KR102117435B1

KR102117435B1 - 한방 복합 추출물을 함유하는 항염증 및 미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102117435B1
Application number: KR1020180090617A
Authority: KR
Inventors: 장영아
Original assignee: (주)디자인엑스투
Priority date: 2018-08-03
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2020-06-01
Also published as: KR20200015167A

Abstract

본 발명은 한방 복합 추출물을 함유하는 항염증 및 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인삼 추출물, 상황버섯 추출물 및 리기다소나무 추출물이 1:1~2:0.5~2의 혼합 중량비로 포함된 한방 복합 추출물을 유효성분으로 하며, 상기 한방 복합 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 최대 농도 25 ㎍/㎖로 함유되는 것을 특징으로 하는 한방 복합 추출물을 함유하는 항염증 및 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

한방 복합 추출물을 함유하는 항염증 및 미백용 화장료 조성물{Cosmetic composition for anti-inflammation and skin whitening comprising the extraction of traditional herb}

본 발명은 한방 복합 추출물을 함유하는 항염증 및 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인삼 추출물, 상황버섯 추출물 및 리기다소나무 추출물을 혼합한 한방 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 및 미백 효능을 갖춘 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 천연 화장품에 대한 소비자의 관심이 증대되고 동시에 한방 소재를 활용하는 많은 화장품들이 출시되면서 인삼도 화장품의 중요한 피부효능을 가진 식물소재로 연구되고 있으나, 대부분 인삼근을 이용한 추출물 또는 인삼근의 진세노사이드 성분과 인삼다당체를 활용한 것일 뿐 인삼 열매의 성분에 의한 것은 전무한 실정이다.

또한, 인삼 열매는 예로부터 인삼보다도 귀하게 여겨지는 것으로서 종자 획득을 목적으로 선별되어 수확되어 왔다. 인삼 열매는 인삼의 재배기간 중 4년생에 한해서 1회만 채종하게 되며, 3년생에서 채종하면 종자가 너무 작기 때문에 좋은 묘삼을 생산하기가 어렵고 5년생 이상에서 채종하면 종자는 충실하고 좋으나 인삼뿌리의 비대발육을 억제할 뿐만 아니라 조직이 치밀하지 못하여 홍삼을 제조할 때 홍삼품질이 크게 저하될 수 있다. 또 채종횟수를 재배기간 중에 2회 이상으로 채종하면 수량 및 홍삼품질이 크게 저하된다(최신고려인삼 “재배편”, 한국인삼연초연구원, 130-131, 1996).

사람의 피부색을 결정하는 데는 여러 가지 요인들이 관여하는데, 그 중에서도 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드와 빌리루빈 등의 인체 내외의 색소 함유유무 등의 요인들이 중요하다.

이중 특히 가장 중요한 요인은 인체 내의 멜라노사이트에서 티로시나아제 등의 여러 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색 색소이다. 이 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인, 호르몬 분비, 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적 요인 등이 영향을 미친다.

신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자물질로서, 태양으로부터 조사되는 자외선을 차단하여 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등을 잡아주는 등 피부 내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 담당한다.

이와 같이 피부 내, 외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는 안정한 물질이다. 그러나 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미, 주근깨 및 점 등과 같은 과색소 침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다.

오늘날 동양권의 여성들은 백옥같이 하얗고 깨끗한 피부를 선호하며 이를 미의 중요한 기준으로 삼고 있기 때문에 과색소 침착에 대한 치료 및 미용상 문제를 해결하고자 하는 요구가 늘어나게 되었다.

이와 같은 요구에 부응하여 종전부터 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체, 또는 티로시나아제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합하여 사용하여 왔으나, 이들의 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합 시 나타나는 제형 및 안정성의 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

한국 공개특허공보 제10-2011-0087763호 (2011.08.03.)

