内源性和外源性炎性信号而从活化的巨噬细胞和单核细胞中释放(Wang等人，1999)。免疫信号转导的过度活性可能导致细胞因子风暴，其可能导致多器官衰竭并最终死亡。存活的患者可能具有正在进行的炎性应答，其可能由HMGB1的晚期和持续释放很好地驱动(Gentile和Moldawer，2014)。
一旦从刺激的单核细胞主动释放和从坏死细胞被动释放，HMGB1作为用于激活宿主免疫应答的警报素(危险信号)起作用。它在激活先天免疫应答中起关键作用，通过用作趋化因子促进免疫细胞移动到感染部位，以及作为损伤相关分子模式(DAMP)，激活其它免疫细胞以分泌促炎细胞因子(Yang等人，2001)。当促炎细胞因子以低和最佳水平产生时，它们将产生针对病毒或细菌侵入的保护性免疫应答；然而，如果它们是过量产生的，如在“细胞因子风暴”的情况下，它们通过介导有害的炎性应答而对宿主有害。在大多数情况下，对于具有潜在健康状况、免疫缺陷或免疫力受损的受试者以及老年人，细胞因子风暴似乎引起急性全身炎性综合征；存活的那些人可能发展延迟的炎症介导，这可能导致持续的炎性、免疫抑制和/或分解代谢应答。除了用作许多细胞类型(包括所有炎性细胞)的化学引诱物之外，HMGB1引起炎性细胞分泌更多的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和巨噬细胞炎性蛋白(MIP)，表明其参与“细胞因子风暴”(Bianchi和Manfredi，2007)。重要的研究还报道了细胞外HMGB1可能触发破坏性的炎性应答并促进脓毒症和急性肺损伤的发展(Entezari等人，2014)。与内毒素刺激几分钟内分泌的TNF-α和IL-1β相反，HMGB1在体外和体内若干小时后分泌，指示其晚期炎性介导。事实上，当在脓毒性发作后24小时给予HMGB1中和抗体时，提供了抗致死性内毒素血症的保护，指示HMGB1作为致死性脓毒性的晚期介质的关键作用(Wang等人，1999)。临床上，对HMGB1持续高水平和脓毒症晚期或死于脓毒症的受试者之间也建立了强关联(Angus等人，2007)。
老化是复杂的退化过程，其随时间影响身体和精神功能，并且差的免疫应答是老年中最多观察到的变化之一。了解老年人发生的免疫应答下降的潜在机制是其缓解的关键第一步。化学诱导的加速老化模型，例如D-半乳糖诱导的胸腺损伤和免疫衰老小鼠模型，是研究老化对免疫系统影响的优选选择。在化学诱导的动物老化模型中，动物表现出免疫衰老，其模拟在老年人中经常观察到的免疫应答的下降(Azman 2019)。D-半乳糖诱导的老化模型是抗老化研究中常用的且验证良好的动物模型之一。尽管在动物体内它以正常浓度转化成葡萄糖，但高浓度的D-半乳糖可能容易地转化成醛糖和氢过氧化物，导致产生氧衍生的自由基。它还可能与蛋白质和肽的游离胺反应，以通过非酶糖化产生晚期糖化终产物(AGE)。在该模型中这些活性氧物质(ROS)的积累和AGE的增加将导致正常器官和免疫系统稳态的不平衡，这随后可能引起氧化应激、炎症、免疫应答降低、线粒体功能障碍和(例如胸腺细胞的)凋亡，其最终加速老化过程。这些变化在衰老和老化的天然发生的病理特征中。
预期的主题描述了用于调节免疫稳态的新的基于芦荟的组合物，其包含多糖和多酚。关于当前预期的主题，已经从对宿主防御机制的两种单独的应答触发物接近实现免疫的稳态。为了简单起见，基于它们的侵袭起源将这些应答触发物分类为内源性/内在的和外源性/外在的。而暴露于污染、感染、慢性疾病和任何外来侵入落入外源性起源范畴；在该预期的主题中，炎症、氧化应激、应激激素、老化及其相关的变化被分类在内源性起源之下。无论原因如何，对任何所公开的内源性和/或外源性侵袭触发物的恢复、保护和/或预防取决于宿主免疫应答恢复稳态的能力。
在一些实施方案中，预期的方法包括通过优化或平衡免疫应答来维持免疫稳态；改进老化和免疫器官衰老损害的免疫；预防慢性炎症和炎症损害的免疫；帮助维持对流感疫苗接种或COVID-19疫苗接种的健康的免疫应答；帮助维持针对病毒感染和细菌感染的健康的免疫功能；保护哺乳动物的免疫系统免受空气污染诱导的氧化应激损伤。
在当前预期的主题中描述的基于芦荟的新型组合物(包含多糖和多酚的UP 360)显示解决内源性和外源性侵袭情况两者。当脂多糖(LPS)诱导的脓毒症、LPS诱导的急性肺损伤、高氧和微生物感染的小鼠模型和免疫模型用于模仿外源性影响时，使用有和没有免疫的D-半乳糖诱导的加速老化模型来模拟预期的组合物的内源性作用。在两种情况下，当前预期的主题显示宿主免疫应答的统计学显著的改进，表明新组合物恢复稳态的积极驱动。基于观察到的关键免疫和/或炎性应答生物标志物(例如HMGB1)的变化和与免疫衰老相关的变化，评估预期的组合物的功效。通过调节HMGB1，基于芦荟的组合物(包含多糖和多酚的UP 360)证明显著缓解促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP和CINC3，同时增加存活率，指示其作为能够恢复、调节和维持免疫稳态的免疫调节剂的用途。类似地，还发现基于芦荟的组合物UP 360显示免疫衰老的逆转，这通过刺激先天和适应免疫应答(增加的IgA、增加的CD3+T细胞、CD4+辅助T细胞、CD8+细胞毒性T细胞、NKp46+天然杀伤细胞、TCRγδ+γδT细胞和CD4+TCRγδ+辅助γδT细胞)、增强抗氧化能力(增加的SOD和Nrf2)和保护关键免疫器官(例如胸腺)免受老化相关的损伤来证明。
包含多糖和多酚的该新的基于芦荟的组合物UP 360在另外的类别例如随机双盲安慰剂对照的人临床试验中证明了宿主免疫系统的引发和激活，以增加免疫监视和/或稳健应答。具体地，TCRγδ+γδT细胞在每日补充UP 360达28天后的受试者中增加，并且在服用补充剂共56天且在第28天接受流感疫苗免疫攻击的受试者中增加。增加的循环TCRγδ+γδT细胞提示在具有更高百分比TCRγδ+γδT细胞的外周组织(例如皮肤、肠和肺)中提高的免疫监视。在体内LPS诱导的脓毒症模型和体外LPS攻击的巨噬细胞中也测试了在当前预期的主题中组合这些来自药用植物的标准化和富集的提取物的优点，并且如在预期的主题的主体中所述发现了出乎意料的协同作用。通常，将免疫系统表示为杠杆，并将包含多糖和多酚的基于芦荟的组合物表示为支点，通过调节HMGB1对杠杆一侧的作用和γδT细胞对另一侧的反作用实现免疫稳态。
附图说明
图1显示基于芦荟的组合物(该图中为UP 360)通过移动倾覆点-HMGB1而维持免疫功能稳态的新颖性。
图2显示来自用UP 360以500mg/kg治疗的LPS诱导的大鼠的肺组织的H&E染色。A＝正常对照，B＝媒介物对照，C＝丁酸钠，D＝UP360(500mg/kg)。放大100倍。
发明内容
公开了用于调节免疫稳态的组合物，其包括富含一种或多种多糖的芦荟提取物；富含一种或多种多糖的茯苓提取物；和富含一种或多种多酚化合物的迷迭香提取物的组合。
公开了通过调节HMGB1用于维持免疫稳态的组合物，其包含一种或多种多糖和一种或多种多酚化合物的组合，其中所述组合物通过抑制HMGB1释放或抵消其作用来调节HMGB1，通过阻断细胞质易位或通过阻断囊泡介导的释放来靶向HMGB1主动或被动释放；或抑制细胞核中的分子内二硫键形成；或在释放并中和其作用后直接靶向HMGB1；或阻断HMGB1模式识别受体例如Toll样受体(TLR)-2/4/7/9和晚期糖基化终产物受体(RAGE)或抑制其信号转导；或改变所述生理化学微环境并防止形成HMGB1四聚体和干扰HMGB1对TLR和RAGE的结合亲和力；或防止HMGB1的簇形成或自缔合。
公开了用于治疗、管理、促进调节哺乳动物的免疫稳态的方法，所述方法包括给予0.01mg/kg至500mg/kg所述哺乳动物体重的有效量的组合物。
具体实施方式
能够调节、抑制和刺激适应或先天免疫的任何组分的天然化合物称为免疫调节剂、免疫恢复剂、免疫增强剂或生物应答改性剂。在临床实践中，免疫调节剂通常分类为免疫、免疫刺激剂和免疫抑制剂。免疫佐剂是增强疫苗功效的特异性免疫刺激剂。激活或诱导免疫系统的介质或组分的试剂称为免疫刺激剂。免疫刺激剂增强了对自身免疫、癌症、过敏和感染的保护。另一方面，免疫抑制剂是抑制免疫系统的分子，并且可以用于控制病理免疫反应，例如器官移植之后的病理免疫反应。
维持严格的免疫稳态对于防御外部侵入性微生物、病毒、真菌、污染物的生理功能、清除死细胞以及引发呼吸和胃肠功能的重建和更新是必需的。过度刺激的免疫功能可能引起过敏反应和自身免疫破坏性疾病。老化、氧化应激、心理应激、全身炎症和许多慢性疾病(例如糖尿病、肥胖症和代谢综合征)可能移动稳态倾覆点，导致免疫功能受损。健康的生活方式(包括每天平衡营养、锻炼、压力管理和补充抗氧化、抗炎和免疫调节(免疫抑制和/或免疫刺激，取决于具体情况)的天然化合物和用于抗病毒、抗生素、类固醇和NTHE的处方或OTC药物)可以提供平衡免疫功能的有益力量。通过这些手段，可以减少全身和慢性炎症。
不幸的是，对于理解是否存在作为倾覆点因子起关键作用的关键的生物学、生理学和病理学途径和生物标志物的知识和关注少得多，当倾覆点因子过度活化时，可能加速免疫应答从健康水平螺旋下降的移动并导致细胞因子风暴。找到这样的倾覆点是重要的。更重要的是发现活性化合物以制成可以使倾覆点远离破坏性方向并恢复免疫稳态的组合物。我们相信HMGB1是这样的生物标志物，其可以用作倾覆点以逐步提高对病毒(例如冠状病毒SARS-CoV-2)、细菌感染和导致受损和破坏性免疫应答的PM2.5污染物的生物应答。包含多糖和多酚的基于芦荟的组合物可以通过控制HMGB1来移动倾覆点，以恢复、调节和维持免疫稳态(图1)。
HMGB1最初被鉴定为通过稳定核小体的结构和介导DNA中的构象变化来调节转录的核蛋白。与其在细胞核中的作用相反，细胞外HMGB1诱导显著的炎性应答。汇编证据已显示，在几种肺感染的动物模型中，高水平的细胞外HMGB1在气道中的积累可能经由巨噬细胞功能的损伤直接损害宿主对细菌和病毒感染的防御机制。在暴露于长期氧化应激的动物和人的气道中，核HMGB1蛋白水平压倒性地高(与健康对照相比为100倍)。因此，降低气道中HMGB1水平和/或阻断它们的活性，可以为越来越多的经受由细胞因子风暴(例如COVID-19感染)产生的氧化应激的人群和患有炎性病症的那些人群提供重要的治疗和预防策略。
公开了用于调节免疫稳态的组合物，其包括富含一种或多种多糖的芦荟提取物；富含一种或多种多糖的茯苓提取物；和富含一种或多种多酚化合物的迷迭香提取物的组合。在预期的实施方案中并且如本文详细所示的，组合物中的芦荟提取物或茯苓提取物或迷迭香提取物以每种提取物的重量计在1％-98％，其中芦荟:茯苓:迷迭香(APR)的最佳重量比为3:2:1(50％:33.3％:16.7％)或1:1:1(33.3％:33.3％:33.3％)或3:6:1(30％:60％:10％)。
在一些实施方案中，预期的多酚化合物包含(并且在一些实施方案中，选自)迷迭香酸、共轭儿茶素(例如EGCG、ECG、表儿茶素等)、木蝴蝶素、山柰酚、染料木素、槲皮素、紫铆因、木犀草素、柯因、芹菜配基、姜黄素、白藜芦醇、辣椒素、球腺糖A、6-姜烯酚、姜辣素、小檗碱、胡椒碱或其组合。
公开了通过调节HMGB1用于维持免疫稳态的组合物，其包含一种或多种多糖和一种或多种多酚化合物的组合，其中所述组合物通过抑制HMGB1释放或抵消其作用来调节HMGB1，通过阻断细胞质易位或通过阻断囊泡介导的释放来靶向HMGB1主动或被动释放；或抑制细胞核中的分子内二硫键形成；或在释放并中和其作用后直接靶向HMGB1；或阻断HMGB1模式识别受体例如Toll样受体(TLR)-2/4/7/9和晚期糖基化终产物受体(RAGE)或抑制其信号转导；或改变生理化学微环境并防止形成HMGB1四聚体和干扰HMGB1对TLR和RAGE的结合亲和力；或防止HMGB1的簇形成或自缔合。图1显示基于芦荟的组合物(该图中为UP360)通过移动倾覆点-HMGB1而维持免疫功能稳态的新颖性。
公开了用于治疗、管理、促进调节哺乳动物的免疫稳态的方法，所述方法包括给予0.01mg/kg至500mg/kg哺乳动物体重的有效量的组合物。在一些实施方案中，预期的组合物包含富含一种或多种多糖的芦荟提取物；富含一种或多种多糖的茯苓提取物；和富含一种或多种多酚化合物的迷迭香提取物的组合。
已公布和正在进行的研究已经证明，可以减弱细胞外HMGB1积累的试剂通过增强对空气污染物、细菌和病毒感染的先天免疫而有效改进呼吸功能，并经由改进的巨噬细胞功能而阻抑炎性应答。该模型需要使小鼠经受高氧，其通常在氧疗法期间用于COVID-19患者和肺感染，并测试潜在的治疗以确定它们是否可以用作通过改进先天免疫和呼吸功能并抑制细胞外HMGB1在气道和循环中的积累而实现更好的临床结果(包括存活)的有效工具。当前预期的主题公开了包含多糖和多酚的独特的基于芦荟的组合物，通过在这些模型中移动HMGB1而改进先天免疫并缓解呼吸功能受损(实施例12-17)。如在实施例51中所详述的，补充基于芦荟的组合物导致气道中细菌载量的显著降低，并降低暴露于高氧并受铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)攻击的动物的死亡率，指示其在抵消高氧和微生物感染的作用中的有益应用。
通过包含多糖和多酚的基于芦荟的组合物，通过将HMGB1的分泌靶向血流(免疫应答中的天然晚期事件)，预期的主题调节免疫的稳态。在体外，用基于芦荟的组合物的单个成分治疗高氧巨噬细胞，并显示减少HMGB1分泌(实施例12)。由于氧化应激是HMGB1从细胞核释放的最有效的诱导子之一，我们证明芦荟组合物及其单独的组分显示UVA和UVB诱导的人角质形成细胞中活性氧物质(ROS)的减少(实施例13-14)，以及人成纤维细胞中过氧化氢诱导的DNA损伤的保护(实施例15)。这些细胞测定显示从药用植物中提取的这些生物活性化合物在通过抑制自由基产生和修复DNA损伤来降低HMGB1水平方面的统计学显著影响，表明它们的标准化制剂对于涉及疾病病理学中公开的机制的病况具有增强的结果。除了显著和协同地降低LPS诱导的存活率研究中动物的死亡率之外(实施例20-22)，UP 360还显著增加高氧诱导的铜绿假单胞菌感染的小鼠中动物的存活率，并降低气道中的细菌载量(实施例51)。已经从体内测定中评价了关键促炎细胞因子和趋化因子，例如与HMGB1结合的IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、CRP和CINC-3(实施例12-31)，并且作为在免疫稳态中移动倾覆点HMGB1的结果，与媒介物治疗组相比，用基于芦荟的组合物(包含多糖和多酚的UP 360)治疗的动物的这些生物标志物统计学显著降低。
如在预期的主题的主体中所述(实施例18-31、51)，在多个体内研究(例如LPS诱导的脓毒症模型、高氧诱导的铜绿假单胞菌感染的小鼠存活模型和急性肺损伤模型)中评估客观治疗和应答作用。在该预期的主题的实施例中描述的数据显示当向脓毒性、高氧诱导的铜绿假单胞菌感染的小鼠或急性肺损伤研究受试者口服给予时，基于芦荟的组合物的显著的免疫稳态作用。来自血清、支气管-肺泡灌洗液(BAL)和肺匀浆的生物标志物水平的这些显著变化以及BAL中总蛋白的降低通过移动HMGB1-倾覆点证明改进的免疫稳态，并且这些发现后来通过组织学检查证实。在用基于芦荟的组合物治疗的动物中观察到肺损伤和肺水肿的总体严重程度的统计学显著降低。当在LPS诱导的脓毒性模型中评价配制含有两种不同种类的天然活性化合物(免疫刺激多糖和免疫抑制多酚)的基于芦荟的植物提取物的优点时，也观察到了出乎意料的协同作用(实施例22)。来自该当前预期的主题的数据指示，由多糖和多酚组成的基于芦荟的组合物通过移动倾覆点-HMGB1帮助维持免疫的稳态。结果是，基于芦荟的组合物可以在空气污染、季节性流感和/或病毒和细菌感染时使用，所述感染需要平衡的免疫应答以保护呼吸和肺功能免受脓毒症和/或呼吸系统的急性和/或慢性损伤。
总之，来自本研究的数据显示，基于芦荟的组合物(其中这些预期的组合物之一在本文中可以称为UP 360)具有出乎意料的协同活性，导致通过抵消HMGB1而显著缓解由气管内LPS诱导的急性肺损伤，如指示疾病病理学的关键生物标志物所证明的(实施例23-29)。已知LPS直接装入肺中经由肺泡巨噬细胞释放大量HMGB1激活固有的先天免疫应答，导致原代细胞因子(例如TNF-α、IL-1β和IL-6)以及炎性蛋白CRP的产生增加。这些细胞因子能够单独或共同引起显著的肺病理学，触发对疾病病理学有害的细胞因子和趋化因子级联的激活。例如，在急性炎性应答时，趋化细胞因子诱导的嗜中性粒细胞化学引诱物(CINC-3)在LPS诱导的急性肺损伤中嗜中性粒细胞向肺的募集中起重要作用。抑制HMGB1(免疫稳态的关键倾覆点)以控制这些涉及肺中急性炎性应答的主要细胞因子和趋化因子在细胞因子风暴干预和缓解急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的严重程度中具有显著的临床相关性。
蛋白质和/或纤维蛋白渗漏到间质空间中是肺水肿的关键组成部分，其中增加的渗出物指示呼吸疾病严重程度。用由多糖和多酚组成的基于芦荟的组合物治疗降低来自支气管-肺泡灌洗液(BAL)的总蛋白，指示其在缓解肺病理学中的重要性(实施例28)。来自血清、BAL和匀浆物的生物标志物的这些显著变化已经证明，给予基于芦荟的多糖和多酚组合物的策略导致肺损伤和肺水肿的总体严重程度的统计学显著降低，这已经通过组织病理学评价证实。基于这里描述的细胞因子和组织病理学数据，基于芦荟的组合物(在这种情况下为UP 360)调节免疫稳态的倾覆点，其导致细胞因子风暴抑制和急性炎性肺损伤严重程度的缓解。
我们将小鼠暴露于D-半乳糖以诱导免疫老化表型，用两种浓度的包含多糖和多酚的基于芦荟的组合物(UP360)治疗它们，且然后引入流感疫苗作为免疫攻击并在多个测定中测量免疫功能以确定预期的基于芦荟的组合物是否保护免疫器官并维持免疫系统的稳态(实施例32)。正常对照组和UP360+D-gal治疗组两者的胸腺指数均显著高于D-gal组，这证明基于芦荟的组合物保护该免疫器官免于衰老(实施例33和35)。与D-gal组相比，虽然仅正常对照组的脾指数显著更高，UP360+D-gal治疗的动物显示保护脾免受氧化应激的积极趋势(实施例34)。
我们发现在免疫组中体液免疫的显著变化。与D-gal组相比，UP360+D-gal组的血清IgA抗体增加(实施例36)。血清中IgA水平的增加指示，由于UP360治疗，粘膜实现了更高水平的免疫保护。
在测量来自不同组的全血中的白细胞并将变化表达为细胞群的百分比时，我们发现在免疫小鼠组中的重要差异(实施例37-42)。CD45+细胞(所有白细胞)在D-gal组中比任何其它免疫组构成更高百分比的活细胞。与仅D-gal免疫组相比，CD3+T细胞、CD45+辅助T细胞、NKp46+天然杀伤细胞和TCRγδ+γδT细胞在免疫的UP360+D-gal组中均增加。这些数据指示，由多糖和多酚组成的基于芦荟的组合物UP360帮助免疫细胞群的扩增，导致较高百分比的作为免疫稳态的关键介质的先天和适应免疫细胞。
以每μL全血的总细胞表示，我们发现在非免疫小鼠组中的显著差异(实施例43-48)。比起仅免疫受损的D-gal组，400mg/kg UP360+D-gal组具有增加的CD3+T细胞、CD4+辅助T细胞、CD8+细胞毒性T细胞、NKp46+天然杀伤细胞、TCRγδ+γδT细胞和CD4+TCRγδ+辅助γδT细胞。这些数据暗示由多糖和多酚组成的基于芦荟的组合物UP360引发失活的免疫系统并引起免疫细胞群的扩增，增加非免疫小鼠中的免疫“准备”。
天然杀伤细胞的激活和扩增是保持免疫稳态的免疫调节的关键模式。天然杀伤细胞是先天免疫系统的重要组分，已知对多种病理攻击；空气污染物；病毒、微生物和真菌感染；和细胞氧化和激素窘迫快速应答而没有任何引发或预先激活。天然杀伤细胞进行细胞完整性的监视以检测细胞表面分子的变化，以调动它们的细胞毒性效应机制。天然杀伤(NK)细胞用作细胞毒性淋巴细胞和免疫调节细胞因子的生产者。刺激后，NK细胞产生大量的细胞因子，主要是干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。这些细胞因子和由NK细胞产生的其它细胞因子在早期免疫应答期间具有直接作用，并且是通过T细胞和B细胞介导的随后的适应免疫应答的显著调节子。由于口服给予由多糖和多酚组成的预期的基于芦荟的组合物(UP360)，在当前预期的主题中NK细胞的显著增加(实施例41和45)清楚地指示预期的主题对先天免疫调节具有显著影响，表明其立即和有效的免疫触发活性参与为免疫稳态奠定基础。
预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)的人临床试验也证明，在免疫攻击之前和之后，在治疗的群中富含特异性免疫细胞(实施例52)。健康和中年受试者在用流感疫苗攻击其免疫系统之前每天补充UP360或安慰剂持续28天。他们继续服用UP360，持续另外的28天，在基线、治疗28天后和治疗56天后(疫苗接种后28天)进行免疫细胞测量。发现γδ(γδ)T细胞群在第56天(疫苗接种28天后)显著增加，高于基线水平和第28天的水平两者。UP360治疗组在第56天具有比安慰剂组显著更高的循环γδ(γδ)T细胞，并且UP360治疗组从第0天至第56天和从第28天至第56天的γδ(γδ)T细胞数目的变化显著高于安慰剂组。也许来自该临床试验初步数据的最显著的主要结果是在这些γδT细胞中观察到的变化。在补充过程中，从第28天至第56天，给予由多糖和多酚组成的基于芦荟的组合物的受试者显示这些T细胞的水平逐渐增加，其中在给予后第28天和第56天，基于芦荟的组合物显示TCRγδ+细胞群的百分比分别增加21.5％和24.5％。相反，安慰剂组在相同的时间范围内显示这些细胞群的减少，其中在给药后第28天和第56天分别观察到TCRγδ+细胞百分比减少10.5％和5.6％。与安慰剂相比，接受由多糖和多酚组成的基于芦荟的组合物的受试者在给予治疗后第28天和第56天分别显示TCRγδ+细胞群百分比增加23.5％和38.9％。这些发现指示，预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)具有增强γδ(γδ)T细胞群的能力，γδT细胞群是帮助针对病原体的第一道防线的细胞类型。
