KR20030012821A

KR20030012821A - 천연항균제

Info

Publication number: KR20030012821A
Application number: KR1020020044767A
Authority: KR
Inventors: 이호; 김철; 최재수; 안원근
Original assignee: (주) 바이오스킨테크
Priority date: 2002-07-29
Filing date: 2002-07-29
Publication date: 2003-02-12
Also published as: JP2004059566A; KR100396184B1

Abstract

본 발명은 천연항균제에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 바이오 신소재로서 식품, 의약품, 화장품, 섬유, 생활용품 등에서 방부 및 항산화 및 노화억제 기능을 가짐으로써 품질의 안전성과 안정성을 높이고 사람을 포함한 포유류에서 안전하고 내성이 유발되지 않으면서 적절한 항산화 및 노화억제 기능까지 보유하고 있어 감염성 질병을 치료하고 예방하는 효과를 갖는 천연항균제에 관한 것이다.

Description

천연항균제{Natural antibiotic composition}

본 발명은 항산화 기능과 항노화 활성을 가지면서 항균력이 우수한 천연항균제에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 황금추출물에서 얻어지는 디티에프(디메톡시 테트라하이드록시 플라본)를 주 활성성분으로 하며, 항산화 기능과 항노화 활성을 가지며, 항균력이 높고, 항균스펙트럼이 광범위한 다기능성 천연항균제에 관한 것이다.

식품, 의약품, 화장품 등의 많은 제품은 품질을 오랫동안 유지하기 위해서는 미생물에 의한 부패를 막아주는 방부제가 필수적인데, 제품 특성상 유통기간이 비교적 길며 미생물 영양원이 많은 화장품의 경우는 더욱 그러하다.

그러나, 기존의 방부제로서 가장 안전하며 화장품, 의약품에 범용적으로 사용되는 파라벤류의 방부제들조차 피부알러지(Andrea Counti등, Contact Dermatitis,1997,37;35-36.)와 환경호르몬으로서의 가능성(Edwin등,Toxicology and Applied Pharmacology,1998,153;12-19.) 및 내성균 유발이라는 문제점을 가지고 있다. 뿐만 아니라 식품용 방부제들도 허용된 기준내의 사용도 불신되고 있고 지속적인 체내 축적으로인한 급,만성 독성, 돌연변이 유발등의 새로운 문제 가능성이 대두되고 있다(신동화, 식품과학과 산업,1990,23(4) 68-72).

이러한 문제점들로 인하여 제품의 안전성과 경제성이 우수한 천연방부제에 대한 연구가 지속되고 있으며, 그 결과로 향신료, 우유 및 어류 등의 식품류, 정유, 한약재 등으로부터 많은 천연 항균성물질이 보고되었다.

천연의 항균성 물질로 알카로이드(alkaloid), 후라보노이드(flavonoid), 피토알렉신(phytoalexin), 항균펩타이드 등이 알려져 있으며, 유기산과 지방산 등의 항균성에 대한 것도 알려져 있다. 이들 대부분은 산의 pH에 의한 효과와 킬레이트에 의한 효과가 주 메카니즘일 것으로 추정된다(EI-shenawy,MA등,J.Food Protec.1989,52(11):771-778) (Bizri,JN 등, J Food Science,1994,59(1),130-135).

그러나, 보고된 천연 항균성물질의 대부분은 색취, 안정성 저하, 좁은 항균스펙트럼, 제형상의 문제점 등으로 인하여 상용화되지 못하고 있으며, 편백추출물인 희노키티올(Hinokitiol), 목련추출물인 메그노놀(Megnonol), 자몽종자추출물 DF-100등 극히 일부만이 상용화되고 있다.

이중에서 가장 제품개발이 앞선 DF-100의 경우에 항균력은 DF-100에 포함된 유기산 및 합성보존료인 benzethonium chloride 때문인 것으로 알려져 있으며, 그외 다른 천연항균제 등은 경제성이 낮거나 좁은 항균스펙트럼 또는 물성에 의한 사용범위의 제한성 등의 문제를 가지고 있어 보다 진보되고 제품화개발이 가능한 천연항균제가 절실한 실정이다.

한편, 현재 일반제품에 사용되고있는 항균제는 제품의 품질을 유지하는 차원이 아니라 미생물에 의한 사람 및 가축에서의 질병발생을 예방하고 치료하기 위하여 합성항생제가 범용되고 있으나, 오용 및 남용으로 인해 다양한 내성균주가 나타나 병원에서는 감염증을 치료하기 위해 고단위의 항생제를 사용하여야 하는 악순환의 고리를 형성하고 있고, 가축에게도 원인균의 감수성이 떨어지고 항생제 잔류라는 공중 보건상 중요한 문제가 대두되고 있다.

특히, 메티실린 저항성 포도상구균(Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus;MRSA) (Voss,A등, Int J. Antimicrob.Agents, 1995,5:101-106)에 대처하기 위해 2가지 이상의 항생제를 복합적으로 사용하거나 반코마이신(Vancomycin)을 사용하고 있으나, 반코마이신에 대하여 저항성을 갖는 장내세균(Vancomycin-resistant enterococci) (Billot-klein D, Antimicrob. Agents.Chemother,1992,36:1487-1490)과 같은 내성균주가 출현하고 있다.

그에 따라 근래에는 항생제의 감수성을 높이기 위해 천연물에서 후라보노이드와 같이 사용하여 감수성을 높였다는 보고가 있으며,(IAIN X,LIU등, J. Pharm.Pharmacol,2000,52:361-366), 항균펩타이드(Giacometti A 등, J. Antimicrob. Chemother 2000 Nov;46(5):807-811)도 병용효과를 위한 대안으로서 많은 연구가 진행되었지만, 항균펩타이드는 항균성만 나타내는 제한성이 있으며 경제적 대량 생성방법에 문제가 있다(Lee JH등, Protein. Expr. Purif, 1998 Feb; 12(1),53-60).

한편, 생체외부 또는 생체 내에서의 생화학적 산화반응에 의해 발생하는 프리라디칼은 류마티스성 관절염, 심장병, 순환기 장애, 암 등과 같은 여러 질환의 원인이 되고 있다. 프리라디칼은 단백질, DNA, 면역세포등 면역계통의 인자를 손상시켜 질환을 유발하고 세포 생체막의 불포화지방산을 공격하여 과산화지질을 축적시키고 이로 인해 생체기능이 저하되고 노화 ,성인병 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다.

또한, 식품 및 화장품, 의약품 등의 산패에 의한 품질저하 역시 경제적 손실을 가져올 뿐만 아니라 그것을 섭취하고 바르는 사람에게까지 영향을 줄 수 있기 때문에 사람과 관련된 식품, 화장품, 의약품 및 가축의 사료 등에 항산화 효과가 있는 물질을 첨가하는 것이 바람직하다.