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 충분한 미백효과를 제공함과 동시에, 피부에 대한 안정성 문제, 화장료에 배합 시 나타나는 제형 및 안정성의 문제를 해결할 수 있는 한방 복합 추출물을 함유하는 항염증 및 미백용 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은, 인삼 추출물, 상황버섯 추출물 및 리기다소나무 추출물이 1:1~2:0.5~2의 혼합 중량비로 포함된 한방 복합 추출물을 유효성분으로 하며, 상기 한방 복합 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 최대 농도 25 ㎍/㎖로 함유되는 것을 특징으로 하는 한방 복합 추출물을 함유하는 항염증 및 미백용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 인삼 추출물, 상황버섯 추출물, 및 리기다소나무 추출물은, 인삼, 상황버섯 및 리기다소나무를 건조하고 분쇄한 다음, 상기 인삼, 상황버섯 및 리기다소나무 각각을 실온에서 24시간 이상 유기용매에 침지하되, 적어도 한번 이상 상층액과 침전물을 분리하여 추출물을 수득한 후, 감압농축 및 동결건조하여 최종 제조되는 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 한방 복합 추출물은, 니트릭옥사이드(Nitric oxide, NO)의 생성을 저해함으로써, 항염증 효과를 부여하는 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 한방 복합 추출물은, 니트릭옥사이드(Nitric oxide, NO)를 생성하는 iNOS(inducible nitric oxide synthase), 또는 염증성 물질인 PGE₂를 합성하는COX-2를 포함한 염증 지표 단백질의 발현을 저해함으로써, 항염증 효과를 부여하는 것을 특징으로 한다.

또한, 바람직하게는, 상기 한방 복합 추출물은, 멜라닌(Melanin) 합성 및 티로시나아제(Tyrosinase) 활성을 억제함으로써, 미백 효과를 부여하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은, 인삼 추출물, 상황버섯 추출물 및 리기다소나무 추출물이 1:1~2:0.5~2의 혼합 중량비로 포함된 한방 복합 추출물을 유효성분으로 하며, 상기 한방 복합 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 최대 농도 25 ㎍/㎖로 함유되도록 함으로써, 피부에 대한 안정성을 확보하고, 또한 화장료에 배합 시 나타나는 제형 및 안정성의 문제를 해결할 수 있다.

또한, 상기 한방 복합 추출물은, 멜라닌(Melanin) 합성 및 티로시나아제(Tyrosinase) 활성을 억제함으로써, 충분한 미백효과를 제공할 수 있다.

도 1은 인삼추출물, 상황추출물 및 리기다소나무 추출물의 혼합 중량비별 항산화 활성 및 미백 활성 분석 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 한방 복합 추출물의 Raw 264.7 및 B16F10 세포주에서의 세포 독성 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 한방 복합 추출물의 Raw 264.7 세포주에서의 니트릭옥사이드(Nitric oxide, NO)의 생성 저해능을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 한방 복합 추출물의 Raw 264.7 세포주에서의 염증 지표 단백질 발현 저해능을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 한방 복합 추출물의 Raw 264.7 세포주에서의 염증 관련 유전자 발현 저해능을 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명에 따른 한방 복합 추출물의 티로시나아제(Tyrosinase) 활성 저해능을 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명에 따른 한방 복합 추출물의 멜라닌(Melanin) 활성 저해능을 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명에 따른 한방 복합 추출물의 미백 관련 단백질 발현 저해능을 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명에 따른 한방 복합 추출물의 미백 관련 유전자 발현 저해능을 나타내는 도면이다.

본 발명에서는 항염증 및 미백 효능을 갖춘 화장료 조성물을 만들기 위해 인삼, 상황버섯 및 리기다소나무를 이용하여 피부에 자극적이지 않은 한방 복합 추출물을 제조하였으며, 상기 한방 복합 추출물의 항염증 및 미백 효과에 대한 생물학적 활성 평가를 수행하였다.

먼저, 상기 한방 복합 추출물의 피부 자극성을 확인하기 위하여, 독성평가를 진행하였으며, 상기 독성평가를 통해 세포독성이 없는 안전한 농도 범위에서 항염증 및 미백 효능을 확인하였다.

