CN113171373A - 安梨多糖的制备方法及其应用 - Google Patents

安梨多糖的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113171373A
CN113171373A CN202110469271.1A CN202110469271A CN113171373A CN 113171373 A CN113171373 A CN 113171373A CN 202110469271 A CN202110469271 A CN 202110469271A CN 113171373 A CN113171373 A CN 113171373A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polysaccharide
enzymolysis
avocado
preparation
pear
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110469271.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113171373B (zh
Inventor
彭飞
杨越冬
任鑫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hebei Normal University of Science and Technology
Original Assignee
Hebei Normal University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hebei Normal University of Science and Technology filed Critical Hebei Normal University of Science and Technology
Priority to CN202110469271.1A priority Critical patent/CN113171373B/zh
Publication of CN113171373A publication Critical patent/CN113171373A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113171373B publication Critical patent/CN113171373B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/73—Rosaceae (Rose family), e.g. strawberry, chokeberry, blackberry, pear or firethorn
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/20—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an exo-1,4 alpha-glucosidase, e.g. dextrose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及梨加工技术领域，公开了安梨多糖的制备方法及其应用。安梨多糖在制备防治PM2.5所致肺损伤药物或食品中的应用。安梨多糖在制备改善由PM2.5引起的肺部炎症因子TNF‑α、IL‑1β和IL‑6含量升高，氧化应激指标MDA和ROS含量升高，SOD和GSH含量降低，i NOS和COX‑2m RNA的相对表达量升高，或HO‑1、Nrf2蛋白的表达受限的药物或食品中的应用。安梨多糖的制备方法，包括：以安梨果渣为原料进行提取得到。采用安梨果渣提取安梨多糖可实现资源的高价值利用，最重要的是提取得到的安梨多糖对于防治PM2.5所致肺损伤有明显的效果。

Description

安梨多糖的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及制药技术领域，具体而言，涉及安梨多糖的制备方法及其应用。
背景技术
安梨(Pyrus ussuriensis Maxim)俗称酸梨，安梨为梨属植物秋子梨的一个种，栽培历史在500年以上，主要分布于冀东北、辽西及京津等地的燕山一带，是燕山地区优质特有果品，在山区农业经济中占有重要地位。安梨果实富含多种人体所需的营养成分，多酚类、糖分、维生素、矿物质、有机脂肪酸、挥发油类和三萜类等，兼具食用和药用价值。目前，燕山地区安梨年产量达到40万吨，主要用于深加工产品为安梨汁，安梨醋等果汁饮料。但是果汁加工时也伴随着大量的果渣废弃，每年仅燕山地区就会产生大量湿皮果渣废料。由于果汁生产的季节性以及研究技术的欠缺，每到生产旺季，只有20％左右的安梨果渣被用作肥料、饲料，绝大部分不得不被当作垃圾处理，不仅造成资源的浪费，同时也对环境造成污染，严重影响了安梨加工业的可持续发展。
多糖是继核酸、蛋白质之后的第三条生命链，是细胞表面信号识别、抗原抗体反应、细胞间信息传递和感受的关键因子，与维持生命所需的多种生理功能密切相关，具有多种活性。如香菇多糖能够激活巨噬细胞，增强自然杀伤细胞的活性。灵芝多糖能够调节NK细胞活性，刺激T、B淋巴细胞增殖。茶树花多糖通过增强宿主免疫调节活性，明显增强巨噬细胞吞噬功能和延迟变态反应，提高机体对肿瘤的防御能力。在各种错综复杂的生命现象的产生与疾病的形成过程中，糖类化合物起到了重要作用。
