KR101417310B1

KR101417310B1 - 아그배나무 가지 추출물, 분획물 또는 화합물을 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101417310B1
Application number: KR1020120085671A
Authority: KR
Inventors: 이남호; 양인정; 김상숙; 오태헌
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2012-08-06
Filing date: 2012-08-06
Publication date: 2014-07-08
Also published as: KR20140019537A

Abstract

본 발명은 아그배나무 가지 추출물, 분획물 또는 화합물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 아그배나무(Malus sieboldii) 가지 추출물은 메탄올 또는 에탄올 중에서 선택되는 어느 하나의 저급알코올로 추출한 후, 이를 극성이 다른 용매인 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 넣고 순차적으로 분획하여 제조하는 것으로 구성된다.
본 발명에 의해 항염활성 및 항균활성을 갖는 아그배나무 가지 추출물, 분획물 또는 화합물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.

Description

아그배나무 가지 추출물, 분획물 또는 화합물을 포함하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containg extract, fraction or compound of Malus sieboldii}

본 발명은 아그배나무 가지 추출물, 분획물 또는 화합물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

천연물로부터 유래한 생리활성 물질에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 질병에 대한 치료 및 예방제 또는 건강보조제로서 식물자원이 널리 이용되고 있다.

최근 고령화와 식생활의 변화에 따라 급성 염증질환과 류마티스관절염, 천식과 같은 만성 염증질환이 증가하는 추세이다. 염증 반응은 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등과 같은 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상 부위를 수복 재생하려는 기전이다. 염증을 일으키는 요인 중에서 세균에 의한 것이 가장 많으며, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 histamine, serotonine, bradykinin, prostaglandins, hydroxyeicosatetraenoic acid(HETE), leukotriene과 같은 혈관생성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증이 유발된다. 그런데 지속적인 염증반응은 도리어 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등과 같은 질환의 요인이 되기도 한다. Nitric oxide(NO)는 NO synthases(NOSs)에 의해 L-arginine이 L-citrulline으로 전환되면서 생성되는 유리기로, 체내 방어 및 신호전달, 혈관 확장 등의 2차 신호전달자로서 다향한 생리기능을 가진다. NOSs는 물리화학적 성질에 따라 3종류의 동종 효소로 분류된다. 이 중에 neuronal NOS(nNOS)와 endothelial NOS(eNOS)는 세포에 지속적으로 존재하기 때문에 constitutive NOS로 분류되며, 상대적으로 대식세포, 혈관평활근세포, 내피세포 등에서 lipopolysaccharide(LPS), interferon-γ(INF0γ) 및 tumor necrosis factor-α(TNF-α)등의 자극제들에 노출되는 경우에 발현되는 inducible NOS(iNOS)가 있다. iNOS에 의해 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다. 그리고 병리적인 원인에 의한 과도한 NO의 생성은 혈관확장, 세포독성, 조직손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타낸다.

이에, 아래와 같이 항염 및 항균과 관련해서 천연물을 이용한 연구가 진행되고 있다.

한국등록특허공보 제10-0036317호(항염증성 조성물)에는 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증성 조성물에 대하여 개시되어 있다.

한국등록특허공보 제10-0084118호(한약재 복합 추출물을 포함하는 함염, 항산화 및 미백, 항균효과를 지닌 기능성 화장품 조성물)에는, 우수한 항염, 항산화 및 미백, 항균 효과를 갖는 생약재 성분인 황금, 형개, 연자육, 사삼, 상백피 복합 추출물에 대해 개시되어 있다.

상기와 같이 여러 식물에 대한 연구가 시행되고 있으나, 아직까지 아그배나무를 이용한 항염, 항균 활성을 지닌 기능성 화장료 조성물에 대한 연구는 시행된 바가 없다.

아그배나무(Malus sieboldii)는 장미과 사과나무속에 속하는 나무이다. 분류학적으로는 사과나무속에 속하니 배나무와 거리가 있지만, 열매가 달린 모습이 돌배나무와 비슷하고, 아기배처럼 작은 모양 때문에 아그배나무라는 이름이 생겼다고 한다. 원산지는 한국, 일본으로 한국에서는 황해도 이남의 산이나 강가에서 자란다. 산지나 냇가에서 자라며 가지가 많이 갈라지고 어린 가지에 털이 난다. 잎은 어긋나고 타원형이나 달걀 모양이며 가장자리에 날카로운 톱니가 있다. 긴 가지에 달린 잎은 넓은 달걀 모양이며 3-5개로 갈라지고, 밑은 둥글며 끝이 뾰족하다. 양면에 털이 나나 겉면의 것은 차차 없어진다. 잎자루는 길이 1-1.2 cm이다. 꽃은 5월 중순에 연한 붉은색이나 흰색으로 피고 가지 끝에 4-5개씩 산형 꽃차례로 달린다. 꽃 지름 3 cm 안팎이고 길이 3cm 정도의 작은 꽃자로가 있다. 꽃받침의 통 부분은 길이 약 4 mm이고 꽃받침조각은 길이 약 6 mm이며 양면에 털이 난다. 수술은 20개로서 길이 6-7 mm이고 꽃밥은 노란색이다. 암술대는 3-4개이고 길이 약 10mm이다. 열매는 이과로서 둥글고 지름 6-8 mm이며 붉은색 또는 노란색을 띤 붉은색으로 익는다. 종자는 타원 모양이고 길이 약 4 mm이다. 번식은 종자나 접붙이기로 한다. 꽃과 열매가 아름답기 때문에 관상용으로 심고, 사과나무를 증식할 때에 대목으로 사용한다. 옛날에는 나무껍질을 염료로 사용하였다.

이러한 아그배나무를 본 발명에서는 메탄올 또는 에탄올 중에서 선택되는 어느 하나의 저급알코올로 추출하여 그 효능을 확인한 결과, 항염 및 항균활성을 확인하였다.

이러한 우수한 활성을 갖는 아그배나무 추출물, 분획물 또는 화합물은 기능성 화장품 원료로의 응용이 가능하며, 천연식물을 사용함으로써 합성원료들로 야기되는 알러지 및 부작용, 안전성 및 안정성 면을 해결할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허공보 제10-0036317호 한국등록특허공보 제10-0084118호

본 발명은 NO 생성 억제 활성, IL-6 생성 억제 활성 및 또는 TNF-α 생성 억제 활성을 갖는 아그배나무(Malus sieboldii) 추출물, 분획물 또는 화합물을 포함하여 항염증성 및 항균 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 3-O-α- L-arabinofuranosyl -8 -methoxyquercetin, Phlorizin, Avicularin, Chrysin -7-O-β-D-glucopyranoside, Taraxerol, Daucosterol 및 Quercetin-4'-O-glucopyranoside중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 3-O-α- L-arabinofuranosyl -8 -methoxyquercetin, Phlorizin, Avicularin, Chrysin -7-O-β-D-glucopyranoside, Taraxerol, Daucosterol 및 Quercetin-4'-O-glucopyranoside중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 약학용 조성물을 제공한다.

본 발명의 아그배나무(Malus sieboldii) 추출물, 분획물 또는 화합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 항염 및 항균활성효과를 갖는다.

도 1은 NO 생성 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2은 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 3에 대한 NO 생성 억제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4은 실시예 3에 대한 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 3에 대한 IL-6 의 억제율을 나타낸 그래프이다.
도 6는 실시예 3에 대한 IL-1 β의 억제율을 나타낸 그래프이다.
도 7는 본 발명인 아그배나무 추출물에서 분리된 활성 화합물의 구조를 나타낸 도면이다.
도 8은 도 7의 분리된 활성 화합물에서 NO 생성 억제 활성을 나타내는 그래프이다.
도 9은 도 7의 분리된 활성 화합물의 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 도 7의 분리된 활성 화합물 중 compound 2, 5, 6, 8번에 대한 IL-6 의 억제율을 나타낸 그래프이다.
도 11은 도 7의 분리된 활성 화합물 중 compound 2, 5, 6, 8번에 대한 IL-1β 의 억제율을 나타낸 그래프이다.
도 12은 본 발명인 아그배나무 추출물에서 분리된 활성 화합물의 구조를 나타낸 도면이다.

상기 화장료 조성물은 아그배나무(Malus sieboldii) 추출물일 수 있다.

또한 상기 화장료 조성물은 상기 화합물을 화장료 조성물 전체중량 대비 0.00001 내지 10.0 중량 % 포함될 수 있으며, 0.001 내지 10.0 중량 % 또는 0.1 ~ 10.0 중량 % 포함될 수 있다.

상기 추출물, 분획물 또는 화합물의 함량이 0.0001 중량 % 미만인 경우에는 항염활성 및 항균활성 효과가 나타나지 않으며, 10 중량 % 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안정 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

상기 화장료 조성물은 항염 및 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.

상기 화장료 조성물의 항염효과를 측정하기 위하여 RAW 264.7 세포배양 시스템을 이용한 NO(Nitric oxide) 저해효과를 측정한 결과, 비양나무 에틸아세테이트 분획추출물에서 높은 NO 저해율을 나타냄을 확인하였다. 여기서 NO(Nitric oxide)는 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 물질이다.

또한 염증 매개 인자인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 정량 실험을 통하여 항염 효과를 확인하였다.

상기 화장료 조성물의 항균활성을 알아보기 위해 아그배나무 가지 추출물의 P. acnes의 항균활성 측정실험(투명 존(clear zone)의 직경 측정) 및 아그배나무 가지 추출물의 S, epidermidis의 항균활성 측정실험(투명 존(clear zone)의 직경 측정)을 실행하여 항균활성을 확인하였다.

일 실시예에서 본 발명은 아그배나무 가지를 메탄올 또는 에탄올 중에서 선택되는 어느 하나의 저급알코올로 추출한 후, 이를 극성이 다른 용매인 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 넣고 순차적으로 분획하여 제조하는 아그배나무 추출물의 제조방법을 제공한다.

아그배나무 가지 중량의 약 20 배 부피의 용매를 사용하여 에탄올추출 등의 방법에 의해 3회 반복 추출하고, 여과한 후 이 여액을 감압 건조하여 분말형태로 제조하여 사용할 수 있다.

상기 분말 형태로 제조된 추출물을 극성이 다른 용매인 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 넣고 순차적으로 분획하여 생성된 분획추출물들을 감압 건조하여 분말형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 아그배나무 추출물, 분획물 또는 화합물은 항염증 및 항균활성이 탁월하여 식품첨가제, 음료조성물, 기능성 건강식품, 화장료조성물 등에 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 보다 상세하게는 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 파운데이션, 젤, 연고 또는 스프레이의 제형으로 제조될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 본 발명의 아그배나무 가지 에탄올추출물 제조

아그배나무(Malus sieboldii)는 제주 한라수목원에서 제공받아 준비하였다.

준비한 아그배나무 가지를 건조시킨 후 건조된 아그배나무 가지 1 kg을 분쇄한 후, 이를 70% 에탄올 20 L에 넣고 실온에서 24시간 침출하였다.

상기 침출시킨 시료를 감압 흡입 여과기를 이용하여 여액만 취하였으며, 이와 같은 방법으로 분리한 잔사에 대하여 동일한 조건으로 2회 더 반복 실시하였다.

이렇게 여과하여 얻어진 여액은 40 ℃ 이하의 수욕상에서 진공농축기(rotary vaccum evaporator)로 농축하여 아그배나무 가지 에탄올 추출물 147.4 g을 얻어 준비하였다.

< 실시예 2> 본 발명의 아그배나무 가지 헥산분획추출물 제조

실시예 1에서 제조한 아그배나무(Malus sieboldii) 가지 추출물을 물 1 L에 현탁시키고 극성순서에 따라 헥산(n-hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(n-butanol), 물(water)을 넣고 순차적으로 분획하여 생성된 분획추출물 중 헥산 분획추출물을 감압 건조하여 분말형태인 아그배나무 가지 헥산분획추출물을 준비하였다.

< 실시예 3> 본 발명의 아그배나무 에틸아세테이트 분획추출물 제조

실시예 2와 같은 방법으로 제조하되, 분획추출물 중 에틸아세테이트 분획추출물을 감압 건조하여 분말형태인 아그배나무 에틸아세테이트 분획추출물을 준비하였다.

< 실시예 4> 본 발명의 아그배나무 부탄올 분획추출물 제조

실시예 2와 같은 방법으로 제조하되, 분획추출물 중 부탄올 분획추출물을 감압 건조하여 분말형태인 아그배나무 부탄올 분획추출물을 준비하였다.

< 실시예 5> 본 발명의 아그배나무 물 분획추출물 제조

실시예 2와 같은 방법으로 제조하되, 분획추출물 중 물 분획추출물을 감압 건조하여 분말형태인 아그배나무 물 분획추출물을 준비하였다.

< 실시예 6> 아그배나무 추출물이 함유된 화장료 조성물의 제조

통상적인 화장료 조성물에 화장료 조성물 전체 중량 대비 상기의 실시예 3의 화장료 조성물 10 중량 % 첨가하여 사용하였다.

< 실시예 7> 본 발명인 아그배나무 가지 추출물의 항염 활성 평가

1. 실험방법

(1) 세포 배양 및 시약

Murine macrophage cell line 인 RAW264.7 세포를 한국 세포주 은행으로부터 분양 받아 100units/mL penicillin-streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃ 5% CO₂ 항온기(incubator)에서 배양하였으며, 2-3에 한번씩 계대 배양을 실시하였다.

(2) Nitric oxide(NO) 생성 억제 활성 측정

RAW264.7 세포(3×10⁵Cells/mL)를 18시간 전 배양 후, 실시예의 각 시료(100 μg/mL)와 LPS(1μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하였고, 생성된 NO는 Griess reagent을 이용하여 세포 배양액 중 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하였다. 세포 배양 상층액 100μL와 Griess 시약(1%(w/v) sulfanilamide, 0.1%(w/v) naphtylehtylenediamine in 2.5%(v/v) phosphoric acid)을 동량 혼합하여 10분간 실온 암실에서 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 sodium nitrite(NaNO₂)를 serial dilution하여 얻었다(10-100μM).

(3) 세포독성 평가

세포 독성은 MTT assay를 이용하여 실험하였다. 생존하면서 대사가 왕성한 세포는, 세포 내 mitochondria의 탈수소효소 작용에 의하여 수용성의 노란색 MTT [3-(4,5-dimethylthiaxol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide]를 환원시켜 자주색을 띠는 불용성의 formazan을 형성한다(Gerlier et al., 1986; Liu 1999). RAW 264.7 세포(3×10⁵Cells/mL)에 각 시료(100 μg/mL)와 LPS(1μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후, MTT 용액 (5mg/mL) 100 μL를 첨가하여 3시간 동안 반응시켰다. 상층액을 완전히 제거하고 dimethylsulfoxied(DMSO)를 1mL를 가하여 침전물을 완전히 용해시킨 후, ELISA reader를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 독성 정도를 평가하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과 도 1 및 도 2와 같이 본 발명의 70% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 추출물에서 세포 독성이 거의 없이 NO(Nitric oxide) 생성 억제 활성이 나타냄을 알 수 있었다.

즉, control과 비교하여 보면 실시예 1의 추출물에서는 54.03% 저해율을 나타냈으며, 실시예 3의 추출물(에틸아세테이트 분획추출물)에서는 47.65% 로 높은 효과를 나타내었다.

< 실시예 8> 본 발명인 아그배나무 가지 에틸아세테이트 분획추출물의 농도별 항염 활성 평가

1. 실험방법

실시예 7과 같은 방법으로 실시하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과 도 3, 도 4와 같이 에틸아세테이트 분획추출물을 농도별로 처리한 결과 세포 독성 거의 없이 농도 의존적으로 NO 생성량이 줄어듦을 확인하였다.

< 실시예 9> 본 발명인 아그배나무 가지 에틸아세테이트 분획추출물의 농도별 염증 매개 인자인 IL -6 정량

1. 실험방법

Murine macrophage cell line인 RAW264.7 세포(5×10⁵Cells/mL)를 18시간 전 배양하고 상기 각 시료(100 μg/mL)를 LPS(1 μg/mL)와 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 배양 배지를 원심분리하여 얻어진 상층액의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 함량을 측정하였다. 정량은 ELISA kit를 이용하여 정량하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과 도 5에 나타나 있듯이, 에틸아세테이트 분획추출물을 농도별로 처리한 결과, 농도 의존적으로 IL-6 생성량이 줄어듦을 확인하였다.

< 실시예 10> 본 발명인 아그배나무 가지 에틸아세테이트 분획추출물의 농도별 염증 매개 인자인 IL -1β의 정량

1. 실험방법

실시예 9와 같은 방법으로 실시하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과 도 6에 나타나 있듯이, 에틸아세테이트 분획추출물을 농도별로 처리한 결과, 농도 의존적으로 IL-1β 생성량이 줄어듦을 확인하였다.

< 실시예 11> 본 발명인 아그배나무 가지 추출물의 P. acnes 의 항균활성 측정실험-투명 존( clear zone)의 직경 측정

1. 실험방법

먼저 Propionibacterium acnes는 GAM배지에 37℃ 온도 조건에서 48시간 초기 배양하였다. 초기 배양 후 상기 각 배양액을 1.5×10⁸ CFU/mL 적정 균수로 평판배지(0.8% agar함유)에 희석하여 패트리디쉬로 분주하여 굳혔다. 그 다음에 각 실시예의 추출물 20 μL를 적신 직경 0.8 mm의 디스크를 배지 표면에 올려놓고, 37℃에서 각각 48시간 배양하였다. 항미생물 효과는 각 균주의 생육이 억제된 투명 존의 직경을 측정함으로써 확인하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과를 아래 표 1에 나타내었다.

	Hex 추출물	Hex추출물 중 CHCl₃에 녹는 층	Hex추출물 중EtOH에 녹는 층
	clear zone(mm)	clear zone(mm)	clear zone(mm)
P. acnes CCARM 0081	12	12	12
P. acnes CCARM 9009	13	12	12
P. acnes CCARM 9010	12	12	11

표 1은 P. acnes에 대한 실시예 2의 추출물(헥산 분획추출물)의 투명 존의 직경(mm)을 나타낸 것으로 Hex추출물과 Hex 추출물(실시예 2의 추출물)을 CHCl₃과 EtOH로 재분획하여 각각 따로 처리하였을 때의 결과이다.

< 실시예 12> 본 발명인 아그배나무 가지 추출물의 S, epidermidis 의 항균활성 측정실험

1. 실험방법

Staphylococus epidermedis 는 TSA배지에 37℃ 온도 조건에서 24시간 초기 배양하였다.

초기 배양 후 상기 각 배양액을 1.5×10⁸ CFU/mL 적정 균수로 평판배지(0.8% agar함유)에 희석하여 패트리디쉬로 분주하여 굳혔다. 그 다음에 각 실시예의 추출물 20 μL를 적신 직경 0.8 mm의 디스크를 배지 표면에 올려놓고, 37℃에서 각각 24시간 배양하였다. 항미생물 효과는 각 균주의 생육이 억제된 투명 존의 직경을 측정함으로써 확인하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과는 아래 표 2에 나타내었다.

	Hex 추출물	Hex추출물 중 CHCl₃에 녹는 층	Hex추출물 중EtOH에 녹는 층
	clear zone(mm)	clear zone(mm)	clear zone(mm)
S. epidermidis CCARM 3709	14	19	16
S. epidermidis CCARM 3710	18	20	18
S. epidermidis CCARM 3711	20	22	22

표2는 S. epidermidis 에 대한 실시예 2의 추출물(헥산 분획추출물)의 투명 존의 직경(mm)을 나타낸 것으로 Hex추출물과 Hex 추출물(실시예 2의 추출물)을 CHCl₃과 EtOH로 재분획하여 각각 따로 처리하였을 때의 결과이다.

< 실시예 13> 본 발명인 아그배나무 가지 추출물의 용매분획물로부터 화합물의 분리 및 구조 동정

상기 실시예 7, 8, 9, 10의 내용을 토대로 추출물의 활성원인이 되는 성분의 분리를 위해 에틸아세테이트 층(실시예 3 추출물)을 선택하였다.

에틸아세테이트 층을 VLC와 Silica gel CC, Sephadex LH-20 CC를 사용하여 활성성분인 8개의 화합물을 분리하였다.

분리된 화합물의 구조는 NMR data를 이용하였으며, 문헌치와 비교하여 동정하였다.

1. 실험방법

실시예 3의 에틸아세테이트 분획추출물의 일부인 3.92 g을 Hex-EtOAc-MeOH gradient 용매로 VLC를 하여 37개의 fraction을 얻었다(Fr. V1~V37).

그 중, Fr. V6(8.1 mg)를 용해도 차이에 의해 2개의 fraction으로 나누었으면, 이때 메탄올에 녹지 않는 부분에서 화합물 1(3 mg)를 얻었다.

Fr. V15(104.0 mg)를 CHCl₃/MeOH(3/1)의 조건으로 Silica gel CC를 하여 화합물 2(18.8 mg)을 얻었다.

Fr. V16~18(187.3 mg)은 화합물 2로 구조 동정하였다.

또한, Fr. V23(507.9 mg)을 CHCl₃/EtOAc/MeOH(2/2/1)의 조건으로 Sephadex LH-20 CC를 하여 11개의 fraction으로 나누고, 그 중 Fr. V23-4를 화합물 3(24.0 mg)로 구조 동정하였으며, V23-7과V23-8를 합쳐(29.4 mg) CHCl₃/EtOAc/MeOH/H₂O(2/1/1/0.2)의 조건으로 Sephadex LH-20 CC를 하여 화합물 4(8.9 mg)를 얻었으며, 화합물 5 (1.2 mg)를 얻었다.

V23-6(93.9 mg)를 CHCl₃/EtOAc/MeOH/H₂O(2/1/1/0.2)의 조건으로 Sephadex LH-20 CC를 하여 화합물 4 (28.5 mg)를 더 얻었다.

Fr. V24(1447.3 mg)을 용해도 차이에 의해 2개의 fraction으로 나누었으면, 이때 메탄올에 녹지 않는 부분에서 화합물 6을 얻었다.

Fr. V24 중 메탄올에 녹는 층 V24-M(1299.7mg)을 VLC하여 7개의 fraction으로 나누고, 그 중 Fr. V24-M-2(33.2 mg)의 메탄올에 녹지 않는 부분에서 화합물 7(4 mg)을 얻었다.

그리고 Fr. V24-M-5(302.8 mg)을 용해도 차이에 의해 2개의 fraction으로 나누었으면, 이 때 메탄올에 녹는 부분에서 화합물 8(70.5 mg)을 얻었다.

이상과 같이 분리된 8개의 화합물은 도 7에 나타내었다.

2. 실험결과

화합물 1은 문헌(M.Rowshanul Habib, Farjana Nikkon, Matiar Rahman (2007). Isolation of Stigmasterol and β-sitosterol from Methanolic Extract of Root Bark of Calotropis gigantea(Linn). 10: 4174-4176)과 비교하여 β-sitosterol으로 동정하였다.

화합물 2는 문헌(Qudsia Kanwal, Ishtiaq Hussain, Hamid Latif Siddiqui, Arshad Javaid (2011). Antimicrobial activity acreenging of isolated flavonoids from Azadirachta indica leaves. 76: 375-384)과 비교하여 epi-catechin으로 동정하였다.

화합물 3은 문헌(Orietta Servettaz, M. Laura Colombo, Maria de Bernardi, Elena Uberti, Giovanni Vidari, Paola Vita-Finzi (1984). Flavonol Glycosides From Dryas Octopetala. 47: 809-814)과 비교하여 3-O-α-L-arabinofuranosyl-8-methoxyquercetin로 동정하였다.

화합물 4는 문헌(Petra Hilt, Andreas Schieber, Caner Yildirim, Gabi Arnold, Iris Klaiber, Jurgen Conrad, Uwe Beifuss, Reinhold Carle (2003). Detection of Phloricizin in strawberries (Fragaria x ananassa Duch.) by HPLC-PDA-MS.MS and NMR Spectroscopy. 51:2896-2899)과 비교하여 Phlorizin로 동정하였다.

화합물 5의 NMR data를 조사한 결과 Quercetin의 유도체로, ¹H NMR에서 δ_H 3 ~ 4 의 피크들과 ¹³C NMR에서 δ_C 60 ~ 109 사이의 5개의 피크로 보아 Taxifolin의 3번 위치에 5탄당이 결합된 것으로 예상되었다. 따라서 화합물 5를 문헌(Sang Min Kim, Kyungsu Kang, Cun Hye Jho, Yu-Jin Jung, Chu Won Nho, Byung-Hun Um, Cheol-Ho(2011). Hepatoprotective Effect of Flavonoid Glycosides from Lespedeza cuneata against Oxidative Stress Induced by tert-Butyl Hyperoxide. 25: 1011-1017)과 비교하여 Quercetin- 3-O-α-L-arabinofuranoside로 동정하였으며, 관용명으로 Avicularin이라 불리는 화합물임을 확인하였다.

화합물 6은 NMR data를 조사한 결과 Chrysin의 유도체로, ¹H NMR에서 δ_H 3 ~ 4 의 피크들과 ¹³C NMR에서 δ_C 60 ~ 102 사이의 6개의 피크로 보아 Chrysin의 7 위치에 6탄당이 결합된 것으로 예상되었다. 따라서 화합물 6을 문헌(Hao Liu, Yan Mou, Jianglin Zhao, Jihus Wang, Ligang Zhou, Mingan Wang, Daoquan Wang, Jianguo Han, Zhu Yu, Fuyu Yang (2010). Flanonoids from Halostachys caspica and Their Antimicrobial and Antioxidant Activities. 15: 7933-7945)과 비교하여 Chrysin- 7-O-β-D-glucopyranoside로 동정하였다.

화합물 7은 문헌(Sanghyun Lee, Kyoung Soon Kim, Ji Myun Jang, Youmie Park, Yang Bae Kim and Bak-Kwang Kim (2002). Phytochemical Constituents from the Herba of Artemisia apiacea). 25:285-288)과 비교하여 Daucosterol로 동정하였다.

화합물 8은 NMR data를 조사한 결과 Quercetin의 유도체로, ¹H NMR에서 δ_H 3 ~ 4 의 피크들과 ¹³C NMR에서 δ_C 60 ~ 102 사이의 6개의 피크로 보아 Quercetin에 6탄당이 결합된 것으로 예상되었다. 화합물 8을 문헌(Torgils Fossen, Atle T. Pedersen and Qyvind M. Andersen (1998). FLAVONOIDS FROM RED ONION(ALLIUM CEPA). 47:281-285)과 비교하여 Quercetin-4'-O-glucopyranoside로 동정하였다.

< 실시예 14> 본 발명인 아그배나무 가지 추출물에서 분리된 화합물에 대한 NO 생성 억제 활성실험

1. 실험방법

실시예 7과 같은 방법으로 실시하였다.

2. 실험결과

그 결과 항염활성 실험에서는 도 8과 같이 실험한 모든 화합물 가운데 화합물 1, 2, 5, 6 및 8을 control과 대비하였을 때 NO 저해 활성을 가졌음을 알 수 있었다. 나머지 화합물은 NO 저해 활성을 거의 보이지 않았다.

NO 저해 활성을 보였던 화합물 1, 2, 5, 6, 8 은 도 9에 나타나 있듯이, 세포 독성은 거의 보이지 않았다.

< 실시예 15> 본 발명인 아그배나무 가지 추출물에서 분리된 화합물에 대한 염증 매개 인자인 IL -6 정량

1. 실험방법

실시예 9와 같은 방법으로 실시하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과 도 10 에 나타나 있듯이, NO 저해 활성을 보인 화합물 2, 5, 6, 8을 처리한 결과, IL-6 생성량이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 16> 본 발명인 아그배나무 가지 추출물에서 분리된 화합물에 대한 염증 매개 인자인 IL -1β의 정량

1. 실험방법

실시예 9와 같은 방법으로 실시하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과 도 11 에 나타나 있듯이, NO 저해 활성을 보인 화합물 2, 5, 6, 8을 처리한 결과, IL-1β 생성량이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 17>본 발명인 아그배나무 가지 추출물의 용매분획물로부터 화합물의 분리 및 구조 동정

상기 실시예 11, 12의 내용을 토대로 추출물의 활성원인이 되는 성분의 분리를 위해 헥산 층(실시예 2 추출물)을 선택하였다.

헥산 층을 VLC와 Silica gel CC을 사용하여 활성성분인 3개의 화합물을 분리하였다.

1. 실험방법

실시예 2의 헥산 분획추출물의 일부인 2.21 g중 용해도 차이에 의해 2개의 fraction으로 나누었으며, 이때 에탄올에 녹는 fraction을 Hex-EtOAc gradient 용매로 VLC를 하여 13개의 fraction을 얻었다(Fr. V1~V13).

그 중 Fr. V4(85.5 mg)를 용해도 차이에 의해 2개의 fraction으로 나누었으면, 이때 에틸아세테이트에 녹지 않는 부분에서 화합물 1(16.6 mg)를 얻었으며, 에틸아세테이트에 녹는 부분은 Hex/EtOAc(9/1) 의 용매 조건으로 Silica gel CC을 실시하여 화합물 2(19.7 mg)을 얻었다.

그리고 Fr. V3(84.0 mg)를 용해도 차이에 의해 2개의 fraction으로 나누었으며, 이 때 에틸아세테이트에 녹는 부분(71.5 mg)을 Hex/EtOAc(13/1)의 용매 조건으로 Silica gel CC을 실시하여 화합물 3(10.9 mg)을 얻었다.

2. 실험결과

이상과 같이 분리된 3개의 화합물은 도 10에 나타내었다.

화합물 9은 문헌(Jae Hyeok Lee, Ki Taek Lee, Jae Heon Yang, Nam In Baek and Dae Keun Kim (2004). Acetylcholinesterase Inhibitors from the Twigs of Vaccinium oldhami Miquel. 27: 53-56)과 비교하여 Taraxerol으로 동정하였다.

화합물 10은 문헌(Yunus Ahmed, Md. Hossain Sohrab, Sharif M. Al-Reza, Faqir Shahidulla Tareq, Choudhury M. Hasan, M.A. Sattar (2010). Antimicrobial and cytotoxic constituents from of Sapium baccatum. 48:549-552)과 비교하여 Lupeol으로 구조 동정하였다.

화합물 11은 문헌(Sungran Huh, Young-Soo Kim, Eunsun Jung, Jihee Lim, Kwang Sun Jung, Myeong-Ok Kim, Jongsung Lee and Deokhoon Park (2010). Melanogenesis Inhibitory Effect of Fatty Acid Alkyl Esters Isolated from Oxalis triangularis. 33:1242-1245)과 비교하여 Ethyl Linoleate으로 동정하였다.

Claims

아그배나무(Malus sieboldii) 에탄올 추출물의 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 분획을 포함하는 항염 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 에틸 아세테이트 분획은 β-시토스테롤(β-sitosterol), epi-카테킨(catechin), 3-O-α-L-아라비노푸라노실(arabinofuranosyl)-8-메톡시퀘르세틴(methoxyquercetin), 플로리진(Phlorizin), 퀘르세틴(Quercetin)-4'-O-글루코피라노사이드(glucopyranoside) (Avicularin), 크리신(Chrysin)-7-O-β-D-글루코피라노사이드(glucopyranoside), 다우코스테롤(Daucosterol) 및 퀘르세틴(Quercetin)-4'-O-글루코피라노사이드(glucopyranoside)를 함유하는 것을 특징으로 하는 항염 조성물.
아그배나무(Malus sieboldii) 에탄올 추출물의 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 분획 유래 epi-카테킨(catechin), 퀘르세틴(Quercetin)-4'-O-글루코피라노사이드(glucopyranoside) (Avicularin), 크리신(Chrysin)-7-O-β-D-글루코피라노사이드(glucopyranoside) 및 퀘르세틴(Quercetin)-4'-O-글루코피라노사이드(glucopyranoside)를 유효성분으로 함유하는 항염 조성물.
아그배나무(Malus sieboldii) 에탄올 추출물의 n-헥산(n-hexane) 분획을 포함하는 항균 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 헥산 분획은 타락세롤(Taraxerol), 루페올(Lupeol) 및 에틸 리놀레에이트(Ethyl Linoleate)를 함유하는 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
제 1항의 항염 조성물 또는 제 4항의 항균 조성물을 함유하는 화장료 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 항염 조성물 또는 항균 조성물이 화장료 조성물 전체중량 대비 0.0001 내지 10.0 중량 % 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.