TWI624226B - a method for preparing a fermentation culture and a method thereof Fermentation culture and its use - Google Patents

Abstract

本發明揭示一種用於製備一發酵培養物的方法以及其所製得的發酵培養物。本發明亦揭示由上述方法所製得的發酵培養物之組合可被用於製造供抗發炎或抗氧化的醫藥品或食品產品。

Description

用於製備一發酵培養物的方法以及其所製得 的發酵培養物暨其用途

本發明揭示一種用於製備一發酵培養物(fermented culture)的方法以及其所製得的發酵培養物。本發明亦揭示由上述方法所製得的發酵培養物之組合可被用於製造供抗發炎(anti-inflammatory)或抗氧化(antioxidant)的醫藥品或食品產品。

已知在好氧生物體(aerobic organisms)利用氧氣進行呼吸反應(respiration)的過程中會生成活性氧族(reactive oxygen species,ROS)[例如，過氧化物(peroxide)和過氧化氫(hydrogen peroxide)]以及自由基(free radicals)[例如，羥基自由基(hydroxyl radicals)和過氧化自由基(peroxy radicals)]，而游離輻射(ionizing radiation)以及暴露於藥物或異生物質(xenobiotics)[例如，四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl₄)]亦會導致活性氧族與自由基的生成。活性氧族以及自由基非常地不穩定，因而容易與細胞內的組成物(包括DNA、蛋白質以及脂質等)相反應，進而導致細胞或組織的氧化性損傷(oxidative damage)。一般而言，生物體內存在有由抗氧化酵素(antioxidant enzymes) 所構成的交互作用網路(interacting network)來保護細胞或組織免於氧化性損害。當活性氧族以及自由基的數量超過細胞或組織本身的抗氧化能力時，氧化性壓力(oxidative stress)就會形成。已有報導指出，氧化性壓力在老化(aging)、癌症(cancer)、發炎(inflammation)以及肝損傷(liver injury)等不同疾病的退化性或病理學過程(degenerative or pathological processes)中扮演一個重要的角色。

發炎(inflammation)意指生物體中的細胞或組織為了對抗外部壓力刺激(external stressful stimuli)或病原體(pathogen)所產生的一種保護反應。在發炎的過程中，受損傷的細胞或組織會釋放出大量的趨化激素(chemokines)，而使得免疫系統中的多核白血球(polynuclear leukocytes)[例如，嗜中性球(neutrophil)]以及單核球(monocytes)往受損傷之處聚集[被稱為浸潤(infiltration)]。經聚集的巨噬細胞會被病原體表面的酯多醣(lipopolysaccharides,LPS)活化，接著經活化的巨噬細胞會藉由促進自身的前發炎性基因(proinflammatory genes)[包括環加氧酶-2基因(cyclooxygenase-2 gene,COX-2 gene)以及誘導性一氧化氮合成酶基因(inducible nitric oxide synthase gene,iNOS gene)]的表現來加強發炎反應，並且釋放出活性氧族以及自由基來殺滅病原體。然而，當發炎持續過久時會使得組織中的活性氧族以及自由基累積過多而形成氧化性壓力與損害，進而造成慢性發炎(chronic inflammation)，最後可能導致慢性疾病(chronic illnesses)(甚至是癌症)。

現今西方醫學中被用來抗氧化(antioxidant)和/或抗發炎(anti-inflammatory)的藥物在臨床應用上存在有療效不佳以及容易產生副作用(side effect)的問題。有鑑於此，許多研究人員開始嘗試從傳統中藥(traditional Chinese medicines,TCM)或天然植物來源中尋找有用的活性組分(active components)來發展出具有抗氧化以及抗發炎活性並且不會產生非所欲的副作用的藥物以供臨床治療之用。

白桑(拉丁學名：Morus alba L.；英文俗名：mulberry、white mulberry；同種異名：Morus atropurpurea Roxb.、Morus multicaulis Perr.等)是桑科(Moraceae)桑屬(Morus)之落葉性喬木，它原生於中國北部並被廣泛種植於世界各地。白桑的利用部位為根皮、果實以及葉，其中白桑的果實又被稱為「桑椹」。在中國民俗醫學上，桑椹被用於治療眩暈耳鳴、心悸失眠、鬚髮早白、津傷口渴、內熱消渴以及血虛便秘。另外，有文獻指出，桑椹具有抗氧化(antioxidation)、抗發炎(antiinflammation)、抗癌(anticancer)、肝臟保護(hepatoprotection)、抗糖尿病(antidiabetes)以及神經保護(neuroprotection)等功效(Hui-Pei Huang et al.(2013),J Tradit Complement Med.,3：7-15)。

在國立中興大學食品科學系的翁義宗所著碩士論文[名稱：桑椹之抗氧化及對酯多醣所誘導RAW264.7巨噬細胞產生PGE2及NO之影響(Effects of mulberry on antioxidant and on production of PGE2 and NO in LPS-induced RAW 264.7 macrophages)]中，翁義宗使用不同的萃取方法來對桑椹進行萃取，藉此而分別得到富含花青素的桑椹萃取物(Anthocyanins-Rich Mulberry Extract,ARME)、桑椹的甲醇萃取物(Methanol Extract of Mulberry,MEM)以及桑椹的水萃取物(Water Extract of Mulberry,WEM)。接著，所得到的ARME、MEM以及WEM分別被拿來進行α,α-二苯-β-苦味基肼基(α,α-diphenyl-β-picryhydrazyl,DPPH)自由基、2,2’-次偶氮基-二(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)[2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]自由基以及超氧陰離子(superoxide anion,O₂ ^-)的清除能力分析。而實驗結果發現：ARME、MEM以及WEM皆具有清除DPPH自由基、ABTS自由基以及超氧陰離子的能力，特別地，ARME具有最佳的抗氧化能力。此外，翁義宗分別以ARME以及MEM來處理帶有酯多醣(LPS)-誘發的發炎[lipopolysaccharide(LPS)-induced inflammation]的小鼠巨噬細胞RAW264.7(mouse macrophage RAW264.7)並以前列腺素E₂(prostaglandin E₂,PGE₂)以及一氧化氮(nitric oxide,NO)的表現量來作為發炎的評估指標。而實驗結果發現：ARME以及MEM皆可降低PGE₂以及NO的表現量，因而具有抑制LPS所誘發之發炎反應的效用，特別地，ARME具有最佳的抗發炎能力。