상기 한방 복합 추출물의 항염증 효과를 입증하기 위하여, 니트릭옥사이드(Nitric oxide, NO) 생성 저해 활성 및 니트릭옥사이드(Nitric oxide, NO)를 생성하는 iNOS(inducible nitric oxide synthase), 또는 염증성 물질인 PGE₂를 합성하는COX-2를 포함한 염증 지표 단백질의 발현량을 확인하였다.

또한, 상기 한방 복합 추출물의 미백 효과를 입증하기 위하여, 멜라닌(Melanin) 합성 및 티로시나아제(Tyrosinase) 활성 저해율을 확인하였다.

이하에서는, 도면을 참조하여, 본 발명의 한방 복합 추출물 및 이를 함유하는 항염증 및 미백용 조성물의 구체적인 실시예에 대하여 상세히 설명한다.

먼저, 본 발명의 한방 복합 추출물을 제조하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 한방 복합 추출물은, 인삼 추출물, 상황버섯 추출물 및 리기다소나무 추출물을 일정 혼합 중량비로 혼합하여 제조된다.

각각의 추출물은 인삼, 상황버섯 및 리기다소나무를 건조하고 분쇄한 다음, 상기 인삼, 상황버섯 및 리기다소나무 각각을 실온에서 24시간 이상 유기용매에 침지하되, 적어도 한번 이상 상층액과 침전물을 분리하여 추출물을 수득한 후, 감압농축 및 동결건조하여 최종 제조될 수 있다.

본 실험에서는, 상기 분쇄한 인삼, 상황버섯 및 리기다소나무 시료 각각을 70% 에탄올을 용매로 하여 침지하되, 시료 중량의 10배 양의 용매를 가하여 실온에서 24시간 침지하였다.

이후, 3회 반복적으로 상층액과 침전물을 분리하였으며, 개별 시료를 원심 분리 및 여과한 다음, rotary vacuum evaporator (HS-10SP; Hahnshin S&T, Korea)를 사용하여 농축한 후 동결기(FD5525; Ilshin BioBase, Korea)로 건조하여 추출물을 수득하였다.

이후 상기의 제조방법으로 수득한 인삼 추출물, 상황버섯 추출물 및 리기다소나무 추출물의 혼합 중량비에 따른 한방 복합 추출물의 항산화 활성 및 미백 활성 분석을 수행함으로써, 최적의 혼합 중량비를 선정하였으며, 이는 도 1을 참조한다.

도 1은 인삼추출물, 상황추출물 및 리기다소나무 추출물의 혼합 중량비별 항산화 활성 및 미백 활성 분석 측정 결과를 나타내는 도면이다.

MIX1, MIX2, MIX3 및 MIX4는 인삼 추출물:상황버섯 추출물:리기다소나무 추출물이 각각 1:1:1, 0.5:1:1, 1:1:0.5 및 0.5:1:1의 혼합 중량비로 혼합된 한방 복합 추출물이며. 상기 혼합 중량비를 가진 한방 복합 추출물의 항산화 활성 분석을 위하여, DPPH에 의한 항산화 활성 측정을 수행하였다.

도 1에 도시된 바와 같이, Electon donating ability 및 ABTS radical scavenging activity assay을 측정한 결과, MIX1, MIX2, MIX3 및 MIX4 모두 높은 항산화 활성을 나타내었으며, Electron donating ability의 경우, 1000ug/ml의 농도에서 90% 정도의 활성을 가져 대조군인 BHA와 유사한 활성을 나타내었다.

또한, Superoxid Dismutase like activity을 측정한 결과, 500ug/ml 및 1000ug/ml의 농도에서 MIX3이 가장 높은 항산화 활성을 나타냈다.

또한, 한방 복합 추출물의 혼합 중량비별 미백 활성 분석을 위해 Tyrosinase 발현 억제에 대한 미백 활성을 측정한 결과, MIX1, MIX2, MIX3 및 MIX4 모두 유사한 미백 활성을 나타내었다.

그리고, 1000ug/ml의 농도에서 MIX1, MIX2, MIX3 모두 30% 이상의 효과를 가졌으나, 특히 MIX3 혼합물이 40% 이상의 활성을 나타내며, 효능이 아주 우수함을 확인하였다.