미생물에 의한 감염과 항산화는 불가분의 관계가 있는데 그람음성균의 엔도톡신(endotoxin)에 의해 쇽이 유발되고 프리라디칼이 내재적 방어인자인 슈퍼록사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)와 같은 활성산소 소거제의 발현이 감소되기도 하는 것을 알려져 있다(Leach M등, Br J. Pharmacol, 1998, oct;125(4):817-825).

또한, 세균과 음식물의 상호작용으로 활성화된 다형핵 백혈구에 의해 생성된 프리라디칼은 산화환원제 활성의 균형을 깨지게 하여 치근막 조직의 파괴를 유도하여 염증이 더욱 진행된다(Waddington RJ등, Oral. Dis,2000, May; 6(3):138-151). 이런 맥락에서 비타민 씨는 중요한 수용성 항산화제중의 하나로서 엔도톡식 쇽과 관련된 증상을 완화시킨다는 보고가 있으나(Victor VV등, Immunopharmacology, 2000 Jan;46(1):89-101), 실제적으로 감염증의 적절한 치료를 위해 항산화제를 병용하여 투여하는 경우는 드물다.

오래전부터 항산화제로는 효소계열과 비효소계열의 천연 항산화물질들이 많이 사용되어져 왔으나, 가장 많이 실용화된 것 중의 하나인 토코페롤(tocopherol)은 항산화 효과가 비교적 낮은 편이고 합성항산화제는 일정 수준 이상 섭취시 여러 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서 안전하고 효과가 높은 천연 항산화제가 필요한 실정이다.

본 발명자는 항산화 기능과 함께 우수한 항균력을 발휘하는 천연항균제에 관한 연구를 지속적으로 수행하였으며, 그 결과 천연항균제에 관한 기술의 일환으로 특허출원번호 제10-2001-0006372호에서 키토올리고당 착화합물과 황금추출물을 포함하는 천연항균제에 관한 기술을 개시하고 있다.

그러나, 상기 본 발명자에 의해 제시된 천연항균제는 기존 천연항균제와 마찬가지로 안정성이 저하되고, 좁은 항균스펙트럼을 가지므로 사용범위에 제한성이 따를 뿐만 아니라 제형상의 문제점으로 인하여 상용화에 많은 어려움을 가지고 있다.

이에, 본 발명은 항금추출물로부터 항균성을 나타내는 성분인 디티에프(디메톡시 테트라하이드록시 플라본)를 분리정제하여 이를 항균제조성물로 활용함으로서 항균력이 매우 우수할 뿐만 아니라 광범위한 스펙트럼을 가지면서 적절한 항산화기능과 노화억제기능까지 가지는 다기능성 천연항균제를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 항균력을 극대화시키기 위하여 디티에프와 함께 디티에프의 항균활성을 상승시키는 물질을 포함하는 천연항균제를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

도 1 내지 도 4는 세포주에 대한 노화억제 활성 실험 결과를 나타낸 사진으로서,

도 1은 무처리 대조군의 세포상태를 나타낸 사진이고,

도 2는 산화제로 4-HNE를 사용하여 12시간 처리한 후의 세포상태를 나타낸 사진이며,

도 3은 항균제로 디티에프를 0.001중량%포함하는 항균제를 사용하여 12시간 처리한 후의 세포상태를 나타낸 사진이며,

도 4는 항균제로 디티에프를 1.0중량%포함하는 항균제를 사용하여 12시간 처리한 후의 세포상태를 나타낸 사진.

도 5는 노화억제활성 실험의 결과를 나타낸 사진.

상기한 목적을 달성하기 위해 본 발명에서는 황금추출물에서 분리정제한 디티에프(디메톡시 테트라하이드록시 플라본)를 주 활성성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 천연항균제를 제공한다.

또한 본 발명은 디티에프를 주 활성성분으로 하며, 상기 디티에프의 항균활성을 상승시키는 항금추출물에서 분리정제한 바이칼린을 포함하는 것을 특징으로 하는 천연항균제를 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 황금추출물에서 분리정제한 디티에프(디메톡시 테트라하이드록시플라본)를 주 활성성분으로 포함하는 천연항균제를 제공한다.

황금추출물은 황금(Scutellaria baicalensis) 건고물을 사용하여 얻어지는 것으로서 해열, 담즙분비촉진, 위액분비억제, 동맥경화방지, 항균 및 항진균, 항바이러스에 효과가 있다고 알려져 있다. 이외에도 황금은 항산화, 노화억제 (Shieh DE, Anticancer Res, 2000 Sep-Oct;20(5A): 2861-2865), 항염 및 항알러지 효과 (Williamson EM등, Potter's New Cyclpaedia of Botanical Drug and Preparations, revised edn,1988,p362, The C.W.Daniel Co.,Ltd, U.K)등의 기능이 알려져 있다.

상기 황금추출물은 통상적으로 식물로부터 유효성분을 추출하기 위해 사용하는 여러 방법에 의해 얻을 수 있다.

일예로, 황금건고물에 에탄올, 메탄올 등의 극성용매 또는 그들과 정제수의 혼합용액을 분쇄물의 10배(중량비) 가량 가하여 냉각콘덴서가 부착된 추출기에서 약 80℃의 온도로 24시간동안 가열하여 추출물을 얻고 여과하여 감압농축시킨 후 농축추출액을 얻는다. 얻어진 농축 추출액의 2배(중량비)에 해당하는 정제수를 가한 다음 에틸아세테이트, 메칠렌클로라이드 등의 비극성용매를 4배(중량비)가량 첨가하고, 강하게 진탕한 후 상층인 비극성용매층을 분리하여 감압농축하면 황금추출물을 얻을 수 있다.

또 다른 예로, 황금건고물에 정제수를 2배(중량비) 가하고, 여기에 에탄올, 메탄올 등의 극성용매 또는 그들과 정제수의 혼합용액을 분쇄물 100중량부에 대한 20중량부를 가하여 냉각콘덴서가 부착된 추출기에서 60℃의 온도로 10시간 가열하여 추출물을 얻고 여과하여 감압농축시켜 농축 추출액을 얻는다. 추출액 무게의 10배에 해당하는 에탄올, 메탄올 등의 극성용매 또는 그들과 정제수의 혼합용액을 가하고 강하게 진탕추출한 다음 여과하여 고형분을 제거하고 여과하면 황금추출액을 얻을 수 있다.

또 다른 예로, 황금추출물중의 주요 항균활성성분은 초임계 유체 추출기술을 사용한 다음과 같은 추출방법으로 얻을 수 있다. 즉 황금건고물을 초임계 추출장치에 채운후 70∼90℃, 4,000∼6,000 PSI 압력으로 이산화탄소로 1차 추출한 다음 이산화탄소 100 부피부에 대해 2∼20(v/v)%의 디에틸아민 또는 트리에틸아민이 용해된 메탄올, 에탄올, 물 또는 이들의 혼합용매에서 선택된 1종 이상의 알카리성 공용매 1∼20부피부를 반응기에서 혼합하여 추출한다음 컬럼크로마토그래피를 사용하여 선택적인 황금추출물 분획을 얻을 수 있다.

