KR102216846B1 - 신규한 하이드록시페닐아세트산 유도체를 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항균용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 하이드록시페닐아세트산 유도체를 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항균용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 4-하이드록시페닐아세트산과 트리글리세라이드를 리파아제 매개 효소적 에스테르 교환반응을 통해 제조된 페놀성 지질의 하이드록시페닐아세트산에 관한 것이다. 본 발명의 페놀성 지질인 하이드록시페닐아세트산 유도체는 소수성 매질에서의 용해도가 우수할 뿐만 아니라 항산화 및 항균 활성이 증가되어, 식품, 화장료 및 의약품 산업에 매우 유용하다.

Description

신규한 하이드록시페닐아세트산 유도체를 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항균용 조성물 {Composition for Antioxidant or Antibacterial Containing Novel Hydroxyphenylacetic Acid Derivatives}

본 발명은 신규 페놀성 지질인 하이드록시페닐아세트산 유도체를 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항균용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 4-하이드록시페닐아세트산과 트리글리세라이드를 리파아제 매개 에스테르 교환반응시켜 항산화 및 항균 활성이 우수한 하이드록시페닐아세트산 유도체의 제조 및 이의 용도에 관한 것이다.

최근 페놀성 화합물은 산화 방지제로 인해 주목을 받고 있다 (Matilla P et al., J Agric Food Chem 54:7193-7199, 2006; Shahidi F et al., J Func Foods 18:820-897, 2015). 페놀성 화합물의 주요 하위 클래스인 페놀산은 방향족 고리 및 적어도 하나의 유기 카르복시산을 포함하는 페놀이다 (Goleniowski M et al., Springer, Berlin, 1951-.1973, 2013). 페놀산의 산화 방지제 잠재력은 방향족 고리상의 페놀 모이어티 (하이드록실) 치환체의 반응성에 의해 주어진다 (Kim YJ et al., Biol Pharm Bull 30:1052-1055, 2007). 모든 식물 및 식물 유래 식품에는 많은 페놀성 화합물이 포함되어 있다. 일부 페놀성 화합물은 페놀산 형태인데, 그 중 하나가 4-하이드록시페닐아세트산 (HPA)이다. 이전의 연구들은 HPA 아미드를 합성하여 항산화 작용을 평가하였다. 이 화합물은 라디칼 소거 작용을 나타내며, 항산화제로서의 가능성을 가지고 있다 (Jung YS et al., Bioorg Med Chem Lett 12:2599-2602, 2002). 그러나, 많은 페놀산이 친유성 매질에서의 용해도를 감소시키는 친수성을 가지며, 지방 및 오일 시스템에서 항산화 활성의 효과가 감소하기 때문에 페놀산의 사용에 대한 많은 제한이 있다 (Stamatis H et al., J Mol Cat B Enzyme 11:323-328, 2001). 따라서, 이러한 한계를 극복하고 소수성 매질에서 페놀산의 생리활성 특성을 유지하는 것이 중요하다.

멘헤이든유 (Menhaden oil)는 미국의 풍부한 어류에서 추출한 오일이다. 어유는 에이코사펜타엔산 (EPA)와 도코사헥사노익산 (DHA)과 같은 오메가-3 고도불포화지방산 (PUFAs)의 양이 풍부하다. 멘헤이든유의 EPA와 DHA 양은 약 14-30% 이다 (Yamaguchi I et al., J Food Lipids 11:65-73, 2004). PUFA는 광범위한 박테리아에 대해 항균 작용을 하는 것으로 알려져 있으며 (Desbois AP et al., Mar Drugs 11:4544-4557, 2013; Huang CB et al., Mol Oral Microbiol 25:75-80, 2010), 이는 식중독 또는 식품 부패 박테리아의 성장을 막기 위해 식품 업계에서 요구되는 중요한 특성이다. 그러나, 최근 연구에 따르면 PUFA는 지질 산화에 대한 민감도가 높기 때문에 실제적인 사용이 제한되고 있다 (Tao L et al., Adv Food Tech Nutri Sci 1:135-142, 2015).