따라서, 상술한 바에 의하여, 본 발명은 인삼 추출물, 상황버섯 추출물 및 리기다소나무 추출물이 1:1~2:0.5~2의 혼합 중량비로 포함된 한방 복합 추출물을 유효 성분으로 하되, 항산화 활성 및 미백 활성 분석 결과, 1:1:0.5의 혼합 중량비를 가진 한방 복합 추출물의 효능이 가장 우수함을 보였다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세하게 설명하고자 하며, 이는 1:1:0.5의 혼합 중량비를 가진 한방 복합 추출물을 실험의 시료로 사용하였다.

하기 실시예 및 실험예에 의하여, 상기 한방 복합 추출물의 니트릭옥사이드(Nitric oxide, NO)의 생성 저해 효과, 염증 지표 단백질 발현 저해 효과를 확인한 결과, 뛰어난 항염증 효과를 발휘함을 확인할 수 있다.

또한, 멜라닌(Melanin) 합성 및 티로시나아제(Tyrosinase) 활성 억제 효과를 확인한 결과, 뛰어난 미백 효과를 나타내었으며, 더불어 피부에 적용시 독성이 없어 안전성에도 문제가 없음을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 한방 복합 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 최대 농도 25ug/ml로 함유되는 것을 특징으로 하며, 이는 25ug/ml을 넘으면 독성효과가 생기기 때문이다.

또한, 상기 최대 농도 범위 내에서는, 조성물의 제형 개발 시, 포뮬라에 영향(점도, pH, 색상 및 분리)을 미치지 않는다.

본 발명에 따른 한방 복합 추출물을 함유하는 화장료 조성물은, 피부에 적용할 수 있는 피부 외용제 제형으로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 화장료 조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세하게 설명하며, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것이 아님은 물론이다.

< 실시예 1 > 세포 독성 측정 실험

1. 세포주 및 배양

실험에 사용된 세포주 Raw 264.7 mouse macrophage cell (murine macrophage cell line)은 한국세포주은행(Korea)에서 구입하였고, B16F10 mouse melanoma cell은 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포배양은 10% fetal bovine serum (FBS; Introgen Therapeutics, USA)과 1% penicillin/streptomycin (Hyclone^™, GE Healthcare Life Sciences, USA) 100 U/mL을 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM; Gibco^™, Thermo Fisher Scientific, USA) 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂ incubator (Forma^™, Thermo Fisher Scientific)에 적응시켜 계대 배양하였다.

2. 세포 독성 측정(세포생존율 측정)

분자생물학적 검증을 위해 실험 시료가 세포생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 대식 세포인 Raw 264.7 cell 과 멜라노마 B16F10 cell의 한방 복합 추출물에 의한 세포독성을 MTT assay를 평가하였다.

더욱 상세하게는, Raw 264.7 세포 및 B16F10 세포는 96 well plate에 well당 0.6×10⁵세포로 180 μL 분주하고, 37℃, 5% CO₂incubator에서 24 h 배양하였다.

배양 후 한방 복합 추출물의 최종농도가 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL이 되도록 각각 20 μL씩 첨가한 후 24 h 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 배양 후 각 well에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT (Sigma-Aldrich) 용액 20 μL를 첨가하여 4 h 배양한 후 배양액을 제거하고 dimethyl sulfoxide와 에탄올을 1:1로 섞은 용액을 각 well당 150 μL를 가하여 실온에서 30 min 동안 반응시킨 뒤 ELISA reader로 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포생존율 측정은 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

3. 결과

도 2를 참조하며, 도 2의 (A)는 Raw 264.7 cell 에서의 한방 복합 추출물의 세포 생존율 결과이며, (B)는 B16F10 cell에서의 한방 복합 추출물의 세포 생존율 결과이다.

본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 평균치 ± 표준편차로 나타내었으며, 대조군(Cont)과 각 실험군과의 평균의 차이는 p-value 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.(*:p＜0.05, **:p＜0.01, ***:p＜0.005)

한방 복합 추출물의 세포 생존율과 실험에 사용될 유효농도 범위를 결정하기 위해 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리한 결과, Raw 264.7 cell 및 B16F10 cell 에서 25 μg/mL 이하 농도의 세포생존율이 90% 이상으로 나타났으며 50 μg/mL 농도에서 세포독성을 나타낸 결과를 토대로 한방 복합 추출물의 항염증 및 미백 실험의 시료농도를 25 μg/mL 이내의 범위에서 진행하였다.