首先，当前预期的主题的免疫调节、监视和稳态活性已经通过在γδ(γδ)T细胞中观察到的诱导水平(在临床和临床前研究两者中)证实，已知γδT细胞用于免疫调节、促进免疫监视和免疫稳态。γδT细胞是独特的T细胞亚群，主要存在于身体中许多进入的入口，包括肠和肺，在那里它们在发育早期迁移并作为固有细胞持续存在。由于其关键的解剖学位置(胃肠和呼吸系统的粘膜内衬)，γδT细胞基于其在直接杀死受感染细胞、募集其它免疫细胞、激活吞噬和限制病原体或污染物向全身区室转运中的先天样应答而提供第一道防线。已知这些细胞经历快速的群扩增，并对二次攻击提供病原体特异性保护。它们在肠和呼吸道中的理想位置也帮助维持肠和呼吸道上皮完整性。通常，γδT细胞的生理作用包括针对细胞外和细胞内病原体或污染物的保护性免疫、监视、调节先天和适应免疫应答、组织愈合和上皮细胞维持、以及调节生理器官功能。γδT细胞与天然杀伤(NK)细胞共有一些特征，如二者：通常被认为是先天免疫的成分，识别转化/受损的细胞，在抗病毒保护中起到重要作用，促进下游适应免疫应答，并且是有效的溶细胞淋巴细胞。此外，γδT细胞承担抗原呈递细胞的作用(Ribot等人，2021；Bonneville等人，2010)。在当前预期的主题中，这些快速应答的免疫细胞(γδT细胞和NK细胞)已经被预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)诱导(实施例42和48)，导致这些T细胞在实现由组合物产生的免疫调节、监视和稳态方面的增强的特性。
我们检查抗氧化酶和生物标志物，以在D-半乳糖诱导的免疫衰老模型中监视抗氧化途径。D-gal模型诱导的老化表型基于晚期糖基化终产物的增加，引起氧化应激和免疫器官损伤，与年老动物中存在的水平相似(Azman KF，2019)。增加抗氧化途径将对抗氧化应激的有害作用。我们发现，与单独的D-gal相比，来自免疫UP360(两种浓度)+D-gal组的小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)增加(实施例49)。这指示预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)增强抗氧化途径，使得动物能够比未治疗的老化动物更好地中和自由基。
在预期的主题中，我们还观察来自免疫组的动物的脾中的蛋白水平。脾是免疫系统的主要器官之一。它含有高水平的白细胞，并控制血液中免疫细胞类型的水平。我们测量Nrf2，它是参与响应于炎症和长期氧化应激而激活抗氧化途径的转录因子，并且发现与单独的D-gal相比，来自UP360+D-gal组的脾匀浆中Nrf2显著增加(实施例50)。
总之，在D-半乳糖诱导的免疫衰老模型中，我们看到用预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)治疗的动物中免疫细胞群、抗氧化应激途径和免疫器官保护的显著变化，这指示免疫系统引发和激活增加，证明正常小鼠表型的逆转。免疫UP360+D-gal组中胸腺指数、血清抗体、T细胞和天然杀伤细胞以及抗氧化因子高于单独的D-gal，指示UP360治疗组中的免疫系统比单独的D-gal组能更好地应答疫苗接种。非免疫UP360+D-gal组中的胸腺指数、T细胞和天然杀伤细胞高于单独的D-gal。这些数据指示，即使在未受攻击的免疫系统中，UP360引发并激活免疫系统，引起免疫细胞的扩增。这些发现证明预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)能够在主动感染期间帮助激活和维持免疫系统的稳态，并且作为预防剂来引发免疫系统对抗感染。
使用常用的方程(Colby方程)，对从LPS诱导的存活研究和LPS攻击的巨噬细胞对HMGB1和TNF-α分泌获得的数据，评价和证实组合芦荟、茯苓和迷迭香酸提取物(尤其是已经富含特定成分的那些)的临界值。使用Colby方法，当观察值低于预期值时(即降低的死亡率、HMGB1和TNF-α的分泌)，推测具有两种或更多种材料的标准化制剂具有出乎意料的协同作用，存在出乎意料的抑制作用。在当前预期的主题中，旨在证实预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)对于降低死亡率具有出乎意料的协同作用，并且对于HMGB1和TNF-α的分泌具有出乎意料的抑制作用。如在实施例20中说明的，对于两个终点测量，从这些提取物的组合观察到降低死亡率的出乎意料的协同作用。使用预期的组合物治疗所看到的有益作用超过在给定比率下对其每一种成分所观察到的预测作用。只有基于芦荟的组合物在LPS攻击6天后实现死亡率降低的统计学显著性。事实上，在治疗后36小时，对于基于芦荟的组合物没有观察到动物死亡，而对于单独给药的每种成分(即，芦荟、茯苓和迷迭香酸)发现很少的动物死亡。这一事实成立，因为比起单独的成分，对于基于芦荟的组合物，观察到HMGB1和TNF-α从LPS攻击的巨噬细胞中的最低分泌(实施例16和17)。如在该预期主题的背景中所详述的，单独地，存在关于这些药用植物的有益用途的报道，然而，据我们所知，这是第一次将这些药用植物配制在一起以产生预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)产生出乎意料的结果，例如脓毒性动物的死亡率降低，以及HMGB1和TNF-α从巨噬细胞的分泌受到抑制。这些结果与其它有利的先天和适应免疫应答(特别是在人临床研究中观察到的和在该预期的主题中记录的γδT细胞的增加)一起，提供了多糖和多酚组合物的独特同一性，根据需要引导宿主免疫应答的方向至平衡的刺激和/或抑制活性，导致总体免疫稳态。
在以上和以下描述中，阐述某些具体细节以提供对本公开的各种实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，可以在没有这些细节的情况下实践预期的主题。
在本说明书中，除非另外指明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值，并且在适当的时候包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。此外，除非另外指明，否则本文所述的涉及任何物理特征(例如多糖亚单元、尺寸或厚度)的任何数值范围应理解为包括所述范围内的任何整数。除非另有说明，否则本文所用的术语“约”和“基本上由……组成”是指所示范围、值或结构的±20％。应当理解，本文所用的术语“一”和“一个”是指所列举的组分中的“一个或多个”。替代方案(例如，“和/或”)的使用应理解为是指替代方案中的一者、两者或其任何组合。除非上下文另有要求，否则在整个本说明书和权利要求书中，词语“包含(comprise)”及其变体(例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”)以及同义术语(如“包括”和“具有”)及其变体应被解释为开放的、包含性的含义；即“包括但不限于”。
在整个说明书中，对“一个实施方案”或“实施方案”的提及意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构、组成或特性包括在本预期的主题的至少一个实施方案中。因此，在整个本说明书中的各个地方出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定全部指代同一实施方案。
术语“前药”还指包括任何共价键合的载体，当将这样的前药给予哺乳动物受试者时，其在体内释放本公开的活性化合物。本公开的化合物的前药可以通过修饰本公开的化合物中存在的官能团来制备，其方式使得所述修饰在常规操作中或在体内裂解为本公开的母体化合物。前药包括本公开的化合物，其中羟基、氨基或巯基与任何基团键合，当将本公开的化合物的前药给予哺乳动物受试者时，所述基团裂解以分别形成游离羟基、游离氨基或游离巯基。前药的实例包括本公开的化合物中的醇的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物或胺官能团的酰胺衍生物等。
“稳定的化合物”和“稳定的结构”是指足够稳健以经受得住从反应混合物中分离至有用纯度并配制为有效治疗剂的化合物。
“生物标志物”或“标志物”组分或化合物是指指示所公开的植物、植物提取物或具有2-3种植物提取物的组合的组合物中的一种或多种固有化学组分或化合物，其用于控制预期的组合物的质量、稠度、完整性、稳定性和/或生物功能。
“哺乳动物”包括人和家养动物两者，例如实验动物或家庭宠物(例如猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔)和非家养动物(例如野生动物)等。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的要素、组分、事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括其中要素、组分、事件或情况发生的情况以及其中它们不发生的情况。例如，“任选取代的芳基”是指芳基可以被取代或不被取代，并且该描述包括取代的芳基和不具有取代的芳基两者。
“药学上或营养学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括美国食品和药物管理局批准的用于人类或家养动物的可接受的任何辅助剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、媒介物或乳化剂。
“药学上或营养学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐两者。“药学上或营养学上可接受的酸加成盐”是指保留游离碱的生物有效性和性质的那些盐，其不是生物学上或其它方面不期望的，并且其用无机酸和有机酸形成，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有机酸例如乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、扑酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。
“药学上或营养学上可接受的碱加成盐”是指保留游离酸的生物有效性和性质的那些盐，其不是生物学上或其它方面不期望的。这些盐通过向游离酸中加入无机碱或有机碱来制备。衍生自无机碱的盐包括钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。在某些实施方案中，无机盐是铵、钠、钾、钙或镁盐。衍生自有机碱的盐包括伯、仲和叔胺、取代的胺(包括天然存在的取代的胺)、环胺和碱性离子交换树脂(例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、苯乙胺、苄星、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等)的盐。特别有用的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
通常，结晶产生本公开的化合物的溶剂化物。如本文所用，术语“溶剂化物”是指包含一个或多个本公开的化合物的分子与一个或多个溶剂分子的聚集体。溶剂可以是水，在这种情况下溶剂化物可以是水合物。或者，溶剂可以是有机溶剂。因此，本预期的主题的化合物可以作为水合物存在，包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等，以及相应的溶剂化的形式。本公开的化合物可以是真溶剂化物，而在其它情况下，本公开的化合物可以仅保留外来的水或者是水加上一些外来溶剂的混合物。
“药物组合物”或“营养组合物”是指本公开的化合物和本领域公认的用于将生物学上活性化合物递送至哺乳动物(例如人)的介质的制剂。例如，本公开的药物组合物可以配制或用作独立的组合物，或作为处方药、非处方(OTC)药、植物药、草药、天然药物、顺势疗法药剂或政府机构审查和批准的任何其它形式的保健产品中的组分。本公开的示例性营养组合物可以配制或用作独立的组合物，或作为食物、功能性食物、饮料、棒、食物香料、医疗食物、膳食补充剂或草药产品中的营养或生物活性组分。本领域公认的介质包括所有药学上或营养学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
如本文所用，“富含”是指与提取或其它制备之前植物材料或其它来源的重量中发现的一种或多种活性化合物的量相比，植物提取物或其它制剂的一种或多种活性化合物增加到至少两倍且至多约1000倍。在某些实施方案中，提取或其它制备之前植物材料或其它来源的重量可以是干重、湿重或其组合。在一些预期的实施方案中，通过溶剂沉淀、超滤、酶消化、具有硅胶、XAD、HP20、LH20、C-18、氧化铝、聚酰胺、CG161和尺寸排阻柱树脂的柱色谱单独地和/或组合地富集多糖。在一些预期的实施方案中，通过溶剂分配、沉淀、蒸馏、蒸发、超滤、具有硅胶、XAD、HP20、LH20、C-18、氧化铝、聚酰胺、尺寸排阻柱和CG161树脂的柱色谱单独地或组合地富集一种或多种多酚。
如本文所用，“主要活性成分”或“主要活性组分”是指在植物提取物或其它制剂中发现的或在植物提取物或其它制剂中富集的一种或多种活性化合物，其能够具有至少一种生物活性。在某些实施方案中，富集的提取物的主要活性成分将是该提取物中富集的一种或多种活性化合物。通常，与其它提取物组分相比，一种或多种主要活性组分将直接或间接地赋予一种或多种可测量的生物活性或作用中的大部分(即，大于50％、30％或20％或10％)。在某些实施方案中，主要活性成分可以是提取物重量百分比的次要组分(例如，小于提取物中所含组分的50％、25％或10％或5％或1％)，但仍提供大部分期望的生物活性。含有主要活性成分的本公开的任何组合物还可以含有次要活性成分，其可以帮助或可以不帮助富集的组合物的药物或营养活性，但并不达到主要活性组分的水平，并且在不存在主要活性成分的情况下，单独的次要活性组分可能无效。
“有效量”或“治疗有效量”是指当给予哺乳动物(例如人)时足以移动免疫稳态的倾覆点(其导致改进的免疫功能)的本公开的化合物或组合物的量，包括以下任何一种或多种：(1)刺激先天免疫；(2)增强适应免疫，尤其是增加CD3+、CD4+、CD8+、NKp46+天然杀伤细胞、TCRγδ+γδT细胞和CD4+TCRγδ+辅助γδT细胞；(3)抑制慢性全身炎症和氧化应激；(4)保护来自HMGB1诱导的细胞因子风暴损伤的免疫和肺细胞；(5)提供作为有效抗氧化剂以减少氧化应激和增加超氧化物歧化酶(SOD)和Nrf2的功能；(6)维持先天和适应免疫应答稳态；(7)增强体液和细胞介导的免疫应答中巨噬细胞的吞噬指数；(8)抑制转录因子(例如NF-kB、NFAT和STAT3)的激活；(9)抑制淋巴细胞激活和促炎细胞因子基因和/或蛋白表达(IL-2、iNOS、TNF-α、COX-2和IFN-γ)；(10)降低促炎细胞因子(例如HMGB1、IL-1β、IL-6和TNF-α)的水平；(11)下调HMGB1、COX-2、NOS-2和NF-κB的基因和/或蛋白表达；(12)通过抑制磷脂酶A2和TXA2合成酶、COX1、COX2、5-LOX、12-LOX、13-LOX活性来抑制类二十烷酸产生；(13)降低Th1和Th17细胞的应答；(14)降低ICAM和VCAM的表达，导致降低的嗜中性粒细胞趋化性；(15)抑制MAPK磷酸化、粘附分子表达、信号转导和转录激活剂3(STAT-3)；(16)激活转录因子NRF2并诱导血红素加氧酶-1(HO-1)；和抑制HMGB1从细胞核的易位；减少HMGB1单体的二聚体和三聚体的形成。
通过包含多糖和多酚的当前预期的主题调节HMGB1可以是抑制HMGB1释放和/或抵消其作用。基于芦荟的组合物的HMGB1调节作用可以是以下的结果：a)通过阻断细胞质易位和/或通过阻断囊泡介导的释放，靶向HMGB1主动和/或被动释放；和/或抑制细胞核中的分子内二硫键形成；b)在释放并中和其作用后直接靶向HMGB1；c)阻断HMGB1模式识别受体例如Toll样受体(TLR)-2/4/7/9和晚期糖基化终产物受体(RAGE)和/或抑制其信号传导。在感染、炎症和细胞死亡中抑制氧化应激介导的HMGB1释放可以靶向1)在活化的免疫细胞中CRM1介导的HMGB1细胞核输出；2)在坏死中PARP1介导的HMGB1释放；3)在凋亡中半胱氨酸蛋白酶3/7介导的HMGB1释放；4)在自噬中ATG5介导的HMGB1释放；5)在细胞焦亡中PKR介导的HMGB1释放；和6)在netosis中PAD4介导的HMGB1释放。基于芦荟的组合物的作用也可以由防止HMGB1的簇形成或自缔合产生，其可以通过靶向特定的生理化学因素而实现，所述因素例如离子强度(增加离子强度降低HMGB1四聚体的强度)、pH(自缔合的最高速率，pH 4.8)、金属离子尤其是锌(包含低剂量Zn2+促进HMGB1四聚体形成)和氧化还原环境(在模拟细胞外环境的更氧化的条件下，HMGB1主要作为四聚体存在，而在更还原的条件下，例如在细胞内环境中，存在更多的二聚体物质)。通过改变生理化学微环境，包含多糖和多酚的基于芦荟的组合物防止HMGB1四聚体的形成并干扰HMGB1对TLR和RAGE的结合亲和力。
在2-3种植物提取物的各种组合下(本公开中的UP360为实例，但不限于此)，免疫功能和肺结构完整性和功能相关的“生物标志物”调节预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)用于调节免疫稳态，所述生物标志物包括但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、GM-CSF、G-CSF、CCL2/3/5、IP-10、CXCL10、CRP、HMGB1、INF-α/β/γ、NF-κB、PDGF-BB、MIP-1α、D-二聚体、血管紧张素II、心肌肌钙蛋白、VEGF、PDGF、白蛋白、Nrf2、SOD、MDA、iNOS、COX1、COX2、LO5、LO12、LO13。
如本文所用，“病毒”包括但不限于高致病性禽流感(H5N1病毒株A)、流感A(H1N1)、肝炎病毒A、B、C和D；SARS-CoV、SARS-CoV-2(COVID-19)、MERS-CoV(MERS)、呼吸合胞病毒(RSV)、肠道病毒A71(EV71)。
构成“治疗有效量”的本公开的化合物、提取物或组合物的量将根据生物活性化合物或所治疗病况的生物标志物及其严重程度、给予方式、治疗持续时间或所治疗受试者的年龄而变化，但可以由本领域普通技术人员根据其自身知识和本公开常规确定。在某些实施方案中，“有效量”或“治疗有效量”可以表示为相对于哺乳动物体重的多糖和多酚组合物的量(即，0.005mg/kg、0.01mg/kg或0.1mg/kg或1mg/kg或5mg/kg或10mg/kg或20mg/kg或50mg/kg或100mg/kg或200mg/kg或500mg/kg)。人等效日剂量可以通过利用FDA指南考虑动物和人的总身体面积和体重的差异，从动物研究中的“有效量”或“治疗有效量”推断。
如本文所用，“膳食补充剂”是改进、促进、增加、管理、控制、维持、优化、修饰、减少、抑制或防止与天然状态或生物过程相关的稳态、平衡、特定状况或结构和功能完整性、生物功能或表型状况的失衡或受损或受抑制或过度刺激(即，不用于诊断、治疗、缓解、治愈或预防疾病)的产品。例如，关于免疫，膳食补充剂可以用于调节、维持、管理、平衡、抑制或刺激适应或先天免疫的任何组分，作为对免疫刺激剂特异性的免疫，其增强疫苗的功效，增强巨噬细胞的吞噬活性，改进NK细胞的天然杀伤活性，调节促炎细胞因子的产生水平，缓解炎症和组织损伤，诱导抗体的应答和产生，增强抗体依赖性细胞毒性，刺激T细胞增殖，促进免疫抑制性调节T细胞的产生，并保护免疫和肺细胞免受HMGB1诱导的细胞因子风暴损伤，并保护器官和/或组织免受氧化应激。在某些实施方案中，膳食补充剂是特殊类别的食物、功能性食物、医疗食物、营养物、营养产品，并且不是药物。
如本文所用，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指在具有关注的痼疾或病况的哺乳动物(例如人)中治疗关注的疾病或病况，并且包括：(i)预防哺乳动物中的疾病或病况发生，特别是当这样的哺乳动物易患所述病况但尚未诊断为患有所述病况时；(ii)抑制疾病或病况，即阻止其发展；(iii)缓解或改变疾病或病况，即，引起疾病或病况的消退；或(iv)缓解由疾病或病况引起的症状(例如，缓解咳嗽和发热、缓解疼痛、减轻炎症、减轻肺水肿、减轻肺炎)而不解决潜在的疾病或病况；(v)平衡调节免疫稳态或改变疾病或病况的表型。
如本文所用，术语“疾病”和“病况”可以互换使用，或者可以不同，因为特定的疾病或病况可能不具有已知的病因(使得尚未解决病因)，并因此尚未被识别为疾病，而仅被识别为不期望的病况或综合征，其中临床医生已鉴定了或多或少的特定症状组。疾病或病况可以是急性的，例如病毒感染(SARS、COVID-19、MERS、肝炎、流感)或微生物感染；并且可以是慢性的，例如由于暴露于空气污染和烟雾而引起的肺损伤。由于稳态失衡导致的免疫功能受损可能引起疾病或病况，或者可能使哺乳动物更容易感染疾病、细胞突变，或者可能导致与病毒或微生物或空气污染物感染直接或间接相关的更多继发性器官和组织损伤。
如本文所用，“统计显著性”是指当使用Students t-检验计算时p值为0.05或更小，并且指示被测量的特定事件或结果不太可能偶然出现。
为了给药的目的，本预期的主题的化合物可以作为未加工的成分给药，或者可以配制为药物或营养组合物。本预期的主题的药物或营养组合物包含该预期的主题中所述结构的化合物和药学上或营养学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本文所述结构的化合物以有效治疗关注的特定的疾病或病况的量存在于组合物中，即，以足以促进先天或适应免疫或一般免疫稳态或本文所述的任何其它相关指征的量存在，并且通常对患者具有可接受的毒性和/或安全性特性。
纯形式或在适当的药物或营养组合物中的本公开的化合物或组合物或它们的药学上或营养学上可接受的盐的给药可以经由用于提供类似用途的药剂的任何可接受的给药方式进行。本公开的药物或营养组合物可以通过将本公开的化合物与适当的药学上或营养学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合来制备，并且可以配制为固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软凝胶、胶质、软膏、溶液、饮料、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、乳膏、洗剂、酊剂、sashay、即饮型、面膜、微球和气溶胶。这样的药物或营养组合物的典型给药途径包括口服、局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道或鼻内。如本文所用，术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或输注技术。在预期的实施方案中，给药所述组合物选自口服给药、局部给药、栓剂给药、静脉内给药、皮内给药、胃内给药、肌内给药、腹膜内给药和静脉内给药。