상기한 방법들 이외에도 다양한 방법을 통해 황금 추출물을 얻을 수 있으며, 얻어진 황금추출물에는 주성분인 바이칼레인(baicalein)을 포함하여 바이칼린(baicalin), 디티에프(DTF), 오고닌(wogonin), 7-메톡시 바이칼레인(7-methoxy baicalein), 오록실린-A(oroxylin-A), 스쿨캡플라본(skullcapflavone)I,II 등의 후라보노이드가 함유되어 있으며, 이외에도 베타 시토스테롤(beta-sitosterol), 캠페스테롤(campesterol) 등의 스테롤류와, 슈크로즈(sucrose), D-글루코즈(D-glucose)등의 당류, 정유 및 기타 여러 가지 수지가 함유되어 있다.

통상적인 추출방법으로 획득되어지는 수율은 건조상태의 원재료중량대비하여 바이칼레인, 바이칼린이 2∼3중량% 정도이고 그외 오고닌, 디티에프 등은 1중량% 미만인 것으로 알려져있으나, 추출방법과 조건에따라 각 활성성분의 수율은 가변적이다.

상기한 바와 같이 황금추출물은 바이칼레인(baicalein)이 주성분을 이루고 있으나 제한적 항균력을 가지고 있는데 반해, 황금추출물에 함유되어 있는 디티에프는 비록 그 함량이 극히 작으나 항균활성이 매우 뛰어나다.

따라서, 본 발명에서는 상기 황금추출물에서 디티에프를 분리정제하여 이를 천연항균제로 사용하였으며, 황금추출물에서 디티에프를 분리정제하는 것은 통상의 컬럼크로마토그래피로 용이하게 분리정제할 수 있다.

본 발명에서는 황금추출물을 실리카겔 컬럼을 사용하여 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트 또는 메칠렌클로라이드 등에서 선택된 용매를 혼합하여 농도구배 방법으로 분획을 실시하여 디티에프를 얻었다.

얻어진 디티에프는 그 자체로도 항균력이 높고 항균스펙트럼이 광범위하며 높은 항산화력과, 노화억제활성을 가지는데, 상기 디티에프는 프로필렌글리콜, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 물 또는 알콜에서 선택된 용매에 용해시켜 항균제로 사용하거나, 기타 여러 가지 물품에 첨가하여 항균력을 가지도록 할 수 있다.

디티에프는 사용과정에서 그 함량이 1중량%를 초과할 경우 항균력이 더 이상 크게 증가하지 않으므로 1중량% 이내로 첨가하면 되고, 그 첨가량이 0.001중량% 미만일 경우 충분한 항균력을 얻을 수 없으므로 디티에프는 0.001∼1.0중량% 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면 디티에프에 항금추출물에서 분리정제한 바이칼린을 첨가할 경우 디티에프의 항균활성을 상승시켜 보다 극대화된 항균력을 얻을 수 있게 되는데, 바이칼린의 함량이 0.1∼5.0중량%일 때 보다 극대화된 상승효과를 얻을 수 있다. 즉, 디티에프 0.001∼1.0중량%와 바이칼린 0.1∼5.0중량% 포함하는 천연항균제의 경우 디티에프의 항균활성을 바이칼린이 상승시켜 보다 우수한 항균력을 얻을 수 있게 된다. 이때, 바이칼린의 함량이 0.1중량% 미만일 경우 디티에프의 항균활성의 상승효과를 충분히 얻을 수 없으며, 그 함량이 5중량%를 초과하여도 항균활성의 상승효과가 비례적으로 증가하지 않고 일정하기 때문에 바이칼린은 0.1∼5.0중량% 포함시키는 것이 바람직하다.

상기 바이칼린은 디티에프와 마찬가지로 황금추출물을 실리카겔 컬럼을 사용하여 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트 또는 메칠렌클로라이드 등에서 선택된 용매를 혼합하여 농도구배 방법으로 분획을 실시하면 용이하게 얻을 수 있다.

디티에프와 바이칼린을 포함하는 천연항균제에 고삼추출물, 금은화추출물, 황련추출물, 연교추출물, 목단피추출물, 오배자추출물, 마늘추출물 또는 감초추출물에서 선택되는 적어도 1종 이상의 생약추출물을 적어도 10중량% 포함되도록 첨가할 경우 높은 항산화력과 노화억제활성을 가지며 항균력이 높고 항균스펙트럼이 광범위한 다기능성 천연항균제를 얻을 수 있게 된다.

이때, 상기 고삼추출물, 금은화추출물, 황련추출물, 연교추출물, 목단피추출물, 오배자추출물, 마늘추출물 또는 감초추출물은 전술한 황금추출물을 획득하는 과정과 마찬가지로 통상의 추출법에 의해 추출하여 사용할 수 있다. 또한 효과적인 추출을 위해 염화나트륨을 이용하여 탄닌을 미리 제거할 수 있으며 추출조건은 가열이 아닌 실온에서 2∼7일간 침적시켜두는 것도 가능하다.

이하 본 발명을 하기 실시예와 실험예를 통하여 상세하게 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<황금추출물 제조예>

황금건고 분쇄물에 정제수를 2배(중량비) 가하고, 여기에 에탄올, 메탄올 등의 극성용매 또는 그들과 정제수의 혼합용액을 분쇄물 100중량부에 대한 20중량부를 가하여 냉각콘덴서가 부착된 추출기에서 60℃의 온도로 10시간 가열하여 추출물을 얻고 여과하여 감압농축시켜 농축 추출액을 얻었다. 이 추출액 무게의 10배에 해당하는 에탄올, 메탄올 등의 극성용매 또는 그들과 정제수의 혼합용액을 가하고 강하게 진탕추출한 다음 여과하여 고형분을 제거하고 여과한 다음, 건조시켜 분말상의 황금추출물을 얻었다.

<활성성분 분획 및 정성확인>

상기 황금추출물 제조예에서 획득한 추출물을 실리카겔 컬럼으로 분획하여 바이칼린과 디티에프 및 오고닌 항균활성성분을 얻었으며, 얻어진 바이칼린과 디티에프 및 오고닌의 성분확인은 고압액체크로마토그래피(컬럼; 마이크로본다팩 씨18 컬럼, 이동상; 아세토니트릴:0.5% 인산을 27:73(v/v)로 혼합한 용매, 유속; 분당 2ml, 인젝션량; 10ul, 검출파장 280nm)로 확인하였다. 그 결과 바이칼린은 16분대, 오고닌은 18분대, 디티에프는 17분대에서 피크가 검출되었으며, 이는 각 표준물질에 의한 검출시간대와 일치하는 결과를 보였다. 또, 각각의 성분들의¹H NMR 또는¹³CNMR 확인결과는 다음과 같으며, 이는 표준물질과 동일한¹H NMR 또는¹³C NMR 결과임을 알 수 있었다.