< 실시예 2 > 항염증 효과 실험

1. 니트릭옥사이드(Nitric oxide, NO)의 생성 저해 측정

Raw 264.7 세포를 6 well plate에 1×10⁵cells/mL로 24 h 배양하였다. 다음날 세포 밀도가 80% 되었을 때 phosphate buffered saline (PBS; Sigma-Aldrich)으로 2번 세척한 후 무혈청 배지를 사용하여 24 h 배양한 후 LPS (1 μg/mL)를 Normal 군을 뺀 모든 well에 넣어서 자극시켰다. 2 h 후에 한방 복합 추출물을 농도별(10, 25, 50 μg/mL) 처리하고 24 h 후에 상층액 100 μL와 griess reagent 100 μL를 1:1로 10 min 동안 반응시킨 후에 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO의 생성량을 확인하였다.

NO 측정은 cell supernatant를 안전한 형태인 nitrate로 환원시켜 griess reagent를 사용하여 측정하였으며, 한방 복합 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위해 NO 생성 억제활성을 측정한 결과는 도 3과 같다.

LPS 처리군(cont)은 LPS 무처리 군(nor)에 비하여 4배에 가까운 NO 발현을 나타내었으며, 한방 복합 추출물은 6.25, 12.5, 25 μg/mL의 농도로 처리한 결과 농도가 증가할수록 각 30.3, 50.2, 69.4%의 NO 발현량이 저해됨을 확인하였다.

2. 염증 지표 단백질의 발현 저해 측정

2-1. 시약 및 기기

단백질정량 시약 RIPA buffer는 Hyclone (Logan, UT, USA)에서 구입하였으며 1차 항체 mouse anti-MITF, goat anti-tyrosinase, mouse anti-iNOS, mouse anti-COX-2와 2차항체 mouse-anti-goat IgG, rabbit-anti-mouse IgG 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX, USA)에서 구입하였다.

mRNA 측정된 시약인 Go Script^™ Reverse Transcriptase, GoTaq® Flexi DNA Polymerase는 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하여 사용하였다. 또한 사용된 측정기기는 ELISA reader (Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 분석하였다.

2-2. Western Blot 실험을 통한 염증관련 단백질 발현량 측정

한방 복합 추출물의 항염증효능을 알아보기 위해 염증매개 물질인 NO를 생성하는 iNOS, 염증성 물질은 PGE₂를합성하는COX-2 유전자 발현에 미치는 영향을 관찰하였다.

Raw 264.7 세포를 6 well plate에 1×10⁵cells/mL의 농도로 접종 및 배양하여 세포 밀도가 80% 되었을 때 무혈청 배지로 교환하고 24 h 배양한 후 LPS (1 μg/mL)를 Normal 군을 뺀 모든 well에 넣어서 자극시키고 2 h 후에 한방 복합 추출물을 농도별(6.25, 12.5, 25) μg/mL로 처리하고 24 h 배양하였다.

그 후 total RNA를 분리하기 위해 배양액을 제거하고 세포를 PBS로 3번 세척한 뒤, trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 분리하였다.

그 결과는 도 4 및 도 5에 나타내었으며, 도 4는 iNOS와 COX-2에 대한 한방 복합 추출물의 저해능을 확인하기 위하여 LPS를 1 μg/mL의 농도가 되도록 처리하고 2시간 뒤 한방 복합 추출물을 각 농도별로 처리한 후 Western blot을 통해 iNOS와 COX-2 단백질의 발현량을 확인한 결과이며, LPS로 유도된 control군 대비 25 μg/mL 농도에서 iNOS는 69%. COX-2는 73%의 높은 저해율을 나타내었으며 농도의존적으로 발현량이 감소되는 경향을 나타내었다.