三相分离技术(Three-phase partitioning,TPP)是一种新的提取生物活性物质的方法，目前大多用来提取和纯化蛋白质和酶类。该法是将样品水溶液与无机盐和有机溶剂混合，振荡使无机盐溶解，经过一定时间后形成三相。在三相分离提取过程中，有机杂质(酶抑制剂、色素、油脂等)进入上层叔丁醇相，极性组分(主要是可溶性糖类等物质)进入下层水相，蛋白质则悬浮于有机相和水相中间，从而实现了蛋白质的分离和纯化。三相分离技术不需要复杂的设备，且省时省力、绿色环保。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供安梨多糖在制备防治PM2.5所致肺损伤药物或食品中的应用，以及安梨多糖的制备方法。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供安梨多糖在制备防治PM2.5所致肺损伤药物或食品中的应用。
第二方面，本发明提供安梨多糖在制备改善由PM2.5引起的肺部炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高，氧化应激指标MDA和ROS含量升高，SOD和GSH含量降低，i NOS和COX-2m RNA的相对表达量升高，或HO-1、Nrf2蛋白的表达受限的药物或食品中的应用。
第三方面，本发明提供安梨多糖的制备方法，包括以安梨果渣为原料进行提取得到。
在可选的实施方式中，制备方法为三相分离法；
优选地，三相分离法包括：
将均质得到的安梨渣纤维浆液进行酶解，然后灭酶，得到梨渣酶解浆液；
将梨渣酶解浆液进行固液分离，得到梨渣酶解液；
将梨渣酶解液与硫酸铵以及叔丁醇混合均匀，待充分提取、溶液分层后取下层溶液；
将下层溶液过高压平板膜得到含安梨多糖的流出液。
在可选的实施方式中，进行酶解之前还包括：
将由安梨渣和水混合得到的安梨渣浆液进行高压均质，高压均质压力为20～50MPa；
优选地，安梨渣与水以质量比1:5～25得到安梨渣浆液。
在可选的实施方式中，进行酶解的方法包括：
调节安梨渣纤维浆液的pH值在4.8～5.2范围内，向安梨渣纤维浆液中加入糖化酶；
优选地，糖化酶的加入量为安梨渣质量的0.5～2.5％；
优选地，加入糖化酶后升高安梨渣纤维浆液温度为45～55℃进行酶解；
更优选地，采用普通酶解，酶解时间为2～3h；或采用超声辅助酶解，酶解频率为320～400W，酶解时间为20～30min；或采用微波辅助酶解，微波功率为380～420W，酶解时间为4～6min；
优选地，灭酶是升高安梨渣纤维浆液温度为85～100℃灭酶4～6min。
在可选的实施方式中，固液分离的具体方法为过滤。
在可选的实施方式中，硫酸铵的用量与梨渣酶解液的体积比为15～25g:100mL；
优选地，叔丁醇的用量为1-1.5倍梨渣酶解液体积。
在可选的实施方式中，将梨渣酶解液与硫酸铵以及叔丁醇混合均匀后搅拌至少30min确保充分提取；
优选地，充分提取后于4000～6000r/min下离心8～12min使混合液分层。
在可选的实施方式中，所用的平板膜为8kDa的平板膜。
在可选的实施方式中，得到含安梨多糖的流出液后还包括浓缩、干燥得到安梨多糖。
本发明具有以下有益效果：
PM2.5入侵机体后，会引起肺部炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高，氧化应激指标MDA和ROS含量升高，SOD和GSH含量降低，i NOS和COX-2m RNA的相对表达量升高，或HO-1、Nrf2蛋白的表达受限。安梨多糖可改善上述各物质在机体中的水平，因此，其可应用于制备调节PM2.5引起的上述各种物质在机体中的含量变化的药物或食品中。而安梨多糖对于PM2.5所致肺损伤有明显的防治效果，因此其适合应用于制备防治PM2.5所致肺损伤药物或食品。而采用梨果渣提取安梨多糖可实现资源的高价值利用，最重要的是由果渣提取得到的安梨多糖对于PM2.5所致肺损伤的效果更为明显。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为不同提取方法得到的安梨多糖红外光谱图；
图2为安梨多糖对小鼠肺组织TNF-α、IL-6、IL-1β含量影响统计图；
图3为安梨多糖对小鼠肺组织氧化应激指标水平影响统计图；
图4为安梨多糖对小鼠肺组织ROS水平的影响统计图；
图5为安梨多糖对COX-2和iNOS mRNA表达水平的影响统计图；
图6为安梨多糖对Nrf2、HO-1蛋白表达水平的影响统计图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请提供的安梨多糖在制备防治PM2.5所致肺损伤药物或食品中的应用；在制备改善由PM2.5引起的肺部炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高，氧化应激指标MDA和ROS含量升高，SOD和GSH含量降低，i NOS和COX-2m RNA的相对表达量升高，或HO-1、Nrf2蛋白的表达受限的药物或食品中的应用进行具体描述。
发明人通过提取安梨中的多糖，发现安梨多糖对于预防PM2.5所致肺损伤有明显的效果。可改善由PM2.5引起的肺部炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高，氧化应激指标MDA和ROS含量升高，SOD和GSH含量降低，i NOS和COX-2m RNA的相对表达量升高，或HO-1、Nrf2蛋白的表达受限。