矮叢藍莓(拉丁學名：Vaccinium angustifolium；英文俗名：Lowbush Blueberry)是杜鵑花科(Ericaceae)越橘 屬(Vaccinium)之落葉性灌木，它主要分佈於加拿大以及美國等地。矮叢藍莓的利用部位為果實。有文獻指出，藍莓的萃取物具有清除活性氧族、抗菌止瀉、強化視網膜、預防糖尿病、促進視紫質再合成、抗潰瘍以及抗發炎等作用。

在嘉南藥理科技大學化粧品科技研究所的楊仲平所著碩士論文[名稱：蔓越莓、藍莓及覆盆子之生物活性及在保養品之應用(The Bioactivity and Effectivity in Cosmetics o_f Cranberry,Blueberry and Raspberry)]中，楊仲平以95%乙醇來對藍莓進行萃取而得到一乙醇萃取物，接著將該乙醇萃取物以水以及乙酸乙酯進行分配分離(partition)而得到一乙醇萃-水層以及一乙醇萃-乙酸乙酯層。接著，所得到的藍莓的乙醇萃取物、乙醇萃-水層以及乙醇萃-乙酸乙酯層分別被拿來進行DPPH自由基、ABTS自由基以及過氧化氫(hydrogen peroxide)的清除能力分析。而實驗結果發現，藍莓的乙醇萃取物、乙醇萃-水層以及乙醇萃-乙酸乙酯層皆能有效地清除DPPH自由基、ABTS自由基以及過氧化氫，因而具有抗氧化活性，特別地，乙醇萃-乙酸乙酯層具有最佳的抗氧化能力。

黑茶藨子(拉丁學名：Ribes nigrum；英文俗名：blackcurrant；同種異名：Ribes cyathiforme、Ribes olidum；中文別名：黑加侖、黑醋栗、黑加倫子、黑豆果以及黑穗醋栗)是茶藨子科(Grossulariaceae)茶藨子屬(Ribes)之小型灌木，它主要分佈於歐洲、蒙古、朝鮮以及中國大陸的黑龍江、內蒙古與新疆等地。黑茶藨子的利用部位為葉、果 實、種子以及根皮。有研究指出，黑茶藨子具有降低血脂、抑制血小板凝聚、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力、抗高血壓、抗心律失常、抗發炎以及抗沙門桿菌感染等作用(賈麗麗等人(2008)，中國中醫藥資訊雜誌，15：110-113)。

在Nancy Garbacki et al.,(2004),BMC Pharmacol.,4：25中，Nancy Garbacki等人從黑茶藨子的葉子中萃取並純化出原花青素(proanthocyanidins,PACs)，然後將所得到的原花青素以腹膜內注射的方式預投藥至一帶有鹿角菜膠-誘發的腳掌水腫(carrageenan-induced paw edema)以及胸膜炎(pleurisy)的大鼠中，接著觀察原花青素對於鹿角菜膠-誘發的腳掌水腫以及胸膜炎的影響，並且分析該大鼠的胸腔滲出液(pleural exudatel)中的TNF-α、介白素-1 β(interleukin-1 β,IL-1 β)以及硝酸鹽(nitrite/nitrate,NOx)的位準。而實驗結果發現：原花青素可以抑制鹿角菜膠-誘發的腳掌水腫以及胸膜炎，並且會降低胸腔滲出液中的TNF-α、IL-1 β以及NOx的位準，因而具有優異的抗發炎活性。

在Lidija Jakobek et al.(2007),Deutsche Lebensmittel-Rundschau,103：58-64中，Lidija Jakobek等人將8種紅色水果(red fruit)[包括黑茶藨子、覆盆子(red raspberry)(Rubus idaeus)、黑莓(blackberry)(Rubus fruticosus)、歐洲酸櫻桃(sour cherry)(Prunus cerasus)、歐洲甜櫻桃(sweet cherry)(Prunus avium)、草莓(strawberry)(Fragaria anannassa)、野櫻莓 (chokeberry)(Aronia melanocarpa)以及接骨木莓(elderberry)(Sambucus nigra)]的果汁分別拿來進行總花青素含量(total anthocyanin content)、總多酚含量(total polyphenol content)以及DPPH自由基清除能力的分析。而實驗結果發現：在上述8種紅色水果的果汁當中，野櫻莓、接骨木莓以及黑茶藨子的果汁皆含有豐富的總花青素含量以及總多酚含量，並且具有優異的抗氧化活性。

靈芝(拉丁學名：Ganoderma lucidum；英文俗名：Reishi；漢語拼音：Lingzhi；中文別名：靈芝草、木靈芝以及菌靈芝等)是靈芝科(Ganodermataceae)靈芝屬(Ganoderma)之真菌，它普遍分佈於中國全區，但以長江以南為多。靈芝的主要利用部位為子實體。在中國民俗醫學上，靈芝被用於治療虛勞、心悸、失眠、頭暈、神疲乏力、久咳氣喘、冠心病、矽肺病以及腫瘤。此外，有研究指出，靈芝具有治療癌症、抗氧化、抗發炎、抗高血壓(antihypertensive)、抗組織胺(antihistaminic)以及抗肝毒性(antihepatotoxic)之功效(Soniamol Joseph et al.(2011),Acta Pharm.,61：335-342)。

在陳淑德等人(2008)，宜蘭大學生物資源學刊，4：109-114中，陳淑德等人以含有小麥或大豆的固態培養基來對靈芝進行發酵培養歷時1至2週，由此所得到的靈芝的小麥發酵產物與大豆發酵產物分別以100℃的熱水來進行萃取，藉此而得到靈芝的小麥發酵產物的熱水萃取物(hot water extract)與大豆發酵產物的熱水萃取物。接著，所得 到的靈芝的2種發酵產物的熱水萃取物分別被拿來進行DPPH自由基清除能力、亞鐵離子螯合能力(Chelating Fe²⁺ability)以及還原力(reducing power)的分析。而實驗結果發現：靈芝的大豆發酵產物的熱水萃取物在DPPH自由基清除能力、亞鐵離子螯合能力以及還原力上皆優越於靈芝的小麥發酵產物的熱水萃取物所具者，因而具有較佳的抗氧化活性。