또한, 한방 복합 추출물의 염증관련 유전자 발현에 미치는 영향, 더욱 상세하게는 상기 한방 복합 추출물의 항염 효능이 mRNA 단계에서 미치는 영향을 알아보기 위하여 RT-PCR을 통한 mRNA 발현량을 알아본 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, LPS를 단독 처리한 군에 비해 한방 복합 추출물을 적용하였을 때 iNOS의 mRNA 발현이 농도 의존적으로 감소되었으며 저해율이 우수함을 나타내었다.

즉, iNOS는 유의성 있게 발현량이 저해되었고, COX-2는 25 μg/mL에서 감소됨을 확인하였다.

이를 통해 한방 복합 추출물은 유전자발현 단계에서부터 염증을 저해하여 단백질 합성을 저해하는 것으로 나타났으며 기능성 항염증 소재 개발에 응용할 수 있는 우수한 소재가 될 가능성을 보였다.

< 실시예 3 > 미백 효과 실험

1. Melanin 정량

멜라닌 양은 Hosoi 등의 방법을 변형하여 사용하였다. B16F10 세포를 6 well에 5×10⁴ cells/well이 되도록 분주하여 24시간 뒤, 각각의 well에 한방 복합 추출물을 농도별(6.25, 12.5, 25) μg/mL로 48시간 동안 처리하였다.

처리 후 phosphate buffered saline (PBS; Gibco, NY, U.S.A)로 2회 세척한 후 12,000 rpm, 4°C, 30분간 원심 분리하여 상층액을 버리고 침전물에 10% dimethyl sulfoxide (DMSO; Duksan, Korea)가 첨가된 1N NaOH 용액을 150 μL 첨가하고 60°C에서 1시간 용해하였으며 405 nm에서 흡광도를 측정한 후 실험군의 멜라닌 양은 대조군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하여 나타내었다.

2. Cellular Tyrosinase 저해율 측정

Cellular tyrosinase 저해율 측정은 Choi 등의 방법을 변형하여 측정하였다. B16F10 세포를 6 well plate에 5×10⁴ cells/well이 되도록 접종하고 각 well에 한방 복합 추출물 (6.25, 12.5, 25) μg/mL을 48시간 동안 처리하였다.

처리 후 PBS로 2회 세척한 후 각 well의 세포에 lysis buffer (1% triton X-100, 0.1 M sodium phosphate buffer, 50 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, pH 6.8)를 가하였다. 얼음 위에서 세포를 용출시키고 12,000 rpm, 4°C, 30분간 원심 분리한 후 상층액만 따로 모아 효소용액으로 사용하였다. L-DOPA를 2 mg/mL 농도로 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.8)에 녹여 기질을 준비하고 기질 160 μL에 효소용액 40 μL를 가하고 37°C에서 1시간 가온하고 생성된 DOPA chrome의 양을 490 nm에서 측정한 후 억제율을 계산하였다.

3. 한방 복합 추출물의 B16F10 cell의 Cellular tyrosinase 및 melanin 생합성 저해율 측정

멜라노마 B16F10 cell 내 한방 복합 추출물의 미백활성을 분석한 결과, Cellular tyrosinase 저해활성에서 α-MSH 자극군(cont)에 대비 한방 복합 추출물을 농도별 (6.25, 12.5, 25, 50) μg/mL로 처리하였을 때 농도의존적으로 tyrosinase 활성이 저해되었으며, 더욱 상세하게는, 각 25.9, 32.6, 34.6, 36.7%의 tyrosinase 활성이 저해 되는 것을 확인하였으며, 이는 도 6을 참조한다. (α-MSH 미처리군 : nor)

반면 천연물의 미백활성을 나타내는 데이터 중 백차추출물은 25μg/mL 농도에서 18.2%, 여정자 추출물은 동일 농도에서 26.2%를 나타내어 한방 복합 추출물의 저해율이 더 우수함을 확인하였다.

Melanin 생합성에 미치는 영향을 측정한 결과 한방 복합 추출물 50 μg/mL 농도에서 멜라닌의 합성을 48% 저해하여 미백활성에 효능이 있음을 확인하였으며, 이는 도 7을 참조한다.