安梨多糖优选为从安梨果渣中提取得到的多糖。
进一步地，制备方法为三相分离法。
制备方法具体包括：
S1、安梨渣纤维浆液的制备。
将安梨榨汁后留下的安梨果渣按照1:5～25(例如1:5、1:10、1:15、1:20或1:25)与水混合得到安梨渣浆液；
将安梨渣浆液进行高压均质，均质压力为20～50MPa(例如20MPa、30MPa、40MPa或50MPa)得到超细安梨渣纤维浆液。
S2、酶解。
调节超细安梨渣浆液的pH在4.7～5.2的范围内，然后向其中加入糖化酶。为保证酶解充分，加入糖化酶的量为安梨果渣质量的0.5～2.5％(例如0.5％、1.5％、2％或2.5％)。
加入糖化酶后控制浆液温度为45～55℃(例如40℃、45℃或55℃)，进行酶解。酶解方式可以包括三种：(1)普通酶解，即升高温度后不做其他操作，酶解时间为2～3h(例如2h、2.5h或3h)；(2)超声辅助酶解，酶解频率为320～400W(例如320W、360W、380W或400W)，酶解时间为20～30min(例如20min、25min或30min)；(3)微波辅助酶解，微波功率为380～420W(例如380W、400W或420W)，酶解时间为4～6min(例如4min、5min或6min)。
酶解完后升高浆液温度85～100℃(例如85℃、90℃或100℃)灭酶4～6min(例如4min、5min或6min)。
S3、固液分离。
将酶解后得到的梨渣酶解浆液进行固液分离，得到梨渣酶解液。
优选地，固液分离方式为最常规的过滤；滤液即梨渣酶解液。
S4、提取。
将梨渣酶解液与硫酸铵以及叔丁醇混合后搅拌至少30min确保充分提取。搅拌结束后将混合液于4000～6000r/min(例如4000r/min、5000r/min或6 000r/min)下离心8～12min(例如8min、10min或12min)使混合液分层。取下层硫酸铵溶液过高压平板膜得到含安梨多糖的流出液。
优选地，为保证提取充分，梨渣酶解液的体积比为15～25g:100mL；叔丁醇的用量为1-1.5倍梨渣酶解液体积。
优选地，所使用的平板膜为8kDa的平板膜。
S5、将S4步骤得到的含安梨多糖的流出液浓缩干燥，得到安梨多糖。
本申请中，以废弃的鲜安梨渣为原料，通过高压匀质处理，断裂膳食纤维的糖苷键，增加物料的比表面积，减少粒径，提高多糖的提取量。随后利用三相制备分离技术同时脱色脱蛋白，高效短时，用较低的成本、较简单的工艺制备出纯度高活性强的安梨渣多糖，且整个制备过程无需使用如氯仿等毒性高的有机溶剂。在三相分离提取过程中，有机物及杂质(酶抑制剂、色素、油脂等)进入上层叔丁醇相，极性组分(主要是可溶性糖类等物质)进入下层水相，蛋白质则悬浮于有机相和水相中间，从而实现了蛋白质的分离和纯化。在此方法中，叔丁醇可以回收再利用，更加环保节能，而且叔丁醇还能够使蛋白质的结构稳定不使其不会变性。
通过本申请提供的方法可以有效提取安梨果渣中的安梨多糖，经发明人研究发现，这种安梨多糖对于预防PM2.5所致肺损伤有明显的效果。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
本实施例提供安梨果渣提取安梨多糖的方法，具体为：
将安梨榨汁后留下的安梨果渣按照1:10与水混合得到安梨渣浆液；
将安梨渣浆液进行高压均质，均质压力为30MPa得到超细安梨渣纤维浆液。
调节超细安梨渣浆液的pH在4.7～5.2的范围内，然后向其中加入占安梨果渣质量的2％糖化酶。加入糖化酶后控制浆液温度为50℃，普通酶解2h。酶解完后升高浆液温度90℃灭酶5min。
将酶解后得到的梨渣酶解浆液过滤，得到滤液，即梨渣酶解液。
将梨渣酶解液与硫酸铵以及叔丁醇混合后搅拌30min。搅拌结束后将混合液于5000r/min下离心10min。取下层硫酸铵溶液过8kDa的高压平板膜得到含安梨多糖的流出液。硫酸铵的用量为20％(g/mL)；叔丁醇的用量为1.5倍梨渣酶解液体积。
将含安梨多糖的流出液浓缩干燥，得到安梨多糖A。
对比例1
本对比例与实施例基本相同，不同之处仅在于不同之处仅在于采用传统酶法提取安梨渣中多糖。
制备方法具体为：收集榨汁后的安梨渣，按照料液比1：10加入蒸馏水，调节pH值为5，然后向其中加入占安梨果渣质量的2％糖化酶。加入糖化酶后控制浆液温度为50℃，普通酶解2h。酶解完后升高浆液温度90℃灭酶5min；将酶解后得到的梨渣酶解浆液过滤，得到滤液，即梨渣酶解液。按体积比1：4加入无水乙醇，静置沉淀12h，离心，收集沉淀，复溶于蒸馏水中，用sevag法(三氯甲烷：正丁醇为3:1)脱除蛋白，磁力搅拌下反应半小时，离心，取上清液，浓缩干燥，得到安梨多糖B。
对比例2
本对比例与实施例基本相同，不同之处仅在于采用微波法提取安梨渣中多糖。
制备方法具体为：收集榨汁后的安梨渣，按照料液比1：10加入蒸馏水，在微波功率为400W，提取时间10min，过滤，得到滤液，重复提取一次，合并滤液。按体积比1：4加入无水乙醇，静置沉淀12h，离心，收集沉淀，复溶于蒸馏水中，用sevag法(三氯甲烷：正丁醇为3:1)脱除蛋白，磁力搅拌下反应半小时，离心，取上清液，浓缩干燥，得到安梨多糖C。
对比例3
本对比例与实施例基本相同，不同之处仅在于采用超声法提取安梨渣中多糖。
制备方法具体为：收集榨汁后的安梨渣，按照料液比1：10加入蒸馏水，在超声功率为360W，提取时间20min，过滤，得到滤液，重复提取一次，合并滤液。按体积比1：4加入无水乙醇，静置沉淀12h，离心，收集沉淀，复溶于蒸馏水中，用sevag法(三氯甲烷：正丁醇为3:1)脱除蛋白，磁力搅拌下反应半小时，离心，取上清液，浓缩干燥，得到安梨多糖D。