在Ruiping Zhang et al.(2011),Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,Volume 2011(Article ID 156810)中，Ruiping Zhang等人以靈芝的甲醇萃取物(methanol extract)來處理小神經膠質細胞(microglia)，接著分別添加酯多醣(LPS)與經MPP⁺處理的MES 23.5細胞膜分離部分(MES 23.5 cell membrane fractions treated with MPP⁺)(下稱CF)來活化小神經膠質細胞，繼而觀察靈芝的甲醇萃取物對於小神經膠質細胞-衍生的細胞毒性因子(microglia-derived cytotoxic factors)[包括一氧化氮(nitric oxide,NO)、TNF-α、IL-1 β以及超氧化物(superoxide)]的表現量的影響。而實驗結果發現：靈芝的甲醇萃取物可以顯著地降低小神經膠質細胞-衍生的細胞毒性因子的表現量，因而被預期可作為一種經由抗發炎效用來治療帕金森氏症(Parkinson’s disease,PD)的藥物。

雖然上述的先前研究已使用各種不同的萃取方法而從傳統中藥或天然植物中製備出具有抗氧化和/或抗發炎活性的成分，但是這些萃取方法必須使用萃取溶劑並且 製程較為複雜，因而在實際產業應用上會受到限制。為了能以無毒性、成本低廉以及生產時間短的方式而從天然的生物材料中獲得具有生物活性的物質，申請人嘗試使用微生物發酵技術來分別對4種生物材料(亦即桑椹、矮叢藍莓、黑茶藨子以及靈芝)進行發酵培養，而由此所得到的4種生物材料的發酵培養物被拿來進行不同的組合並且經由活體外(in vitro)實驗而被證實具有一優異的抗發炎和/或抗氧化的效用。因此，該等生物材料的發酵培養物的組合被預期可供用於抗發炎和/或抗氧化。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種用於製備一發酵培養物的方法，其包括：(a)將一生物材料與一啤酒酵母菌進行發酵培養，藉此而得到一第一發酵培養物；(b)將該第一發酵培養物與一醋酸菌進行發酵培養，藉此而得到一第二發酵培養物；(c)對該第二發酵培養物進行一固-液分離處理，藉此而得到一澄清液；以及(d)將該澄清液與一由保加利亞乳酸桿菌、芽孢乳酸菌、雙叉型雙叉桿菌以及布氏乳酸菌所構成的乳酸菌組合進行發酵培養，藉此而得到該發酵培養物。

在第二個方面，本發明提供一種用於抗發炎的組成物，其包含有： (1)一依據如上所述的方法並且使用桑椹作為生物材料而被製得的桑椹發酵培養物；以及(2)下列的至少一者：一依據如上所述的方法並且使用矮叢藍莓作為生物材料而被製得的矮叢藍莓發酵培養物以及一依據如上所述的方法並且使用黑茶藨子作為生物材料而被製得的黑茶藨子發酵培養物。

在第三個方面，本發明提供一種用於抗氧化的組成物，其包含有：(1)一依據如上所述的方法並且使用桑椹作為生物材料而被製得的桑椹發酵培養物；(2)一依據如上所述的方法並且使用靈芝作為生物材料而被製得的靈芝發酵培養物；以及(3)下列的至少一者：一依據如上所述的方法並且使用矮叢藍莓作為生物材料而被製得的矮叢藍莓發酵培養物以及一依據如上所述的方法並且使用黑茶藨子作為生物材料而被製得的黑茶藨子發酵培養物。

在第四個方面，本發明提供一種用於治療一具有或被懷疑具有發炎之個體的方法，其包括對該個體投予(administering)一如上所述的用於抗發炎的組成物。

在第五個方面，本發明提供一種用於治療一具有或被懷疑具有與氧化性壓力有關聯的疾病之個體的方法，其包括對該個體投予一如上所述的用於抗氧化的組成物。

發明的詳細說明

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

為了從植物中獲得具有抗發炎和/或抗氧化效用的天然活性組分(natural active components)，申請人嘗試以微生物發酵技術來分別對4種生物材料(亦即桑椹、矮叢藍莓、黑茶藨子以及靈芝)進行發酵，由此所得到4種生物材料的發酵培養物被拿來進行不同的組合，藉此而得到6種不同的混合物(亦即混合物1至6)。有關本發明的混合物1至6各自所含有的成分與用量比例被彙整於下面表2中。之後，申請人將所得到的混合物1至6分別拿來進行活體外抗氧化效用(in vitro antioxidative effect)以及活體外抗發炎效用(in vitro anti-inflammatory effect)的評估，而實驗結果顯示：依據本發明的方法所製得的混合物1至6具有 優異的抗發炎和/或抗氧化的效用。

於是，本發明提供一種用於製備一發酵培養物的方法，其包括：(a)將一生物材料與一啤酒酵母菌進行發酵培養，藉此而得到一第一發酵培養物；(b)將該第一發酵培養物與一醋酸菌進行發酵培養，藉此而得到一第二發酵培養物；(c)對該第二發酵培養物進行一固-液分離處理(solid-liquid separation treatment)，藉此而得到一澄清液；以及(d)將該澄清液與一由保加利亞乳酸桿菌、芽孢乳酸菌、雙叉型雙叉桿菌以及布氏乳酸菌所構成的乳酸菌組合進行發酵培養，藉此而得到該發酵培養物。

依據本發明，在該方法中，該生物材料是選自於由下列所構成之群組：漿果(berry)、食用蕈類(edible mushroom)，以及它們的組合。

如本文中所用的，術語“漿果(berry)”意指任何含有種子的新鮮水果，並且包括聚合果(aggregate fruits)。

依據本發明，在該方法中，該生物材料是一選自於由下列所構成之群組中的漿果：桑椹、矮叢藍莓、黑茶藨子、西印度櫻桃(Barbados cherry)、熊葡萄(bearberry)、黑莓(blackberry)、博伊森莓(boysenberry)、櫻桃(cherry)、美國野櫻(choke cherry)、雲莓(cloudberry)、越橘(cranberry)、露珠莓(dewberry)、接骨木莓(elderberry)、葡 萄(grape)、鵝莓(gooseberry)、酸越橘(huckleberry)、羅甘莓(loganberry)、olallieberry、plains berry、prairie berry、覆盆子(raspberry)、薩斯卡通莓(Saskatoon berry)、美洲大樹莓(salmonberry)、沙棘莓(Seabuckthorn berry)、黑刺李莓(sloe berry)、草莓(strawberry)、果實樹莓(thimbleberry)、刺莓(Thornberry)、裹白樹莓(wineberry)以及鳥嘴莓(whortleberry)。在本發明的一個較佳具體例中，該生物材料是桑椹。在本發明的另一個較佳具體例中，該生物材料是矮叢藍莓。在本發明的又一個較佳具體例中，該生物材料是黑茶藨子。