디티에프:¹H NMR(DMSO-d6) δ: 3.74,3.77(3H each, s, -OMe), 6.30,6.35(1H each, s), 6.61,6.94(1H each, d, 9.0, aromatic H), 9.0, 9.40, 10.72(1H ech, br s, -OH), 12.56(1H,s,OH5)

¹³C NMR(DMSO-d6) δ: 161.7(s,C2), 111.1(d), 181.7(s), 157.0(s), 99.0(d), 150.4(s), 127.6(s), 156.3(s), 103.7(s), 114.8(s,C1'), 148.2(s), 111.6(d), 119.8(d), 142.4(s), 146.0(s), 60.8(q,-OCH3),60.4(q,-OCH3)

바이칼린:¹H NMR(DMSO-d6) δ: 7.01(1H,s,H3 or 8), 7.07(1H,s,H8 or 3), 7.40-7.70(3H,m,H3',4',5'), 7.90-8.20(2H,m,H2',6'), 12.59(1H,br.s,OH5), 5.11(1H,d,8.0,anomeric H)

¹³C NMR(DMSO-d6) δ: 163.7, 104.8, 182.8, 146.7, 131.0, 151.8, 94.3, 149.4, 106.2, 130.8, 126.5, 129.3, 132.2, 129.3, 126.5, 101.1, 73.2, 75.9, 69.8, 77.4, 60.7

오고닌:¹³C NMR(DMSO-d6) δ: 162.9, 105.1, 182.0, 157.3, 99.2, 149.6, 127.8, 156.2, 103.8, 130.9, 126.2, 129.1, 131.9, 129.1, 126.2, 61.0

상기와 같이 황금추출물에서 분획하여 얻어진 바이칼린, 디티에프, 오고닌및 분말상 황금추출물의 항균력과 특성을 확인하고자 하기한 실험예들을 실시하였다.

<실험예 1>

황금추출물에서 분획하여 얻어진 바이칼린, 디티에프, 오고닌 및 분말상 황금추출물의 항균력을 측정하기 위해 고체배양 희석법(Agar Serial Dilution Method)를 이용하여 균주를 배양하여 사용하였으며, 세균은 뮐러힌텅육즙(Mueller Hinton broth)을 사용하였고 배지에 균을 접종하여 37℃ 배양기에서 20시간동안 배양하였다. 진균배양에는 사보라우드 덱스트로즈육즙(Sabouraud dextrose broth)을 사용하였고 배지에 균을 접종하여 25℃ 배양기에서 7일간 배양하여 사용하였고, 식물병원균인 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)에 대해서는 포테이토 덱스트로즈배지를 사용하여 25℃에서 7일동안 배양한 것을 사용하였다. 사용한 균주로는 그람양성균으로Bacillus subtilisATCC 6633,Staphylococcus aureusATCC 6538P, 그람음성균으로Escherichia coliATCC 10536,Pseudomonas aeroginosaATCC 1636, 효모로Candida albicansATCC 10231, 진균으로Aspergillus nigerATCC 9029,Trichophyton mentagrophytesKCTC 6077,Fusarium solani를 사용하였다.

보다 구체적인 항균시험은 먼저 뮐러힌턴육즙에 균을 접종(2×10⁶CFU/ml)하여 37℃에서 24시간 전배양한다. 한편 멸균된 페트리접시에 2배수로 3μg/ml 농도의 항균제 용액(5% DMSO;Dimethylsulfoxide 생리식염수용액) 2ml씩을 넣고 대조군은 멸균증류수 2ml을 넣고 비교군은 아모클라(Amocla:Amoxicillin염,건일제약)를2ml 넣는다. 각 페트리접시에 멸균후 50℃로 식은 뮐러힌턴한천융해배지를 18ml씩 넣고 페트리접시의 밑바닥을 회전시켜 잘 섞는다. 이후 전배양시킨 균을 백금이를 사용하여 5mm정도 도말한다. 세균은 37℃에서 24시간 배양하고 진균 및 효모는 22℃ 배양기에서 6일간 배양한 후 각 구획안에 집락형성여부를 관찰하여 성장이 인정되지 않는 평판의 최소 항균제농도를 최소저해농도(MIC,Minimum inhibitory concentration)로 한다.

구분	B.subtilis	S.aureus	M.luteus	MRSA	E.coli	E.coliO157	P.aeruginosa	K.pneumoniae	C.albicans	A.niger	T.mentagrophytes	F.solani
바이칼린	250	250	125	125	500	500	500	250	63	500	1000	1000
디티에프	125	125	32	63	125	125	250	125	16	63	125	63
오고닌	500	250	250	1000	500	1000	1000	500	125	1000	2000	1000
황금추출물	500	250	250	500	500	1000	1000	500	125	500	1000	1000

상기 표1에서 보는 바와 같이 황금추출물에서 얻어지는 디티에프는 최소저해농도가 16ppm에서 250ppm으로 항균력이 가장 높은 것으로 확인되었으나, 오고닌의 경우에는 최소저해농도가 125ppm에서 2,000ppm이고, 황금추출물의 경우 최소저해농도가 125ppm에서 1,000ppm으로 낮은 항균력을 보임을 알 수 있다. 따라서 디티에프만으로도 충분히 항균제로 사용 가능함을 알 수 있다.

<실험예 2>

황금추출물에서 분획하여 얻어진 바이칼린, 디티에프 및 오고닌의 함량에 따른 황균력을 확인하고자 바이칼린, 오고닌 및 디티에프를 하기 표2에 나타낸 중량비율이 되도록 하되, 잔량을 글리세린이 되도록 혼합하여 천연항균제를 제조하였으며, 이렇게 제조된 천연항균제의 항균력을 측정하기 위해 페이퍼디스크 고체배양법(paper disk agar assay method)을 이용하였다. 즉, 멸균식염수에 준비한 각 균액을 10⁸cfu/ml으로 준비하고, 균액평판제조용 배지인 뮐러힌턴한천배지를 121℃에서 15분 멸균하고 45∼50℃로 식힌 배지에 균액을 가하여 10⁶cfu/ml 균농도로 제조한 고체배지를 사용한다. 뮐러힌턴한천 균액배지위에 직경 6밀리미터 페이퍼디스크를 올리고 여기에 바이칼린, 오고닌, 디티에프를 0.0001∼10중량% 농도로 25ul 씩 가하여 37℃, 24시간 배양한 다음 균생장 저해환의 직경을 측정하여 최적 항균력 범위를 평가하였다.