实验例
一、制得的安梨多糖的提取率比较
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。标准曲线的制作如下：称取葡萄糖1.00g，制得100g/mL标准葡萄糖溶液。分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL于试管，以去离子水定容至1.0mL，即得到不同浓度葡萄糖标准溶液(0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g/mL)，加入5％苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL，室温静置30min，以不加葡萄糖标准溶液的溶液作为空白对照，用紫外分光光度计在490nm处测定其吸光值。多糖提取率公式：
Figure BDA0003044716950000091
式中，Y-多糖提取率(％)，C-由标准曲线计算得到的多糖质量浓度(g/mL)，V-样品溶液体积(mL)，M-安梨果渣总质量(g)。
表1不同提取方法所得安梨多糖的提取率
Figure BDA0003044716950000092
二、多糖分子量测试
取适量安梨多糖溶于适量纯净水中，采用液相色谱法测定多糖的分子量分布。以蒸馏水为流动相，以Agilent PL aquagel-OH MIXED-H柱(8μm300×7.5mm)为固定相，以Agilent GPC/SEC Calibration Kits为标样，在流速为0.8mL/min、柱温为35℃、检测器温度为35℃的条件下，在RID检测器上进行检测。
表2不同提取方法所得安梨多糖的分子量分布
Figure BDA0003044716950000093
Figure BDA0003044716950000101
注：*表示主要组分分子量
不同方法所得安梨多糖出现起始峰的先后顺序为：B(Rt＝5.637min)、C(Rt＝7.696min)、A(Rt＝8.215min)、D(Rt＝8.467min)。不同提取方法提取所得多糖出现最高峰的先后顺序为：A(Rt＝9.187min，Mw＝360Da)、C(Rt＝9.194min，Mw＝353Da)、D(Rt＝9.288min，Mw＝300Da)、B(Rt＝9.518min，Mw＝124Da)，因此本申请提供的方法所得多糖中的最大分子量大于其他提取方法得到的，表明采用专利法对安梨多糖分子的降解影响最小。
三、安梨多糖的单糖组成测试
(1)多糖样品的水解：取5mg多糖样品加入1mL 2M的TFA溶液，于120℃水解2h。冷却后通入氮气吹干，加入2mL甲醇清洗，再吹干。重复清洗3次后加入1mL水溶解，转入色谱瓶中待测。
(2)标准母溶液的配制：取岩藻糖(Fuc)、鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、果糖(Fru)、核糖(Rib)、半乳糖醛酸(Gal-UA)标准品各100mg溶解于8mL水中，然后定容至10mL，配制成10mg/mL的混标母液。将母液稀释100倍后，再梯度稀释至1、5、10、20、30、40、50、60μg/mL。
(3)单糖组成的测定：
利用高效阴离子交换色谱-脉冲安培(HPAEC-PAD)检测样品的单糖组成和含量，根据色谱峰的保留时间对单糖组成进行定性，外标法定量。离子色谱条件：色谱柱：DionexTMCarboPacTM PA20(150mm×3mm)；检测器：脉冲安培检测器；电极：金电极；进样量：20μL；流动相：H2O，0.1M NaOH，0.1M NaOH/0.2M NaAC；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；数据分析：Chromeleon 7.2色谱工作站。
表3不同提取方法得到的安梨多糖单糖组成及含量
Figure BDA0003044716950000111
将不同提取方法得到的安梨多糖利用HPAEC-PAD检测单糖组成，各多糖样品的单糖组成及含量见表3。由表可知，A和B均含有10种测试单糖，C和D组分均不含有果糖和核糖。A主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成；B主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖醛酸组成；C主要由葡萄糖和甘露糖组成；D主要由葡萄糖和甘露糖组成。
四、红外光谱分析
取2mg安梨多糖与200mg干燥KBr颗粒研磨均匀，经压片机压片后在红外光谱仪上测定波长范围为4000～500cm-1的红外光谱。
如图1所示，样品在3400cm-1左右处宽而深的峰是由羟基的O-H伸缩振动引起，位于2900cm-1和1400cm-1处吸收峰分别来自于多糖中C-H的伸缩振动和弯曲振动。以上两组峰为多糖特征吸收峰，断定4个样品均为多糖类物质。另外在1630cm-1处左右的吸收峰为羧基酯化吸收峰，表明各样品为一种酸性果胶类多糖。C和D在1750cm-1处由羧基的C＝O键伸缩振动，推断有半乳糖醛酸的存在，此结果与单糖组分分析中含有半乳糖醛酸结果相同，表明有部分蛋白未脱离。在800-1200cm-1的多糖指纹区，在1140cm-1处的吸收峰对应于吡喃糖环中C-O-H的特征吸收，结合在623cm-1处由C-H横向振动引起微弱吸收峰，推断有β型吡喃糖存在。A和B光谱中在995cm-1处出现了吡喃糖的C-H变角振动峰，在765cm-1处则出现了吡喃环的对称伸缩振动峰。A在818cm-1处有吸收峰表明该多糖具有少量α型糖苷键。