配制本公开的药物或营养组合物以在将组合物给予患者后允许其中包含的活性成分是可生物利用的。将给予受试者或患者或哺乳动物的组合物采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如片剂可以是单一剂量单位，并且气溶胶形式的本公开的化合物或提取物或2-3种植物提取物的组合物的容器可以容纳多个剂量单位。制备这样的剂型的实际方法是本领域技术人员已知的，或将是显而易见的；例如，参见Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第20版(Philadelphia College of Pharmacy and Science,2000)。待给药的组合物在任何情况下将含有治疗有效量的本公开的化合物或其药学上或营养学上可接受的盐，用于根据该预期的主题的教导治疗关注的疾病或病况。
本公开的药物组合物或营养组合物，其中活性剂、辅助剂、赋形剂或载体选自以下的一种或多种：大麻(Cannabis sativa)油或提取物或CBD或THC、姜黄提取物或姜黄素、榄仁树提取物、柳树皮提取物、钩果草根提取物、辣椒提取物或辣椒素、花椒树皮提取物、黄檗树皮提取物、啤酒花提取物、乳香(Boswellia)提取物、蔷薇果提取物、绿茶提取物、槐属(Sophora)提取物、薄荷或胡椒薄荷提取物、姜或黑姜提取物、绿茶或葡萄籽多酚、Ω-3和/或Ω-6脂肪酸、磷虾油、γ-亚麻酸、柑橘生物类黄酮、金虎尾(Acerola)浓缩物、虾青素、西洋参、亚洲人参、接骨木、大蒜提取物、大蒜油、狭叶松果菊提取物、龙舌兰糖浆、桉树油、抗坏血酸、碧萝芷、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、维生素B、维生素A、L-赖氨酸、钙、锰、锌、矿物氨基酸螯合物、氨基酸、硼和甘氨酸硼、二氧化硅、益生菌、樟脑、薄荷醇、钙基盐、二氧化硅、组氨酸、葡糖酸铜、CMC、β-环糊精、纤维素、葡萄糖、盐水、水、油、鲨鱼和牛软骨。
本公开的药物或营养组合物可以是固体或液体形式。在一个方面，一种或多种载体是颗粒，使得组合物是例如片剂或粉末形式。一种或多种载体可以是液体，其中组合物是例如口服糖浆、可注射液体或气溶胶，其可用于例如吸入给药。
当旨在口服给药时，药物或营养组合物为固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文考虑作为固体或液体的形式中。
作为用于口服给药的固体组合物，药物或营养组合物可以配制成粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、口香糖、胶质、软凝胶、sashay、薄片、棒剂或类似形式。这样的固体组合物通常含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载体。此外，可以存在以下一种或多种：粘结剂，例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、环糊精、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂，例如藻酸、藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotex；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；调味剂，例如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂；和着色剂。
当药物或营养组合物为胶囊(例如明胶胶囊)形式时，除了上述类型的材料之外，其还可以含有液体载体，例如聚乙二醇或油。
药物或营养组合物可以是液体形式，例如酏剂、酊剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。作为两个实例，液体可以用于口服给药或用于通过注射递送。当旨在口服给药时，除了本发明化合物外，有用的组合物还含有甜味剂、防腐剂、乳化剂、染料/着色剂和增味剂中的一种或多种。在旨在通过注射给药的组合物中，可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
本公开的液体药物或营养组合物，无论它们是溶液、悬浮液或其它类似形式，都可以包括一种或多种以下辅助剂：无菌稀释剂例如注射用水，盐水溶液例如生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠，不挥发油例如可以用作溶剂或悬浮介质的合成的甘油单酯或甘油二酯，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。生理盐水是通常有用的辅助剂。可注射药物或营养组合物是无菌的。
旨在肠胃外或口服给药的本公开的液体药物或营养组合物应当含有一定量的本公开的化合物，使得将获得合适的剂量。
本公开的药物或营养组合物可以旨在局部给药，在这种情况下，载体可以适当地包含溶液、乳液、乳膏、洗剂、软膏或凝胶基料。例如，基料可以包含以下的一种或多种：矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂(例如水和醇)以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于局部给药的药物或营养组合物中。如果旨在经皮给药，则组合物可以包括经皮贴剂或离子电渗装置。
本公开的药物或营养组合物可以旨在直肠给药，例如，以栓剂的形式，其将在直肠中融化并释放药物。用于直肠给药的组合物可以含有油性基料作为合适的无刺激赋形剂。这样的基料包括羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
本公开的药物或营养组合物可以包括改变固体或液体剂量单位的物理形式的各种材料。例如，组合物可以包括在活性成分周围形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常是惰性的，并且可以选自例如糖、虫胶和其它肠溶包衣剂。或者，活性成分可以包裹在明胶胶囊中。
固体或液体形式的本公开的药物或营养组合物可以包括与本公开的化合物结合并从而帮助化合物递送的试剂。可以发挥这种能力的合适的试剂包括单克隆或多克隆抗体、蛋白质或脂质体。
固体或液体形式的本公开的药物或营养组合物可以包括减小颗粒的尺寸以例如改进生物利用度。有或没有赋形剂的组合物中的粉末、颗粒、微粒、微球体等的尺寸可以是宏观的(例如，肉眼可见或尺寸为至少100μm)、微观的(例如，尺寸可以在约100μm至约100nm的范围内)、纳米的(例如，尺寸可以不超过100nm)和其间的任何尺寸或其任何组合，以改进尺寸和堆积密度。
本公开的药物或营养组合物可以由可以作为气溶胶给药的剂量单位组成。术语气溶胶用于表示各种系统，从胶体性质的那些到由加压包装组成的系统。可以通过液化或压缩气体或通过分配活性成分的合适的泵系统进行递送。本公开的化合物的气溶胶可以在单相、双相或三相系统中递送以递送活性成分。气溶胶的递送包括必要的容器、激活器、阀、子容器等，它们一起可以形成试剂盒。本领域技术人员无需过度实验就可以确定最适当的气溶胶。
本公开的药物或营养组合物可以通过药物或营养领域中公知的方法制备。例如，旨在通过注射给药的药物或营养组合物可以通过将本公开的化合物与无菌蒸馏去离子水组合以形成溶液来制备。可以加入表面活性剂以促进形成均匀的溶液或悬浮液。表面活性剂是与本公开的化合物非共价相互作用以促进化合物在水性递送系统中溶解或均匀悬浮的化合物。
本公开的化合物或其药学上或营养学上可接受的盐以治疗有效量给药，其将根据多种因素而变化，所述因素包括采用的具体化合物的活性；化合物的代谢稳定性和作用时间长度；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药方式和时间；排泄速率；药物组合；特定病症或病况的严重程度；和经历疗法的受试者。
本公开的化合物或其药学上或营养学上可接受的衍生物也可以与食物、水和一种或多种其它治疗剂同时、在其之前或之后给药。这样的组合疗法包括给予单一药物或营养剂量制剂，其含有本公开的化合物或提取物或具有2-3种植物提取物的组合物和一种或多种另外的活性剂，以及给予本公开的化合物或提取物或具有2-3种植物提取物的组合物和在其自身单独的药物或营养剂量制剂中的每种活性剂。例如，本公开的化合物或提取物或具有2-3种植物提取物的组合物和另一种活性剂可以以单一口服剂量组合物(例如片剂或胶囊)一起给予患者，或者每种药剂可以以单独的口服剂量制剂给药。当使用单独的剂量制剂时，本公开的化合物和一种或多种另外的活性剂可以在基本上相同的时间(即，同时)或在分开交错的时间(即，顺序)给药；组合疗法应理解为包括所有这些方案。
应理解，在本说明书中，仅当所述化学式的取代基或变量的组合产生稳定化合物时，所述组合才是允许的。
本领域技术人员还将理解，在本文所述的方法中，中间体化合物的官能团可能需要通过合适的保护基团保护。这样的官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。用于羟基的合适的保护基团包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。用于氨基、脒基和胍基的合适的保护基团包括叔丁氧基羰基、苄氧基羰基等。用于巯基的合适的保护基团包括C(O)R”(其中R”是烷基、芳基或芳烷基)、对甲氧基苄基、三苯甲基等。用于羧酸的合适的保护基团包括烷基酯、芳基酯或芳烷基酯。保护基团可以根据本领域技术人员已知的并且如本文所述的标准技术加入或去除。保护基团的使用详细描述于Green,T.W.和P.G.M.Wutz,Protective Groups in Organic Synthesis(1999),第3版,Wiley。如本领域技术人员将理解的，保护基团还可以是聚合物树脂，例如Wang树脂、Rink树脂或2-氯三苯甲基氯树脂。
本领域技术人员还将理解，尽管该预期的主题的化合物的这样的受保护的衍生物本身可能不具有药理学活性，但可以将它们给予哺乳动物，并且之后在体内代谢以形成药理学活性的本公开的化合物。因此，这样的衍生物可以描述为“前药”。该预期的主题的化合物的所有前药都包括在本公开的范围内。
此外，以游离碱或酸形式存在的本公开的所有化合物或提取物可以通过本领域技术人员已知的方法用适当的无机或有机碱或酸处理，将其转化为它们的药学上或营养学上可接受的盐。本公开的化合物的盐可以通过标准技术转化为它们的游离碱或酸形式。
预期的化合物、药用组合物和组合物可以包含或另外包含至少一种活性成分或由其组成。在一些实施方案中，至少一种生物活性成分可以包含植物粉末或植物提取物等或由其组成。
在任何上述实施方案中，包含提取物或化合物的混合物的组合物可以以特定的重量比混合。例如，可以分别以1:2的重量比共混含有多糖的芦荟叶凝胶粉末和含有迷迭香酸的迷迭香提取物。在某些实施方案中，本公开的两种提取物或化合物的比率(按重量计)在约0.5:5至约5:0.5的范围内。当使用多于两种提取物或化合物(例如，三种、四种、五种)时，应用类似的范围。在实施例10中证明的示例性比率包括0.5:1、0.5:2、0.5:3、0.5:4、0.5:5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、2:2、2:3、2:4、2:5、3:1、3:2、3:3、3:4、3:5、4:1、4:2、4:3、4:4、4:5、5:1、5:2、5:3、5:4、5:5、1:0.5、2:0.5、3:0.5、4:0.5或5:0.5。在某些实施方案中，将所公开的芦荟和/或茯苓和/或迷迭香的单独提取物分别以1:1:1、2:1:1、3:1:1、4:1:1、5:1:1、1:2:1、1:3:1、1:4:1、1:5:1、1:1:2、1:1:3、1:1:4、1:1:5、1:2:3、1:2:4、1:2:5、1:2:6、1:2:6、1:2:8、1:2:9或1:2:10等重量比共混成在实施例9和10中证明的具有3种单独提取物的组合物中。在进一步的实施方案中，所公开的芦荟、茯苓和迷迭香的单独提取物已经被组合为称为UP360的预期的组合物，作为实例，但不限于3:6:1或1:1:1或3:2:1共混比的芦荟:茯苓:迷迭香。
在进一步的实施方案中，在体外和/或离体和/或体内模型上评价芦荟、茯苓和迷迭香的单独提取物的这样的组合，以2-3种这些提取物的各种组合(其中包含多糖和多酚的UP360为实例但不限于此)，评价了所感知的生物学功能的优点/缺点和出乎意料的协同/拮抗作用，以及免疫功能的稳态的有效调节，和缓解由细胞因子风暴、氧化应激和脓毒症引起的器官损伤。基于在体外和/或离体和/或体内模型上测量的出乎意料的协同作用，选择具有特定共混比的芦荟或茯苓或白桦茸或迷迭香的单独提取物的最佳组合物，所述协同作用归因于每种提取物中化学组分的多样性和来自每种提取物中不同类型的生物活性化合物的不同作用机制，以及组合物中天然化合物的ADME的潜在增强以最大化生物输出。
在任何上述实施方案中，包含提取物或化合物的混合物的组合物可以以一定的百分比水平或比率存在。在某些实施方案中，包含芦荟全叶或内叶凝胶粉末(实施例3和4)和/或迷迭香提取物(实施例6)的组合物可以包括0.1％至49.9％或约2％至约40％或约0.5％至约10％的多糖、0.1％至99.9％或约1％至约10％或约5％至约50％的迷迭香酸或其组合。在某些实施方案中，包含芦荟凝胶粉末(实施例3和4)或茯苓水性提取物(实施例5)或迷迭香提取物(实施例6)的组合物可以包括约0.01％至约99.9％的多糖或包括至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或90％的迷迭香酸。
在某些实施例(实施例9)中，本公开的组合物可以被配制成进一步包含药学上或营养学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所述药物或营养制剂包含约0.05重量百分比(重量％)或0.5重量百分比(重量％)或5％或25％至约95重量％的提取物混合物的活性或主要活性成分。在进一步的实施方案(实施例9)中，药物或营养制剂包含约0.05重量百分比(重量％)至约90重量％的多糖、约0.5重量％至约80重量％的迷迭香酸、约0.5重量％至约75重量％的总多酚、约0.5重量％至约70重量％、约0.5重量％至约50重量％、约1.0重量％至约40重量％、约1.0重量％至约20重量％、约1.0重量％至约10重量％、约3.0重量％至约9.0重量％、约5.0重量％至约10重量％、约3.0重量％至约6重量％的提取物混合物中的主要活性成分等。在任何上述制剂中，将本公开的组合物配制为片剂、硬胶囊、软凝胶胶囊、粉末或颗粒。
本文还预期所公开的化合物的试剂。这样的产物可以由例如所给予的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等产生，主要是由于酶促过程。因此，预期的化合物是通过包括将预期的化合物或组合物给予哺乳动物一段足以产生其代谢产物的时间的方法产生的那些。通常通过以可检测剂量给予动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、狗、猫、猪、绵羊、马、猴或人)放射性标记的或非放射性标记的本公开的化合物，允许足够的时间以发生代谢，然后从尿、血液或其它生物样品中分离其转化产物，来鉴定这样的产物。
预期的化合物、药用组合物和组合物可以包含或另外包含至少一种药学上或营养学上或化妆品上可接受的载体、稀释剂或赋形剂或由其组成。如本文所用，短语“药学上或营养学上或化妆品上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括美国食品和药物管理局批准的用于人类或家养动物的可接受的任何辅助剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。预期的化合物、药用组合物和组合物可以包含或另外包含至少一种药学上或营养学上或化妆品上可接受的盐或由其组成。如本文所用，短语“药学上或营养学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐两者。
天然免疫抑制剂是抑制免疫系统、抑制慢性全身炎症和氧化应激、保护免疫和肺细胞免受HMGB1诱导的细胞因子风暴损伤、提供有效的抗氧化剂以减少氧化应激和降低NF-kb，和减少促炎途径(COX/LOX和细胞因子-IL-1、IL-6、TNF-α)的分子，因此可以用于控制生理和/或病理免疫反应以实现如当前预期的主题中所证明的免疫功能的稳态。以上说明的那些酚类天然化合物包括但不限于迷迭香酸、山柰酚、染料木素、槲皮素、紫铆因、木犀草素、柯因、芹菜配基、姜黄素、白藜芦醇、辣椒素、球腺糖A、6-姜烯酚、姜辣素、姜油酮、小檗碱、胡椒碱、表儿茶素、秋水仙碱、石蒜碱。
预期迷迭香酸衍生自、获自或选自以下至少一种，单独地或与所有植物部分之一组合：迷迭香、香蜂草(Melissa officinalis)、胶苦瓜(Momordica balsamina)、辣薄荷(Mentha piperita)、紫苏(Perilla frutescens)、鼠尾草(Salvia officinalis)、林地鼠尾草(Teucrium scorodonia)、欧洲变豆菜(Sanicula europaea)、彩叶草(Coleusblumei)、百里香(Thymus spp.)、灌木薄荷(Hyptis verticillata)、紫草(Lithospermumerythrorhizon)和hornwort Anthoceros agrestis或其组合。
含有上述免疫抑制天然酚类化合物的植物物种包括但不限于荜茇(Piper longumLinn)、黄连(Coptis chinensis Franch)、当归(Angelica sinensis(Oliv.)Diels)、苦参(Sophora flavescens Ait)、漆树(Toxicodendron vernicifluum)、光果甘草(Glycyrrhiza glabra)、姜黄(Curcuma longa)、迷迭香、迷迭香、姜(Zingiberofficinalis)、远志(Polygala tenuifolia)、啤酒花(Humulus lupulus)、忍冬(LoniceraJaponica)、药用鼠尾草(Salvia officinalis L.)、积雪草(Centella asiatica)、乳香(Boswellia carteri)、长叶薄荷(Mentha longifolia)、青海云杉(Picea crassifolia)、柑(Citrus nobilis Lour)、酸橙(Citrus aurantium L.)、茶(Camellia sinensis L.)、野葛根(Pueraria mirifica)、葛根(Pueraria lobata)、大豆(Glycine max)、红花石蒜(Lycoris radiate)、秋水仙(Colchicum autumnale)、辣椒物种(Capsicum species)、虎杖(Fallopia japonica)。许多酚类化合物也可以在各种果实和蔬菜中发现，例如茶、番茄、十字花科蔬菜、葡萄、蓝莓、接骨木、树莓、蔓越莓、桑葚、苹果、红辣椒等。
刺激先天免疫、增强适应免疫(特别是CD3+、CD4+、CD8+、NKp46+天然杀伤细胞、TCRγδ+γδT细胞和CD4+TCRγδ+辅助γδT细胞)、保护免疫和肺细胞免受HMGB1诱导的细胞因子风暴损伤、通过与免疫抑制性酚类天然化合物一起配制来维持先天和适应免疫应答的稳态的天然多糖包括但不限于甘露聚糖、乙酰甘露聚糖、半乳糖甘露聚糖、葡聚糖、β-葡聚糖(例如来自茯苓提取物)、α-1,6和α-1,4葡聚糖、β-1,3-葡聚糖、岩藻依聚糖、果聚糖和果胶。
含有上述免疫刺激天然多糖化合物的植物物种包括但不限于芦荟、库拉索芦荟、好望角芦荟(Aloe ferox)、木立芦荟(Aloe arborescens)、黄芪(Astragalusmembranaceus)、灵芝(Ganoderma lucidum)、青稞(Hordeum vulgare)、姬松茸(Agaricussubrufescens)(巴西菇(A.blazei))、松果菊(Echinacea purpurea)、狭叶松果菊(Echinacea angustifolia)、舟形乌头(Aconitum Napellus)(舟形乌头)、接骨木花(Sambucus nigra)、茯苓、茯苓、催眠睡茄(Withania somnifera)、柴胡(Bupleurumfalcatum)、柴胡(Radix Bupleuri)、甘草(Radix Glycyrrhiza)、连翘(FructusForsythiae)、西洋参(Panax quinquefolium)、人参(Panax ginseng C.A.Meyer)、韩国红参(Korea red ginseng)、香菇(Lentinula edodes)(香菇)、桦褐孔菌(Inonotusobliquus)(白桦茸)、香菇、宁夏枸杞(Lycium barbarum)、裂蹄木层孔菌(Phellinuslinteus)(子实体)、变色栓菌(Trametes versicolor)(子实体)、瓜尔豆胶(Cyamopsistetragonolobus)(瓜耳胶)、变色栓菌、岗村枝管藻(Cladosiphon okamuranus Tokida)、裙带菜(Undaria pinnatifida)。许多多糖化合物也可以在各种果实和蔬菜中发现，例如蘑菇、海藻、酵母、褐藻、龙舌兰糖浆、褐色海藻、可发酵纤维、谷物、海参、龙舌兰、洋蓟、芦笋、韭菜、大蒜、洋葱、黑麦、大麦仁、小麦、梨、苹果、番石榴、榅桲、李子、鹅莓、橙子和其它柑橘果实。
乙酰化多糖是植物细胞壁聚合物的一部分。据报道，与常规多糖相比，乙酰化多糖具有更高的抗氧化、更好的免疫调节性质。O-乙酰化的程度可以根据物种、部分和发育状态而变化。已经证明，一些天然多糖中的乙酰基含量在它们的生物活性中起到重要作用，尽管O-乙酰化机制仍然没有完全了解。
在一些实施方案中，本公开的多糖和/或酚类化合物或提取物可以从植物和/或海洋来源分离，例如，从实施例1-8和整个本申请中别处包括的那些植物分离。用于分离化合物的合适的植物部分包括叶、树皮、树干、树干皮、茎、茎皮、小枝、块茎、根、根茎、根皮、树皮表面、嫩枝、籽、果实、子实体、雄蕊群、雌蕊群、花萼、雄蕊、花瓣、萼片、心皮(雌蕊)、花或其任意组合。在一些相关的实施方案中，化合物或提取物从植物来源分离、全合成、用植物或真菌组织、干细胞和转基因微生物合成并合成修饰以含有任何所述取代基。在这方面，从植物分离的化合物的合成修饰可以使用本领域已知的并且在本领域普通技术人员的知识范围内的任何数目的技术来完成。
预期的主题的其它实施方案涉及使用包含多糖和多酚的基于芦荟的组合物调节免疫稳态的方法，以2-3种植物提取物的各种组合，UP360为本公开中的实例但不限于此，所述方法包括但不限于优化和/或平衡免疫应答；帮助维持针对病毒感染和细菌感染的健康的免疫功能；保护免疫系统免受空气污染和吸烟诱导的氧化应激损伤；保护正常健康的肺功能免受病毒感染、细菌感染和空气污染；支持健康的炎性应答；维持细胞因子的健康水平和细胞因子对感染的应答；升高和维持抗炎细胞因子(例如IL-10)；控制氧化应答和缓解氧化应激；维持肺清洁和排毒能力；保护肺结构完整性和氧交换能力；维持呼吸道并增强肺泡的吸氧能力；缓解氧化应激引起的肺损伤；促进肺的微循环和保护正常凝血功能；增加白细胞的活性和计数、增强天然杀伤(NK)细胞功能；增加T和B淋巴细胞的计数；增加CD3+、CD4+NKp46+天然杀伤细胞、TCRγδ+γδT细胞和CD4+TCRγδ+辅助γδT细胞和CD8+细胞计数；保护和促进巨噬细胞吞噬活性；支持和/或促进正常抗体产生；维持呼吸器官中的健康的肺微生物群和/或共生系统；缓解和/或降低感冒/流感样症状，包括但不限于身体疼痛、喉咙痛、咳嗽、轻微的喉咙和支气管刺激、鼻塞、鼻窦充血、窦压、流鼻涕、打喷嚏、丧失嗅觉、丧失味觉、肌肉疼痛、头痛、发热和寒战；帮助疏松痰(粘液)和稀薄支气管分泌物，以使咳嗽更生痰；降低支气管刺激的严重程度；降低由病毒感染、微生物感染和空气污染引起的肺损伤和/或水肿和/或炎性细胞浸润的严重程度；在感冒/流感和/或污染季节支持支气管系统和舒适呼吸；预防和/或治疗肺纤维化；降低普通感冒/流感的持续时间和/或严重程度；降低呼吸系统的病毒和细菌感染的严重程度和/或持续时间；预防和/或治疗和/或治愈由病毒、微生物和空气污染物引起的呼吸道感染；管理和/或治疗和/或预防和/或逆转呼吸感染的进展；促进和加强和恢复肺和整个呼吸系统等的修复和更新功能。
实施例
实施例1.有机和水性提取物的制备
将干燥的磨碎的各植物的植物粉末(20g)装入100ml不锈钢管中，并使用ASE 300自动提取物器在80℃和1500psi下用有机溶剂混合物(比率为1:1的二氯甲烷/甲醇)提取两次。自动过滤并收集提取溶液，然后用新鲜溶剂冲洗并用氮气吹扫至干燥，然后在50℃下转换为水性提取。用旋转蒸发器蒸发合并的有机提取溶液，以得到粗有机提取物(OE)。将生物质风干，并用DI水提取一次。过滤水性溶液并冷冻干燥以提供水性提取物(AE)。
使用相同的程序获得类似的结果，但是用甲醇或乙醇代替有机溶剂混合物，以分别提供甲醇提取物(ME)或乙醇提取物(EE)、乙醇:H2O(7:3)提取物、乙醇:H2O(1:1)提取物、乙醇:H2O(3:7)提取物和水提取物。
实施例2.芦荟叶凝胶粉末的样品制备
洗涤芦荟植物的新鲜叶，并去除外皮。用纤维素酶处理叶凝胶的渗出物，并通过活性炭过滤。通过低压蒸发浓缩滤液，并通过冷冻干燥、涂抹干燥或处理脱水至干粉末。以200:1至100:1的比率生产冻干物形式的芦荟叶凝胶粉末，具有不少于8％的多糖。
实施例3.用乙醇沉淀方法制备芦荟多糖
将芦荟叶凝胶粉以40g/L的浓度溶解在水中，并在用磁力搅拌棒持续搅拌期间缓慢地向溶液中加入乙醇，使溶液达到80％乙醇。通过以2500rpm离心从上清液中分离沉淀物，并通过Speedvac干燥。加工1kg芦荟叶凝胶粉末(批次WM 180141)总共可以得到379g沉淀物。将沉淀物和上清液进行尺寸排阻柱(SEC)色谱法，同时进行HPLC分析，揭示在上清液中没有检测到超过10K的多糖，并且沉淀物含有40.5％的分子量大于10KD的多糖(表1)。
表1.芦荟沉淀物和上清液中多糖的含量
nd＝未检测到
实施例4.通过超滤制备三种芦荟多糖级分
将379g芦荟沉淀物以20g/L的浓度溶解在水中。水溶液以0.5-10L/小时的流速经受超滤(BONA-GM-18，得自Jinan Bona Biotechnology)，顺序通过具有不同孔径的有机超滤膜，分别过滤出分子量为1KD、5KD、50KD、300KD和500KD的多糖。收集三种多糖级分：>500kD(45.7g)、50-500kD(30.1g)和5-50KD(19.8g)，并用冻干机干燥。用SEC HPLC和NMR方法分析分子量分布和多糖纯度。
实施例5.茯苓提取物的制备
将干燥的磨碎的植物茯苓菌核粉末(20g)装入100ml不锈钢管中，并使用ASE 300自动提取物器在80℃和1500psi下用有机溶剂混合物(比率为1:1的二氯甲烷/甲醇)提取两次。自动过滤并收集提取溶液，然后用新鲜溶剂冲洗并用氮气吹扫至干燥，然后在50℃下转换为水性提取。用旋转蒸发器蒸发合并的有机提取溶液，以得到粗有机提取物(OE)0.82g(4.10％产率)。将生物质风干，并用水提取一次。过滤水性溶液并冷冻干燥以提供水性提取物(AE)0.51g(2.55％产率)。
将干燥的磨碎的植物茯苓菌核粉末(20g)装入100ml不锈钢管中，并使用ASE 300自动提取物器在80℃和1500psi下用乙醇提取两次。自动过滤并收集提取溶液，然后随后用新鲜溶剂冲洗并用氮气吹扫至干燥，然后在50℃下转换为水性提取。用旋转蒸发器蒸发合并的有机提取溶液，以得到粗乙醇提取物0.3893g(1.95％产率)。将生物质风干，并用水提取一次。过滤水性溶液并冷冻干燥以提供水性提取物(AE)0.3581g(1.79％产率)。
使用相同的程序获得类似的结果，但是用甲醇或乙醇代替有机溶剂，以分别提供甲醇提取物(ME)或乙醇提取物(EE)、乙醇:H2O(7:3)提取物、乙醇:H2O(1:1)提取物、乙醇:H2O(3:7)提取物和水提取物。
用水提取干燥的磨碎的茯苓子实体粉末，以得到批号为210317的茯苓水提取物，提取产率为15:1。茯苓提取物中的多糖通过比色法测定，使用苯酚-硫酸方法，UV波长490nm，针对葡萄糖。通过香草醛-硫酸方法在548nm UV波长下针对齐墩果酸定量茯苓提取物中的总三萜类化合物。用比色法测定多糖含量在10-40％的范围内的不同的茯苓提取物的活性含量(表2)。
表2.茯苓提取物的活性含量
表3.基于SEC HPLC分析的茯苓多糖的分子量分布
茯苓提取物样品ID L784 L770 P00482 201109-2
多糖(>5kD) 33.05％ 38.21％ 8.71％ 7.67％
>2000K 0％ 0％ 0％ 0.00％
2000K-1000K 0.03％ 0％ 0％ 0.00％
1000K-500K 0.29％ 0％ 0％ 0.00％
500K-200K 0.95％ 0.11％ 0％ 0.10％
200K-50K 5.02％ 2.23％ 0％ 1.18％
50K-5K 69.77％ 75.17％ 11.91％ 15.63％
5K-0.5K 23.93％ 22.48％ 88.00％ 83.09％
制备20mg/mL浓度的具有多糖的茯苓提取物样品，并通过尺寸排阻色谱法(SEC)HPLC用PolySep-SEC-P5000柱(Phenomenex OOH-3145KO，30×0.78cm)在50℃下分析，用100mM NaCl溶液以0.7mg/min的流速等度洗脱，通过RI检测器使用一系列分子量在9.9KDa至2,285KDa的范围内的葡聚糖分子量标准物检测。基于每个分子量截止值(由标准校准适当地预先计算)，将多糖与目标峰上的垂直游标积分。如在表3中所示，计算每个样品的多糖分布和总多糖含量。
用该SEC-HPLC方法计算茯苓提取物L784中分子量超过5KDa的总多糖含量为33.05％，主要在5-2000KDa的范围内。通过该SEC-HPLC方法，茯苓多糖含量在5％-40％的范围内变化。
实施例6.迷迭香提取物的制备
将干燥的磨碎的植物迷迭香地上部分粉末(20g)装入100ml不锈钢管中，并使用ASE 300自动提取物器在80℃和1500psi下用有机溶剂混合物(比率为1:1的二氯甲烷/甲醇)提取两次。自动过滤并收集提取溶液，然后用新鲜溶剂冲洗并用氮气吹扫至干燥，然后在50℃下转换为水性提取。用旋转蒸发器蒸发合并的有机提取溶液，以得到粗有机提取物(OE)2.19g(10.95％产率)。将生物质风干，并用水提取一次。过滤水性溶液并冷冻干燥以提供水性提取物(AE)1.26g(6.31％产率)。
用乙醇/水提取干燥的迷迭香叶并浓缩滤液。分离上层液体并通过真空进一步干燥并通过柱富集，以得到迷迭香提取物，其中迷迭香酸含量在5-95％的范围内。
使用相同的程序获得类似的结果，但是用甲醇或乙醇代替有机溶剂混合物，以分别提供甲醇提取物(ME)或乙醇提取物(EE)、乙醇:H2O(7:3)提取物、乙醇:H2O(1:1)提取物、乙醇:H2O(3:7)提取物和水提取物。
以100:1的提取比，通过乙醇和水的混合溶剂提取干燥的迷迭香叶，并用乙酸乙酯进一步提取，以得到具有约30％的迷迭香酸的富含迷迭香酸的迷迭香提取物。通过HPLC检测和定量迷迭香酸提取物，含量在10-90％的范围内(表4)。
表4.迷迭香提取物的活性含量
实施例7.白桦茸提取物的制备
将干燥的磨碎的植物白桦茸(桦褐孔菌)粉末(20g)装入100ml不锈钢管中，并使用ASE 300自动提取物器在80℃和1500psi下用有机溶剂混合物(比率为1:1的二氯甲烷/甲醇)提取两次。自动过滤并收集提取溶液，然后随后用新鲜溶剂冲洗并用氮气吹扫至干燥，然后在50℃下转换为水性提取。用旋转蒸发器蒸发合并的有机提取溶液，以得到粗有机提取物(OE)。将生物质风干，并用水提取一次。过滤水性溶液并冷冻干燥以提供水性提取物(AE)。
以4:1的比率用水提取磨碎的干燥的白桦茸(桦褐孔菌)粉末，以得到水提取物，其中多糖含量在5-95％的范围内。使用相同的程序获得类似的结果，但是用甲醇或乙醇代替有机溶剂混合物，以分别提供甲醇提取物(ME)或乙醇提取物(EE)、乙醇:H2O(7:3)提取物、乙醇:H2O(1:1)提取物、乙醇:H2O(3:7)提取物和水提取物。
实施例8.黄芪提取物的制备
将干燥的磨碎的植物黄芪根粉末(20g)装入100ml不锈钢管中，并使用ASE 300自动提取物器在80℃和1500psi下用有机溶剂混合物(比率为1:1的二氯甲烷/甲醇)提取两次。自动过滤并收集提取溶液，然后用新鲜溶剂冲洗并用氮气吹扫至干燥，然后在50℃下转换为水性提取。用旋转蒸发器蒸发合并的有机提取溶液，以得到粗有机提取物(OE)1.68g(8.42％产率)。将生物质风干，并用水提取一次。过滤水性溶液并冷冻干燥以提供水性提取物(AE)2.93g(14.68％产率)。
以1:8的比率用水提取磨碎的干燥的黄芪根粉末两次，以得到提取产率为4:1的水提取物，具有不少于10％的多糖。使用相同的程序获得类似的结果，但是用甲醇或乙醇代替有机溶剂混合物，以分别提供甲醇提取物(ME)或乙醇提取物(EE)、乙醇:H2O(7:3)提取物、乙醇:H2O(1:1)提取物、乙醇:H2O(3:7)提取物和水提取物。
实施例9.基于芦荟的组合物UP360和其它组合的制备
如在上述实施例中证明的，以200:1的比率生产冻干物形式的芦荟叶凝胶粉末，具有不少于10％的多糖。通过水提取制备茯苓提取物，具有不少20％的多糖。通过乙醇/水提取制造迷迭香叶提取物，以得到不低于30％的迷迭香酸。将三种成分以3:6:1的重量比混合，以得到预期的基于芦荟的组合物的最终组合(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)。通过用YUCHENGTECH10L Lab干粉末混合机将三种成分混合1小时，生产两批次批号为APR-05012020-1和APR-05012020-2(表5)的UP360，其中通过SEC-HPLC方法如在实施例5中测定多糖含量(>5KDa)为12.07％。
将芦荟内凝胶粉末、茯苓提取物和迷迭香叶提取物以1:1:1的重量比共混，以得到批号为UP0319的组合组合物UP360。
将芦荟内凝胶粉末、茯苓提取物、迷迭香叶提取物和赋形剂(Gillco)以3:2:1:4的重量比共混，以得到批号为UP360-APR-09012020的组合物UP360的另一组合(4.011kg)，其中通过SEC-HPLC方法测定多糖含量(>5KDa)为11.01％(表6)。
将芦荟内凝胶粉末、茯苓提取物、迷迭香叶提取物和赋形剂(Gillco)以3:3:1:3的重量比共混，以得到批号为UP360-Lit-1的组合物UP360的另一组合。通过SEC-HPLC方法测定多糖含量(>5KDa)为16.73％(表6)。
表5.批号APR-05012020-1和APR-05012020-2的UP360的共混记录。
表6：通过SEC HPLC测定的UP360中多糖的分子量分布
批号 APR-05012020-1 APR-09012020 UP360-Lit-1
多糖(>5kD) 12.07％ 11.01％ 16.73％
>2000K 0.00％ 0.79％ 1.14％
2000K-1000K 0.00％ 1.37％ 1.33％
1000K-500K 0.00％ 1.18％ 0.93％
500K-200K 0.00％ 1.26％ 1.41％
200K-50K 0.05％ 1.53％ 2.97％
50K-5K 11.75％ 8.77％ 14.41％
5K-0.5K 88.20％ 85.49％ 77.81％
实施例10.组合1和组合2的制备。
组合1是芦荟叶凝胶粉末(L0765，10％的多糖)、茯苓提取物(L0761，20％的多糖)和迷迭香提取物(L0762，30％的迷迭香酸)的混合物，比率为1:1:1，按每个单独成分的重量计。
组合2是白桦茸(桦褐孔菌)提取物(L0762，30％的多糖)和黄芪提取物(L0759，黄芪甲苷>0.3％，多糖>10％)的混合物，重量比为1:1。组合2可以由白桦茸(桦褐孔菌)提取物和黄芪提取物以1:99至99:1的比率混合制成。
实施例11.富含多糖的样品与α-淀粉酶的酶促反应，以及通过尺寸排阻色谱法对茯苓提取物、芦荟凝胶粉末和UP360的多糖定量
将在pH值为6.87的NaH2PO4·H2O和Na2HPO4·7H2O的10mL缓冲溶液中的200mg植物提取物用200μLα-淀粉酶酶溶液(2mg/mL)在室温下处理过夜。在SpeedVac中干燥反应混合物并通过尺寸排阻色谱法分析。
制备20mg/mL浓度的具有多糖的样品，并通过尺寸排阻色谱法HPLC用PolySep-SEC-P5000柱(Phenomenex OOH-3145KO，30×0.78cm)在50℃下用100mM NaCl溶液以0.7mg/min的流速等度洗脱进行分析，这通过RI检测器使用一系列分子量在9.9KDa至2,285KDa的范围内的葡聚糖分子量标准物进行检测。基于每个分子量截止值(由标准校准适当地预先计算)，将多糖与目标峰上的垂直游标积分。计算每个样品的多糖分布和总多糖含量。
茯苓多糖对该酶有抗性，淀粉酶处理前后具有33.50％至30.04％的非常轻微的变化。反应前后最终UP360组合物(APR-09012020)中的多糖也是这样。而主要由α型多糖组成的麦芽糖糊精几乎完全被淀粉酶消化，在反应前具有64.1％的多糖，处理后仅有0.97％的多糖(>5Ka)。
表7.在α-淀粉酶水解前后，用HPLC方法对茯苓提取物、UP360和麦芽糊精进行多糖定量
实施例12.抑制高氧诱导的HMGB1从功能障碍的巨噬细胞中的释放
在高氧条件下培养的巨噬细胞经历氧化应激，引起它们分泌HMGB1到细胞培养基中。为了测定基于芦荟的组合物及其组分在减少培养的巨噬细胞的细胞外HMGB1的积累中的功效，在存在或不存在25μg/mL浓度的测试物质的情况下，将RAW 264.7细胞暴露于21％O2(室内空气(RA))或95％O2达24小时。在单一浓度的测试物质下，通过ELISA一式两份测定细胞培养物上清液中的HMGB1水平。数据表示为一式两份测定的一个实验的平均值±SEM。与仅用媒介物在高氧下处理的巨噬细胞相比，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。对照细胞用水杨酸钠(SS)处理作为阳性对照，其减弱高氧损害的巨噬细胞功能和氧化应激诱导的HMGB1释放。
表8.在RAW 264.7细胞中的抗HMGB1作用
实施例13.高氧诱导的功能障碍巨噬细胞吞噬测定
研究已揭示培养的巨噬细胞中HMGB1的细胞外积累的水平与它们的吞噬能力相关。在测试物质或其媒介物存在下，将RAW 264.7细胞保持在室内空气(21％O2)中或者暴露于95％O2达24小时。通过MTT测定确定细胞活力。每个值代表一式三份4次独立实验的平均值±SEM。与T24(21％O2；0μg/ml)对照组相比，*P≤0.05。
表9.在培养的RAW 264.7细胞中的MTT测定
表10.在培养的RAW 264.7细胞中的吞噬测定
在测试物质存在下，将RAW 264.7细胞保持在室内空气(21％O2)中或者暴露于95％O2达24小时。然后将细胞与FITC标记的乳胶微珠孵育1小时，并用鬼笔环肽和DAPI染色以分别显现肌动蛋白细胞骨架和细胞核。为了定量吞噬活性，计数每组至少200个细胞，并且每个细胞的珠数目表示为与21％O2(0μg/ml)对照组相比的百分比增加。每个值代表每组一式两份3次独立实验的平均值±SEM。与21％O2(0μg/ml)对照组相比，*P≤0.05。
测试纯迷迭香酸(实施例6)、白桦茸的水性提取物(实施例7)和两种组合物(实施例10)，并且结果总结于表9和10中。
实施例14.在HaCaT细胞中UVA和UVB诱导的ROS测定
将HaCaT细胞(人永生化角质形成细胞)以8,000个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板中，并用25μg/mL的测试物质处理24小时。评价细胞毒性以去除假阳性(CCK>80％活力)。将DCFH-DA(荧光探针)加入到细胞中以检测ROS产生，并在37℃下孵育25分钟。在具有紫外滤光器的太阳模拟器(Sol-UV-6太阳模拟器)下暴露于UV照射10分钟后，通过多模式读取器在488nm(激发)和525nm(发射)下测量荧光值。维生素C用作阳性对照，以40μg/mL处理，ROS产生减少43％。与暴露于UV的HaCaT细胞的水平相比，在25μg/mL下，迷迭香酸使ROS产生减少24％。以50μg/mL测试有机提取物(OE)，而以100μg/mL测试水性提取物。在该测定中，以25μg/mL测试级分或纯化合物。
表11.在HaCaT细胞中针对UV-ROS产生的抑制
实施例15.30％过氧化氢测定诱导的人成纤维细胞的DNA损伤
将HSF细胞(人成纤维细胞)接种在96孔组织培养板中，并在37℃和5％CO2和95％空气中与测试物质一起孵育。通过与浓度为1mM的H2O2孵育4小时，处理过的HSF细胞经受DNA损伤，然后免疫染色γH2AX，其为DNA双链断裂标志物的磷酸化组蛋白。DAPI用于染色细胞核。由Image Xpress拍摄照片并用Meta Xpress分析。儿茶素(100μg/ml)用作阳性对照，DNA损伤减少70％，如通过γH2AX染色的定量评估。迷迭香酸在25μg/mL时将DNA损伤降低24％。
实施例16：包含多糖和多酚的基于芦荟的组合物(UP360)显示在LPS攻击的巨噬细胞中HMGB1和TNF的剂量相关的抑制
将1,000,000个RAW 264.7小鼠巨噬细胞样细胞在具有1μg/mL脂多糖(LPS)的60mm培养皿中的无血清培养基中铺板(对照组除外)。一式两份地加入以下浓度的在实施例9中制备的包含多糖和多酚的UP360组合物：UP360-125、250和500μg/mL。在抽吸培养基之前，将细胞处理24小时，并在10,000MWCO过滤器中离心以浓缩。将培养基在SDS-PAGE上运行并转移到PVDF膜以印迹HMGB1和TNF-α。用丽春红S染色印迹，并将光密度分析法归一化为总蛋白量。
基于芦荟的组合物UP360显示在LPS攻击的巨噬细胞中HMGB1和TNF-α的剂量相关的显著抑制。从蛋白质印迹半定量数据发现，当巨噬细胞用LPS攻击时，对于媒介物对照，HMGB1和TNF-α分别存在1.1±0.17和9.8±0.33的相对谱带强度。相反，用UP360处理LPS攻击的巨噬细胞，对于125、250和500μg/mL浓度，HMGB1谱带强度水平分别降低至0.48±0.02、0.27±0.01和0.17±0.01。类似地，对于250和500μg/mL浓度的UP360，分别发现TNF-α的分泌显著减少，即0.54±0.01和0.37±0.01。
巨噬细胞未经处理(对照)，仅用LPS(媒介物)处理，或用LPS和所示浓度的提取物或组合物处理(左图)24小时，一式两份，然后收集培养基并在10,000MWCO过滤器上浓缩。浓缩的培养基在SDS-PAGE上运行，并对指示的蛋白质进行印迹(上图)。对印迹进行光密度分析法，归一化为总丽春红染色，并相对于对照计算蛋白质表达。
表12：来自归一化为丽春红S染色并相对于对照组的UP360蛋白质印迹的HMGB1和TNF-α的半定量
LPS(1μg/mL) HMGB1 TNF-α
对照 - 1.0+/-0.07 1.0+/-0.005
媒介物 + 1.1+/-0.17 9.8+/-0.33
UP360 HMGB1 TNF-α
125μg/mL + 0.48+/-0.02 6.6+/-0.49
250μg/mL + 0.27+/-0.01 0.54+/-0.01
500μg/mL + 0.17+/-0.01 0.37+/-0.01
实施例17：包含多糖和多酚的基于芦荟的组合物(UP360)显示HMGB1和TNF-α的出乎意料的协同抑制活性
将1,000,000个RAW 264.7小鼠巨噬细胞样细胞在具有1μg/mL脂多糖(LPS)的60mm培养皿中的无血清培养基中铺板(对照组除外)。一式两份地加入以下浓度的用于在实施例9中制备UP360的植物提取物：芦荟叶凝胶粉末-37.5、75和150μg/mL，茯苓提取物-75、150和300μg/mL，和迷迭香提取物-12.5、25和50μg/mL。三种浓度的芦荟、茯苓和迷迭香等于上述实施例中的125、250和500μg/mL UP360中的浓度。在抽吸培养基之前，将细胞处理24小时，并在10,000MWCO过滤器中离心以浓缩。将培养基在SDS-PAGE上运行并转移到PVDF膜上以印迹HMGB1和TNF-α。用丽春红S染色印迹，并将光密度分析法归一化为总蛋白量。