세균은 뮐러힌텅육즙(Mueller Hinton broth)을 사용하였고 배지에 균을 접종하여 37℃ 배양기에서 20시간동안 배양하였다. 진균배양에는 사보라우드 덱스트로즈육즙(Sabouraud dextrose broth)을 사용하였고 배지에 균을 접종하여 22℃ 배양기에서 6일간 배양하여 사용하였고 식물병원균인 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)에 대해서는 포테이토 덱스트로즈배지를 사용하였다.

사용한 균주로는 그람양성균으로Staphylococcus aureusATCC 6538P, 그람음성균으로Escherichia coliATCC 10536, 효모로Candida albicansATCC 10231, 진균으로Aspergillus nigerATCC 9029를 사용하였다.

구분	균주	항균활성(mm)
구분	균주	0.0001%	0.001%	0.01%	0.1%	1.0%	2.0%	5.0%	10%
바이칼린	S. aureus	ND	TR	TR	14	18	22	27	27
	E. coli	ND	ND	ND	11	15	18	22	22
	C. albicans	ND	TR	TR	16	21	26	27	28
	A. niger	ND	ND	TR	10	13	17	19	20
오고닌	S. aureus	ND	ND	ND	8	10	14	15	15
	E. coli	ND	ND	ND	7	8	11	11	12
	C. albicans	ND	ND	TR	8	11	15	16	16
	A. niger	ND	ND	TR	9	11	14	14	15
디티에프	S. aureus	TR	11	15	18	23	26	26	27
	E. coli	ND	10	14	17	21	21	22	21
	C. albicans	8	12	17	23	26	28	28	28
	A. niger	TR	10	13	17	19	20	20	20

상기 표 2의 결과 바이칼린의 경우 0.1∼5.0중량% 범위가 세균, 효모 및 진균에 대하여 항균력을 가지는 적정 유효농도인 것을 알 수 있으며, 오고닌은 0.1∼2.0중량%에서 그리고 디티에프의 경우에는 0.001∼1.0중량%에서 적정 유효항균활성을 가짐을 확인할 수 있다.

<실시예 1 내지 54>

황금추출물에서 얻은 디티에프와 바이칼린, 오고닌 및 상기 황금추출물 제조예와 동일한 방법으로 제조한 생약추출물(고삼추출물, 금은화추출물, 황련추출물, 연교추출물, 목단피추출물, 오배자추출물, 마늘추출물, 감초추출물)을 하기 표3에 나타낸 중량비율이 되도록 하되, 잔량을 글리세린이 되도록 혼합하여 천연항균제를 제조하였다.

구분	디티에프(%)	바이칼린(%)	오고닌(%)	생약추출물/함량(%)
실시예1	0.0005	0	0	0
실시예2	0.001	0	0	0
실시예3	0.001	0.05	0	0
실시예4	0.001	0.1	0	0
실시예5	0.001	1.0	0	0
실시예6	0.001	5.0	0	0
실시예7	0.001	7.0	0	0
실시예8	0.001	0	0.05	0
실시예9	0.001	0	0.1	0
실시예10	0.001	0	0.5	0
실시예11	0.001	0	2.0	0
실시예12	0.001	0	5.0	0
실시예13	0.01	0	0	0
실시예14	0.01	0.05	0	0
실시예15	0.01	0.1	0	0
실시예16	0.01	1.0	0	0
실시예17	0.01	5.0	0	0
실시예18	0.01	7.0	0	0
실시예19	0.01	0	0.05	0
실시예20	0.01	0	0.1	0
실시예21	0.01	0	0.5	0
실시예22	0.01	0	2.0	0
실시예23	0.01	0	5.0	0
실시예24	0.1	0	0	0
실시예25	0.1	0.05	0	0
실시예26	0.1	0.1	0	0
실시예27	0.1	1.0	0	0
실시예28	0.1	5.0	0	0
실시예29	0.1	7.0	0	0

<표 3 계속>

구분	디티에프(%)	바이칼린(%)	오고닌(%)	생약추출물/함량(%)
실시예30	0.1	0	0.05	0
실시예31	0.1	0	0.1	0
실시예32	0.1	0	0.5	0
실시예33	0.1	0	2.0	0
실시예34	0.1	0	5.0	0
실시예35	1.0	0	0	0
실시예36	1.0	0.05	0	0
실시예37	1.0	0.1	0	0
실시예38	1.0	1.0	0	0
실시예39	1.0	5.0	0	0
실시예40	1.0	7.0	0	0
실시예41	1.0	0	0.05	0
실시예42	1.0	0	0.1	0
실시예43	1.0	0	0.5	0
실시예44	1.0	0	2.0	0
실시예45	1.0	0	5.0	0
실시예46	2.0	0	0	0
실시예47	0.001	5.0	0	고삼추출물(10%)
실시예48	0.001	5.0	0	금은화추출물(10%)
실시예49	0.001	5.0	0	황련추출물(10%)
실시예50	0.001	5.0	0	연교추출물(10%)
실시예51	0.001	5.0	0	목단피추출물(10%)
실시예52	0.001	5.0	0	오미자추출물(10%)
실시예53	0.001	5.0	0	마늘추출물(10%)
실시예54	0.001	5.0	0	감초추출물(10%)

<실험예 3>

상기 실시예 1 내지 54에서 제조한 천연항균제를 이용하여 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 실시하여 최소저해농도를 측정하였다. 이때, 사용한 균주로는 그람양성균으로Bacillus subtilisATCC 6633,Staphylococcus aureusATCC 6538P,Micrococcus luteusATCC 9341,Methicillin resistant staphylococcus aureus(MRSA) C2207, 그람음성균으로Escherichia coliATCC 10536,Escherichia coli0157:K88ac,Pseudomonas aeroginosaATCC 1636,Klebsiella pneumoniaeATCC 10031, 효모로Candida albicansATCC 10231, 진균으로Aspergillus nigerATCC 9029,Trichophyton mentagrophytesKCTC 6077,Fusarium solani를 사용하였다.