如本文中所用的，術語“食用蕈類(edible mushroom)”與“蕈類(mushroom)”以及“真菌(fungus)”可被交換地使用，並且意指所有無毒的蕈類(包括野生的蕈類以及被人工培育的蕈類)。較佳地，該食用蕈類是具有藥用價值的蕈類。

依據本發明，在該方法中，該生物材料是一選自於由下列所構成之群組中的食用蕈類：靈芝以及樟芝。在本發明的一個較佳具體例中，該生物材料是靈芝。

如本文中所用的，術語“培養(culturing)”以及“培育(cultivation)”可被交換地使用。有關發酵培養的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在此方面，可以參考，例如陳淑德等人(2008)(同上述)以及CN 102940288 A。

依據本發明，在該方法中的步驟(a)包括下列次 步驟：(i)將該生物材料、該啤酒酵母菌以及一醣類進行混合，俾以形成一具有一糖度落在2至15°Bx內的混合物；以及(ii)對該混合物進行發酵培養。

依據本發明，該醣類是選自於由下列所構成的群組：葡萄糖、果糖、蔗糖以及以蔗糖為主要成分的食用糖。

較佳地，該醣類是以蔗糖為主要成分的食用糖。適用於本發明的以蔗糖為主要成分的食用糖包括，但不限於：冰糖、白砂糖以及赤砂糖(它亦被稱為紅糖或黑糖)。在本發明的一個較佳具體例中，該以蔗糖為主要成分的食用糖是白砂糖。

依據本發明，在該方法中的步驟(b)包括下列次步驟：(i)將該第一發酵培養物與該醋酸菌加入至一被進行通氣處理的反應器內以形成一混合物，繼而對該混合物進行發酵培養；以及(ii)當該混合物具有一大於1.5g/mL的滴定酸度時，停止對該反應器進行通氣處理。

如本文中所用的，術語“固-液分離處理(solid-liquid separation treatment)”意指使一混合物中的固體以及液體相互分離或彼此明顯區隔的方法，例如離心、過濾以及重力沈積等。有關固-液分離處理的操作程序與參 數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在此方面，可以參考，例如US 5,208,054、US 7,156,999 B2以及US 8,816,118 B2。

依據本發明，在該方法的步驟(c)中，該固-液分離處理是選自於由下列所構成的群組：離心、過濾、重力沈積，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該固-液分離處理是離心。

依據本發明，在該方法的步驟(d)中，在該乳酸菌組合當中的保加利亞乳酸桿菌、芽孢乳酸菌、雙叉型雙叉桿菌以及布氏乳酸菌是呈一範圍落在1：1：1：1(v/v/v/v)至1：1.5：1：1.5(v/v/v/v)內的比例。在本發明的一個較佳具體例中，在該乳酸菌組合當中的保加利亞乳酸桿菌、芽孢乳酸菌、雙叉型雙叉桿菌以及布氏乳酸菌是呈一為1：1：1：1(v/v/v/v)的比例。

依據本發明，在該方法的步驟(a)、步驟(b)以及步驟(d)中的發酵培養是在一範圍落在25℃至32℃內的溫度下被進行。

依據本發明所製得的混合物1至6經由活體外試驗而被證實可以有效地降低帶有酯多醣(LPS)-誘發的發炎[lipopolysaccharide(LPS)-induced inflammation]的小鼠巨噬細胞RAW264.7(mouse macrophage RAW264.7)中的亞硝酸鹽(nitrite)的位準。因此，本發明預期該等混合物1至6在製備抗發炎組成物上的應用。

於是，本發明提供一種用於抗發炎的組成物， 其包含有：(1)一依據如上所述的方法並且使用桑椹作為生物材料而被製得的桑椹發酵培養物；以及(2)下列的至少一者：一依據如上所述的方法並且使用矮叢藍莓作為生物材料而被製得的矮叢藍莓發酵培養物以及一依據如上所述的方法並且使用黑茶藨子作為生物材料而被製得的黑茶藨子發酵培養物。

在本發明的一個較佳具體例中，該組成物包含有該桑椹發酵培養物以及該矮叢藍莓發酵培養物。

在本發明的另一個較佳具體例中，該組成物包含有該桑椹發酵培養物以及該黑茶藨子發酵培養物。

在本發明的又一個較佳具體例中，該組成物包含有該桑椹發酵培養物、該矮叢藍莓發酵培養物以及該黑茶藨子發酵培養物。

依據本發明，該組成物進一步包含有一依據如上所述的方法並且使用靈芝作為生物材料而被製得的靈芝發酵培養物。

在本發明的一個較佳具體例中，該組成物包含有該桑椹發酵培養物、該矮叢藍莓發酵培養物以及該靈芝發酵培養物。

在本發明的另一個較佳具體例中，該組成物包含有該桑椹發酵培養物、該黑茶藨子發酵培養物以及該靈芝發酵培養物。

在本發明的又一個較佳具體例中，該組成物包 含有該桑椹發酵培養物、該矮叢藍莓發酵培養物、該黑茶藨子發酵培養物以及該靈芝發酵培養物。

依據本發明，該組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥(oral administration)的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：溶液(solution)、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、粉末(powder)、錠劑(tablet)、丸劑(pill)、糖漿(syrup)、口含錠(lozenge)、片劑(troche)、酏劑(elixir)、口嚼膠(chewing gum)、膠囊(capsule)、濃漿(slurry)以及類似之物。

依據本發明，該組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該藥學上可接受的載劑包含有一 選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)，以及它們的組合。

本發明亦提供一種用於治療一帶有或被懷疑帶有發炎之個體的方法，其包括對該個體投予(administering)一如上所述的用於抗發炎的組成物。

如本文中所用的，術語“投予(administering)”與“投藥”以及“施用(application)”可被交換地使用。

依據本發明，投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被改善的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被改善的個體之體重、年齡、身體狀況與反應。而有關投藥劑量與投藥次數的選擇是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