PUFAs를 포함하는 식품에서 자동 산화를 예방하거나 지연시키는 한 가지 방법은 PUFA의 안정화를 향상시키기 위해 페놀산과 같은 항산화 화합물을 첨가제로 첨가하는 것이다 (Lee S et al., Meat Sci 72:18-24, 2006). 트리글리세라이드 또는 지방알콜을 사용한 페놀산의 효소적 에스테르 교환 반응은 광범위한 산업적 적용을 위해 소수성 매질에서의 가용화 및 항산화 특성을 증가시킬 수 있다 (Karboune S et al., J Biotechnol 119:281-290, 2005; Natalia A et al., Mol Cat B Enzym 133:475-481, 2016; Stamatis H et al., J Mol Catal B Enzyme 11:323-328, 2001). 트리글리세라이드와 페놀 화합물을 컨쥬게이트 시키는 것은 화학적으로 또는 효소적으로 수행할 수 있다. 그러나, 기질의 변성, 기질 특이성 및 위치 선택성을 최소화하기 위해 지방 분해 에스테르 교환 반응의 사용이 바람직하다 (Kirk O et al., Org Proc Res Dev 6:446-451, 2002). 또한, 유기 매질에서의 효소 적 합성은 소수성 기질의 용해도를 증가시키고, 추가로 반응 생성물의 단순한 회수를 가능하게 할 수 있다 (Stevenson DE et al., Enzyme Microbiol Technol 40:1078-1086, 2007).

이에, 본 발명자들은 본래의 생리활성 특성을 안정하게 유지하면서도 용해도가 우수하여 광범위한 산업적 적용이 가능한 페놀산을 제조하고자 예의 노력한 결과, CalB를 매개로 4-하이드록시페닐아세트산과 트리올레인 또는 어유의 효소적 에스테르 교환반응을 통해 신규한 페놀성 지질인 하이드록시페닐아세트산 유도체를 제조하여, 소수성 매질에서의 용해도가 우수하고 항산화 및 항균 활성을 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 소수성 매질에서도 용해도 및 항산화 활성이 우수하고, 항균 활성을 나타내므로 식품 및 화장품 산업에 유용한 하기 화학식 I 또는 화학식 II로 표시되는 하이드록시페닐아세트산 (Hydroxyphenylacetic Acid) 유도체 화합물을 제공하는데 있다.

[화학식 I]

[화학식 II]

본 발명의 다른 목적은, 상기 화학식 I 또는 화학식 II로 표시되는 하이드록시페닐아세트산 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항균 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 4-하이드록시페닐아세트산과 트리올레인 (triolein) 또는 어유 (fish-oil)를 에스테르 교환반응시키는 단계를 포함하는 상기 화학식 I 또는 화학식 II로 표시되는 하이드록시페닐아세트산 유도체의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 하이드록시페닐아세트산 (Hydroxyphenylacetic Acid) 유도체 화합물을 제공한다.

[화학식 I]

본 발명은 또한, 하기 화학식 II로 표시되는 하이드록시페닐아세트산 (Hydroxyphenylacetic Acid) 유도체 화합물을 제공한다.

[화학식 II]

본 발명은 또한, 상기 화학식 I 또는 화학식 II로 표시되는 하이드록시페닐아세트산 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 화학식 I 또는 화학식 II로 표시되는 하이드록시페닐아세트산 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 항균 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 4-하이드록시페닐아세트산과 트리올레인 (triolein)을 에스테르 교환반응시키는 단계를 포함하는 상기 화학식 I로 표시되는 하이드록시페닐아세트산 유도체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 4-하이드록시페닐아세트산과 어유 (fish-oil)를 에스테르 교환반응시키는 단계를 포함하는 상기 화학식 II로 표시되는의 하이드록시페닐아세트산 유도체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 4-하이드록시페닐아세트산과 트리글리세라이드의 효소적 에스테르 교환반응을 통해 제조된 패놀성 지질의 하이드록시페닐아세트산은 소수성 매질에서의 용해도가 우수할 뿐만 아니라 항산화 및 항균 활성이 증가되어, 식품, 화장료 및 의약품 산업에 매우 유용하다.