구분	B.subtilis	S.aureus	M.luteus	MRSA	E.coli	E.coli0157:K88ac	P.aerosinosa	K.pneumonia	C.albicans	A.niger	T.mentagr-ophyte	F.solani
실시예1	1000	2000	1000	2000	1000	2000	2000	1000	500	500	500	1000
실시예2	1000	1000	500	2000	1000	2000	1000	1000	500	500	500	500
실시예3	500	1000	500	1000	1000	1000	500	1000	250	500	250	500
실시예4	500	1000	500	1000	1000	1000	500	1000	250	500	250	500
실시예5	500	500	250	500	1000	1000	500	250	63	250	125	125
실시예6	250	250	125	250	500	500	125	125	32	125	63	63
실시예7	250	125	125	250	500	500	125	125	32	125	63	63
실시예8	2000	2000	2000	2000	2000	2000	2000	1000	1000	2000	1000	1000
실시예9	1000	1000	1000	1000	2000	2000	1000	1000	1000	1000	500	500
실시예10	1000	1000	1000	1000	500	1000	500	1000	500	500	500	250
실시예11	500	500	1000	1000	500	1000	500	1000	250	500	250	500
실시예12	500	500	500	1000	500	1000	500	1000	250	500	250	500
실시예13	500	250	250	500	500	500	500	1000	500	500	250	250
실시예14	250	250	250	500	250	500	500	500	250	250	250	125
실시예15	125	250	250	500	250	500	250	500	125	125	125	63
실시예16	63	125	63	250	250	250	125	250	125	63	63	32
실시예17	32	63	63	125	125	250	125	250	63	63	63	32
실시예18	32	32	63	125	125	250	125	250	63	63	63	32
실시예19	1000	1000	1000	500	500	500	250	250	250	125	250	250
실시예20	500	500	500	500	250	500	250	250	125	125	250	125
실시예21	500	250	250	250	125	250	125	125	125	125	250	125
실시예22	250	125	250	250	125	125	125	63	125	63	125	125
실시예23	250	125	125	250	125	125	125	63	125	63	125	125
실시예24	125	250	250	500	500	250	500	250	125	250	125	125
실시예25	125	250	125	500	250	250	250	125	125	125	125	63
실시예26	63	125	125	250	250	250	125	125	63	63	125	63
실시예27	125	125	63	63	125	125	63	63	32	32	63	32
실시예28	63	63	32	32	63	63	32	16	8	16	32	16
실시예29	63	63	32	32	63	32	32	16	8	16	32	16
실시예30	500	500	250	500	250	500	250	125	250	250	250	250
실시예31	250	250	125	500	250	250	125	125	125	250	125	125
실시예32	250	250	125	125	500	125	125	63	63	125	63	63
실시예33	125	125	63	125	250	125	63	63	32	32	16	16
실시예34	125	125	63	125	125	125	63	63	32	32	16	16
실시예35	63	125	63	125	125	250	125	250	125	63	63	63
실시예36	63	63	32	63	125	125	63	63	63	32	32	63
실시예37	32	32	16	32	63	63	32	32	16	16	8	8
실시예38	32	16	16	32	32	32	16	8	8	4	4	4
실시예39	16	8	16	16	16	16	8	8	4	4	2	2
실시예40	16	8	16	16	16	8	8	8	4	4	2	2
실시예41	125	250	63	125	125	63	63	32	63	32	63	32
실시예42	125	125	63	63	125	63	63	32	63	16	63	16
실시예43	125	63	63	63	125	63	32	16	32	16	16	16
실시예44	63	32	16	32	32	32	16	16	16	16	16	16
실시예45	63	32	16	32	16	32	16	16	16	16	8	16

<표 4 계속>

구분	B.subtilis	S.aureus	M.luteus	MRSA	E.coli	E.coli0157:K88ac	P.aerosinosa	K.pneumonia	C.albicans	A.niger	T.mentagr-ophyte	F.solani
실시예46	63	63	32	363	125	125	63	125	125	63	32	63
실시예47	125	250	125	250	250	125	125	125	63	63	63	32
실시예48	125	250	125	250	250	250	125	125	32	63	125	63
실시예49	250	500	125	250	500	250	250	125	63	250	125	125
실시예50	125	250	125	250	250	500	250	125	63	125	250	125
실시예51	125	250	250	250	125	250	125	250	125	63	125	250
실시예52	125	125	250	125	63	125	125	63	63	125	63	63
실시예53	250	125	250	250	250	250	125	250	125	125	250	125
실시예54	125	63	125	63	125	125	63	125	63	63	125	63

상기 표 3 및 4에서 보는 바와 같이 본 발명의 바람직한 범위내에서 디티에프를 사용한 경우 항균활성이 매우 높음을 알 수 있으나, 바이칼린을 0.1∼5.0중량% 범위내에서 포함되도록 첨가한 경우 디티에프의 항균활성 상승효과를 가져오는 것을 확인할 수 있다. 또한 디티에프와 바이칼린에 생약추출물을 추가로 투입한 실시예의 경우 투입하지 않은 실시예에 비하여 항균력이 보다 향상됨을 확인할 수 있다.

<실험예 4>

상기 실험예 3의 결과를 토대로 본 발명의 바람직한 범위내에서 항균제를 제조한 실시예 4 내지 6, 실시예 9 내지 11, 실시예 15 내지 17, 실시예 20 내지 22, 실시예 26 내지 28, 실시예 31 내지 33, 실시예 37 내지 39, 실시예 42 내지 44에서 제조한 항균제를 이용하여 내성유발성을 확인하였다. 또한 비교확인을 위하여 통상 사용되는 항생제인 에리스로마이신도 내성유발성을 확인하였다. 실험에 사용한 균주는 대장균 0157:K88ac이며 유당육즙(0.5% 효모추출물,트립톤,1%염화나트륨)에 접종하여 37℃, 150rpm에서 12시간 배양하고 원심분리(500g, 4분)하여 균을 분리한 뒤 인산완충용액(0.1M,pH 7.0)으로 희석하여 균수를 조정하였으며 유당육즙배양액 20ml에 치사농도이하인 실시예 16의 항균제를 0.05 ppm을 첨가하고 균의 농도가 2×10⁶되게 접종하였다. 에리쓰로마이신(Erythromycin) 처리군은 에리쓰로마이신을 0.05 ppm 되게 12시간 배양후 동일한 방법으로 균을 원심분리한 후 동일한 농도의 항균제가 들어있는 배양액에 동일한 농도가 되도록 접종하였다. 이와 같은 과정을 5회 반복한 후 초기상태의 항균제 항균력과 6회 배양후의 항균제 항균력을 비교하였다. 12시간후 배양액을 10ul씩 분취하여 990ul의 인산완충액이 포함된 시험관에 넣고 50ul를 막콩키한천배지에 도말하여 생존하는 집락수를 비교하였다.

구분	계대배양전	6회 계대배양 후	AI
실시예4	1000	1000	1.0
실시예5	500	500	1.0
실시예6	250	250	1.0
실시예9	125	125	1.0
실시예10	1000	1000	1.0
실시예11	250	250	1.0
실시예15	125	125	1.0
실시예16	125	125	1.0
실시예17	250	250	1.0
실시예20	250	250	1.0
실시예21	125	125	1.0
실시예22	63	63	1.0
실시예26	125	125	1.0
실시예27	63	63	1.0
실시예28	63	125	1.0
실시예31	250	250	1.0
실시예32	125	125	1.0
실시예33	125	125	1.0
실시예37	63	63	1.0
실시예38	32	32	1.0
실시예39	32	32	1.0
실시예42	125	125	1.0
실시예43	125	125	1.0
실시예44	63	63	1.0
Erythromycin	150	1300	8.7

상기 표 5에서 AI(Adaptation Index;적응지수)=계대배양후 MIC/계대배양 전 MIC를 나타낸다. 상기 표 5에서 보는 바와 같이 적응지수(AI) 즉 내성유발성은 본발명에 따라 제조한 천연항균제의 경우 6회계대배양 후에도 최소저해농도가 변화없이 전혀 내성을 유발하지 않았으나, 통상 사용되는 항생제인 에리스로마이신의 경우 초기 최소저해농도가 150ppm에서 6회계대후 1,300ppm으로 증가하여 적응지수가 8.7로서 내성유발성이 높음을 확인할 수 있었다.

<실험예 5>

상기 실험예 3의 결과를 토대로 본 발명의 바람직한 범위내에서 항균제를 제조한 실시예 4 내지 6, 실시예 9 내지 11, 실시예 15 내지 17, 실시예 20 내지 22, 실시예 26 내지 28, 실시예 31 내지 33, 실시예 37 내지 39, 실시예 42 내지 44에서 제조한 항균제를 이용하여 다음과 같이 항산화 효과를 확인하고 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

먼저 토끼로부터 채취한 혈액을 원심분리(8,000rpm, 5분)하고 세척하고 얻은 적혈구를 생리식염수로 희석하여 적혈구현탁액(적혈구 6천만개/4ml)을 제조하였다. 직경 1.0cm의 10ml 파이렉스 시험관 9개를 준비하고 각각에 적혈구 현탁액을 4ml씩 넣는다. 9개의 시험관중 1개는 대조군으로서 에탄올 50μl를 첨가하고 나머지 8개는 처리군으로서 상기 실시예에서 제조한 항균제 시료를 50μl씩 첨가하고 암소에서 30분간 융화시켰다. 융화가 끝난뒤 광증감제로써 헤마토포르피린(Hematoporphyrin)의 수용액(80μM) 50μl를 첨가하고 입구를 파라필름으로 봉한 후 내부를 검게 칠한 50cm×20cm×25cm의 직육면체의 상자안에 20W의 형광등을 장치하고 형광등에서 5cm거리에 그 시험관들을 배열시키고 15분동안 광조사하였다. 광조사가 끝난 후 시험관들을 암소에 두면서 15분 간격으로 700나노미터에서 흡광도를 측정하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도의 증가는 적혈구의 용혈에 비례한다. 모든 실험은 27℃ 항온실에서 실시하였으며 시료가 활성산소류로부터 세포를 보호하는 활성은 위의 측정조건에서 첨가된 적혈구의 50%가 광용혈하는데 소요되는 시간(분)으로 정의하였다.

천연항균제	항산화효과(분)
토코페롤 2.0%아스코르빅산 3%	60
천연항균제 배제	35
실시예4	40
실시예5	50
실시예6	78
실시예9	125
실시예10	70
실시예11	90
실시예15	115
실시예16	135
실시예17	125
실시예20	140
실시예21	165
실시예22	130
실시예26	200
실시예27	160
실시예28	125
실시예31	150
실시예32	163
실시예33	170
실시예37	192
실시예38	200
실시예39	220
실시예42	200
실시예43	210
실시예44	220

상기 표 6에서 항산화효과는 각 시료가 적혈구의 50%를 광용혈시키는데 소요되는 시간(분)으로 나타내었으며, 상기 표 6에서 보는 바와 같이 본 발명의 바람직한 범위내에서 제조된 천연항균제는 종래의 3%아스코빅산과 2%토코페롤 및 잔량이 활성수로 이루어지는 항산화제에 비하여 최고 3배 이상의 항산화력을 가지는 것을확인할 수 있다.

<실험예 6>

본 발명에 따른 항산화제의 세포주에 대한 노화억제 활성을 알아보기 위하여 다음과 같이 실시하고 그 결과를 도 1 내지 4에 나타내었다. 실험에 사용한 세포주는 보바인 에어로틱 엔도셀리알 세포주 (Bovine aortic endothelial cells, BAEC)와 보바인 펄모나리 아테리 엔도셀리알 세포주 (Bovine pulmonary artery endothelial cells, CPAE)를 사용하였다. 세포는 10% 페탈칼프 세럼 (FCS, GIBCO BRL)이 포함된 듀벨코스 모디파이 이글 배지(DMEM, GIBCO BRL, Grand Island, NY)를 사용하여 37℃시 5% CO₂인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 정도 배양한 세포주에 산화제로서 0.2μM 4-하이드록시 2,3-노네날(4-HNE)을 처리하여 12시간 배양한 후 세포를 잘 씻은 다음 산화제를 제거하여 배양하였다. 이것을 다시 24시간 후에 본 발명에 따른 항산화제(실시예 4, 실시예 39) 10μM를 첨가하여 12시간 후에 수거하였다. 이후 형광현미경을 사용하여 세포관찰을 하였으며, 형광현미경의 사용은 형광 디엔에이 결합염료인 100 ㎍/ml 아크리딘 오렌지와 100 ㎍/ml 에티디움 브로마이드를 이용하여 생존한 세포와 죽은 세포를 관찰하였다. 아크리딘 오렌지는 세포질은 염색하는데 디엔에이에 삽입되어 살아있는 세포에서는 초록색으로 관찰되어지고, 에티디움 브로마이드는 죽은 세포들에서 주황색으로 나타난다. 염색된 세포는 형관반사현미경 (Olympus, Japan)으로 관찰하였으며, 도 1에 무처리 대조군의 세포상태를 나타내었으며, 도 2에는 산화제로 4-HNE를 사용하여 12시간 처리한 후의 세포상태를 나타내었으며, 도 3에는 항균제로 디티에프를 0.001중량%포함하는 항균제(실시예 4)를 사용하여 12시간 처리한 후의 세포상태를 나타내었으며, 도 4에는 항균제로 디티에프를 1.0중량%포함하는 항균제(실시예 39)를 사용하여 12시간 처리한 후의 세포상태를 나타내었다.

도 1 내지 4에서 보는 바와 같이 세포에 산화제 4-HNE를 처리한 도 2의 경우 세포질에 에이팝토시스로 인한 세포사멸 흔적인 보이는데, 이러한 에이팝토시스 유도 세포에 본 발명에 따른 항규제를 처리한 결과 산화제 무처리군의 경우와 같이 세포질이 녹색으로 관찰되었다. 이것은 산화제로 인해 사멸된 사멸세포를 본 발명에 따른 항균제가 다시 활성화시킴으로서 세포기능을 회복시키는 활성을 가진다는 것을 보여주는 결과로 노화억제활성을 보여주는 것이다.

<실험예 7>

본 발명에 따른 항균제의 노화억제활성 작용을 확인하기 위하여 다음과 같이 실시하고 그 결과를 도 5에 나타내었다. 웨스턴 블라팅을 이용해 노화진행과 관련있는 bcl-2 단백질을 분석하였다. 세포주로는 보바인 펄모나리 아테리 엔도셀리알 세포주 (Bovine pulmonary artery endothelial cells, CPAE)를 사용하였는데, 4-하이드록시 2,3-노네날에 6시간 노출시킨 후 본 발명에 따른 항산화제(실시예 4, 실시예 39) 10μM로 처리하여 단백질을 세포로부터 모으고 이것을 웨스턴 블라팅 분석으로 확인하였다. 배양한 세포를 모으고 원심분리 하였고 단백질은 1μg/mL 아프로티닌과 100μg/mL 페닐메틸 슬포닐 플루라이드 (PMSF)를 포함하는 용해완충액(1% 트리톤 X-100. 50mM 트리스에이치씨엘, 150mM 소디움클로라이드, 0.2% 소디움 아지드)로 추출하였다. 세포용해는 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 모았고 단백질 농도는 비에스에이 에세이로 측정하였다. 세포 단백질들은 에스디에스 폴리아크릴아미드 전기영동 (SDS-PAGE)로 분리하였으며 니트로셀루로즈 트랜스퍼 멤브레인으로 트랜스퍼시켰다. 4℃에서 트리스완충액에 스킴밀크를 넣고 니트로셀루로즈 멤브레인을 블록킹하여 비특이성 결합을 막았으며 항체에 대해 Bcl-2를 1:1000으로 희석하여 사용하였고 2차항체는 안티마우스 아이지지(IgG) 항체(1:1000 dilution)를 사용하였다. 이렇게 형성된 면역복합체는 이씨엘(enhanced chemiluminescence) 검색키트로 확인하고 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 A는 무처리 대조군의 세포상태를 나타내었으며, 도 5의 B는 산화제로 4-HNE를 사용하여 12시간 처리한 후의 세포상태를 나타내었으며, 도 5의 C는 항균제로 디티에프를 0.001중량%포함하는 항균제(실시예 4)를 사용하여 12시간 처리한 후의 세포상태를 나타내었으며, 도 5의 D는 항균제로 디티에프를 1.0중량%포함하는 항균제(실시예 39)를 사용하여 12시간 처리한 후의 세포상태를 나타내었다.

상기 도 5에서 보는 바와 같이 산화제인 4-HNE를 처리한 보바인 펄모나리 아테리 엔도셀리알 세포주(Bovine pulmonary artery endothelial cells, CPAE)에서는 노화와 관련된 P21 단백질이 다량 발현되었으나(도 5의 B), 본 발명에 따른 항균제로 처리한 경우 P21 단백질 발현이 억제되어 노화억제활성도 가지는 것을 알 수 있다.

<실험예 8>

실험예 1과 같은 방법으로 배양한Bacillus subtilisATCC 6633,Escherichia coliATCC 10536,Candida albicansATCC 10231,Aspergillus nigerATCC 9029,Fusarium solani를 동량 혼합힌 후 하기 표 7과 같은 조성을 갖는 영양화장수 제형에 접종하여 2×10⁶CFU/g 되게 하였다. 이후 시간경과에 따른 균수의 증감을 관찰하여 제품에서의 방부력을 검토하였으며, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

<비교실험예 1>

상기 실험예 8과 동일하게 실시하되 항균제로 혼합항균제(methyl paraben 2.0%, propyl paraben 1.0%, Germal115 2.0%)를 사용하여 방부력을 검토하고 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

<비교실험예 2>

상기 실험예 8과 동일하게 실시하되 항균제를 투입하지 않고 방부력을 검토하고 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

성분	조성비율(%)
글리세릴 스테아레이트(Glyceryl stearate)	1.50
스쿠알란(Squalane)	7.00
미네랄 오일(Mineral oil)	7.00
세테아릴 알콜(Cetearyl alcohol)	1.20
소비탄 스테아레이트(Sorbitan stearate)	0.30
폴리소르베이트 (Polysorbate 60)	1.00
카르보머(Carbomer)	0.12
글리세린(Glycerin)	10.00
천연항균제	디티에프	1.0
천연항균제	바이칼린	5.0
탈이온수	잔량

천연항균제	접종당시	1일후	3일후	1주일후	2주일후	3주일후	4주일후
실험예 8	2.0*10⁶	45	10	0	0	0	0
비교실험예 1	2.0*10⁶	3.0*10⁴	5.0*10²	1.0*10²	10	0	0
비교실험예 2	2.0*10⁶	2.5*10⁶	4.5*10⁶	5.5*10⁶	1.4*10⁷	3.5*10⁷	6.8*10⁷

상기 표 8에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 천연항균제의 경우 방부력이 매우 우수한 것을 확인 할 수 있다.

상기에서 설명한 바와 같이 본 발명은 천연물로부터 천연항균제를 제조함에도 불구하고 항균력이 높고 내성을 유발하지 않으면서 내성균 및 진균류에도 높은 항균력을 보여 광범위한 항균스펙트럼을 나타내었고, 적절한 항산화기능 뿐만아니라 노화억제활성까지 가지고 있는 천연소재임을 알 수 있다. 따라서, 식품, 의약품, 화장품 그리고 생활용품 등에서 다기능성 방부제로서 그리고 사람을 포함한 포유류에서의 노화억제활성의 다기능성 천연항균제로서 폭넓은 응용이 가능할 것으로 보인다.

상기에서 설명한 바와 같이 본 발명에 의한 다기능성 천연항균제는 바이오 신소재로서 식품, 의약품, 화장품, 섬유, 생활용품 등에서 방부 및 항산화 및 노화억제 기능을 가짐으로써 품질의 안전성과 안정성을 높이고 사람을 포함한 포유류에서 안전하고 내성이 유발되지 않으면서 적절한 항산화 및 노화억제 기능까지 보유하고 있어 감염성 질병을 치료하고 예방하는 효과를 갖는다.

Claims

황금추출물에서 분리정제한 디티에프(디메톡시 테트라하이드록시 플라본)를 주 활성성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 천연항균제.
청구항 1에 있어서, 상기 디티에프의 함량이 0.001∼1.0중량%임을 특징으로 하는 천연항균제.
청구항 1 또는 2에 있어서, 바이칼린 0.1∼5.0중량% 포함함을 특징으로 하는 천연항균제.
청구항 3에 있어서, 프로필렌글리콜, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 물, 알콜에서 선택되는 용매를 포함함을 특징으로 하는 천연항균제.
청구항 4에 있어서, 고삼추출물, 금은화추출물, 황련추출물, 연교추출물, 목단피추출물, 오배자추출물, 마늘추출물 또는 감초추출물에서 선택되는 적어도 1종 이상의 생약추출물을 적어도 10중량% 포함함을 특징으로 하는 천연항균제.