另外，依據本發明所製得的混合物5以及6經由活體外試驗而被證實可以有效地增加帶有過氧化氫(H₂O₂)-誘發的氧化性損傷[hydrogen peroxide (H₂O₂)-induced oxidative damage]的人類子宮頸癌細胞(Hela cell)的細胞可活性。因此，本發明預期該混合物5以及6在製備抗氧化組成物上的應用。

於是，本發明亦提供一種用於抗氧化的組成物，其包含有：(1)一依據如上所述的方法並且使用桑椹作為生物材料而被製得的桑椹發酵培養物； (2)一依據如上所述的方法並且使用靈芝作為生物材料而被製得的靈芝發酵培養物；以及(3)下列的至少一者：一依據如上所述的方法並且使用矮叢藍莓作為生物材料而被製得的矮叢藍莓發酵培養物以及一依據如上所述的方法並且使用黑茶藨子作為生物材料而被製得的黑茶藨子發酵培養物。

在本發明的一個較佳具體例中，該組成物包含有該桑椹發酵培養物、該矮叢藍莓發酵培養物以及該靈芝發酵培養物。

在本發明的另一個較佳具體例中，該組成物包含有該桑椹發酵培養物、該黑茶藨子發酵培養物以及該靈芝發酵培養物。

依據本發明，該組成物的投藥途徑以及劑型是如上面所述者。

本發明亦提供一種用於治療一帶有或被懷疑帶有氧化性壓力關聯性疾病之個體的方法，其包括對該個體投予一如上所述的用於抗氧化的組成物。

依據本發明，投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被改善的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被改善的個體之體重、年齡、身體狀況與反應。而有關投藥劑量與投藥次數的選擇是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

此外，本發明亦預期如上所述的組成物可被拿來製備用於抗發炎和/或抗氧化的保健食品或非處方醫藥 品。

因此，本發明提供一種食品產品，其包含有一如上所述的用於抗發炎和/或抗氧化的組成物。

依據本發明，該用於抗發炎和/或抗氧化的組成物可被當作食品添加成分(food additive)，藉由習知方法於原料製備時被添加，或是於食品的製作過程中被添加，而與任一種可食性材料一起被配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。

依據本發明，該食品產品的種類包括，但不限於：烤焙物(baked goods)，例如麵包(bread)、酥餅(cookies)、糕點(pastry)、保久烤培物(long-keeping baked goods)、脆餅乾(crackers)以及鬆餅(waffles)；甜點(desserts)，例如布丁(pudding)、鮮乳油(cream)以及幕斯(mousse)；麵包塗醬(spreads for bread)；人造奶油產品(margarine products)；酥油(shortening)；水果產品(fruit products)，例如蜜餞(preserves)、果醬(jams)、果凍(jellies)、罐頭水果(canned fruit)、果漿(fruit pulp)、果汁(fruit juices)、果汁濃縮液(fruit juice concentrates)、以水果為主的軟性飲料(fruit-based soft drinks)以及水果粉(fruit powder)；蔬菜食品(vegetable products)，例如罐頭蔬菜(canned vegetables)、蔬菜汁(vegetable juices)以及蔬菜漿(vegetable pulp)；穀類食品(cereals)、燕麥片(granola)以及穀類混合料(cereal mixtures)；甜食(sweets)，例如巧克力(chocolate)、硬糖果(hard candy)、口香糖(chewing gum)、糖衣糖果(sugar-coated candy)、甘草(licorice)、棉花糖型產品(marshmallow-type products)、薄片(flakes)以及核果糖產品(nougat products)；發酵食品(fermented foods)；動物飼料(animal feeds)；健康食品(health foods)；以及膳食補充品(dietary supplements)。

依據本發明，該食品產品可進一步包含有一膳食補充劑(dietary supplement)。適用於本發明的膳食補充劑包括，但不限於：香氣(aromas)，例如香草(vanilla)；著色劑(coloring agents)；調味劑(flavoring agents)；乳化劑(emulsifiers)，例如卵磷脂(lecithin)；增稠劑(thickening agents)，例如果膠(pectin)、刺槐豆膠(carob gum)以及關華豆膠(guar gum)；抗氧化劑；防腐劑(preservatives)；三酸甘油酯(triglycerides)；安定劑(stabilizers)；甜味劑，例如蔗糖素(sucralose)、賽克拉美鈉(sodium cyclamate)、安賽蜜(acesulfame K)、阿斯巴甜(aspartame)、糖精(saccharine)、賽克拉美(cyclamate)、索馬甜(thaumatine)以及新橘皮苷(neohesperidin)；以及天然或合成的維生素(vitamins)，例如維生素A、維生素B₁、維生素B₂、維生素B₆、維生素B₁₂、複合維生素B(vitamin B complex)、維生素C、維生素D、維生素E以及維生素K。

此外，依據本發明，該食品產品亦可被製造成呈一即溶沖泡食品(instant food)的形式，這包括，但不限於：可溶性飲料粉末(soluble drink powder)、速食湯(instant soup)、速食甜點(instant dessert)、糖漿(syrup)、濃縮物(concentrate)、發泡散(effervescent powder)以及發泡錠 (effervescent tablet)。該即溶沖泡食品包含有可直接食用之經冷凍乾燥(lyophilized)或噴霧乾燥(spray-dried)的如上所述的組成物。有關食品產品的製備，可以參見，例如EP 2,747,585 A2、US 2014/0220177 A1以及US 2013/0287893 A1。

本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：圖1顯示帶有過氧化氫(H₂O₂)-誘發的氧化性損傷[hydrogen peroxide(H₂O₂)-induced oxidative damage]的人類子宮頸癌細胞(Hela cell)在以不同的混合物溶液予以處理後所測得的細胞可活性百分比；以及圖2顯示帶有酯多醣(LPS)-誘發的發炎[lipopolysaccharide(LPS)-induced inflammation]的小鼠巨噬細胞RAW264.7(mouse macrophage RAW264.7)在以不同的混合物溶液予以處理後所測得的亞硝酸鹽(nitrite)的濃度，其中“＊”表示：當與病理對照組作比較，p<0.05。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。

實施例 一般實驗方法： 1.統計學分析(Statistical analysis)：

在下面的實施例中，各組的實驗被重複3次，所得到的實驗數據是採用SigmaPlot統計軟體來進行統計分析，並以“平均值(mean)±標準偏差(Standard Deviation,S.D.)”來表示。所有的數據是藉由變異數分析(Analysis of variance,ANOVA)來評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是p<0.05，這表示有統計學顯著性(statistical significance)。

實施例1. 製備桑椹、矮叢藍莓、黑茶藨子以及靈芝的發酵培養物以及含有不同發酵培養物的混合物 實驗材料： 1.製備米麴菌(Aspergillus oryzae)的糙米發酵培養物：

首先，將適量的有機糙米浸泡於無菌水中，繼而予以加入適量的米麴菌(Aspergillus oryzae)菌粉(商品名稱：熟米麴；型號：102346：購自於大山器材原料行)，由此所形成的混合物具有一濃度為1.5mg/L的米麴菌菌粉。之後，於室溫下進行發酵歷時2至3天，接著於80℃下進行加熱處理歷時10分鐘，繼而於室溫下予以冷卻至37℃，即得到米麴菌的糙米發酵培養物。

2.製備啤酒酵母菌的接種源(inoculum of Saccharomyces cerevisiae)：

將適量之啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌粉(商品名稱：美國紅星牌酵母；型號：2801-08；購自於 汎球國際貿易有限公司)添加至依據上面第1項所得到的米麴菌的糙米發酵培養物中並予以混合均勻，由此所形成的混合物具有一濃度為169.4mg/L的啤酒酵母菌菌粉。接著，於室溫下進行培養歷時2至3天，所形成的培養物被使用作為本實施例中的啤酒酵母菌接種源。

3.製備醋酸菌的接種源(inoculum of Acetobacter aceti)：

將醋酸菌(Acetobacter aceti)菌粉(商品名稱：紅醋種母菌；型號：3102401；購自於汎球國際貿易有限公司)、依據上面第1項所得到的米麴菌的糙米發酵培養物以及95%乙醇(ethanol)以一為1：1：1(v/v/v)的比例添加至一發酵桶中並予以混合均勻，然後以一透氣棉布來覆蓋該發酵桶。接著，使該發酵桶在室溫以及一為150rpm的攪拌速率下進行發酵歷時2個月，所形成的培養物被使用作為本實施例中的醋酸菌接種源。

實驗方法： A.製備桑椹的發酵培養物(fermented culture of fruits of Mours alba L.)：

將300kg之桑椹[亦即白桑的果實(fruits of Mours alba L.)](購自於台南市仁德區的果農)清洗乾淨並且風乾(air-dried)，接著將之切塊並放置於一個2噸的發酵槽中，繼而將適量的砂糖(台糖2號)添加至該發酵槽中並完全地覆蓋該等經切塊的桑椹果實。之後，將啤酒酵母菌接種源以一為1：1(v/v)的接種量接種至該發酵槽中並予以混合均勻，接著藉由使用糖度計(saccharometer)(ATAGO，宏宜 儀器股份有限公司)來測量所形成的混合物的糖度(Brix)，然後依據所測得的糖度來添加適量的砂糖，而使得該混合物具有一為8至10°Bx的糖度。接著，令該發酵槽在一為25至32℃的溫度下靜置發酵歷時約14天。

之後，將醋酸菌接種源以一為10%(v/v)的接種量接種至該發酵槽中並予以混合均勻，繼而令該發酵槽在一為25至32℃的溫度、一為20L/min的通氣量以及一為150rpm的攪拌速率下進行發酵。在醋酸菌接種之後的第2天開始，藉由使用酸鹼滴定法(acid-base titration)[0.1N氫氧化鈉溶液(NaOH solution)(Sigma)]來測量該發酵槽中的混合物的滴定酸度(titratable acidity)，每天1次。當所測得的滴定酸度大於1.5時，停止對該發酵槽進行通氣與攪拌。在醋酸菌接種之後，發酵培養總共歷時約15至30天。

之後，收集該發酵槽中的混合物，並以5000rpm來進行離心歷時15分鐘。接著，收取上澄液，然後將包含有如下面表1所示之組分的乳酸菌菌粉(商品名稱：乳酸菌四益菌；購自於原生生物醫學股份有限公司)以一為20%(v/v)的接種量接種至所得到的上澄液中並予以混合均勻，繼而在一為25至32℃的溫度下靜置發酵歷時約90至120天。

之後，藉由使用酒精計(alcohol meter)(ROCKER，三美玻璃儀器行)、pH測定儀(pH meter)以及酸鹼滴定法來分別檢測所得到的桑椹發酵培養物的酒精含量(alcohol content)、pH值以及滴定酸度，繼而收取具有一為2(±2)%(v/v)的酒精含量、一為3(±2)的pH值以及一為3(±2)的滴定酸度之桑椹發酵培養物，俾以供下面的實驗之用。

B.製備矮叢藍莓的發酵培養物(fermented culture of Vaccinium angustifolium)：

將300kg之矮叢藍莓(Vaccinium angustifolium)的果實(購自於盈慶有限公司，美國)清洗乾淨並且風乾，接著將之切塊並放置於一個2噸的發酵槽中，然後參照上面第A項「製備桑椹的發酵培養物」當中所描述的操作程序以及操作條件來進行發酵培養(包括：添加砂糖、接種啤酒酵母菌接種源、接種醋酸菌接種源以及接種乳酸菌菌粉)以及進行糖度、酒精含量、pH值與滴定酸度之測量。最後所得到的矮叢藍莓發酵培養物被測得具有一為2(±2)%(v/v)的酒精含量、一為3(±2)的pH值以及一為3(±2)的滴定酸 度。

C.製備黑茶藨子的發酵培養物(fermented culture of Ribes nigrum)：

將300kg之黑茶藨子(Ribes nigrum)的果實(購自於盈慶有限公司，美國)清洗乾淨並且風乾，接著將之切塊並放置於一個2噸的發酵槽中，然後參照上面第A項「製備桑椹的發酵培養物」當中所描述的操作程序以及操作條件來進行發酵培養(包括：添加砂糖、接種啤酒酵母菌接種源、接種醋酸菌接種源以及接種乳酸菌菌粉)以及進行糖度、酒精含量、pH值與滴定酸度之測量。最後所得到的黑茶藨子發酵培養物被測得具有一為2(±2)%(v/v)的酒精含量、一為3(±2)的pH值以及一為3(±2)的滴定酸度。

D.製備靈芝的發酵培養物(fermented culture of Ganoderma lucidum)：

取300kg的靈芝子實體(fruiting body of Ganoderma lucidum)(購自於嘉義彥廷農場)並加入適量的水，然後於100℃下煮沸歷時約20分鐘，接著將該經加熱處理的靈芝子實體放置於一個2噸的發酵槽中，然後參照上面第A項「製備桑椹的發酵培養物」當中所描述的操作程序以及操作條件來進行發酵培養(包括：添加砂糖、接種啤酒酵母菌接種源、接種醋酸菌接種源以及接種乳酸菌菌粉)以及進行糖度、酒精含量、pH值與滴定酸度之測量。最後所得到的靈芝發酵培養物被測得具有一為2(±2)%(v/v)的酒精含量、一為3(±2)的pH值以及一為3(±2)的滴定酸 度。

E.製備包含有不同的發酵培養物的混合物：

將上面第A至D項所得到的桑椹發酵培養物、矮叢藍莓發酵培養物、黑茶藨子發酵培養物以及靈芝發酵培養物依據下面表2中所示的組合與用量比例來進行混合，藉此而得到混合物1至6。

所得到的混合物1至6分別以一孔徑為0.22μm的濾網予以過濾，繼而收集濾液。對各個濾液各取適量並分別以無菌水溶液予以稀釋10倍，藉此而得到混合物溶液(mixture solution)1至6[各自具有一為10%(v/v)的發酵培養物濃度]備用。

實施例2. 包含有不同的發酵培養物的混合物溶液在活體外抗氧化效用(in vitro antioxidative effect)上的評估

在本實施例中，申請人選用帶有過氧化氫(H₂O₂)-誘發的氧化性損傷[hydrogen peroxide (H₂O₂)-induced oxidative damage]的人類子宮頸癌細胞(Hela cell)來進行活體外試驗，並以細胞可活性(cell viability)來作為氧化性傷害的指標，俾以評估包含有不同的發酵培養物的混合物溶液在活體外的抗氧化效用。

實驗材料： 1.細胞株的來源與培養：

在本實施例中所使用的人類子宮頸癌細胞(Hela cell)(BCRC 60005)是購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)。

人類子宮頸癌細胞被培養於含有最低基本培養基(Minimal Essential Medium,MEM)[添加有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)(Gibco,Mexico)]的25T-cm²培養皿(25T-cm² petri dish)中，接著在培養條件被設定為37℃與5% CO₂的培養箱中進行培養。之後，大約每隔2天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約85%匯聚(confluence)時，移除培養基並以磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate Buffered Saline,PBS)來洗滌細胞共計2次，接著加入胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)以使細胞自培養皿的底部脫離。之後，加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以量吸管(pipette)反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將所形成的細胞 懸浮液分配到新的培養皿中，並在培養條件被設定為37℃與5% CO₂的培養箱中進行培養。

實驗方法：

首先，將依據上面“實驗材料”的第1項「細胞株的來源與培養」來進行繼代培養的人類子宮頸癌細胞分成8組，其中包括1個正常對照組(normal control)、1個病理對照組(pathological control)以及6個實驗組(亦即實驗組1至6)。將各組細胞分別以一為1×10⁴細胞/井的數量培養於含有180μL的MEM(添加有10% FBS)的96-井培養盤(96-well plate)中，接著在培養箱(37℃、5% CO₂)中進行培養歷時24小時。

之後，將各組細胞培養物以磷酸鹽緩衝生理鹽水洗滌1次，繼而加入160μL新鮮的MEM[添加有0.1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(Sigma,USA)]。接著，將20μL的0.2μM H₂O₂分別添加至病理對照組以及實驗組1至6的細胞培養物中，至於正常對照組的細胞培養物則不作任何處理。之後，依據下面表3所示，將在上面實施例1中所得到的混合物溶液1至6分別添加至各個實驗組的細胞培養物中，而正常對照組與病理對照組則不添加任何混合物溶液。

各組細胞培養物在培養箱(37℃，5% CO₂)中進行培養歷時30分鐘之後，移除各井中的液體，繼而加入200μL新鮮的MEM(添加有10% FBS)，然後在培養箱(37℃，5% CO₂)中進行培養歷時24小時。

接著，將5μL的3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯四唑溴化物{3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide}(MTT，5μg/mL，配於PBS溶液)分別添加至各井中並予以培養歷時4至6小時。之後，移除各井中的液體，繼而加入100μL的二甲基亞碸(dimethylsulfoxide,DMSO)並予以混合均勻，然後於540nm的波長下以一ELISA讀取儀(ELISA Reader)來讀取各井的吸光值(OD₅₄₀)。

細胞可活性百分比(%)是藉由將所測得的吸光值(OD₅₄₀)代入下列公式(1)而被計算出：公式(1)：A=(B/C)×100

其中：A=細胞可活性百分比(%)

B=各組所測得的OD₅₄₀吸光值

C=正常對照組所測得的OD₅₄₀吸光值

之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。

結果：

圖1顯示帶有過氧化氫-誘發的氧化性損傷的人類子宮頸癌細胞在以不同的混合物溶液予以處理後所測得的細胞可活性百分比。由圖1可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的細胞可活性百分比被顯著地降低，這表示過氧化氫會對人類子宮頸癌細胞產生氧化性傷害。另外，與病理對照組相較之下，實驗組5以及6的細胞可活性百分比皆高達91%以上，並且近似於正常對照組所具者。

這個實驗結果顯示：依據本發明的混合物溶液5以及混合物溶液6可以有效地保護細胞免於過氧化氫所造成的氧化性損傷並且展現出一優異的抗氧化效用。因此，申請人認為：依據本發明的混合物溶液5以及混合物溶液6具有發展成為一抗氧化藥物的高潛力。

實施例3. 包含有不同的發酵培養物的混合物溶液在活體外抗發炎效用(in vitro anti-inflammatory effect)上的評估

在本實施例中，申請人選用帶有酯多醣(LPS)-誘發的發炎[lipopolysaccharide(LPS)-induced inflammation]的小鼠巨噬細胞RAW264.7(mouse macrophage RAW264.7)來進行活體外試驗，並以一氧化氮(nitric oxide,NO)的表現量來作為發炎的指標，俾以評估包 含有不同的發酵培養物的混合物溶液在活體外的抗發炎效用。

實驗材料： 1.細胞株的來源與培養：

在本實施例中所使用的小鼠巨噬細胞RAW264.7(mouse macrophage RAW264.7)(BCRC 60001)是購自於台灣的食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。

巨噬細胞RAW264.7被培養於含有杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)[添加有10%胎牛血清(FBS)]的25T-cm²培養皿中，接著在培養條件被設定為37℃與5% CO₂的培養箱中進行培養。之後，大約每隔2天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約85%匯聚時，移除培養基並以磷酸鹽緩衝生理鹽水來洗滌細胞共計2次，接著加入胰蛋白酶-EDTA以使細胞自培養皿的底部脫離。之後，加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以量吸管反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將所形成的細胞懸浮液分配到新的培養皿中，並在培養條件被設定為37℃與5% CO₂的培養箱中進行培養。

實驗方法：

有關各組細胞培養物的一氧化氮的含量是以亞硝酸鹽(nitrite)的濃度來作為評估指標。首先，將依據上面“實驗材料”的第1項「細胞株的來源與培養」來進行繼代 培養的巨噬細胞RAW264.7分成7組，其中包括1個病理對照組以及6個實驗組(亦即實驗組1至6)。將各組細胞分別以一為1×10⁵細胞/井的數量培養於含有180μL的DMEM[添加有10% FBS以及酚紅(phenol red)]的96-井培養盤中，接著在培養箱(37℃、5% CO₂)中進行培養歷時24小時。

之後，病理對照組的細胞被更換以200μL的含有1μg/mL酯多糖(lipopolysaccharides,LPS)的DMEM(添加有0.1% BSA)，而實驗組1至6的細胞則被更換以180μL的含有1μg/mL酯多糖的DMEM(添加有0.1% BSA)。之後，依據下面表4所示，將在上面實施例1中所得到的混合物溶液1至6分別被添加至各個實驗組的細胞培養物中，而病理對照組則不添加任何混合物溶液。

各組細胞培養物在培養箱(37℃，5% CO₂)中進行培養歷時48小時之後，繼而予以離心並收集上清液。接著，將50μL上清液與50μL胺苯璜醯胺(sulfanilamide)(60mM，配於5% H₃PO₄)加入至一微量離心管中並予以混合均勻，接著加入50μL的N-1-萘基乙二胺二氯化氫 (N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride)(4mM，配於ddH₂O)，並於室溫下進行反應歷時5分鐘。之後，對所形成的反應混合物取出適量的體積，並於540nm的波長下以一ELISA讀取儀來讀取各個反應混合物的吸光值(OD₅₄₀)。所得到的OD₅₄₀吸光值分別根據預先以具有不同已知濃度的亞硝酸鈉(sodium nitrite,NaNO₂)相對於它們自身的OD₅₄₀吸光值所作出的一標準曲線而被換算成亞硝酸鹽的濃度(μM)。

之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。

結果：

圖2顯示帶有酯多醣-誘發的發炎的小鼠巨噬細胞RAW264.7在以不同的混合物溶液予以處理後所測得的亞硝酸鹽的濃度。由圖2可見，與病理對照組相較之下，實驗組1至6的亞硝酸鹽的濃度(大約4μM)皆顯著地被降低。

這個實驗結果顯示：依據本發明的混合物溶液1至6能夠藉由減少一氧化氮的生成來達到優越的抗發炎效用。因此，申請人認為：依據本發明的混合物溶液1至6具有發展成為一抗發炎藥物的高潛力。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述， 明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

Claims (9)

1. 一種用於製備一發酵培養物的方法，其包括：(a)在一範圍落在25至32℃內的溫度下，對一漿果、一食用蕈類以及一啤酒酵母菌進行發酵培養歷時14天，藉此而得到一第一發酵培養物，其中，該漿果是一由桑椹以及矮叢藍莓所構成的組合或者一由桑椹以及黑茶藨子所構成的組合，以及該食用蕈類是靈芝；(b)將該第一發酵培養物與一醋酸菌加入至一被進行通氣處理的反應器內以形成一混合物，繼而在一範圍落在25至32℃內的溫度以及一為20L/min的通氣量下，對該混合物進行發酵培養歷時15至30天，藉此而得到一第二發酵培養物，其中當該混合物具有一大於1.5g/mL的滴定酸度時，停止對該反應器進行通氣處理；(c)對該第二發酵培養物進行一固-液分離處理，藉此而得到一澄清液；以及(d)在一範圍落在25至32℃內的溫度下，對該澄清液與一由保加利亞乳酸桿菌、芽孢乳酸菌、雙叉型雙叉桿菌以及布氏乳酸菌所構成的乳酸菌組合進行發酵培養歷時90至120天，藉此而得到該發酵培養物，其中在該乳酸菌組合當中的保加利亞乳酸桿菌、芽孢乳酸菌、雙叉型雙叉桿菌以及布氏乳酸菌是呈一範圍落在1：1：1：1(v/v/v/v)至1：1.5：1： 1.5(v/v/v/v)內的比例。
2. 如請求項1的方法，其中該步驟(a)包括下列次步驟：(i)將該漿果、該食用蕈類、該啤酒酵母菌以及一醣類進行混合，俾以形成一具有一糖度落在2至15°Bx內的混合物；以及(ii)在一範圍落在25至32℃內的溫度下，對該混合物進行發酵培養歷時14天。
3. 如請求項1的方法，其中在該步驟(c)中，該固-液分離處理是選自於由下列所構成之群組：離心、過濾、重力沈積，以及它們的組合。
4. 如請求項3的方法，其中在該步驟(c)中，該固-液分離處理是離心。
5. 一種組成物，其包含有依據請求項1的方法所製得的漿果的發酵培養物以及食用蕈類的發酵培養物，其中，該漿果是一由桑椹以及矮叢藍莓所構成的組合或者一由桑椹以及黑茶藨子所構成的組合，以及該食用蕈類是靈芝。
6. 如請求項5的組成物，其中該漿果是一由桑椹以及矮叢藍莓所構成的組合，在該組成物中，桑椹的發酵培養物、矮叢藍莓的發酵培養物以及靈芝的發酵培養物是呈一為2：1：1.5(v/v/v)的比例。
7. 如請求項5的組成物，其中該漿果是一由桑椹以及黑茶藨子所構成的組合，在該組成物中，桑椹的發酵培養物、黑茶藨子的發酵培養物以及靈芝的發酵培養物是呈 一為2：1：1.5(v/v/v)的比例。
8. 一種如請求項5至7中任一項的組成物供應用於製備一用來抗發炎之醫藥品或食品產品的用途。
9. 一種如請求項5至7中任一項的組成物供應用於製備一用來抗氧化之醫藥品或食品產品的用途。