이러한 결과로 보아 한방 복합 추출물은 B16F10 세포내에서의 tyrosinase 활성을 저해시킴으로써 멜라닌 생합성 저해에 영향을 주는 것으로 확인되었다.

4. 한방 복합 추출물의 미백 관련 단백질 및 유전자 발현에 미치는 영향

한방 복합 추출물의 미백 활성을 알아보기 위해 melanin 합성에 관여하는 중요한 효소인 tyrosinase와 tyrosinase 발현을 촉진하는 전사인자인 MITF의 단백질 발현량을 확인하였으며, 이는 도 8을 참조한다.

tyrosinase 및 MITF 발현은 α-MSH 자극군(cont)에서 현저히 증가되는 것을 확인하였고, 한방 복합 추출물을 농도별 (6.25, 12.5, 25, 50) μg/mL로 처리하였을 때 농도 의존적으로 저해되는 것을 확인하였다.

또한, 한방 복합 추출물의 tyrosinase 및 MITF 유전자 발현에 미치는 영향을 보기 위하여 RT-PCR을 통한 mRNA 발현량을 알아본 결과에서도, α-MSH 자극군(cont)에 대비해서 한방 복합 추출물의 농도가 높아질수록 저해율이 높아짐을 보였다.

특히, 25 μg/mL 농도에서는 tyrosinase 및 MITF 유전자 발현량이 40% 정도의 높은 저해율을 보여, 한방 복합 추출물은 유전자발현 단계에서부터 MITF의 전사를 억제하여 tyrosinase 생성을 감소시켜 멜라닌생성을 저해하는 것을 확인하였으며, 이는 도 9를 참조한다.

이상으로, 상술한 실시예의 결과로 보았을 때 인삼 추출물, 상황버섯 추출물, 리기다소나무 추출물을 함유한 한방 복합 추출물은 세포독성이 없는 안전한 범위내의 농도에서 항염증과 미백 효능에 안전함을 확인하였다.

Claims

인삼 추출물, 상황버섯 추출물 및 리기다소나무 추출물이 1:1~2:0.5~2의 혼합 중량비로 포함된 한방 복합 추출물을 유효성분으로 하며, 상기 한방 복합 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 최대 농도 25 ㎍/㎖로 함유되는 것을 특징으로 하며,
상기 한방 복합 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 최대 농도 25 ㎍/㎖로 함유하여 독성이 없어 피부에 적용 시 안전성이 높은 것을 특징으로 하며,
상기 인삼 추출물, 상황버섯 추출물, 및 리기다소나무 추출물은,
인삼, 상황버섯 및 리기다소나무를 건조하고 분쇄한 다음, 상기 인삼, 상황버섯 및 리기다소나무 각각을 실온에서 24시간 이상 유기용매에 침지하되, 적어도 한번 이상 상층액과 침전물을 분리하여 추출물을 수득한 후, 감압농축 및 동결건조하여 최종 제조되는 것을 특징으로 하는
한방 복합 추출물을 함유하는 항염증 및 미백용 화장료 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 한방 복합 추출물은,
니트릭옥사이드(Nitric oxide, NO)의 생성을 저해함으로써, 항염증 효과를 부여하는 것을 특징으로 하는 한방 복합 추출물을 함유하는 항염증 및 미백용 화장료 조성물.
제 1 항, 또는 제 3 항에 있어서,
상기 한방 복합 추출물은,
니트릭옥사이드(Nitric oxide, NO)를 생성하는 iNOS(inducible nitric oxide synthase), 또는 염증성 물질인 PGE₂를 합성하는COX-2를 포함한 염증 지표 단백질의 발현을 저해함으로써, 항염증 효과를 부여하는 것을 특징으로 하는 한방 복합 추출물을 함유하는 항염증 및 미백용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 한방 복합 추출물은,
멜라닌(Melanin) 합성 및 티로시나아제(Tyrosinase) 활성을 억제함으로써, 미백 효과를 부여하는 것을 특징으로 하는 한방 복합 추출물을 함유하는 항염증 및 미백용 화장료 조성물.