由以上表征结果可知，专利方法得到的安梨多糖提取率最高，提取条件温和对多糖分子的降解影响最小，选择本申请提供的制备方法制得的A组多糖进行下一步动物实验。
五、PM2.5所致肺损伤实验
(1)实验动物分组
本实验使用的实验动物为6-7周龄(体质量20-25g)SPF级昆明雄性小鼠，词养在温度(25±3℃)，相对湿度(45±5％)的环境中，小鼠可自由进食、饮水，经过一周的适应性喂养后，按随机数字表法分为4个实验组，每组10只，分组情况如下：
①空白对照组(A组)：向小鼠腹腔中注射无菌生理盐水0.3mL，每日一次，连续注射7天，并在第8天开始往小鼠的气管内滴注无菌生理盐水0.2mL，每日一次，连续3天；
②PM 2.5组(B组)：向小鼠腹腔中注射无菌生理盐水0.3mL，每日一次，连续注射7天，并在第8天开始往小鼠的气管内滴注PM 2.5(20mg/Kg)0.2mL，每日一次，连续3天；
③安梨多糖低剂量组(C组)：向小鼠腹腔中注射安梨多糖(20mg/Kg)0.3mL，每日一次，连续干预7天，并在第8天开始往小鼠的气管内滴注PM 2.5(20mg/Kg)0.2mL，每日一次，连续3天；并在最后一次PM 2.5气管滴注的一天后处死全部小鼠，之后取小鼠肺组织及肺泡灌洗液备用。
④安梨多糖中剂量组(D组)：向小鼠腹腔中注射安梨多糖(40mg/Kg)0.3mL，其余操作与C组相同。
⑤安梨多糖高剂量组(E组)：向小鼠腹腔中注射安梨多糖(80mg/Kg)0.3mL，其余操作与C组相同。
(2)PM 2.5染毒方法
借助小动物喉镜对小鼠进行PM 2.5气管滴注染毒，具体步骤如下：使用天平给每只小鼠称重，然后根据体重(50mg/mL)向腹腔内注射浓度为0.6％戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠，待小鼠充分麻醉后，先将小鼠四肢固定在架台上，然后用细线牵拉小鼠的门牙固定好头部，右手使用小动物喉镜从左侧进入撑开小鼠口腔，充分暴露其咽喉，此时发现小鼠咽喉部可见一呈倒“V”字型的随呼吸张合的声门裂，在声门裂张开时将头皮针沿着喉镜凹槽送入气管。然后用注射器抽取所需体积的PM 2.5混悬液并将其缓慢滴入气管中。滴注后将小鼠从固定架上取下，使其直立并轻柔其肺部，观察小鼠的状态，之后将其放在清洁实验室中正常饲养，每日进行一次PM 2.5气管滴注，连续进行3日。生理盐水对照组也采取同样的方式向小鼠气管中滴注等体积的无菌生理盐水。PM 2.5染毒期间小鼠仍可自由饮水、进食，并在每日染毒后观察小鼠的精神状态、饮食情况及活动变化。
实验期间各组小鼠均未见死亡。其中A组小鼠进食、活动如常，无明显异常行为；而与空白对照组相比，PM 2.5组(C组)小鼠在染毒后均出现对外界刺激反应差，精神状态不佳、气促、口鼻等呼吸道分泌物增多、进食、活动减少等现象。安梨多糖组(D和E组)小鼠的症状较PM 2.5组小鼠有所改善，C组改善不明显。
(3)支气管肺泡灌洗液(BALF)的收集和处理
末次PM2.5染毒后24小时，用0.6％戊巴比妥钠(70mg/ml)腹腔注射麻醉不同实验组的每只小鼠，待小鼠全身肌力下降，四肢瘫软后，将小鼠四肢固定在架台上，然后用细线牵拉小鼠的门牙固定好头部，经心脏采血处死小鼠，充分暴露小鼠的气管及肺脏的各个肺叶，随后在右肺门处用手术线打结，并使用剪刀于左主支气管下端分叉处剪一“V”字型的口，用灌洗针头插于此处并用手术线结扎固定。随后使用注射器缓慢向肺内注入预冷的PBS1ml用于灌洗小鼠左肺，随后缓慢回抽肺内灌洗液，并重复上述动作灌洗左肺3次，得到肺泡灌洗液。肺泡灌洗液经4℃，1500转/分钟离心机离心5分钟后，留取并分装上清液，保存于-80℃的冰箱内备用。
(4)小鼠肺组织炎症指标水平检测
取(3)步骤制得的一部分BALF，按照ELISA试剂盒说明书方法分别检测炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。结果如图2所示。
实验结果表明：PM 2.5组大鼠灌洗液中促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β较空白对照组均显著升高，且差异性显著(P<0.01)。本发明物中剂量和高剂量组较模型组可以显著降低TNF-α、IL-1β和IL-6(P<0.01或P<0.001)，提示本发明安梨多糖在一定剂量作用下，具有预防和改善肺部PM2.5沉积致肺组织免疫损伤。
(5)小鼠肺组织氧化应激指标水平检测
取右肺下叶，液氮研磨后制成匀浆组织，3000r/min离心10min，取上清液依据试剂说明书分别进行MDA、SOD、GSH的检测。结果如图3所示。
以MDA、SOD和GSH的水平作为反映小鼠氧化与抗氧化状态的指标。与对照组相比，PM 2.5组小鼠肺组织MDA水平明显升高，而SOD和GSH抗氧化酶水平下降，差异均有统计学意义(P<0.01)。与SOD、GSH相比，安梨多糖低中高组肺组织中MDA水平降低，SOD和GSH抗氧化酶的水平升高(P<0.01或P<0.05)。
(6)小鼠肺组织中ROS的检测
取左肺组织，用研磨棒边研磨边以PBS冲洗，收集细胞悬液，然后300μm尼龙网过滤，PBS重悬后细胞计数不少于106个细胞/m L。每组样品加入10μM的荧光探针DCFH-DA，37℃孵育30min，1400r/min离心10min，用PBS洗涤2次后收集细胞沉淀物，加入200μL Bindingbuffer用流式法进行检测，结果以平均荧光强度值(每个细胞含有的荧光强度)表示，如图4所示。