利用来自过夜LPS攻击的巨噬细胞的上清液来评价当将来自芦荟、茯苓和RA的提取物使用Colby方法以特定比率配制在一起时，可能的出乎意料的抑制作用。在该方法中，如果某一终点测量的观察值大于假设计算的预期值，则推测具有两种或更多种材料的制剂具有出乎意料的协同作用。当预期值和观察值相等时，存在相加作用。然而，当观察值低于预期值时，存在出乎意料的抑制作用。在本情况下，在该测定中监测的炎症标志物(HMGB1和TNF-α)的水平都降低，以实现期望的有意义的抗炎结果。
表13：归一化为丽春红S染色并相对于对照组的芦荟、茯苓和迷迭香蛋白质印迹的半定量
LPS(1μg/mL) HMGB1 TNF-α
对照 - 1.0+/-0.03 1.0+/-0.23
媒介物 + 1.8+/-0.07 2.9+/-0.16
芦荟叶凝胶粉末 HMGB1 TNF-α
37.5μg/mL + 0.36+/-0.05 0.38+/-0.07
75μg/mL + 0.28+/-0.004 0.42+/-0.02
150μg/mL + 0.37+/-0.008 0.53+/-0.02
茯苓提取物 HMGB1 TNF-α
75μg/mL + 0.33+/-0.007 0.49+/-0.02
150μg/mL + 0.44+/-0.009 0.47+/-0.01
300μg/mL + 0.48+/-0.15 0.52+/-0.16
迷迭香提取物 HMGB1 TNF-α
12.5μg/mL + 1.7+/-0.21 2.2+/-0.34
25μg/mL + 1.3+/-0.007 2.1+/-0.01
50μg/mL + 1.6+/-0.16 1.7+/-0.22
表14.基于芦荟的组合物(UP360)在HGMB1和TNF-α的降低中的出乎意料的协同作用
X＝芦荟，Y＝茯苓，Z＝迷迭香酸；用于预期值的Colby方程：(X+Y+Z)-(XY+XZ+YZ/100)+XYZ/10000
巨噬细胞未经处理(对照)，仅用LPS(媒介物)处理，或用LPS和所示浓度的提取物或组合物处理(左图)24小时，一式两份，然后收集培养基并在10,000MWCO过滤器上浓缩。浓缩的培养基在SDS-PAGE上运行，并对指示的蛋白质进行印迹(上图)。对印迹进行光密度分析法，归一化为总丽春红染色，并相对于对照计算蛋白质表达。
如表中所证明的，我们观察到HMGB1和TNF-α两者水平显著降低，指示组合这些药用植物材料产生UP360的出乎意料的抑制作用。当提取物在构成125、250和500μg/mL UP360剂量的单独浓度下孵育时，标准化组合物UP360的抑制作用大于两种标志物的每种剂量的理论计算预期值，除了在125μg/mL下观察的TNF-α值高于预期。在125、250和500μg/mL下，对于HMGB1，这些值分别为0.48相对于2.38、0.27相对于2.01以及0.17相对于2.43，而对于TNF，这些值分别为6.6相对于3.05、0.54相对于2.97以及0.37相对于2.73。因此，预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)处理的有益的出乎意料的抑制作用超过减少HMGB1和TNF-α分泌到培养基中的预期结果。
实施例18.动物和饲养
CD-1小鼠购自USDA批准的供应商。8周龄的雄性CD-1小鼠购自Charles RiverLaboratories,Inc.(Wilmington,MA)。动物在到达时适应环境，并在11周龄时用于研究。在研究时，动物平均重量为33.6±2.4克。将它们在温控室(71-72°F)中以12小时的亮-暗循环进行饲养，并提供饲料和水，随意取食。
每个聚丙烯小鼠笼饲养3-5只动物，并通过在它们的尾部特征性编号来单独鉴别。每个笼子用小鼠铁丝条盖和过滤的小鼠顶(Allentown,NJ)覆盖。用指示项目编号、测试制品、剂量水平、组、动物编号和性别的笼卡鉴别单独的笼。使用Harlan T7087软穗轴垫层，并且每周更换至少两次。给小鼠提供淡水和来自Harlan(Harlan Teklad,370W,Kent,WA)的啮齿动物食物#T2018，随意取食。
实施例19：脂多糖(LPS)诱导的脓毒症模型作为外源性侵袭触发应答
该模型使用动物的存活/死亡率作为终点测量(Wang等人，1999)。LPS(一种外源侵袭触发物)是革兰氏阴性菌外膜的完整组分，并且是引发可能导致内毒素性休克的全身炎症过程的主要贡献因素。它是主要由巨噬细胞/单核细胞介导的状态，这归因于若干种早期细胞因子(例如TNF、IL-1、IL-6和γ干扰素)以及晚期介质HMGB1的过量产生。在给药中值致死剂量的溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS；Lifeline，批号07641)中的LPS(25mg/kg)后，动物发展内毒素血症，并且在8小时在血清中检测到HMGB1，并且在LPS后16-32小时达到峰值和平稳水平。如果不治疗，小鼠将在24小时内开始死亡。在本研究中，我们在LPS注射后监测小鼠4天。比较与LPS+丁酸钠(SB；Aldrich,St.Louis,MO；批号MKCG7272)、LPS+媒介物(0.5％CMC；Spectrum,New Brunswick,NJ；批号1IJ0127)和LPS+UP360(在实施例9中制备的包含多糖和多酚的基于芦荟的组合物)的存活/死亡率。在研究中包括以下组：
表15.治疗组详情
在该模型中，用在实施例9中说明的UP360预治疗小鼠一周(7天)，然后用10mL/kgPBS体积以25mg/kg致死剂量腹膜内注射LPS(大肠杆菌055:B5；Sigma,St.Louis,MO；批号081275)。每小时观察动物。考虑到丁酸钠通过抑制HMGB1释放改进小鼠中LPS诱导的损伤的事实，我们选择该化合物作为我们研究的阳性对照(Li等人，2018)。
实施例20：在致死剂量的毒素下基于芦荟的组合物(UP360)改进动物存活率
腹膜内注射LPS三小时后，小鼠开始显示早期内毒素血症的迹象。小鼠的探索性行为逐渐减少，并伴随有皱皮(立毛)、活动性降低、嗜睡和腹泻。虽然这些迹象和症状似乎存在于所有治疗组中，但在媒介物治疗组中严重程度更显著。
发现来自媒介物治疗的两只小鼠和来自阳性对照丁酸钠(SB)组的一只小鼠在LPS注射后24小时死亡。如在表16中所见，测定这些组的存活率，并且发现分别为62.5％和75％。用基于芦荟的组合物(UP360)治疗的小鼠在LPS注射24小时后的存活率为100％。在LPS注射后34小时，观察到用预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)、丁酸钠(SB)和媒介物治疗的小鼠的存活率分别为87.5％、62.5％和50％。也许对于基于芦荟的组合物(UP360)治疗的小鼠的最显著的观察结果是在LPS注射后48小时观察到的。在这个时间点，对于媒介物治疗的小鼠仅有12.5％的存活率，而基于芦荟的组合物(UP360)治疗的小鼠显示62.5％的存活率。即使对于阳性对照组SB，在该时间点一半的动物死亡。在第三天(LPS注射后72小时)，UP360、丁酸钠和媒介物组的存活率分别为62.5％、50％和12.5％。
媒介物对照组中的所有小鼠在LPS注射后82小时死亡，该组存活率0％。另一方面，用基于芦荟的组合物(UP360)和阳性对照丁酸钠(SB)治疗的小鼠显示62.5％和50％的存活率，并且在LPS注射后96小时和120小时保持相同。这些存活率对于基于芦荟的组合物(UP360)和阳性对照都是统计学显著的(表16)。这些组中存活的动物显示其健康的逐渐改进。小鼠表现得身体更好，并逐渐恢复，显示正常行为。这些数据表明，预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)可能用作预防和/或干预膳食补充剂，以克服脓毒症时细胞因子和HMGB1的突然激增。表16：由LPS诱导的内毒素血症和脓毒症，基于芦荟的组合物(UP360)提供62.5％的存活率
存活率计算如下：100-[(死亡小鼠/小鼠总数)×100]％。
实施例21：基于芦荟的组合物(UP360)及其成分在LPS诱导的脓毒症模型中的比较
在脂多糖(LPS)诱导的内毒素血症中评价将芦荟、茯苓和迷迭香酸(RA)组合以产生在实施例9中证明的包含特定比率的多糖和多酚的UP 360的优点。在LPS注射前，分别用在实施例9中用于制成UP360的芦荟、茯苓和迷迭香酸(RA)以150mg/kg、300mg/kg和50mg/kg治疗雄性CD-1小鼠(n＝13)达7天。在第8天，给小鼠以10mL/kg腹膜内注射溶解于PBS的25mg/kg LPS。UP360治疗组中的小鼠接受500mg/kg的日剂量的UP360。所有小鼠继续每天接受各自的治疗达研究的持续时间。腹膜内给药中值致死剂量的LPS(25mg/kg)后，预期动物在若干小时内发展为脓毒症。如果不治疗，小鼠将在24小时内开始死亡。每小时观察动物。在本研究中，我们在LPS注射后监测小鼠6天。比较LPS+丁酸钠(SB)、LPS+媒介物(0.5％CMC)、LPS+UP360、LPS+芦荟、LPS+茯苓和LPS+迷迭香酸的存活率。正常对照动物仅腹膜内接受PBS，并仅用载体媒介物0.5％CMC强饲。考虑到丁酸钠(SB)通过抑制HMGB1释放改进小鼠的LPS诱导的损伤的事实，我们选择该化合物作为我们研究的阳性对照(Li等人，2018)。
将预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)的存活率和死亡率与其在制剂中出现的单独提取物的那些剂量进行比较，以使用Colby方程(Colby，1967)找出组合的潜在的相加、拮抗或协同作用。为了使这些植物提取物的共混具有出乎意料的协同作用，需要观察到的抑制大于计算值。
腹膜内注射LPS几小时后，小鼠开始显示脓毒症的早期迹象。小鼠的探索性行为逐渐减少，并伴随有皱皮(立毛)、活动性降低、嗜睡、腹泻和颤抖，并伴随有一些眼睑闭合。虽然这些迹象和症状存在于所有治疗组中，但在媒介物治疗组中严重程度量级更严重。
如在表17、18和19中所见，在模型诱导后的前36小时，用基于芦荟的组合物(UP360)治疗的小鼠没有观察到死亡。用基于芦荟的组合物(UP360)治疗导致在最初36小时内100％的存活率。在另一方面，成分(例如芦荟、茯苓和迷迭香酸)治疗的小鼠的存活率分别为69.2％、76.9％和69.2％。在该时间范围内(注射后36小时-hpi)，媒介物组显示53.8％的存活率。在LPS后第2天(48hpi)观察到每组的最高死亡率。
表17：在LPS诱导的脓毒症中存活和死亡的时程
·存活率计算如下：100-[(死亡小鼠/小鼠总数)×100]％。
RA-迷迭香酸。
表18：用基于芦荟的组合物UP360治疗的LPS诱导的脓毒性小鼠的存活率
·存活率计算如下：100-[(死亡小鼠/小鼠总数)×100]％。
RA-迷迭香酸
表19：用基于芦荟的组合物UP360治疗的LPS诱导的脓毒性小鼠的死亡率
·死亡率计算如下：100-存活率。RA-迷迭香酸
LPS后48小时，分别观察到芦荟、茯苓和迷迭香酸治疗的小鼠的死亡率为61.5％、46.2％和61.5％。基于芦荟的组合物(UP360)组中的小鼠仅经历15.4％的死亡率。媒介物治疗的小鼠在LPS后48小时时显示84.6％的死亡率，并且在研究期间的其余时间保持相同。在第三天(LPS注射后72小时)，对于芦荟组合物(UP360)、芦荟、茯苓和迷迭香酸，治疗组的存活率分别为76.9％、30.8％、46.2％和38.5％。阳性对照在该时间范围内显示38.5％的存活率。
在第6天(144hpi)结束时，基于芦荟的组合物(UP360)显示69.2％的存活率，而芦荟、茯苓和RA组中的小鼠分别显示23.1％、46.2％和38.5％的存活率(表17、18、19)。与媒介物治疗组相比，观察到的基于芦荟的组合物的存活率在统计学显著增加。SB组完成研究时存活率为30.8％。组中存活的动物显示其健康的逐渐改进。小鼠表现得身体更好，并逐渐恢复显示正常的探索性行为。
实施例22：对于包含多糖和多酚的基于芦荟的组合物(UP360)观察到降低死亡率的出乎意料的协同作用
利用该LPS诱导的存活研究来评价将来自芦荟、茯苓和迷迭香酸(RA)提取物在以特定比率用Colby方法配制在一起时可能的协同作用或出乎意料的作用。当以500mg/kg的剂量给予小鼠基于芦荟的组合物(UP360)时，在每个分析的时间点，死亡率低于理论上计算的预期值(表20)。例如，LPS注射后24小时和60小时的预期的死亡率分别为33.9％和94.5％，而基于芦荟的组合物(UP360)的实际观察的死亡率分别为0％和15.4％。这些发现表明，以3:6:1的特定比率配制这三种来自芦荟、茯苓和RA的标准化提取物，在延长研究受试者在脓毒症时的寿命方面比单独使用芦荟、茯苓或RA提取物具有大得多的益处。
表20：对于基于芦荟的组合物UP360，观察到在降低死亡率方面的出乎意料的协同作用
X＝芦荟，Y＝茯苓，Z＝迷迭香酸；用于预期死亡率的Colby方程：
(X+Y+Z)-(XY+XZ+YZ/100)+XYZ/10000
在观察期结束时，预期95.9％的研究受试者死亡，而发现基于芦荟的组合物(UP360)的实际死亡率为30.8％。
因此，在该LPS诱导的存活研究中，使用Colby方程评价和证实组合芦荟、茯苓和RA提取物的优点。在该方法中，如果某一终点测量的观察值大于假设计算的预期值，则推测具有两种或更多种材料的制剂具有出乎意料的协同作用。这些药用植物在LPS注射后24、36、48、60、72、96、120和144小时的死亡率值用于确定计算的功效值，并与基于芦荟的组合物(UP360)在指定时间点的观察的死亡率值进行比较。在本研究中，我们发现作为芦荟、茯苓和RA提取物的组合的结果的出乎意料的协同作用。与单独给予提取物相比，基于芦荟的组合物(UP360)治疗的有益作用超过预期的死亡率结果。在观察期结束时，基于芦荟的组合物(UP360)的死亡率为30.8％，而对于每个芦荟、茯苓和RA提取物治疗组死亡率分别为76.9％、53.9％和61.5％，这表明包含多糖和多酚的这些植物提取物在保护细胞因子风暴并因此降低患者在脓毒症时的死亡率方面具有出乎意料的协同活性(表20)。
实施例23：基于芦荟的组合物(UP360)对缓解大鼠中脂多糖(LPS)诱导的急性炎性肺损伤的功效-作为外源性侵袭触发应答
设计该研究以评价实施例9中制备的基于芦荟的组合物(UP360)在缓解LPS诱导的急性肺损伤方面的直接影响，以500mg/kg和250mg/kg口服给药。急性肺损伤是一种临床综合征，其特征在于肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞损伤，导致弥漫性肺损伤，如在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中所见。在本研究中，我们在用LPS诱导模型前用测试材料口服治疗大鼠7天。在第8天，在口服治疗后一小时，将溶解在0.1mL/100g PBS中的10mg/kg LPS气管内(i.t.)滴注到每只大鼠。正常对照大鼠仅接受相同体积的i.t.PBS。
表21.研究组
已知LPS诱导全身和肺应答，导致促炎细胞(包括嗜中性粒细胞和巨噬细胞)以及促炎细胞因子(例如IL-1、IL-8、IL-6、MIP-2/CINC-3和TNF-α)的积累。这引起肺间质和肺泡水肿，以及上皮细胞损伤，其中HMGB1由巨噬细胞和单核细胞主动分泌和/或从坏死细胞被动释放。
我们在气管内给予大鼠LPS后24小时处死存活的动物。在尸体剖检时，通过气管内注射1.5mL PBS到右叶，然后轻轻抽吸至少3次，收集支气管肺泡灌洗液(BAL)。汇集回收的液体，在4℃下以1500rpm离心10分钟，并用于测量细胞因子(例如IL-6)和肺蛋白水平。从每只大鼠收集相同的右叶用于组织匀浆，用于MIP-2/CINC-3蛋白分析。用福尔马林固定左叶，并提交给全国组织学进行组织病理学评价，以供经认证的病理学家分析。尸体剖检时收集的血清用于测量细胞因子，例如TNF-α和IL-1β。气管内滴注10mg/kg LPS后，所有动物在攻击后存活24小时。这里，我们已经汇编了被认为参与急性肺感染的病理学的关键细胞因子和化学引诱物以及来自以下实施例中的组织病理学分析的数据。
实施例24：基于芦荟的组合物(UP360)显示血清TNF-α的剂量相关的统计学显著降低
如下使用来自R&D Systems的大鼠TNF-αQuantikine ELISA试剂盒(产品号：RTA00)测量来自实施例23的未稀释的大鼠血清中TNF-α的存在：将未稀释的血清加入到用TNF-α抗体包被的微板中。在室温下2小时后，血清中的TNF-α结合到板上，并彻底洗涤板。将酶偶联的TNF-α抗体加入到板中，并使其在室温下结合2小时。重复洗涤，并将酶底物加入到板中。在室温下显影30分钟后，加入终止溶液，并在450nm处读取吸光度。基于TNF-α标准曲线的吸光度读数计算TNF-α的浓度。
如在表22中所见，在用LPS攻击的媒介物治疗的大鼠中观察到血清TNF-α的统计学显著的激增。当用预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)治疗大鼠时，该增加显著降低。对于用基于芦荟的组合物(UP360)以500mg/kg和250mg/kg口服治疗的大鼠，观察到统计学显著的且剂量相关的降低。相对于媒介物对照计算血清TNF-α水平的这些降低，并且发现500mg/kg和250mg/kg的基于芦荟的组合物(UP360)治疗组分别降低为91.9％和73.6％。阳性对照丁酸钠(SB)显示血清TNF-α水平统计学显著(67.9％)降低。
表22：基于芦荟的组合物(UP360)对血清TNF-α水平的作用。
组 剂量(mg/kg) N 平均值±SD(pg/mL) p值
正常对照 0 7 -1.27±0.93 0.000001
媒介物对照 0 10 10.43±2.48 -
丁酸钠 500 10 3.35±1.73 0.000001
UP360 500 10 0.85±1.08 0.000001
UP360 250 10 2.75±1.22 0.000001
实施例25：基于芦荟的组合物(UP360)显示血清IL-1β的剂量相关的统计学显著降低
如下使用来自R&D Systems的Rat IL-1βQuantikine ELISA试剂盒(产品号：RLB00)测量来自实施例23的未稀释的大鼠血清中IL-1β的存在：将未稀释的血清加入到用IL-1β抗体包被的微板中。在室温下2小时后，血清中的IL-1β结合到板上，并彻底洗涤板。将酶偶联的IL-1β抗体加入板中，并使其在室温下结合2小时。重复洗涤，并将酶底物加入到板中。在室温下显影30分钟后，加入终止溶液，并在450nm处读取吸光度。基于IL-1β标准曲线的吸光度读数计算IL-1β的浓度。
这里再次，对于用预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)治疗的大鼠，观察到IL-1β剂量相关的且统计学显著的降低。对于用媒介物治疗的LPS诱导的急性肺损伤大鼠，观察到IL-1β血清水平的统计学显著增加。当以500mg/kg和250mg/kg的口服剂量给药时，用基于芦荟的组合物(UP360)治疗的大鼠分别显示IL-1β水平降低80.0％和63.0％(表23)。丁酸钠(SB)组显示血清IL-1β降低65.3％。对于基于芦荟的组合物(UP360)和丁酸钠(SB)组两者，所证明的血清IL-1β降低都是统计学显著的。
表23：基于芦荟的组合物(UP360)对血清IL-1β水平的作用。
组 剂量(mg/kg) N 平均值±SD(pg/mL) p值
正常对照 0 7 -0.14±4.20 0.000001
媒介物对照 0 10 65.09±13.24 -
丁酸钠 500 10 22.58±9.46 0.000001
UP360 500 10 13.01±4.79 0.000001
UP360 250 10 24.07±7.74 0.000001
实施例26：基于芦荟的组合物(UP360)显示支气管-肺泡灌洗液(BAL)中的IL-6水平剂量相关的且统计学显著降低
如下使用得自R&D Systems的Rat IL-6Quantikine ELISA试剂盒(产品号：R6000B)测量来自实施例23的未稀释大鼠支气管-肺泡灌洗液(BAL)中IL-6的存在：将未稀释的BAL加入到用IL-6抗体包被的微板中。在室温下2小时后，BAL中的IL-6结合到板上，并彻底洗涤板。将酶偶联的IL-6抗体加入到板中，并使其在室温下结合2小时。重复洗涤，并将酶底物加入到板中。在室温下显影30分钟后，加入终止溶液，并在450nm处读取吸光度。基于IL-6标准曲线的吸光度读数计算IL-6的浓度。
与上述TNF-α和IL-1β数据一致，基于芦荟的组合物(在实施例9中制备的UP360)显示BAL IL-6水平的剂量相关的统计学显著降低。而较高剂量(500mg/kg)导致BAL IL-6水平降低82.0％，较低剂量(250mg/kg)显示BAL IL-6水平降低51.0％(表24)。当与媒介物治疗的急性肺损伤大鼠相比时，对于预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)，该降低是统计学显著的。对于低剂量的基于芦荟的组合物(UP360)也观察到强烈的趋势(即p＝0.087)。相对于媒介物治疗的疾病模型，丁酸钠(SB)组显示BAL IL-6统计学上不显著的降低37.7％。
表24：基于芦荟的组合物(UP360)对BAL IL-6水平的作用。
组 剂量(mg/kg) N 平均值±SD(pg/mL) p值
正常对照 0 7 66.41±4.86 0.000001
媒介物对照 0 10 3103.95±3057.13 -
丁酸钠 500 10 1933.30±1744.23 0.27
UP360 500 10 558.94±354.88 0.0005
UP360 250 10 1522.03±1407.62 0.087
实施例27：基于芦荟的组合物(UP360)治疗产生CINC-3的统计学显著降低
CINC-3/巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)属于称作趋化因子的趋化细胞因子家族。MIP-2属于CXC趋化因子家族，被命名为CXCL2，并且通过CXCR1和CXCR2的结合而起作用。它主要由巨噬细胞、单核细胞和上皮细胞产生，并负责趋化炎症源和激活嗜中性粒细胞。
将50μL来自实施例23的各大鼠肺匀浆样品(对于媒介物、丁酸钠(SB)、UP360低剂量、UP360高剂量是10个/组，对于对照是7个/组)和50μL测定稀释缓冲液加入到用单克隆CINC-3抗体包被的96孔微板的孔中，并允许结合2小时。使板经受5次洗涤，然后加入酶连接的多克隆CINC-3，并使其结合2小时。将孔再洗涤5次，然后将底物溶液加入到孔中，并允许酶促反应在避光的室温下开始30分钟。酶促反应产生蓝色染料，加入终止溶液后变为黄色。在450nm处读取每个孔的吸光度(具有580nm校正)并与CINC-3的标准曲线比较，以近似每个大鼠肺匀浆物样品中CINC-3的量。
以500mg/kg预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)(在实施例9中制备的UP360)每天口服治疗一周，引起细胞因子诱导的嗜中性粒细胞化学引诱物在LPS诱导的急性肺损伤中统计学显著降低(表25)。在气管内仅接受PBS的正常对照大鼠中CINC-3的水平接近零。相反，用载体媒介物治疗的气管内LPS诱导的急性肺损伤大鼠显示CINC-3的平均肺匀浆水平为563.7±172.9pg/mL。对于500mg/kg基于芦荟的组合物(UP360)治疗的大鼠，该水平降低至280.92±137.84pg/mL的平均值。当与媒介物治疗的疾病模型相比时，用500mg/kg基于芦荟的组合物(UP360)治疗的大鼠的CINC-3水平的该50.2％降低是统计学显著的。当与媒介物对照组相比时，较低剂量的基于芦荟的组合物(UP360)产生CINC3水平的中度(即27.6％)降低。与媒介物治疗的大鼠相比，丁酸钠(SB)组的肺匀浆CINC-3水平仅有微不足道的(即17.7％)降低。
表25：基于芦荟的组合物(UP360)对肺匀浆MIP-2/CINC-3活性水平的作用
组 剂量(mg/kg) N 平均值±SD(pg/mL) p值
正常对照 0 7 -4.21±2.38 0.0000
媒介物对照 0 10 563.71±194.81 -
丁酸钠 500 10 464.00±220.32 0.2980
UP360 500 10 280.92±137.84 0.0020
UP360 250 10 408.29±209.20 0.1028
实施例28：基于芦荟的组合物(UP360)降低支气管-肺泡灌洗液(BAL)中的总蛋白
如下使用得自ThermoFisher Scientific的Pierce BCA Protein Assay试剂盒(产品号：23225)测量来自实施例23的支气管-肺泡灌洗液(BAL)样品中的总蛋白的量：将BAL以1:5稀释，与二辛可宁酸(BCA)试剂在微板中混合，并在37℃下孵育30分钟。在580nm处读取吸光度，并基于牛血清白蛋白标准曲线的吸光度读数计算BAL中的蛋白质浓度。
发现与正常对照大鼠相比，用媒介物治疗的LPS诱导的急性肺损伤大鼠中来自BAL的肺总蛋白水平增加到3倍。当与媒介物治疗的LPS诱导的急性肺损伤大鼠相比时，用预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)(在实施例9中制备的UP360)以500mg/kg和250mg/kg每日口服治疗大鼠一周，分别导致BAL总蛋白含量降低40.1％(相对于媒介物p＝0.12)和38.3％(p＝0.17)(表26)。相对于媒介物治疗的LPS诱导的急性肺损伤大鼠，阳性对照丁酸钠(SB)组BAL总蛋白水平降低30.2％(p＝0.27)。
表26：基于芦荟的组合物(UP360)对BAL蛋白水平的作用。
组 剂量(mg/kg) N 平均值±SD(μg/mL) p值
正常对照 0 7 1488.88±322.01 0.00367209
媒介物对照 0 10 4214.86±3311.32 -
丁酸钠 500 10 2940.14±2092.32 0.265745965
UP360 500 10 2526.23±1497.78 0.124589339
UP360 250 10 2599.89±691.39 0.168377963
实施例29：基于芦荟的组合物(UP360)显示在支气管-肺泡灌洗液(BAL)中的C反应蛋白统计学显著降低
如下使用来自Abcam的C反应蛋白(PTX1)Rat ELISA试剂盒(产品号：ab108827)测量1:1,000稀释的大鼠BAL中C反应蛋白(CRP)的存在：将1:1,000稀释的BAL加入到用CRP抗体包被的微板中。在室温下在板振荡器上2小时后，BAL中的CRP结合到板上，并彻底洗涤板。将生物素化C反应蛋白抗体加入到板中，并使其在室温下在板振荡器上结合1小时。重复洗涤，并将链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物加入到板中。在室温下孵育30分钟后，重复洗涤，并加入色原底物。在室温下显影10分钟后，加入终止溶液，并在450nm处读取吸光度。基于CRP标准曲线的吸光度读数计算CRP的浓度。
与正常对照大鼠相比，在用媒介物治疗的LPS诱导的急性肺损伤大鼠中观察到BALCRP水平统计学显著的5.6倍增加。相对于媒介物治疗的疾病模型，用在实施例9中制备的预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)以500mg/kg口服治疗大鼠一周，使BAL CRP的水平降低38.2％(p＝0.06)(表27)。与媒介物治疗的患病大鼠相比，阳性对照丁酸钠(SB)和低剂量UP360组导致CRP水平的最小变化。
表27：基于芦荟的组合物(UP360)对BAL CRP水平的作用
组 剂量(mg/kg) N 平均值±SD(pg/mL) p值
正常对照 0 7 4344.5±3321.6 0.0002
媒介物对照 0 10 24302.8±8826.1 -
丁酸钠 500 10 20093.5±8826.1 0.35
UP360 500 10 15012.0±9274.3 0.06
UP360 250 10 20999.6±6421.2 0.42
实施例30：基于芦荟的组合物(UP360)显示在支气管-肺泡灌洗液中IL-10的统计学显著降低
如下使用来自R&D Systems的Rat IL-10 Quantikine ELISA试剂盒(产品号：R1000)测量来自实施例23的未稀释的支气管-肺泡灌洗液(BAL)样品中IL-10的存在：将未稀释的BAL加入到用IL-10抗体包被的微板中。在室温下2小时后，血清中的IL-10结合到板上，并彻底洗涤板。将酶偶联的IL-10抗体加入到板中，并使其在室温下结合2小时。重复洗涤，并将酶底物加入到板中。在室温下显影30分钟后，加入终止溶液，并在450nm处读取吸光度。基于IL-10标准曲线的吸光度读数计算IL-10的浓度。
在用500mg/kg和250mg/kg预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)(在实施例9中制备的UP360)每天口服治疗持续7天预诱导后，在气管内滴注LPS后24小时处死的患病大鼠的BAL中测量抗炎IL-10水平。通常，IL-10的水平对应于感染或损伤时宿主需要的感染和炎性应答的严重程度。如在表28中所见，发现媒介物治疗的大鼠的IL-10水平显著增加(即，正常对照大鼠的80倍)，指示急性肺损伤的严重程度高。相反，在包含多糖和多酚(并且在某些情况下由多糖和多酚组成)的基于芦荟的组合物(UP360)组中的大鼠显示在BAL中IL-10的剂量相关的减少。对于500mg/kg和250mg/kg的基于芦荟的组合物(UP360)，这些降低分别计算并确定为73.2％和41.0％。对于高剂量(500mg/kg)的基于芦荟的组合物(UP360)，降低是统计学显著的，p≤0.05。至少对于这种特定模型，作为基于芦荟的组合物(UP360)治疗的结果的抗炎细胞因子的减少可以由以下事实解释：由于疾病严重程度缓解，宿主的炎性应答可能存在减弱作用。包含多糖和多酚(并且在某些情况下由多糖和多酚组成)的基于芦荟的组合物(UP360)引起炎性细胞因子(例如IL-1β、IL-6和TNF-α)的统计学显著减少，导致稳健的炎性应答，使得宿主对于抗炎细胞因子(例如IL-10)的需要不太重要，这加强了该假设。事实上，正常对照组的IL-10水平几乎为零，表明抗炎细胞因子的诱导基于急性肺损伤的存在和/或严重程度。
表28：基于芦荟的组合物(UP360)对BAL IL-10水平的作用
组 剂量(mg/kg) N 平均值±SD(pg/mL) p值
正常对照 0 7 2.63±8.35 0.004
媒介物对照 0 10 207.77±171.33 -
丁酸钠 500 10 154.84±159.63 0.48
UP360 500 10 55.64±40.53 0.02
UP360 250 10 122.6±83.76 0.18
实施例31.基于芦荟的组合物(UP360)降低肺水肿和总体肺损伤严重程度
使用H&E染色的肺组织评价实施例23中作为气管内LPS的结果的肺损伤的严重程度。肺的左叶用于组织病理学分析。如在下表29和图2中所见，媒介物治疗组的大鼠在肺损伤严重程度(增加3.5倍)、肺水肿(增加2.5倍)和多形核(PMN/PMC)细胞浸润(增加2.4倍)方面显示统计学显著增加。当与媒介物治疗的LPS诱导的急性肺损伤大鼠相比，用500mg/kg的高剂量的基于芦荟的组合物(在实施例9中制备的UP360)每日口服治疗大鼠一周，导致总体肺损伤严重程度统计学显著降低37.9％(表29，图2)。类似地，当与媒介物治疗的大鼠相比时，对于高剂量的基于芦荟的组合物(UP360)观察到肺水肿的强烈的、统计学显著减少(37％减少)。对于用高剂量的包含多糖和多酚(并且在某些情况下由多糖和多酚组成)的基于芦荟的组合物(UP360)治疗的大鼠，也观察到PMN浸润减少的积极趋势。相对于媒介物治疗的患病大鼠，阳性对照组丁酸钠(SB)组在组织病理学评价中引起最小变化。
表29：来自大鼠急性肺损伤的基于芦荟的组合物(UP360)的组织病理学数据
组 剂量(mg/kg) N 总体肺组织严重程度a 肺水肿b PMC的浸润c
正常对照 0 7 0.93±0.49*** 1.21±0.52*** 1.14±0.58**
媒介物 0 9 3.22±0.58 3.00±0.67 2.72±0.82
SB 500 10 3.05±0.42 2.35±0.95 2.75±0.78
UP360 500 9 2.00±0.94* 1.89±0.57** 2.06±0.83
UP360 250 10 3.30±0.60 2.75±0.75 3.30±0.60
*P≤0.05；**P≤0.001；***P≤0.00001；SB-丁酸钠；PMN-多形核细胞
a总体严重程度：正常，最小-轻度，中度，重度，极严重。病灶、m-病灶、区域性、reg.ext coalesing，弥散性，0-4评分。b急性渗出性变化：肺泡、导管和支气管，肺泡壁和内部水肿，充血，出血血管周围(hemorrhage perivasc)，肺泡囊，水肿，纤维渗出，出血肺泡囊，肺泡导管增厚的dt Hyal膜I型损失，凋亡细胞，具体参数评分0-4。c炎性浸润期：中性粒细胞，其它多晶型物MNC，主要是组织细胞和巨噬细胞。BALT肺泡，间质性，肺泡-导管，细支气管弥漫性，斑块细胞聚生体(patch celllar consol)，具体参数评分0-4。
实施例32：D-半乳糖诱导的加速免疫衰老老化模型作为内源性和外源性侵袭触发应答
全身给予D-半乳糖诱导加速免疫细胞衰老，在攻击时影响免疫应答，类似于老年小鼠。这些现象被推测是模拟老年人的免疫应答特征。在该实验性老化的小鼠模型中测试包含多糖和多酚的新型预期的主题(在实施例9中制备的UP360)，以证明其免疫刺激作用。购买专门饲养的CD-1小鼠(12周龄)，并在适应2周后用于加速老化研究。将小鼠随机分配到4个免疫组和3个非免疫组。免疫组包括G1＝正常对照+媒介物(0.5％CMC)，G2＝D-半乳糖+媒介物，G3＝D-半乳糖+UP360400mg/kg和G4＝D-半乳糖+UP360 200mg/kg。非免疫治疗组包括G1＝正常对照+媒介物(0.5％CMC)，G2＝D-半乳糖+媒介物，和G3＝D-半乳糖+UP360400mg/kg。尽管对于免疫设定在每个治疗组中分配10只动物，但对于非免疫设定在每组中包括八只动物。
对小鼠每天皮下注射500mg/kg的D-半乳糖，持续9周以诱导老化。在诱导的第4周，开始口服2剂量的悬浮在0.5％CMC中的UP360(200mg/kg-低剂量和400mg/kg-高剂量)的治疗。包括另一组400mg/kg的UP360，以用作非免疫小鼠的对照。在第7周，对除了非免疫组中的那些小鼠之外的每只小鼠注射3μg Fluarix四价IM(2020-2021流感季疫苗，来自GSK)。其含有60μg血凝素-HA/0.5mL单人剂量。配制该疫苗以含有15μg的4种流感株(例如H1N1、H3N2、B-Victoria谱系和B-Yamagata谱系)中的每一种用于以单一剂量免疫。
进行包含多糖和多酚(并且在某些情况下由多糖和多酚组成)的UP360的每日口服强饲，从第4周持续至第9周。在尸体剖检时(即免疫后14天)，收集全血(1mL)并等分，110μL用于流式细胞术免疫组(在冰上递送至Flow Contract Site Laboratory,Bothell,WA)，从剩余血液分离血清(产生约400μL血清)用于抗体ELISA和酶测定(Unigen,Tacoma WA)，并将60μL在两个试管中经由Fedex过夜运输至Sirona DX,Portland,OR用于细胞因子分析。测量每只动物的胸腺和脾的重量以确定胸腺和脾指数。从每组中获取胸腺和脾的代表性图像。在尸体剖检时将脾保持在干冰上，并转移至-80℃用于进一步使用。多聚甲醛和蔗糖固定的胸腺被送到全国性组织学中用于衰老相关的β-半乳糖苷酶染色和分析。
实施例33：UP360产生胸腺指数的统计学显著增加
将D-半乳糖重复皮下给予小鼠中产生差的免疫应答，类似于在正常老化过程中发生的变化。胸腺是最重要的免疫器官之一，其将受到长期暴露于D-gal的作用。胸腺指数是机体免疫功能强度的良好指标。较高的胸腺指数对应于较强的非特异性免疫应答。在免疫小鼠中，与正常对照小鼠相比，用媒介物治疗的D-gal小鼠显示胸腺指数显著降低(54.5％)。胸腺指数的这种降低被包含多糖和多酚的UP360的两个剂量逆转。当与媒介物治疗的D-gal组相比时，用UP360以400mg/kg和200mg/kg口服治疗的小鼠显示胸腺指数分别增加52.9％和50.6％。与媒介物治疗的D-gal小鼠相比，这种逆转对于两个剂量的UP360都是统计学显著的。类似地，用UP360以400mg/kg治疗的非免疫小鼠也显示胸腺指数的统计学显著增加。当与媒介物治疗的D-gal小鼠相比时，发现这种增加为26.9％。在该研究中观察到，不管免疫状态如何，UP360补充似乎保护小鼠免受年龄相关的胸腺退化。
表30：用于胸腺保护的体内治疗组
实施例34：UP360补充显示恢复健康脾指数的趋势
脾是免疫系统中的另一个重要器官，因此其指数对于健康的免疫功能是至关重要的。在我们的研究中，以500mg/kg注射D-半乳糖产生免疫小鼠的脾指数统计学显著的25.4％的降低。非免疫小鼠显示脾指数降低16.3％。
对于用UP360口服治疗的小鼠，在400mg/kg下在免疫和非免疫组中以及在200mg/kg下在免疫组中观察到脾指数的最小至中等增加。尽管这些改进没有达到统计学显著性，但UP360治疗显示抑制组织萎缩的趋势，如脾指数的增加所证明的。
表31：用于脾保护的体内治疗组
实施例35：UP360补充保护小鼠免于年龄相关的胸腺退化
尸体剖检时，从每只小鼠解剖胸腺，并在预冷却的多聚甲醛中固定24小时，然后将它们转移到30％蔗糖溶液中持续另外的24小时。然后将固定的组织在液氮中快速冷冻并在干冰中包装运输到全国性组织学用于分析。将组织在冷冻保护剂中快速冷冻，并以10微米厚度在Superfrost Plus载玻片上切片。然后在PBS中漂洗组织，并采用来自CellSignaling Technologies的β-半乳糖苷酶染色试剂盒的方案进行。加入浅曙红复染剂以形成对比，并用非水性封固剂封固载玻片。然后将衰老细胞在象限中计数以确定阳性细胞的总百分比。使用Olympus BH2，Nikon Eclipse 800显微镜进行细胞计数和成像，该显微镜具有Olympus DP26照相机，用Cellsens Standard 1.9软件操作。
SA-β-gal染色检测每个胸腺中的衰老细胞，以评价包含多糖和多酚的UP360的免疫器官保护作用。发现SA-β-Gal阳性细胞被染成蓝色(表达高度衰老特异性β-半乳糖苷酶)并随机分散在整个皮层和髓质中。对于较低剂量UP360胸腺组织学观察到的变化与胸腺指数数据一致。如在表32中所见，当与媒介物治疗的D-gal小鼠相比时，用UP360(200mg/kg)治疗的免疫小鼠显示衰老细胞比例的统计学显著降低。这些发现进一步证实包含多糖和多酚的新型组合物UP360的免疫细胞和/或器官保护能力。当与正常对照小鼠相比时，皮下给予D-gal使衰老细胞增加157.8％，而与用媒介物治疗的D-gal小鼠相比，用UP360以200mg/kg治疗的小鼠显示衰老细胞减少42.7％。
表32：用于衰老细胞变化的体内治疗组
实施例36：基于芦荟的组合物UP360增加D-gal诱导的血清IgA
在研究结束时收集血清，并评估体液免疫的标志物，包括IgG。免疫对照组与非免疫对照组的IgA抗体水平没有显著差异。D-gal+200mg/kg UP360组具有高于D-gal组的趋势(p＝0.06)，而D-gal+400mg/kg UP360组具有比D-gal组显著更高的血清IgA。
表33：用UP360治疗的D-gal诱导的小鼠血清中的IgA抗体
*表示统计学显著性
实施例37：基于芦荟的组合物UP360对CD45+细胞(白细胞)的作用
研究开始九周后，收集小鼠全血以总体评估白细胞群，和具体评估免疫细胞亚群。使用两种方法分析数据，作为对特异性标志物阳性的细胞的百分比，和作为每μL血液的细胞(Alvarez DF)(Vera EJ)。因为D-gal处理的小鼠具有高水平的CD45+细胞(白细胞)，以CD45+细胞的百分比报告的发现突出显示了与以细胞/μL血液报告的发现不同的发现。这两个数据组都报告UP360作为免疫增强剂的性能。
表34：小鼠全血中的CD45+细胞白细胞
*表示统计学显著性
在从全血中去除红细胞后，使用7-氨基-放线菌素D区分活细胞和死细胞，并使用CD45标记白细胞。表34显示在来自每组的活细胞群中CD45+细胞(白细胞)的量。与非免疫对照组相比，免疫对照组的白细胞百分比显著降低，这潜在地证明流感疫苗接种后其它细胞类型的扩增。与免疫对照组相比，D-gal组的血液中每个活细胞群的白细胞百分比显著更高，其在200mg/kg UP360+D-gal组中降低至对照水平(UP360低)。
实施例38：基于芦荟的组合物对全血中的CD3+T细胞(淋巴细胞群的％)的作用
CD3+CD45+细胞是T细胞群。以所有白细胞(CD45+细胞)的百分比表示，我们发现在流感接种后两周，与非免疫对照相比，免疫对照动物中循环T细胞存在减少的趋势(p＝0.07)。用400mg/kg UP360+D-gal治疗的免疫动物具有比D-gal组显著更高百分比的循环T细胞，指示包含多糖和多酚的UP360响应于流感疫苗接种增加CD3+T细胞扩增或分化。
表35：小鼠全血中的CD3+T细胞
*表示统计学显著性
实施例39：基于芦荟的组合物对全血中的CD4+辅助T细胞(淋巴细胞群的％)的作用
CD45+CD3+CD4+细胞是辅助T细胞，是识别抗原呈递细胞上的抗原并对细胞分裂和细胞因子分泌作出应答的细胞。以所有白细胞(CD45+细胞)的百分比表示，我们发现在流感接种后两周，用200和400mg/kg UP360+D-gal治疗的免疫动物具有比D-gal组显著更高百分比的循环辅助T细胞，指示包含多糖和多酚的UP360增加响应流感接种的辅助T细胞扩增或分化。
表36：小鼠全血中的CD3+CD4+辅助T细胞。
*表示统计学显著性
实施例40：基于芦荟的组合物对全血中的CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞群的％)的作用
CD45+CD3+CD8+细胞是细胞毒性T细胞，是响应于免疫攻击，具有细胞分裂和分泌促凋亡酶以杀死感染细胞的细胞。以所有白细胞(CD45+细胞)的百分比表示，我们发现在流感接种后两周，用200和400mg/kg UP360+D-Gal治疗的免疫动物具有比D-gal组更高百分比的循环细胞毒性T细胞，并且在免疫对照组和非免疫D-gal组中具有比非免疫对照组显著更低百分比的循环细胞毒性T细胞的趋势。
表37：小鼠全血中的CD3+CD8+细胞毒性T细胞。
*表示统计学显著性
实施例41：基于芦荟的组合物对全血中的NKp46+天然杀伤细胞(淋巴细胞群的％)的作用
我们利用两种不同的天然杀伤细胞标志物(小鼠CD49b和NKp46)来鉴定白细胞群中天然杀伤细胞的百分比。天然杀伤细胞参与先天免疫系统。当被激活时，它们分泌细胞因子和颗粒以募集免疫细胞并直接引起感染病原体的细胞中的细胞死亡，因此它们对于对病原体的即时免疫应答是重要的，并且在全身感染早期是有活性的。CD49b是特异性存在于大多数天然杀伤细胞以及可能是天然杀伤T(NKT)细胞的T细胞亚群上的整联蛋白。NKp46是天然细胞毒性受体，其仅存在于天然杀伤细胞上且不标记NKT细胞。NKT和NK样T细胞也基于它们对CD3的表达而排除，因为NK通常是CD45+CD3-CD49b+NKp46+(Goh W)(Narni-MancinelliE)。以所有白细胞(CD45+细胞)的百分比表示，我们发现在流感接种两周后，在任何组中CD3-CD49b+群没有显著差异。然而，当我们观察CD3-NKp46+群时，用D-gal治疗的免疫动物具有比免疫对照组显著更低百分比的天然杀伤细胞，而免疫200和400mg/kg UP360+D-gal治疗组两者具有比免疫D-gal组显著更高百分比的循环天然杀伤细胞。非免疫400mg/kgUP360+D-gal组也具有比非免疫D-gal组显著更高百分比的循环天然杀伤细胞。
表38：小鼠全血中的CD3-NKp46+天然杀伤细胞。
*表示统计学显著性
这些结果是混淆的，因为两种天然杀伤细胞标志物给出了显著不同的结果。天然杀伤细胞标志物根据小鼠品系而变化很大。因为NKp46是对大多数小鼠品系中的天然杀伤细胞具有非常特异性的标志物，而CD49b可以标记其它细胞类型，NKp46可能更可靠。然而，与CD49b相比，对于NKp46，NK细胞在CD45+细胞中的百分比是高的，这与外周血中的人NK数更接近一致(Angelo LS)。小鼠外周血中的NK细胞可能与人相似，或者它们可能与对于NKp46检测到的一样高。
实施例42：基于芦荟的组合物对全血中的TCRγδ+γδT细胞(淋巴细胞群的％)的作用
CD45+CD3+TCRγδ+细胞是γδT细胞，是可以具有不同活性并影响先天和适应免疫应答两者的T细胞小群。它们定位于粘膜以引起针对病原体的第一道防线并帮助建立适应免疫应答。
表39：小鼠全血中的CD3+TCRγδ+γδT细胞
*表示统计学显著性
以所有T细胞(CD3+细胞)的百分比表示，我们发现在流感接种后两周，用200mg/kgUP360+D-gal治疗的免疫动物具有比D-gal组显著更高百分比的循环γδT细胞，而400mg/kgUP360+D-gal组具有比D-gal更高百分比的循环γδT细胞的趋势。这可以指示包含多糖和多酚的UP 360治疗组更好地提供对粘膜中遇到的病原体的免疫应答。
实施例43：基于芦荟的组合物对全血中的CD45+淋巴细胞(细胞/μL)的作用
我们还分析来自非免疫和流感疫苗接种的小鼠组的全血中的细胞群，作为细胞/μL全血。这些数据代表免疫细胞群，而不考虑CD45+细胞和CD3+细胞的差异，这种差异可能混淆代表对那些标志物呈阳性的细胞的每百分比的数据。通常，我们发现以这种方式分析数据获得的显著差异适用于非免疫小鼠组而不是免疫组。
表40：小鼠全血中的CD45+白细胞。
*表示统计学显著性
在非免疫和免疫小鼠组中，每μL血液的CD45+细胞没有显著差异，但在非免疫400mg/kg UP360+D-gal组中CD45+细胞的数量比单独的非免疫D-gal组中的高。
实施例44：基于芦荟的组合物对全血中的CD3+T细胞、CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞(细胞/μL)的作用
与D-gal非免疫组相比，非免疫400mg/kg UP360+D-gal组具有显著更高的CD3+细胞/μL全血。对于CD3+CD4+辅助T细胞和CD3+CD8+细胞毒性T细胞，看到相同的增加。这些发现指示，与仅D-gal组相比，在UP360+D-gal非免疫组中辅助T细胞、细胞毒性T细胞和T细胞的水平一般更高，这可以指示UP360治疗组中的免疫监视和“准备”更好。
表41：小鼠全血中的CD3+T细胞
*表示统计学显著性
表42：小鼠全血中的CD3+CD4+辅助T细胞
*表示统计学显著性
表43：小鼠全血中的CD3+CD8+细胞毒性T细胞
*表示统计学显著性
实施例45：基于芦荟的组合物对全血中的CD49b+天然杀伤细胞(细胞/μL)的作用
用于检测天然杀伤细胞的两种标志物产生相似的结果，与单独的非免疫D-gal相比，在非免疫400mg/kg U360+D-gal组中，具有CD49b+NK细胞增加且NKp46+NK细胞显著增加的趋势。每种标志物的细胞计数变化很大，类似于如前分析的CD45+细胞百分比的变化。两种标志物都指示，与单独的非免疫D-gal相比，非免疫UP360+D-gal组中NK细胞的富集，这可能是UP360治疗组中免疫监视和免疫“准备”的另一指示。
表44：小鼠全血中的CD3-CD49b+天然杀伤细胞
*表示统计学显著性
表45：小鼠全血中的CD3-NKp46+天然杀伤细胞
*表示统计学显著性
实施例46：基于芦荟的组合物对全血中的Ly6C+粒细胞(细胞/μL)的作用
在治疗组和D-gal组中每μL的CD3-Ly6C+粒细胞没有显著差异。与非免疫对照组相比，在非免疫D-gal组和非免疫400mg/kg UP360+D-gal组中的粒细胞显著增加，并且与免疫D-gal和对照组相比，在免疫UP360+D-gal组中每μL的粒细胞存在减少的趋势。与非免疫400mg/kg UP360+D-gal组相比，在免疫400mg/kg UP360+D-gal组中粒细胞存在统计学显著减少。
表46：小鼠全血中的CD3-Ly6C+粒细胞
*表示统计学显著性
实施例47：基于芦荟的组合物对全血中的B220+B细胞(细胞/μL)的作用
在治疗组中，CD3-B220+B细胞没有显著差异，如以每μL全血中的细胞表示，但与单独的非免疫D-gal相比，在非免疫400mg/kg UP360+D-gal组中B细胞有增加的趋势。
表47：小鼠全血中的CD3-B220+B细胞
*表示统计学显著性
实施例48：基于芦荟的组合物对全血中的TCRγδ+γδT细胞、CD4+TCRγδ+γδ辅助T细胞、CD8+TCRγδ+γδ细胞毒性T细胞(细胞/μL)的作用
与单独的非免疫D-gal相比，在非免疫400mg/kg UP360+D-gal组中CD3+TCRγδ+γδT细胞/μL全血增加。这也在CD3+CD4+TCRγδ+辅助γδT细胞群中发现。在CD3+CD8+TCRγδ+细胞毒性γδT细胞群中没有显著差异。这些发现指示在粘膜的T细胞群中增加免疫监视和免疫“准备”。
表48：小鼠全血中的CD3+TCRγδ+γδT细胞
*表示统计学显著性
表49：小鼠全血中的CD3+CD4+TCRγδ+γδ辅助T细胞
*表示统计学显著性
表50：全血中的CD8+TCRγδ+γδ细胞毒性T细胞(细胞/μL)
*表示统计学显著性
实施例49：基于芦荟的组合物显著增加超氧化物歧化酶(SOD)
D-gal引起老化表型的机制是通过产生自由基，尤其是晚期糖基化终产物。我们试图测量抗氧化酶浓度和自由基水平，以确定UP360是否影响小鼠模型的这一方面(AzmanKF)。
表51：小鼠血清样品的超氧化物歧化酶含量
SOD的单位是表现出超氧化物自由基50％歧化作用所需的量。
*表示统计学显著性
超氧化物歧化酶中和氧自由基以防止对细胞结构、蛋白质和核酸的氧化损伤。活性氧物质用作免疫信号传导的第二信使(Ighodaro OM)。抗氧酶的表达增加指示中和过量活性氧物质的能力。我们测试免疫小鼠血清样品的超氧化物歧化酶水平，并且发现UP360+D-Gal组具有比D-Gal组显著更高水平的超氧化物歧化酶。
实施例50：基于芦荟的组合物对Nrf2的蛋白表达的作用
Nrf2是在氧化应激条件下激活并上调参与抗氧化应答的转录因子。延长的免疫系统激活或氧化应激引起Nrf2的上调。脾匀浆在SDS-PAGE上运行，转移，并对所述蛋白质进行印迹。通过光密度分析法测量条带强度，并将每种关注的蛋白相对于β-肌动蛋白负载对照归一化。比较每组中每种关注的蛋白的半定量，并且发现免疫200mg/kg UP360+D-gal和400mg/kg UP360+D-gal组具有比单独的D-gal显著更高的Nrf2，指示在UP360组中抗氧化途径激活的增加。
表52：归一化为β-肌动蛋白且相对于对照组的免疫小鼠脾匀浆的Nrf2蛋白水平
*表示统计学显著性
实施例51：基于芦荟的组合物(UP360)对缓解氧化应激加上肺感染诱导的小鼠死亡率和急性炎症性肺损伤的作用
使用高氧和微生物(铜绿假单胞菌(PA))感染诱导的小鼠评价在实施例9中制备的预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)对死亡率的作用。
诱导前使小鼠适应一周。为了研究UP360是否能降低动物死亡率并增加它们的存活，在用UP360治疗七天后将小鼠暴露于高氧(>90％氧，72小时)，并在用PA接种前持续这3天。在细菌接种后观察小鼠48小时。与留在室内空气中的小鼠相比，预先暴露于高氧引起显著更高的死亡率(O2)(RA，表53)。通过肠，我们出乎意料地发现，在PA接种前仅暴露于高氧48小时的小鼠中，PA接种后24小时，有相当大的死亡率。与保留在室内空气(RA)中并接受相同量的PA的小鼠中9％的死亡率相比，在PA接种前用高氧治疗2天的小鼠中观察到64％的死亡率。另一方面，在暴露于高氧2天之前用白藜芦醇(RES)和包含多糖和多酚的UP360预防性治疗7天，然后接种PA的小鼠在接种后24小时的死亡率分别为27％和31％。这些结果表明UP360在降低动物死亡率方面提供改进的优点。对于预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)观察到的这些存活数据与实施例20-22中LPS诱导的存活研究记录的数据一致，其中UP360补充产生动物死亡率的统计学显著降低。
表53：UP360对PA感染的小鼠中高氧诱导的死亡率的作用
RA O2 RES(50mg/kg) UP360(500mg/kg)
死亡动物 1 9 3 4
总动物 11 14 11 13
死亡率％ 9.09％ 64.29％ 27.27％ 30.77％
在证实基于芦荟的组合物在降低高氧和PA诱导的动物的死亡率中的有益作用之后，进行由细菌感染诱导的氧化应激加剧的急性肺损伤。使小鼠适应一周。在高氧暴露之前，通过口服给予UP360(500mg/kg)和白藜芦醇(50mg/kg)治疗动物7天。将小鼠暴露于>99％O2 48小时，同时维持每日口服给予测试材料。经由鼻内吸入用PA(5×108CFU)接种的小鼠仍然保持测试材料的每日治疗。接种后将小鼠恢复到21％O2。感染后24小时收获支气管-肺泡灌洗液(BAL)、收集血液样品和肺组织。测量BAL中的总蛋白质含量并测定BAL和肺中的活细菌数。进行测定以确定表54中列出的生物标志物，例如TNF-α、IL-1、IL-6、CRP、IL-8、IL-10、HMGB-1、MPO、MIP-2、NF-κB、Nrf2、巨噬细胞计数、嗜中性粒细胞计数、组织学疾病严重程度。
如在表54中所见，基于芦荟的组合物显示对高氧和微生物感染的小鼠的气道中的细菌清除的统计学显著作用。以前，已经显示暴露于高氧可能损害宿主对细菌感染的防御，导致气道中较高的细菌载量(Patel等人，2013)。表54中的结果指示，与保持在室内空气(RA)中的小鼠相比，将小鼠预先暴露于高氧(O2)，气道中的细菌载量显著升高。对应于在用白藜芦醇治疗的小鼠中显著降低肺损伤，在这些小鼠中气道细菌载量显著降低(RES)。
表54：基于芦荟的组合物对高氧和微生物感染的小鼠的气道中的细菌清除显示统计学显著作用。
统计分析：Dunnett氏多重比较测试
表55：来自BAL、血清和肺匀浆的生物标志物的测定优先顺序
类似地，与暴露于高氧并单独用媒介物治疗的小鼠相比，用UP360治疗的小鼠在其气道中具有显著更低量的细菌载量。与用高氧和媒介物对照(O2)治疗的小鼠相比，气道中细菌载量的差异是统计学显著的。这些结果表明UP360实际上可以减少气道中的细菌载量。
实施例52：在人临床试验中评价包含多糖和多酚的基于芦荟的组合物
方案：随机、三盲、安慰剂对照、平行临床试验，以研究在健康成人中支持免疫功能的产品。本研究的目的是研究在实施例9中制备的包含多糖和多酚(并且在某些情况下由多糖和多酚组成)的研究产品(IP)UP360在健康成人中支持免疫功能上的功效。
在随机、三盲、安慰剂对照、平行研究中，评价研究产品在疫苗接种前28天和疫苗接种后28天在健康成人群中支持免疫功能的功效。该研究包括年龄在40-80岁之间(包括端值)的男性和女性，他们还没有接受流感疫苗，但是愿意接受流感疫苗，同意提供流感疫苗接种的口头历史，同意在整个研究中尽可能多地维持当前的生活习惯，这取决于他们维持以下各项的能力：饮食、药物、补充物、锻炼和睡眠，并且避免服用新的补充物，健康的(如由病史和实验室结果确定的，如由合格调查员(QI)评估的)，愿意完成与研究相关的问卷和日记并且完成所有临床就诊，并且自愿地书面提供知情同意参与研究。
排除以下受试者：1.在研究期间怀孕、哺乳或计划怀孕的妇女。2.对UP360、安慰剂或流感疫苗中的活性或非活性成分过敏的参与者。3.在自2020年9月起的基线前或第28天疫苗接种前未接种流感的参与者。4.在基线前或第28天疫苗接种前自我报告COVID-19的诊断的参与者。5.接受COVID-19疫苗的参与者。6.在基线4周内正使用处方免疫调节剂(包括皮质类固醇)，例如免疫抑制剂或免疫刺激剂。7.除非愿意清除，否则正使用与增强或调节免疫系统有关的膳食补充剂或草药。
预期研究受试者参与研究最多达56天。受试者参加研究，在第1次就诊(筛选，第-45天至-4天)获得知情同意，并在第2次就诊(基线，第0天)以确认合格性和随机化。
在第2次就诊(第0天)、第3次就诊(第28天)和第4次就诊(第56天)评估研究的主要和次要功效和安全终点。在筛选就诊时记录人口统计学信息和病史。研究受试者每日服用UP360，直到流感疫苗接种(在第28天)，然后持续每日服用UP360持续另外4周内(直到第56天)。
主要研究结果是UP360和安慰剂在免疫参数变化方面的差异，如通过第28天和56天时，血液中的淋巴细胞群(CD3+、CD4+、CD8+、CD45+、TCRγδ+、CD3-CD16+56+)和免疫球蛋白(IgG、IgM和IgA)距基线的变化来评估的。
进行统计分析，并获得总体样品和研究组的统计学汇总，包括关于人口统计学特征的平均值、中值、标准偏差、最小值、最大值、比例(如果分类的话)和结果测量。当满足正常假设时，使用方差分析(ANOVA)检查两个治疗组(UP360和安慰剂)之间连续变量的平均值的差异，而当不满足正常假设时，使用Kruskal-Wallis检验。适当时，使用Chi-square和Fisher精确检验(当细胞计数小于5时)来研究分类变量的差异。重复测量方差分析(线性混合模型)用于检查治疗组之间随时间变化的结果平均值的差异。基线值作为协变量包括在每个模型中。重复测量方差分析(线性混合模型)也用于检查两个治疗组之间结果随时间(从基线到28天、从基线到56天，和从第28天到56天)变化的平均值的差异，基线值作为协变量包括在每个模型中。来自LMM的成对统计学显著性(组间和组内)。Bonferroni校正用于成对比较。统计学显著性定义为p值≤0.05。统计分析系统软件版本9.4(SAS InstituteInc.,Cary,NC,USA)用于分析。
在初步临床数据报告中观察到主要终点(TCRγδ+和CD45+细胞)的统计学显著结果。如在表56中所见，与接受安慰剂的受试者相比，接受预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)的受试者在多个时间点显示γδT细胞细胞群百分比的统计学显著增加。虽然安慰剂组的受试者显示TCRγδ+细胞百分比降低10.5％和5.6％，而预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)在给药后第28天和第56天分别显示TCRγδ+细胞群百分比增加21.5％和24.5％。与安慰剂相比，接受基于芦荟的组合物的受试者在治疗给药后第28天和第56天分别显示TCRγδ+细胞群百分比增加23.5％和38.9％(P≤0.001)。与安慰剂相比，在第0-56天(p＝0.0002)和第28-56天(p<0.0108)观察到的TCRγδ+细胞群百分比变化的这些增加对于在实施例9中制备的基于芦荟的组合物(UP360)是统计学显著的。类似地，对于组内基于芦荟的组合物，相同时间范围内的这些变化是统计学显著的。反映临床前数据，预期的基于芦荟的组合物(包括UP360，其包含多糖和多酚，并且在一些实施方案中由多糖和多酚组成)显示统计学显著诱导γδT细胞。基于讨论中描述的这种独特的T细胞亚群的特征，其中这些数据清楚地显示基于芦荟的组合物在免疫调节、监视和稳态中的主要活性是这些细胞的诱导的结果。
表56：相对于安慰剂，UP360中TCRγδ+细胞的变化％
表57.相对于安慰剂，UP360中CD45+细胞的变化％
作为补充基于芦荟的组合物的结果，观察到CD45+细胞水平的相似但相反的模式。如在表57中所见，与接受安慰剂的那些参与者相比，在第56天，接受UP360的参与者的CD45+细胞％平均低3.761(p＝0.0066)。与接受安慰剂的那些参与者相比，从第0天至第56天，接受UP360的参与者的CD45+细胞变化％平均低3.811(p＝0.0175)。类似地，与接受安慰剂的那些参与者相比，从第28天至第56天，接受UP360的参与者的CD45+细胞变化％平均低3.220(p＝0.0442)。
第二结果是在第28天和第56天UP360和安慰剂之间在以下方面存在差异：1.确认的COVID-19感染的数量；2.确认的流感病例的数量；3.COVID-19对生活质量的影响，通过COVID-19对QoL问卷调查的影响来评估；4.非处方感冒和流感药物的使用。在第56天UP360和安慰剂之间在以下方面存在差异：1.由于COVID-19而住院的数量；2.由于流感而住院的数量。
UP360和安慰剂之间在从基线到第28天和第56天的那些测量值的变化方面存在差异：1.红细胞沉降率(ESR)和C-反应蛋白(CRP)；2.血液学参数：分化(嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)的白细胞(WBC)计数、网织红细胞计数、红细胞(RBC)计数、血红蛋白、血细胞比容、血小板计数、RBC指数(平均血细胞体积(MCV)、平均血细胞血红蛋白(MCH)、平均血细胞血红蛋白浓度(MCHC)和红细胞分布宽度(RDW))；3.补体C3和C4蛋白；4.平均全球严重程度指数，如通过改进的Wisconsin上呼吸道症状调查(WUSS)-24日症状评分的曲线下面积(AUC)测量；5.平均症状严重程度评分，如通过WURSS-24日严重程度症状评分的AUC测量的；6.良好天数(定义为对于问题“你今天感觉不舒服吗？”评分为0(没有不舒服)的天数)，如通过改进的WURSS-24问卷调查评估的；7.生病天数(定义为对于问题“你今天感觉不舒服吗？”评分为1-7中的任一数值(生病)的天数)，如通过改进的WURSS-24问卷调查评估的；8.普通上呼吸道感染(UTRI)症状的频率，如通过改进的WURSS-24问卷调查评估的；9.普通UTRI症状的持续时间，如通过改进的WURSS-24问卷调查评估的；10.普通UTRI症状的严重程度，如通过改进的WURSS-24问卷调查评估的；11.活力和生活质量，如通过活力和生活质量(QoL)问卷调查评估的。
预期的方法进一步包括用于支持健康的炎性应答的方法；维持补体C3和C4蛋白、细胞因子和细胞因子对感染的应答的健康水平；缓解、调节和维持TNF-α、IL-1β、IL-6、GM-CSF；IFN-α；IFN-γ；IL-1α；IL-1RA；IL-2；IL-4；IL-5；IL-7；IL-9；IL-10；IL-12p70；IL-13；IL-15；IL17A；IL-18；IL-21；IL-22；IL-23；IL-27；IL-31；TNF-β/LTA、CRP和CINC3。
收集并储存样品用于将来分析，以分析UP360和安慰剂在第28天和第56天在以下方面距基线的变化差异：
1.细胞因子(GM-CSF；IFN-α；IFN-γ；IL-1α；IL-1β；IL-1RA；IL-2；IL-4；IL-5；IL-6；IL-7；IL-9；IL-10；IL-12p70；IL-13；IL-15；IL17A；IL-18；IL-21；IL-22；IL-23；IL-27；IL-31；TNF-α；TNF-β/LTA 150)
2.高迁移率组盒1(HMGB1)蛋白、细胞核因子κB(NF-κB)、核因子红细胞样2-相关因子2(Nrf-2)
3.氧化应激，如通过8-异前列腺素F2α、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和晚期糖基化终产物(AGE)评估的
4.特定病毒株的血凝素抑制(HI)滴度
除了功效分析外，还进行安全性评价。1.临床化学参数：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素、肌酸酐、电解质(Na+、K+、Cl-)、估计的肾小球滤过率(eGFR)、葡萄糖；突发前和突发后不良事件的发生率；3.生命体征(血压(BP)和心率(HR))
实施例53：对UP360的快速免疫调节作用的临床概念验证研究。
该临床概念验证研究的目标是比较在实施例9中制备的包含多糖和多酚的新型营养共混物UP360与安慰剂的急性免疫作用。该数据对于验证免疫相关作用是重要的。
该临床概念验证研究目的在于通过评价免疫细胞活化、细胞运输和细胞因子向促炎和抗炎细胞因子、抗病毒肽和恢复性生长因子的变化来记录服下测试产品的急性作用。
收集关于免疫细胞运输和监视的数据。测试显示服下包含多糖和多酚的新型组合物是否使免疫系统的警觉性快速改变，以寻找和尝试消除微生物侵入物，并在免疫细胞类型之间有效地协作。
对于该临床研究，遵循建立的安慰剂对照、随机、双盲、交叉研究设计来测试人受试者。具体地，研究设计已经用于关于淋巴细胞运输变化的免疫调节产品的先前临床研究，特别是干细胞亚群。在给药前将受试者随机分配到活性剂或安慰剂，收集基线样品，在摄取研究产品后，在给药后1、2、3小时收集血液样品。在7天的洗出后，受试者返回就诊，并以交叉的方式服用相反的产品，重复研究程序。
我们评价的测试参数不一定保持恒定，甚至在几个小时内，因为它们与人的新陈代谢、个体昼夜节律和其它正常生理参数有关。因此，这种性质的研究必须包括安慰剂测试日，允许在受试者内分析每个人测试日之间的变化。这极大地加强了来自这种类型的试验性研究的数据分析。在缺乏安慰剂测试日的情况下，我们认为数据是不确定的，因为变化不能被解释为与产品摄入相关。
主要结果测量：免疫监视：免疫细胞的体内运输和激活。该研究被设计为通过免疫监视和免疫警觉性来显示快速的免疫支持。
对于该研究，12名任一性别的健康受试者在IRB批准的书面知情同意书之后招募。这种性质的研究的包含/排除概况不是不重要的，并且在招募之前仔细评价每个潜在的研究参与者。为了使研究的最初临床就诊期间的预期压力和忧虑最小化，每个研究参与者必须在我们的设施处参与先前的研究，或者必须在临床研究日之前在我们经历研究程序的地方参加就诊。
研究包括健康成人；年龄18-75岁(包括端值)；BMI在18.0-34.9之间(包括端值)；愿意遵守研究程序，包括：在整个研究中维持一致的饮食和生活方式常规，在临床就诊当天保持一致的清淡早餐习惯，在研究就诊早晨戒除运动和营养补充剂，在临床就诊前至少一小时戒除使用咖啡、茶和软饮料；在临床就诊期间，戒除音乐、糖果、口香糖、计算机/手机的使用。
排除满足这些标准的受试者：先前的大胃肠手术(可能改变测试产品的吸收)(小手术不是问题，包括先前阑尾和胆囊的去除)；每天服用抗炎药物；正经历强烈的压力事件/生命变化；正在密集运动训练中(例如马拉松跑步者)；在过去12个月期间的癌症；在过去12个月期间的化疗；正用免疫抑制剂药物治疗；诊断患有自身免疫病症，例如系统性红斑狼疮、溶血性贫血；在研究期间或在研究开始前4周内捐献血液；在过去12周内已经接受可的松注射；在最后一个月期间的免疫；正服用抗焦虑、催眠或抗抑郁处方药物；正在进行的急性感染(包括牙齿、窦、耳等)；在该试验期间参与另一临床试验研究，涉及研究产品或生活方式改变；异常睡眠程序(实例：上夜班工作、频繁熬夜的不规则作息、学习、派对)；不愿意在研究的持续时间期间维持恒定的补充物摄入；具有生育潜力的女性：怀孕、哺乳或试图怀孕；已知的与活性测试产品或安慰剂中的成分相关的食物过敏。处方药物将在逐个病例的基础上进行评价。
可服用的测试产品：将提供在实施例9中制备的包含多糖和多酚的测试产品活性剂UP360和安慰剂。在每个临床日，基线抽血后，在临床工作人员在场的情况下，立即给予受试者单一剂量的活性测试产品UP360或安慰剂。受试者将该胶囊与水和少量清淡的苏打饼干一起服下以刺激消化功能。
所提出的临床研究程序的解释：在监测免疫激活事件的临床试验中，我们预期事件的级联，开始于肠中免疫细胞的激活、细胞因子水平的全身变化、免疫细胞运输的变化(增强的免疫监视)，随后是全身组织中的免疫监视，并且可能激活的免疫细胞再进入回到血液循环。
血液样品提供了产品被服下后发生的免疫事件的便利窗口。我们没有方便的窗口进入在最初的肠激活时可能发生的情况，但是我们设想这是类似的体外事件。我们没有进入组织的窗口，并因此不能监测免疫细胞从血液迁移进入组织以清除微生物侵入物和进行先天和适应类型的免疫应答之后的下游事件。因此，我们通过取一些血液样品并用微生物模拟物离体(体外)攻击免疫细胞来模拟这种情况。
所述测试目的在于监测血液循环中所见的免疫细胞的类型和活化状态的快速变化。血液中免疫细胞数量的增加和减少是细胞进出血流运输的量度。
我们正在寻找微妙的事件，其中在大多数研究参与者服下相同的测试产品后观察到的任何全身变化表明诱导了免疫激活事件。这是产品已经触发增加的免疫意识的良好指示。
在免疫监视中，免疫细胞移入和移出组织，这可以通过测量循环血液中的细胞数量来测量。在免疫警觉性中，我们测量了在循环血液中发挥功能的特定细胞。
免疫细胞运输和免疫警觉性状态
该分析允许我们检测服下测试产品是否导致循环中细胞数量的快速变化，和/或体内激活细胞。新鲜抽取的血液样品用于测试免疫细胞数量和活化状态的变化。一式三份测定每次抽血的细胞。
用T细胞标志物(CD3和CD56和CD57标志物)以及两种活化标志物(CD69和白介素-2受体CD25)染色细胞。这允许分析研究中每个时间点血液循环中的以下类型的免疫细胞的数目：CD3-阴性、CD56-阳性NK细胞；CD3+CD56+NKT细胞；CD3+CD56-T淋巴细胞；CD3-CD56-非NK、非T淋巴细胞；CD3-CD57+NK细胞；
CD3-CD56+CD57+NK细胞；单核细胞(通过前向/侧向散射图谱鉴定)。
在分析期间，测定上述细胞群的表面上活化分子CD69和生长因子受体CD25的表达水平。
注意：免疫监视涉及淋巴细胞亚群(包括NK和T细胞)的持续再循环。运输显示显著的昼夜节律并且受人的代谢状态影响。当比较可服用的免疫调节产品对免疫监视的急性作用时，重要的是具有安慰剂对照测试日，以说明给定的人的代谢状态。
加入更多的流式细胞术组是可行的。预算选项包括如下。另外的组包括γδ(γδ)T细胞(γδTCR+CD5-CD8-)数量的附加组：CD3/γδT细胞受体；CD5；在γδT细胞上CD56-可以是+或-；CD69、CD25。
B和T淋巴细胞亚群数量的附加组，和CD45同种型表达：CD4T细胞亚群、CD8T细胞亚群、CD19B淋巴细胞、在幼稚T和B细胞上表达的CD45RA、在活化和记忆T和B细胞上表达的CD45R0。
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Claims (49)

1.用于调节免疫稳态的组合物，其包含富含一种或多种多糖的芦荟提取物；富含一种或多种多糖的茯苓提取物；和富含一种或多种多酚化合物的迷迭香提取物的组合。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中的所述芦荟提取物或茯苓提取物或迷迭香提取物以每种提取物的重量计在1％-98％的范围内，其中芦荟:茯苓:迷迭香(APR)的最佳重量比为3:2:1(50％:33.3％:16.7％)或1:1:1(33.3％:33.3％:33.3％)或3:6:1(30％:60％:10％)。
3.权利要求1所述的组合物，其中所述芦荟提取物是来自芦荟或库拉索芦荟的全叶凝胶或内叶凝胶，所述茯苓提取物来自茯苓(Poria cocos)或茯苓(Wolfiporia extensa)的蘑菇或子实体，和迷迭香提取物是来自迷迭香的叶。
4.权利要求1所述的组合物，其中所述芦荟提取物包含0.01％-99.9％的多糖。
5.权利要求1所述的组合物，其中所述茯苓提取物包含0.01％-99.9％的多糖。
6.权利要求1所述的组合物，其中所述迷迭香提取物包含0.01％-99.9％的迷迭香酸。
7.权利要求1所述的组合物，其中来自所述芦荟提取物的所述一种或多种多糖是乙酰化多糖或乙酰吗喃或其任意组合。
8.权利要求1所述的组合物，其中来自所述茯苓提取物的所述一种或多种多糖是β-葡聚糖或其组合。
9.权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种多糖从选自以下的植物物种或其组合富集：芦荟、库拉索芦荟、好望角芦荟、木立芦荟、黄芪、灵芝、青稞、姬松茸(巴西菇)、松果菊、狭叶松果菊、舟形乌头(舟形乌头)、接骨木花、茯苓、茯苓、催眠睡茄、柴胡、甘草属、西洋参、人参、韩国红参、香菇(香菇)、桦褐孔菌(白桦茸)、香菇、宁夏枸杞、枸杞、裂蹄木层孔菌(子实体)、变色栓菌(子实体)、瓜尔豆胶(瓜耳胶)、变色栓菌、岗村枝管藻、裙带菜、蘑菇、海藻、酵母、褐藻、龙舌兰糖浆、褐色海藻、可发酵纤维、谷物、海参、龙舌兰、洋蓟、芦笋、韭菜、大蒜、洋葱、黑麦、大麦仁、小麦、梨、苹果、番石榴、榅桲、李子、鹅莓、橙子和其它柑橘果实。
10.权利要求1所述的组合物，其中所述多酚化合物从选自以下的植物物种或其组合富集：香蜂草、胶苦瓜、辣薄荷、紫苏、鼠尾草、林地鼠尾草、欧洲变豆菜、彩叶草、百里香、灌木薄荷、紫草、hornwort Anthoceros agrestis、荜茇、黄连、当归、漆树、光果甘草、乌拉尔甘草、姜黄、迷迭香、迷迭香、姜、远志、啤酒花、忍冬、药用鼠尾草、积雪草、乳香、长叶薄荷、青海云杉、柑、酸橙、茶、野葛根、葛根、大豆、辣椒物种、虎杖、茶、番茄、十字花科蔬菜、葡萄、蓝莓、树莓、桑葚、苹果、红辣椒。
11.权利要求1所述的组合物，其中所述多酚化合物包含迷迭香酸、共轭儿茶素例如EGCG、ECG、表儿茶素、木蝴蝶素、山柰酚、染料木素、槲皮素、紫铆因、木犀草素、柯因、芹菜配基、姜黄素、白藜芦醇、辣椒素、球腺糖A、6-姜烯酚、姜辣素、小檗碱、胡椒碱或其组合。
12.权利要求1所述的组合物，其中所述多糖和多酚从选自以下的植物部分或真菌富集：叶、树皮、树干、树干皮、茎、茎皮、小枝、块茎、根、根茎、根皮、树皮表面、嫩枝、籽、果实、子实体、蘑菇、雄蕊群、雌蕊群、花萼、雄蕊、花瓣、萼片、心皮(雌蕊)、花或其任意组合。
13.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中的所述芦荟提取物、所述茯苓提取物和所述迷迭香提取物用任何合适的溶剂提取，所述溶剂包括CO2超临界流体、水、甲醇、乙醇、丙酮、醇、水-混合溶剂或其组合。
14.权利要求1所述的组合物，其中通过溶剂沉淀、超滤、酶消化、具有硅胶、XAD、HP20、LH20、C-18、氧化铝、聚酰胺、CG161和尺寸排阻柱树脂的柱色谱单独地和/或组合地富集所述多糖。
15.权利要求1所述的组合物，其中通过溶剂分配、沉淀、蒸馏、蒸发、超滤、具有硅胶、XAD、HP20、LH20、C-18、氧化铝、聚酰胺、尺寸排阻柱和CG161树脂的柱色谱单独地或组合地富集一种或多种多酚。
16.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物进一步包含药学上或营养学上可接受的活性剂、辅助剂、载体、稀释剂或赋形剂，并且其中所述药物或营养制剂包含约0.1重量百分比(重量％)至约99.9重量％的活性化合物。
17.权利要求16所述的组合物，其中所述活性剂、辅助剂、赋形剂或载体包含大麻油或CBD/THC、姜黄提取物或姜黄素、榄仁树提取物、柳树皮提取物、钩果草根提取物、辣椒提取物或辣椒素、花椒树皮提取物、黄檗树皮提取物、啤酒花提取物、乳香提取物、蔷薇果提取物、绿茶提取物、槐属提取物、薄荷或胡椒薄荷提取物、姜或黑姜提取物、绿茶或葡萄籽多酚、Ω-3或Ω-6脂肪酸、磷虾油、γ-亚麻酸、柑橘生物类黄酮、金虎尾浓缩物、虾青素、碧萝芷、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、维生素B、维生素A、L-赖氨酸、钙、锰、锌、矿物氨基酸螯合物、氨基酸、硼和甘氨酸硼、二氧化硅、益生菌、樟脑、薄荷醇、钙基盐、二氧化硅、组氨酸、葡糖酸铜、CMC、麦芽糖糊精、β-环糊精、纤维素、葡萄糖、盐水、水、油、鲨鱼和牛软骨或其组合。
18.权利要求1所述的组合物，其中将所述组合物配制为片剂、硬胶囊、软凝胶胶囊、粉末或颗粒、压缩片剂、丸剂、胶质、口香糖、sashay、薄片、棒剂或液体形式、酊剂、气涂敷剂、半固体、半液体、溶液、乳液、乳膏、洗剂、软膏、凝胶基料或类似形式。
19.用于治疗、管理、促进调节哺乳动物的免疫稳态的方法，所述方法包括给予0.01mg/kg至500mg/kg所述哺乳动物体重的有效量的组合物。
20.权利要求19所述的方法，其中所述组合物包含富含一种或多种多糖的芦荟提取物；富含一种或多种多糖的茯苓提取物；和富含一种或多种多酚化合物的迷迭香提取物的组合。
21.权利要求19所述的方法，其中给药所述组合物选自口服给药、局部给药、栓剂给药、静脉内给药、皮内给药、胃内给药、肌内给药、腹膜内给药和静脉内给药。
22.权利要求19所述的方法，其包括通过优化或平衡免疫应答来维持免疫稳态；改进老化和免疫器官衰老损害的免疫；预防慢性炎症和炎症损害的免疫；帮助维持对流感疫苗接种或COVID-19疫苗接种的健康的免疫应答；帮助维持针对病毒感染和细菌感染的健康的免疫功能；保护哺乳动物的免疫系统免受空气污染诱导的氧化应激损伤。
23.权利要求19所述的方法，其进一步包括用于以下的方法：调节作为内源性或外源性反应侵袭触发物的HMGB1，并通过抑制HMGB1释放或抵消其作用来转换宿主免疫应答以恢复稳态，通过阻断细胞质易位或通过阻断囊泡介导的释放来靶向HMGB1主动或被动释放；或抑制细胞核中的分子内二硫键形成；在释放并中和其作用后直接靶向HMGB1；阻断HMGB1模式识别受体例如Toll样受体(TLR)-2/4/7/9和晚期糖基化终产物受体(RAGE)或抑制其信号转导；改变生理化学微环境并防止形成HMGB1四聚体和干扰HMGB1对TLR和RAGE的结合亲和力，防止HMGB1的簇形成或自缔合。
24.权利要求19所述的方法，其进一步包括用于以下的方法：支持健康的炎性应答；维持补体C3和C4蛋白、细胞因子和细胞因子对感染的应答的健康水平；缓解、调节和维持TNF-α、IL-1β、IL-6、GM-CSF；IFN-α；IFN-γ；IL-1α；IL-1RA；IL-2；IL-4；IL-5；IL-7；IL-9；IL-10；IL-12p70；IL-13；IL-15；IL17A；IL-18；IL-21；IL-22；IL-23；IL-27；IL-31；TNF-β/LTA、CRP和CINC3。
25.权利要求19所述的方法，其进一步包括控制氧化应答和缓解氧化应激；通过增加过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和Nrf2来增强抗氧化能力；降低或维持丙二醛(MDA)、8-异前列腺素F2α和晚期糖基化终产物(AGE)；中和活性氧物质；保护哺乳动物免于UV和化学氧化应激引起的DNA损伤。
26.权利要求19所述的方法，其进一步包括改进先天免疫；改进适应免疫；增加白细胞的活性和计数、增强天然杀伤(NK)细胞功能；增加、调节、维持T和B淋巴细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞的计数；增加CD3+、CD3-CD56+NK细胞、CD3+CD56+NKT细胞、CD3+CD56-T淋巴细胞、CD3-CD56-非NK、非T淋巴细胞、CD3-CD57+NK细胞、CD3-CD56+CD57+NK细胞、CD4+NKp46+天然杀伤细胞、TCRγδ+γδT细胞和CD4+TCRγδ+辅助γδT细胞和CD8+细胞计数；调节CD45+细胞、CD45RA原初T和B细胞、CD45R0活化的和记忆T和B细胞；保护和促进巨噬细胞吞噬活性；和支持或促进正常抗体IgG、IgM、IgA产生、哺乳动物的对于特定病毒株的血凝素抑制(HI)滴度。
27.权利要求19所述的方法，其进一步包括维持呼吸器官中的健康肺微生物群或共生系统；维持肺清洁和排毒能力；保护肺结构完整性和氧交换能力；维持呼吸道并增强肺泡的吸氧能力；保护正常健康的肺功能免受病毒感染、细菌感染、吸烟和空气污染；缓解氧化应激引起的肺损伤；和促进肺的微循环和保护哺乳动物的正常凝血功能。
28.权利要求19所述的方法，其进一步包括缓解或降低感冒/流感样症状，包含身体疼痛、喉咙痛、咳嗽、轻微的喉咙和支气管刺激、鼻塞、鼻窦充血、窦压、流鼻涕、打喷嚏、丧失嗅觉、丧失味觉、肌肉疼痛、头痛、发热和寒战；帮助疏松痰(粘液)和稀薄支气管分泌物，以使咳嗽更生痰；降低支气管刺激的严重程度；降低病毒感染、微生物感染和空气污染引起的肺损伤或水肿或炎性细胞浸润的严重程度；在整个感冒/流感或污染季节支持支气管系统和舒适呼吸；预防或治疗肺纤维化；降低普通感冒/流感的持续时间或严重程度；降低呼吸系统的病毒和细菌感染的严重程度或持续时间；预防或治疗或治愈由病毒、微生物和空气污染物引起的呼吸道感染；管理或治疗或预防或逆转呼吸道感染的进展；和管理或治疗或预防或逆转肺炎的进展、促进和加强和恢复哺乳动物的肺和整个呼吸系统的修复和更新功能。
29.通过调节HMGB1用于维持免疫稳态的组合物，其包含一种或多种多糖和一种或多种多酚化合物的组合，其中所述组合物调节HMGB1，通过抑制HMGB1释放或抵消其作用，通过阻断细胞质易位或通过阻断囊泡介导的释放，靶向HMGB1主动或被动释放；或抑制细胞核中的分子内二硫键形成；或在释放并中和其作用后直接靶向HMGB1；或阻断HMGB1模式识别受体例如Toll样受体(TLR)-2/4/7/9和晚期糖基化终产物受体(RAGE)或抑制其信号转导；或改变生理化学微环境并防止形成HMGB1四聚体和干扰HMGB1对TLR和RAGE的结合亲和力；或防止HMGB1的簇形成或自缔合。
30.权利要求29所述的组合物，其中所述组合物中的所述多糖和酚类化合物在1％:99％和99％:1％的范围内，以每种类型的化合物的重量计。
31.权利要求29所述的组合物，其中所述一种或多种多糖从包含以下的植物物种富集：芦荟、库拉索芦荟、好望角芦荟、木立芦荟、黄芪、灵芝、青稞、姬松茸(巴西菇)、松果菊、狭叶松果菊、舟形乌头(舟形乌头)、接骨木花、茯苓、茯苓、催眠睡茄、柴胡、甘草属、西洋参、人参、韩国红参、香菇(香菇)、桦褐孔菌(白桦茸)、香菇、宁夏枸杞、枸杞、裂蹄木层孔菌(子实体)、变色栓菌(子实体)、瓜尔豆胶(瓜耳胶)、变色栓菌、岗村枝管藻、裙带菜、蘑菇、海藻、酵母、褐藻、龙舌兰糖浆、褐色海藻、可发酵纤维、谷物、海参、龙舌兰、洋蓟、芦笋、韭菜、大蒜、洋葱、黑麦、大麦仁、小麦、梨、苹果、番石榴、榅桲、李子、鹅莓、橙子和其它柑橘果实或其组合。
32.权利要求29所述的组合物，其中所述多酚化合物从包含以下的植物物种富集：香蜂草、胶苦瓜、辣薄荷、紫苏、鼠尾草、林地鼠尾草、欧洲变豆菜、彩叶草、百里香、灌木薄荷、紫草、hornwort Anthoceros agrestis、荜茇、黄连、当归、漆树、光果甘草、乌拉尔甘草、姜黄、迷迭香、迷迭香、姜、远志、桑、啤酒花、忍冬、药用鼠尾草、积雪草、乳香、长叶薄荷、青海云杉、柑、酸橙、茶、野葛根、葛根、大豆、辣椒物种、虎杖、茶、番茄、十字花科蔬菜、葡萄、蓝莓、树莓、桑葚、苹果、红辣椒或其组合。
33.权利要求29所述的组合物，其中所述多酚化合物包含迷迭香酸、共轭儿茶素例如EGCG、ECG、表儿茶素等、木蝴蝶素、山柰酚、染料木素、槲皮素、紫铆因、木犀草素、柯因、芹菜配基、姜黄素、白藜芦醇、辣椒素、球腺糖A、6-姜烯酚、姜辣素、小檗碱、胡椒碱或其组合。
34.权利要求29所述的组合物，其中所述多糖和多酚化合物从选自以下的植物部分或真菌富集：叶、树皮、树干、树干皮、茎、茎皮、小枝、块茎、根、根茎、根皮、树皮表面、嫩枝、籽、果实、子实体、蘑菇、雄蕊群、雌蕊群、花萼、雄蕊、花瓣、萼片、心皮(雌蕊)、花或其任意组合。
35.权利要求29所述的组合物，其中所述组合物中的所述多糖和多酚化合物用任何合适的溶剂从生物质提取，所述溶剂包括CO2超临界流体、水、甲醇、乙醇、醇、水-混合溶剂或其组合。
36.权利要求29所述的组合物，其中通过溶剂沉淀、超滤、酶消化、具有硅胶、XAD、HP20、LH20、C-18、氧化铝、聚酰胺、尺寸排阻柱和CG161树脂的柱色谱单独地或组合地富集所述多糖。
37.权利要求29所述的组合物，其中通过溶剂分配、沉淀、超滤、蒸馏、蒸发、具有硅胶、XAD、HP20、LH20、C-18、氧化铝、聚酰胺和CG161树脂的柱色谱单独地或组合地富集一种或多种多酚化合物。
38.权利要求29所述的组合物，其中所述组合物进一步包含药学上或营养学上可接受的活性剂、辅助剂、载体、稀释剂或赋形剂，其中所述药物或营养制剂包含约0.1重量百分比(重量％)至约99.9重量％的活性化合物。
39.权利要求38所述的组合物，其中所述活性剂、辅助剂、赋形剂或载体选自以下的一种或多种：大麻油或CBD/THC、姜黄提取物或姜黄素、榄仁树提取物、柳树皮提取物、钩果草根提取物、辣椒提取物或辣椒素、花椒树皮提取物、黄檗树皮提取物、啤酒花提取物、乳香提取物、蔷薇果提取物、绿茶提取物、槐属提取物、薄荷或胡椒薄荷提取物、姜或黑姜提取物、绿茶或葡萄籽多酚、Ω-3或Ω-6脂肪酸、磷虾油、γ-亚麻酸、柑橘生物类黄酮、金虎尾浓缩物、虾青素、碧萝芷、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、维生素B、维生素A、L-赖氨酸、钙、锰、锌、矿物氨基酸螯合物、氨基酸、硼和甘氨酸硼、二氧化硅、益生菌、樟脑、薄荷醇、钙基盐、二氧化硅、组氨酸、葡糖酸铜、CMC、麦芽糖糊精、β-环糊精、纤维素、葡萄糖、盐水、水、油、鲨鱼和牛软骨或其组合。
40.权利要求29所述的组合物，其中将所述组合物配制为片剂、硬胶囊、软凝胶胶囊、粉末或颗粒、压缩片剂、丸剂、胶质、口香糖、sashay、薄片、棒剂或液体形式、酊剂、气涂敷剂、半固体、半液体、溶液、乳液、乳膏、洗剂、软膏或凝胶基料。
41.权利要求29所述的组合物，其中所述组合物的给药途径包含口服给药、局部给药、栓剂给药、静脉内给药、皮内给药、胃内给药、肌内给药、腹膜内给药和静脉内给药。
42.用于治疗、管理、促进调节哺乳动物的免疫稳态的方法，所述方法包括给予0.01mg/kg至500mg/kg所述哺乳动物体重的量的有效量的权利要求29所述的组合物。
43.用于以下的方法：通过优化或平衡免疫应答来维持免疫稳态；帮助维持针对病毒感染和细菌感染的健康的免疫功能；保护免疫系统免受空气污染诱导的氧化应激损伤；保护正常健康的肺功能免受病毒感染、细菌感染和空气污染，所述方法包括给予0.01mg/kg至500mg/kg所述哺乳动物体重的量的有效量的权利要求29所述的组合物。
44.用于以下的方法：调节作为内源性或外源性反应侵袭触发物的HMGB1和移动宿主免疫应答以恢复稳态，所述方法包括给予0.01mg/kg至500mg/kg所述哺乳动物体重的量的有效量的权利要求29所述的组合物。
45.用于以下的方法：支持健康的炎性应答；维持补体C3和C4蛋白、细胞因子和细胞因子对感染的应答的健康水平；缓解、调节和维持TNF-α、IL-1β、IL-6、GM-CSF；IFN-α；IFN-γ；IL-1α；IL-1RA；IL-2；IL-4；IL-5；IL-7；IL-9；IL-10；IL-12p70；IL-13；IL-15；IL17A；IL-18；IL-21；IL-22；IL-23；IL-27；IL-31；TNF-β/LTA、CRP和CINC3，所述方法包括给予0.01mg/kg至500mg/kg所述哺乳动物体重的量的有效量的权利要求29所述的组合物。
46.以下方法：控制氧化应答和缓解氧化应激；通过增加过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和Nrf2来增强抗氧化能力；降低或维持丙二醛(MDA)、8-异前列腺素F2α和晚期糖基化终产物(AGE)；中和活性氧物质；保护UV和化学氧化应激免于引起DNA损伤，所述方法包括给予0.01mg/kg至500mg/kg所述哺乳动物体重的量的有效量的权利要求29所述的组合物。
47.用于以下的方法：改进先天免疫；改进适应免疫；增加白细胞的活性和计数、增强天然杀伤(NK)细胞功能；增加、调节、维持T和B淋巴细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞的计数；增加CD3+、CD3-CD56+NK细胞、CD3+CD56+NKT细胞、CD3+CD56-T淋巴细胞、CD3-CD56-非NK、非T淋巴细胞、CD3-CD57+NK细胞、CD3-CD56+CD57+NK细胞、CD4+NKp46+天然杀伤细胞、TCRγδ+γδT细胞和CD4+TCRγδ+辅助γδT细胞和CD8+细胞计数；调节CD45+细胞、CD45RA原初T和B细胞、CD45R0活化的和记忆T和B细胞；保护和促进巨噬细胞吞噬活性；支持或促进正常抗体IgG、IgM、IgA产生、特定病毒株的血凝素抑制(HI)滴度，所述方法包括给予0.01mg/kg至500mg/kg所述哺乳动物体重的量的有效量的权利要求29所述的组合物。
48.以下方法：维持呼吸器官中的健康肺微生物群或共生系统；维持肺清洁和排毒能力；保护肺结构完整性和氧交换能力；维持呼吸道并增强肺泡的吸氧能力；缓解氧化应激引起的肺损伤；促进肺的微循环和保护正常凝血功能，所述方法包括给予0.01mg/kg至500mg/kg所述哺乳动物体重的量的有效量的权利要求29所述的组合物。
49.以下方法：缓解或降低感冒或流感样症状，包含身体疼痛、喉咙痛、咳嗽、轻微的喉咙和支气管刺激、鼻塞、鼻窦充血、窦压、流鼻涕、打喷嚏、丧失嗅觉、丧失味觉、肌肉疼痛、头痛、发热和寒战；帮助疏松痰(粘液)和稀薄支气管分泌物，以使咳嗽更生痰；降低支气管刺激的严重程度；降低病毒感染、微生物感染和空气污染引起的肺损伤或水肿或炎性细胞浸润的严重程度；在整个感冒/流感或污染季节支持支气管系统和舒适呼吸；预防或治疗肺纤维化；降低普通感冒/流感的持续时间或严重程度；降低呼吸系统的病毒和细菌感染的严重程度或持续时间；预防或治疗或治愈由病毒、微生物和空气污染物引起的呼吸道感染；管理或治疗或预防或逆转呼吸道感染的进展；和管理或治疗或预防或逆转肺炎的进展，促进和加强和恢复哺乳动物的肺和整个呼吸系统的修复和更新功能，所述方法包括给予0.01mg/kg至500mg/kg所述哺乳动物体重的量的有效量的权利要求29所述的组合物。
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