도 1은 HPA와 트리올레인 (반응 I) 또는 멘헤이든 어유 (Menhaden fish oil) (반응 II)를 사용한 CalB 리파아제-매개 에스테르 교환반응을 나타낸 것이다. HPA: 4-hydroxyphenylacetic acid; TON: 트리올레인; HPA-DON: HPA-디올레인; FO: 멘헤이든 어유; HPA-dFO: HPA-어유 디글리세라이드; CalB: Candida antarctica lipase B
도 2는 기질 농도, 효소량 및 반응시간이 전환 수율에 미치는 영향을 보여주는 것이다. (a) 40mM HPA 및 다양한 농도 (40-240mM)의 멘헤이든 어유를 사용한 에스테르 교환 반응이고, (b) 40mM HPA, 240mM FO 및 다양한 농도 (50-400mg)의 CalB 리파아제를 사용한 에스테르 교환 반응이며, (c) 전환율은 시간에 따라 측정되었다. ○: HPA 및 TON을 이용한 반응; ●: HPA 및 FO를 이용한 반응
도 3은 반응 생성물의 HPLC 크로마토그래피를 나타낸 것으로, HPA 및 TON의 반응 혼합물을 (a) 0 시간 및 (b) 24 시간에 분석하고, (c) HPA-DON을 Prep-LC로 정제한 것이다. HPA 및 FO의 반응 혼합물을 (d) 0 시간 및 (e) 24 시간에 분석하고, (f) HPA-dFO를 Prep-LC로 정제한 것이다.
도 4는 HPA-DON과 HPA-dFO를 사용한 DPPH 라디칼 소거를 나타낸 것으로, HPA-DON (좌) 및 HPA-dFO (우)를 사용하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 것이다. 용매 (○), 10 mM HPA (□),및 10 mM HPA-DON (또는 HPA-dFO) (●)를 사용하여 (a) 및 (b) 메탄올, (c) 및 (d) 1-부탄올, (e) 및 (f) 디클로로메탄, (g) 및 (f) 헥산 시스템에서 분석을 수행한 것이다.
도 5는 HPA-DON 및 HPA-dFO를 사용한 ABTS^ㆍ+ 소거를 나타낸 것으로, HPA-DON (좌) 및 HPA-dFO (우)를 사용하여 ABTS^ㆍ+ 소거 활성을 측정한 것이다. 이소프로판올 (○), 10 mM HPA (□),및 10 mM HPA-DON (또는 HPA-dFO) (●)를 사용하여 (a) 및 (b) 메탄올, (c) 및 (d) DMSO/디클로로메탄 (2:8.v/v) 시스템에서 분석을 수행한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 하이드록시페닐아세트산 (HPA)의 항산화 활성을 확인하고, CalB (Candida antarctica lipase B)를 이용한 에스테를 교환반응을 수행하여, 용해도가 향상된 페놀성 지질인 하이드록시페닐아세트산 유도체를 제조하였다. 하이드록시페닐아세트산 유도체 중 HPA-DON (하이드록시페닐아세트산-디올레인)은 하이드록시페닐아세트산과 트리올레인으로부터 합성하였고, HPA-dFO (하이드록시페닐아세트산-어유 디글리세라이드)는 하이드록시페닐아세트산과 멘헤이든 어류로부터 합성하였다. 전환 수율을 높이기 위해 기질 몰비, 효소량 및 반응 시간 등의 효소 반응 조건을 최적화 하였으며, 반응 후, prep-LC를 사용하여 HPA-DON 및 HPA-dFO를 순수하게 분리하였다. DPPH 및 ABTS 라디칼을 사용하여 HPA-DON 및 HPA-dFO의 항산화 활성을 확인하였으며, HPA-DON은 비극성 용매에서 높은 활성을 나타냈고, HPA-dFO는 극성 용매 및 비극성 용매 모두에서 강한 활성을 나타냈다. 또한, HPA-dFO는 식품 유해균의 성장을 억제하는 활성도 나타냈다. 즉, HPA-dFO는 항산화 작용과 항균 작용을 동시에 가진 새로운 페놀성 지질의 하이드록시페닐아세트산 유도체를 제조하였다.