当机体受到外界刺激后会引起氧化应激来防御所受的刺激，但是过度的氧化应激致ROS的大量生成，会造成疾病的发生发展。因此，ROS的含量是用来判断氧化应激是否发生的重要衡量指标。结果表明，模型组的峰明显向空白组的右侧移动。与空白组进行对比，平均荧光值明显升高，差异具有统计学意义(p<0.01)。安梨多糖处理后，峰向左移动，平均荧光值明显低于模型组，差异具有统计学意义(p<0.05或p<0.01)。
(7)COX-2和iNOS mRNA表达水平的检测
取100mg组织，加入匀浆管中。匀浆仪完全研磨直到没有可见的组织块。离心10min后抽吸上清液。加入250μL三氯甲烷，振荡混匀，静置3min。4℃离心10min。将上清液移入新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，振荡混匀。在-20℃环境下放置15min。在4℃环境下离心10min，管底白色沉淀即为RNA。除去液体，加入1.5mL 75％乙醇洗涤沉淀。4℃环境下离心5min。取出液体，将离心管放在超净台上吹3min。加入RNA酶的溶液溶解。用Nanodrop2000检测RNA的浓度和纯度。并用逆转录试剂盒(RT-PCR)(按照Prime Script TMRT MasterMix试剂盒进行)进行RNA逆转录。采用Step One PlusTM Real-Time PCR System试剂盒进行荧光定量PCR反应，反应体系如表4和表5：
表4 RT-PCR反应液配置
Figure BDA0003044716950000151
Figure BDA0003044716950000161
表5荧光定量PCR引物序列表
Figure BDA0003044716950000162
COX-2和iNOS mRNA表达水平的检测结果如图5。
i NOS和COX-2可诱导巨噬细胞在炎症，肿瘤等病理条件下的表达，并释放相应的炎症介质NO和PGE2。通过RT-PCR检测，结果显示，与空白组相比，PM 2.5组明显增加炎性基因i NOS和COX-2的m RNA的相对表达量，差异有统计学意义(P<0.01)；安梨多糖处理后可降低i NOS和COX-2m RNA的相对表达量，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.001)。
(8)Nrf2，HO-1蛋白的表达
使用免疫印迹法检测Nrf2，HO-1蛋白表达水平。从肺组织中提取蛋白质，用含有PMSF的裂解缓冲液与细胞充分接触，通过电泳分离并转移到PAGE膜上。将转好的膜用5％BSA封闭液在室温下封闭1小时，之后将膜与稀释好特定的一抗在4℃下孵育过夜，孵育完成后回收一抗，然后与相应的二抗一起孵育。二抗孵育结束后，用PBST洗涤剂洗膜(3次，5min/次)，最终通过增强化学发光(ECL)系统检测。结果如图6所示。
HO-1是一种压力诱导酶，可介导抗氧化和细胞保护作用，以保护生物体免受氧化应激。当机体受到刺激时，Nrf2从Keap1释放，与核中的ARE相互作用，并调节II期排毒酶和抗氧化酶的基因表达，从而保护生物体免受损害。结果显示经过安梨多糖处理后，肺组织中Nrf2及HO-1水平明显升高，keap1含量降低，差异具有统计学意义(p<0.01)。安梨多糖处理后可激活Nrf2信号通路，并且使Nrf2发生核异位与ARE启动子结合上调了下游HO-1蛋白的表达。这些结果证明，安梨多糖可能通过上调Nrf2-HO-1信号通路发挥作用。
综上，安梨多糖由于对于PM2.5所致肺损伤有明显的防治效果，因此其适合应用于制备防治PM2.5所致肺损伤药物或食品。安梨多糖可改善由PM2.5引起的肺部炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高，氧化应激指标MDA和ROS含量升高，SOD和GSH含量降低，i NOS和COX-2m RNA的相对表达量升高，或HO-1、Nrf2蛋白的表达受限。其可应用于制备调节PM2.5引起的上述各种物质在机体中的含量变化的药物或食品中。特别是，本申请中成功采用资源量大、价廉质优的安梨作为原材料，综合加工提取得到高附加值、高活性的安梨果渣多糖，充分发挥安梨中功能物质含量丰富、综合营养价值高的有点，为深入开发安梨果渣提供了重要的技术基础。尤其增加了一种优良的安梨多糖，具有巨大的消费市场和很高的经济价值。
本申请基于对安梨多糖的长期大量研究和分析实验，提供了针对性的酶解工艺，利用糖化酶酶解去除安梨渣中的淀粉，然后采用三相分离技术同时对安梨粗多糖进行脱色脱蛋白处理，不破坏多糖结构，且工艺简单，适合规模化生产。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.安梨多糖在制备防治PM2.5所致肺损伤药物或食品中的应用。
2.安梨多糖在制备改善由PM2.5引起的肺部炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高，氧化应激指标MDA和ROS含量升高，SOD和GSH含量降低，i NOS和COX-2m RNA的相对表达量升高，或HO-1、Nrf2蛋白的表达受限的药物或食品中的应用。
3.安梨多糖的制备方法，其特征在于，包括：以安梨果渣为原料进行提取得到；
优选地，采用三相分离法进行提取；
更优选地，所述三相分离法包括：
将均质得到的安梨渣纤维浆液进行酶解，然后灭酶，得到梨渣酶解浆液；
将所述梨渣酶解浆液进行固液分离，得到梨渣酶解液；
将所述梨渣酶解液与硫酸铵以及叔丁醇混合，待充分提取、溶液分层后取下层溶液；
将所述下层溶液过高压平板膜得到含安梨多糖的流出液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，进行酶解之前还包括：
将由安梨渣和水混合得到的安梨渣浆液进行高压均质，高压均质压力为20～50MPa；
优选地，所述安梨渣与水以质量比1:5～25得到所述安梨渣浆液。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，进行酶解的方法包括：
调节所述安梨渣纤维浆液的pH值在4.8～5.2范围内，向所述安梨渣纤维浆液中加入糖化酶；
优选地，糖化酶的加入量为所述安梨渣质量的0.5～2.5％；
优选地，加入所述糖化酶后升高所述安梨渣纤维浆液温度为45～55℃进行酶解；
更优选地，采用普通酶解，酶解时间为2～3h；或采用超声辅助酶解，酶解频率为320～400W，酶解时间为20～30min；或采用微波辅助酶解，微波功率为380～420W，酶解时间为4～6min；
优选地，灭酶是升高所述安梨渣纤维浆液温度为85～100℃灭酶4～6min。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，固液分离的具体方法为过滤。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸铵的用量与所述梨渣酶解液的体积比为15～25g:100mL；
优选地，所述叔丁醇的用量为1-1.5倍所述梨渣酶解液体积。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将所述梨渣酶解液与硫酸铵以及叔丁醇混合后搅拌至少30min确保充分提取；
优选地，充分提取后于4000～6000r/min下离心8～12min使混合液分层。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所用的平板膜为8kDa的平板膜。
10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，得到所述含安梨多糖的流出液后还包括浓缩、干燥得到所述安梨多糖。
CN202110469271.1A 2021-04-28 2021-04-28 安梨多糖的制备方法及其应用 Active CN113171373B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110469271.1A CN113171373B (zh) 2021-04-28 2021-04-28 安梨多糖的制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110469271.1A CN113171373B (zh) 2021-04-28 2021-04-28 安梨多糖的制备方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113171373A true CN113171373A (zh) 2021-07-27
CN113171373B CN113171373B (zh) 2022-07-19

Family

ID=76925226

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110469271.1A Active CN113171373B (zh) 2021-04-28 2021-04-28 安梨多糖的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113171373B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117243256A (zh) * 2023-09-15 2023-12-19 东莞理工学院 一种西番莲果皮多糖低脂酸奶及其制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030056582A (ko) * 2001-12-28 2003-07-04 김형민 면역 증강용 조성물
CN104187456A (zh) * 2014-07-11 2014-12-10 合肥工业大学 提取梨渣中膳食纤维的工艺方法
CN108822230A (zh) * 2018-09-12 2018-11-16 贵阳学院 一种超声提取刺梨果渣的多糖
CN110934911A (zh) * 2019-12-18 2020-03-31 四川大学 刺梨或其提取物在制备防治肺纤维化的药品或保健品中的用途
CN112225828A (zh) * 2020-10-26 2021-01-15 新疆医科大学 一种库尔勒香梨酸性多糖的提取方法及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030056582A (ko) * 2001-12-28 2003-07-04 김형민 면역 증강용 조성물
CN104187456A (zh) * 2014-07-11 2014-12-10 合肥工业大学 提取梨渣中膳食纤维的工艺方法
CN108822230A (zh) * 2018-09-12 2018-11-16 贵阳学院 一种超声提取刺梨果渣的多糖
CN110934911A (zh) * 2019-12-18 2020-03-31 四川大学 刺梨或其提取物在制备防治肺纤维化的药品或保健品中的用途