상기 식품 유해균인 박테리아 바실러스 코아귤런스 (B. coagulans)는 pH 4-4.5인 산성화된 식품에서 흔히 발견되며, 신맛을 유발한다. 알칼리제니스 페칼리스 (A. faecalis)는 의료 기기를 오염시켜 혈액에 감염된다. 지오바실러스 스테로써모필러스 (G. stearothermophilus)는 통조림 식품 및 연유와 같은 가공 식품에서 부패를 일으킨다.

본 발명에서는 멘헤이든 어유에 항균 활성이 있는 PUFAs가 다량 함유되어 있어서 HPA-dFO가 항균 작용을 할 것으로 예상되므로, 에스테르 교환반응을 통해 HPA-DON과 HPA-dFO를 합성하였다. HPA-DON은 비극성 용매에서 항산화 작용을 하고, HPAdFO는 극성 용매뿐만 아니라 비극성 용매에서도 항산화 작용을 하였다. 또한, HPA-dFO는 B. coagulans , A. faecalis 및 G. stearothermophilus를 포함한 일부 식품 오염 박테리아에 대해 항균 활성을 보나타냈다. 즉, 이러한 페놀성 지질의 하이드록시페닐아세트산 유도체는 식품 및 화장품 산업에서 중요한 생체 적합 물질로 사용될 것으로 기대될 수 있다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 하기 화학식 I로 표시되는 하이드록시페닐아세트산 (Hydroxyphenylacetic Acid) 유도체 화합물에 관한 것이다.

[화학식 I]

.

본 발명은 다른 관점에서, 하기 화학식 II로 표시되는 하이드록시페닐아세트산 (Hydroxyphenylacetic Acid) 유도체 화합물에 관한 것이다.

[화학식 II]

본 발명에서, 하이드록시페닐아세트산은 화학식 C₈H₈O₃로 표시되며, 하이드록시페닐아세트산 분자는 8 개의 수소 원자, 8 개의 탄소 원자 그리고 3 개의 산소 원자로 구성되어 총 19 개의 원자로 형성되며, 2-, 3-, 4-하이드록시페닐아세트산이 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 화학식 I 또는 화학식 II의 하이드록시페닐아세트산 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, "항산화 조성물"이란 산소가 불안정한 상태에 있는 활성산소를 억제 또는 제거하는 작용을 통해 산화를 방지하는 물질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 노화 및 각종 질환의 억제 또는 치료를 위한 의약품, 건강보조제, 화장품, 식품, 식품 첨가제 등에 유용하게 이용될 수 있으며, 이에 의해 제한되지 않는다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 화학식 II의 하이드록시페닐아세트산 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 항균 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 "항균"은 균에 저항하는 능력을 의미하며, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 작용으로부터 방어하기 위해 이루어지는 모든 기작을 의미한다.

본 발명에서 "항균 조성물"이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 세균의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미한다.

본 발명의 화학식 I 또는 화학식 II의 하이드록시페닐아세트산 유도체는 바실러스, 알칼리제니스 또는 지오바실러스 에 대한 항균 활성을 가진 균주인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 바실러스 코아귤런스 (B. coagulans), 알칼리제니스 페칼리스 (A. faecalis)또는 지오바실러스 스테로써모필러스 (G. stearothermophilus)인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물이 의약품으로 이용될 경우에는 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 제형으로 제조될 수 있다.

상기 담체 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드, 파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물류가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체 및 부형제는 모두 사용 가능하다. 또한 항산화 조성물을 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료로 이용될 경우에는 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 화학식 I 또는 화학식 II의 하이드록시페닐아세트산 유도체를 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강 보조식품류 등이 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 유효성분인 화학식 I 또는 화학식 II의 하이드록시페닐아세트산 유도체 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 식품으로 인정될 수 있는 제형이라면 다양한 형태의 제형으로 제조할 수 있다.

일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있으므로, 예를들어, 항균 효과를 향상시키기 위한 보조제 또는 식품의 보존성 또는 안전성 향상을 위한 식품 첨가제 또는 식품 소독제 형태로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 4-하이드록시페닐아세트산과 트리올레인 (triolein)을 효소 매개 에스테르 교환반응시키는 단계를 포함하는 상기 화학식 I의 하이드록시페닐아세트산 유도체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 4-하이드록시페닐아세트산과 트리올레인의 몰비는 1:4~1:7인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1:6인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 4-하이드록시페닐아세트산과 어유 (fish-oil)를 효소 매개 에스테르 교환반응시키는 단계를 포함하는 상기 화학식 II의 하이드록시페닐아세트산 유도체의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 4-하이드록시페닐아세트산과 어유의 몰비는 1:4~1:7인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1:6인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 효소는 리파아제인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 리조퍼스 델레머(Rhizopus delemar), 무코 미에헤이(Mucor miehei), 알칼리진 속(Alcaligenes sp), 아스퍼질러스 니거( Aspergillus niger), 칸디다 안타르티카(Candida antarctica), 칸디다 실린드라세(Candida cylindracea) 및 지오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum)을 포함하는 미생물 유래의 리파아제인 것이며, 가장 바람직하게는 칸디다 안타르크티카 (Candida antarctica) 리파아제 B인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 에스테르 교환반응은 35℃에서 48시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하할 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: HPA와 트리글리세라이드의 에스테르 교환반응

이전의 문헌(Jo JC et al., J Mol Cat B Enzym 129:54-60, 2016)을 기초로, 2가지 CalB-매개 에스테르 교환반응을 HPA와 TON (triolein) 또는 FO (fish-oil)를 사용하여 수행하였다 (도 1).

CalB는 아크릴 레진에 고정화된 Candida antarctica lipase B (Sigma-Aldrich)를 사용하였으며, 4-hydroxyphenylacetic acid (HPA, 98%), 멘헤이든 어유 (FO), 트리올레인 (TON), 분자체 (4 Å)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

먼저, 기질 몰비가 에스테르 교환반응에 미치는 영향을 조사하였다.

HPA 농도는 40mM로 고정하고, FO 농도를 40-240mM로 변경하면서 최적 반응조건을 탐색하였다. 그 결과, 1:6의 몰비일 때, 56%의 최고 수율을 얻을 수 있었다 (도 2a). 따라서, 40mM HPA 및 240mM FO를 이후 실시예에 사용하였다.

다음으로, 다양한 양의 CalB 효소를 사용하여 최대 전환율을 얻기 위해 필요한 효소량을 조사하였다. 그 결과, 200mg CalB를 사용할 때 65.5%의 최대 전환율을 나타냈다 (도 2b). CalB의 양이 많을수록 (400mg) 오히려 전환 수율이 감소했는데, 이는 기질의 확산 제한과 관련이 있다. 따라서, 200mg의 CalB를 이후 실시예에 사용하였다.

최종 최적화된 반응 혼합물은 다음과 같다.

반응 I: 40 mM HPA, 240 mM TON, 200 mg 분자체, 및 1 unit (200 mg) CalB 리파아제가 포함된 10 ml의 n-hexane/2-butanone 혼합물 (75:25, v/v)

반응 II: 40 mM HPA, 240 mM FO, 200 mg 분자체, 및 1 unit CalB 리파아제가 포함된 5 ml의 hexane/2-butanone 혼합물 (85:15, v/v)

상기 반응 혼합물은 35 ℃ 및 210 rpm에서 48 시간 동안 반응시키고, 혼합물로부터 리파아제를 제거함으로써 반응을 중단시켰다.

최적화된 반응 시스템을 사용하여 전환율을 시간 경과에 따라 모니터링한 결과, 전환율은 24 시간까지 증가하였며, 얻어진 전환율은 HPA-DON 및 HPA-dFO의 경우 각각 87 % 및 59 %였다 (도 2c).

24 시간 후, 전환율은 72 시간까지 안정적으로 유지되었으며, 이러한 결과는 HPA와 트리글리세라이드를 사용하는 순방향 반응이 진행됨에 따라 지방산이 축적되고 HPA-디글리세라이드와 지방산을 이용한 역반응이 시작되었음을 의미한다. 순방향 반응 속도 및 역반응 속도는 24 시간에서 동일한 속도가 되었다. 또한, 반응 I과 반응 II 사이의 최종 전환율의 차이는 두 반응의 평형 상수의 차이와 관련이 있는 것으로 보인다.

실시예 2: 반응 생성물의 HPLC 분석

CalB-매개 에스테르 교환반응에 의해 생성된 반응 생성물을 HPLC 시스템을 사용하여 분석하였다.

실시예 1의 효소 반응 후에는 반응 매질을 Speed-Vac 시스템 (Eyela, Tokyo, Japan)에서 20 분 동안 증발시켜 건조시키고, 생성된 농축물을 HPLC 분석을 위해 이소프로판올에 용해시켰다. 농축된 용액을 HPLC 시스템에 주입하고, 이전 문헌 (Karboune S et al., J Biotechnol 119:281-290, 2005)에 기술된 절차에 따라 분석하였다. HPLC 분석은 Cogent C18 e-컬럼 (5 μm, 4.6 mm x 250 mm, MicroSolv Technology Corp., Eaton, NJ, USA)을 사용하여 수행하였다. 용출 구배는 메탄올, 이소프로판올, 물, 아세트산 (95:5:1:0.5, v/v)의 혼합물로 제조된 용매 A 및 이소프로판올로 구성된 용매 B로 0.9 ㎖/분의 유속에서 수행하였다. 용출은 10 분 동안 100% 용매 A의 등용매 흐름 (isocratic flow)에 의해 시작되었고, 20 분 동안 100% 용매 B에 대한 선형 구배가 이어지며, 5 분간 유지되었다. 주입된 시료의 부피는 20 ㎕였고 반응 성분의 검출은 UV 가변 파장 검출기 (VWD)에 의해 215 nm에서 수행하였다.

전환율 (%)은 하기 수학식 (1)을 사용하는 효소 반응에 의한 HPA의 감소에 기초하여 계산하였다.

[수학식 (1)]

(A _HPA,t0 : 0 시간에서 HPA의 피크 면적; A _HPA,t : 주어진 시간 t에서의 HPA의 피크 면적)

그 결과, 0 시간 반응 혼합물은 도 3a 및 3d에서와 같이 HPA, TON (또는 FO) 피크를 나타냈다. 첫 번째 피크 (RT 2.9 분)는 HPA로 확인되었다. TON 피크 및 FO 피크는 각각 RT 28.9-30.4 분 및 RT 20.8-29.1 분에 나타났다. FO 피크는 멘헤이든 오일의 다양한 지방산 조성으로 인해 많은 부분의 피크로 구성되었다.

다음으로, HPA : TON의 24 시간 반응 혼합물은 HPA 피크의 크기가 감소하고 RT 18.2-21.9 분에 새로운 주요 피크가 생성되었다 (도 3b). HPA : FO의 결과 또한 HPA 피크 크기가 감소하고 RT 8-18.6 분에서 많은 피크가 발생하였다 (도 3e). 이전 문헌 (Natalia A et al., J Mol Cat B Enzym 133:475-481, 2016)의 다른 크로마토그램과 비교하여, 효소 반응에 의해 생성된 새로운 피크는 각각 HPA-DON 및 HPA-dFO로 명명하였다.

실시예 3: HPA- 디글리세라이드의 정제

다량의 HPA-디글리세라이드를 얻기 위해, 농축된 반응 혼합물을 5 ml의 이소프로판올에 용해시키고, Prep-LC 컬럼에 주입하였다. Prep-LC (Preparative HPLC) 는 실시예 2의 HPLC 분석 시스템과 동일한 용출 조건에서 XBridge BEH C18 OBD Prep 컬럼 (5 μm, 50 mm × 250 mm, Waters, Milford, MA, USA)을 사용하여 수행하였다. 유속은 55 ml/min이고, 반응 성분의 검출은 UV 검출기로 215 nm에서 수행하였다. 8 내지 20 분 동안 용리되는 분획을 수집하고, 회전식 증발기 (EYELA N1000V, Tokyo, Japan)를 사용하여 농축시켜 점성의 황색 오일 액체를 수득하였다. 이어서 정제된 HPA-디글리세라이드를 계량하여 몰 농도의 생성물을 수득하고, 이후의 연구를 위해 농축시켰다 (도 3c 및 3f).

실시예 4: HPA- 디글리세라이드의 DPPH 라디칼 소거 활성 분석

HPA, HPA-DON, HPA-dFO의 라디칼 소거능은 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical) 분석에 의해 평가하였다.

DPPH 분석은 각각 메탄올, 1-부탄올, 디클로로메탄 및 헥산에 용해된 0.4M DPPH 스톡 용액으로 수행하였다. 10 mM의 반응 생성물과 HPA를 같은 유기 용매에서 DPPH 라디칼 용액 (50 mM)과 혼합하고 실온의 암실에서 반응시켰다. DPPH 라디칼 환원은 5 분 간격으로 517 nm에서 30 분 동안 분광 광도계로 모니터링 하였다.

라디칼 소거 활성은 잔류 DPPH 라디칼 백분율을 하기 수학식 (2)로 계산하여 나타냈다.

[수학식 (2)]

(A₅₁₇: 517 nm에서의 흡광도; 대조군은 HPA 또는 HPA-디글리세라이드 대신 용매 250μl가 포함되어 있음)

메탄올 (logP, -0.74), 1 부탄올 (logP, 0.836), 디클로메탄 (logP, 1.25) 및 헥산 (logP, 4.66)을 비롯한 다양한 용매의 존재하에 DPPH 분석 결과, 메탄올 시스템에서 HPA-DON은 약한 소거 활성 (30 분 후 18.2 %)을 나타내지만, HPA-dFO는 매우 강력한 소거 활성 (약 15 분 후 100 %)을 보였다 (도 4a 및 4b). 따라서 HPA-dFO는 메탄올 시스템에서 HPA-DON과 HPA보다 훨씬 강한 산화 방지 활성을 나타낸다. 화합물의 DPPH 라디칼 소거능은 용매의 종류에 따라 다르다 (Natalia A et al., J Mol Cat B Enzym 133:475-481, 2016).

다음으로, HPA, HPA-DON 및 HPA-dFO의 라디칼 소거능과 용매의 소수성 특성 사이의 관계를 밝히기 위해, DPPH 분석을 비극성 용매에서 수행하였다.

그 결과, 1-부탄올 시스템에서 HPA와 HPA-DON은 각각 20.43 %와 5.89 %의 DPPH 라디칼을 제거하는 반면, HPA-dFO는 52 %의 좀 더 강력한 소거 활성을 보였다 (도 4c 및 4d). HPA의 라디칼 소거 활성은 매우 낮기 때문에 디클로로메탄 및 헥산 시스템에서 분석할 수 없었다.

실시예 5: HPA- 디글리세라이드의 ABTS 라디칼 소거 활성 분석

HPA, HPA-DON, HPA-dFO의 라디칼 소거능은 또한 ABTS (2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) 분석에 의해 평가하였다. ABTS 분석은 ABTS 라디칼 양이온 용액 (ABTS^ㆍ+)을 사용하여 수행하였다. ABTS 염을과 과황산칼륨과 반응시켰을 때 ABTS 양이온 라디칼 (ABTS^ㆍ+)이 생성되고, ABTS 라디칼의 환원은 734 nm의 색 변화로 측정하였다.

ABTS^ㆍ+ 용액은 사용하기 전에 16 시간 동안 실온의 암실에서 2.45 mM 과황산칼륨 (potassium persulfate)과 7 mM ABTS 스톡 용액 함께 (1:1, v/v) 반응시킴으로써 생성시켰다. ABTS^ㆍ+ 용액을 메탄올 또는 DMSO/디클로로메탄 혼합물 (2:8, v/v)로 희석하여 734 nm에서 0.77의 초기 흡광도를 얻었다. 그 다음 이소프로판올에 용해된 3 mM HPA 또는 HPA-디글리세라이드 100 μl를 ABTS^ㆍ+ 용액 900 μl와 혼합하고 20 분 동안 실온에서 반응시켰다. 흡광도는 5 분 간격으로 734 nm에서 측정하여 흡광도의 감소를 검출하였다.

라디칼 소거 활성은 잔류 ABTS^ㆍ+ 라디칼 백분율을 하기 수학식 (3)으로 계산하여 나타냈다.

[수학식 (3)]

(A₇₃₄: 734 nm에서의 흡광도; 대조군은 HPA 또는 HPA-디글리세라이드 대신 용매 250μl가 포함되어 있음)

메탄올 (LogP, -0.74) 및 DMSO:디클로로메탄 (2:8, v/v) (LogP, 0.45)을 포함하는 2 가지 용매 시스템에서 ABTS 분석을 수행하였다.

그 결과, 메탄올 시스템에서 HPA-DON과 HPA-dFO는 각각 20 분 후에 72.2 %와 73.9 % 소거되었다 (도 5a 및 5b). 또한, DMSO:디클로로메탄 (2:8, v/v) 시스템에서 HPA-DON과 HPA-dFO는 20 분 후에 각각 40.3 %와 51.1 % 소거되었다 (도 5c 및 5d). 이러한 결과는 HPA 및 HPA 유도체가 두 용매에서 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타내었고, 메탄올 용매에서의 활성은 비교적 컸지만 용매 시스템에 따른 활성 차이는 예상보다 크지 않았다.

실시예 6: HPA- 디글리세라이드의 항균 활성 분석

HPA 및 HPA-디글리세라이드의 항균 활성은 3가지 식품 부패 박테리아 (Alcaligenes faecalis , Bacillus coagulans 및 Geobacillus stearothermophilus)을 사용하여 측정하였다. Bacillus coagulans KCTC 3625와 Geobacillus stearothermophilus (KCTC 2107)는 Korean Collection for Type Cultures (KCTC, Daejeon, Korea)에서 구입하였으며, Alcaligenes faecalis KCCM 40078은 Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM, Seoul, Korea)에서 구입하였다.

에탄올에 용해된 HPA 및 HPA-디글리세라이드의 연속 희석액을 LB (Luria-Bertani) 배지 (1 % 트립톤, 0.5 % 효모 추출물 및 1 % 염화나트륨) 4ml에 용해시켜 최종 농도 31.25-1000 μM로 만들었다. A. faecalis와 B. coagulans는 37 ℃에서, G. stearothermophilus는 55 ℃에서 600 nm에서 0.6의 광학 밀도에 도달할 때까지 배양하였다. 배양 후, 항균 활성을 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다. 에탄올에 용해된 HPA-DON 및 HPA-dFO를 1 % (v/v) 부피로 박테리아 세포 배양액에 첨가하였다. LB 배지 중 1 % 에탄올을 음성 대조군으로 사용하였다.

그 결과, HPA-DON이 박테리아 균주에 대해 박테리아 저해 활성을 나타내지 않는 반면, HPA-dFO는 모든 박테리아 균주에 대해 특정한 항균 활성을 나타냈다 (표 1).

250 μM 농도의 B. coagulans 및 A. faecalis에서 가장 높은 저해가 관찰되었다. HPA-dFO는 1000μM에서 G. stearothermophilus의 세포 성장을 강력하게 억제하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 하기 화학식 II로 표시되는 하이드록시페닐아세트산 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 항균 조성물:
   [화학식 II]
   

   

   .
   
6. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 의약품, 건강보조제, 화장료 또는 식품의 첨가제로 사용되는 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제

Images