CN112225828A (zh) * 2020-10-26 2021-01-15 新疆医科大学 一种库尔勒香梨酸性多糖的提取方法及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张兆熙等: "梨渣膳食纤维提取改性及应用研究", 《中国果菜》 *
李政红等: "梨果实提取物的体外抗氧化活性", 《食品科技》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117243256A (zh) * 2023-09-15 2023-12-19 东莞理工学院 一种西番莲果皮多糖低脂酸奶及其制备方法
CN117243256B (zh) * 2023-09-15 2024-05-17 东莞理工学院 一种西番莲果皮多糖低脂酸奶及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113171373B (zh) 2022-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Preparation, deproteinization, characterisation, and antioxidant activity of polysaccharide from cucumber (Cucumis saticus L.)
Abboud et al. Gastroprotective effect of soluble dietary fibres from yellow passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa) peel against ethanol-induced ulcer in rats
CN108785342B (zh) 一种具有降血糖活性的辣木叶提取物及其制备方法
Shashidhar et al. Functional polysaccharides from medicinal mushroom Cordyceps sinensis as a potent food supplement: extraction, characterization and therapeutic potentials–a systematic review
CN109400742B (zh) 一种齿瓣石斛精制多糖及其制备方法和应用
CN116042342A (zh) 一种人参露酒及其生产工艺
Qiao et al. Anti-fatigue activity of the polysaccharides isolated from Ribes stenocarpum Maxim
CN113171373B (zh) 安梨多糖的制备方法及其应用
US9763990B2 (en) Method to prepare Ganoderma lucidum polysaccharides possessing protective activities on fatty liver disease
CN105639617A (zh) 一种茯苓的综合开发和应用的方法及其新用途
Shi et al. Bioactive effects advances of natural polysaccharides
CN105663444A (zh) 一种复方免疫增强及抗衰老剂及其制备方法
Yue et al. Extraction, purification, structural features and biological activities of longan fruit pulp (Longyan) polysaccharides: A review
CN111019008A (zh) 一种抗炎活性桑黄多糖shp及其制备方法
CN112386665B (zh) 天然原料的发酵液以及其用于制备抑制过敏反应或提升免疫力的组合物的用途
CN113349368A (zh) 猴头菌-人参发酵菌质酵素口服液的制备工艺及应用
Liu et al. Tea polysaccharides from Taiping Houkui may serve as a potential candidate for regulation of lipid metabolism: roles of gut microbiota and metabolite in vitro
CN109232758B (zh) 一种榆黄蘑菌糠多糖及其提取工艺和应用
CN113181231B (zh) 具有增强巨噬细胞吞噬活性功能的组合物及其应用和免疫药物
CN115634241A (zh) 一种山东灵芝提取物的制备方法及其在制备降血糖药物中的应用
CN110974849B (zh) 一种具有降血糖活性的复合海参提取物及制备方法与应用
US9782431B2 (en) Method to prepare hirsutella sinensis polysaccharides possessing anti-obesity properties and uses thereof
CN110218263B (zh) 一种猴头菇菌糠多糖、制备方法及应用
CN107875179B (zh) 一种混合藻提取物及其制备方法和应用
CN111440186A (zh) 一种从小马泡中提取的、具有保肝效果的香豆素骈高异黄酮化合物及其制备方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant