KR100838621B1

KR100838621B1 - 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스활성을 지닌모로우붉은실 추출물 및 이로부터 분리한 브로모페놀계열화합물을 함유한 조성물

Info

Publication number: KR100838621B1
Application number: KR1020060130195A
Authority: KR
Inventors: 강소영; 오명주; 김석렬
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2006-12-19
Filing date: 2006-12-19
Publication date: 2008-06-16

Abstract

본 발명은 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스활성을 지닌 모로우붉은실 추출물 및 이로부터 분리한 브로모페놀계열 화합물을 함유한 조성물에 관한 것으로, 이를 더욱 상세하게 설명하면, 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey)의 추출물 또는 비극성용매가용추출물을 함유하는 양어용 사료첨가제 또는 항바이러스제제용 조성물을 제공하기 위하여, 상기 모로우붉은실 비극성용매가용추출물은 메틸렌클로라이드로 추출하였으며, 이 용매의 가용추출물 중 90 % 메탄올(MeOH)로 추출한 것이며, 상기 브로모페놀계열 화합물은 3-브로모-4,5-디하이드로실벤질 메틸에테르 (3-bromo-4,5-dihydroxybenzyl methyl ether)로 본 화합물 또는 이와 유사한 디-하이드록실(di-hyroxy)기를 갖는 모노_브로모페놀(mono-bromophenol )계열 화합물을 포함하는 것으로, 어류병원성 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 나타내는 해조류 추출물 및 그로부터 분리된 화합물로서, 모로우 붉은실 추출물 또는 이로부터 분리한 브로모페놀계열 화합물을 함유하는 양어사료첨가물 또는 양어용 항바이러스제 등 약학적 용도의 조성물에 관한 것이다.

모로우붉은실, 브로모페놀, 항바이러스활성

Description

어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스활성을 지닌 모로우붉은실 추출물 및 이로부터 분리한 브로모페놀계열 화합물을 함유한 조성물{ Composition comprising bromophenols or the extract of Polysiphonia morrowii Harvey having antiviral activity against fish pathogenic viruses }

도 1은 활성물질의 항바이러스 활성 연구 실험 모델을 나타낸 도식도

도 2는 활성해조류의 추출, 분획 및 활성화합물의 분리를 나타낸 도식도

도 3은 90% 메탄올 가용추출물화합물 1에 대한 아이피엔브이(IPNV)의 항바이러스 활성(Antiviral activity)

도 4는 90% 메탄올 가용추출물화합물 1에 대한 아이피엔브이(IPNV)의 중화실험(direct virucidal activity)

도 5는 화합물 1에 대한 아이에치엔브이(IHNV)와 아이피엔브이(IPNV)의 항바이러스 활성(Antiviral activity)

도 6은 화합물 1에 대한 아이에치엔브이(IHNV)와 아이피엔브이(IPNV)의 중화실험(direct virucidal activity)

본 발명은 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스활성을 지닌 모로우붉은실 추출물 및 이로부터 분리한 브로모페놀계열 화합물을 함유한 조성물에 관한 것으로, 이를 더욱 상세하게 설명하면, 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey)의 추출물 또는 비극성용매가용추출물을 함유하는 양어용 사료첨가제 또는 항바이러스제제용 조성물을 제공하기 위하여, 상기 모로우붉은실 비극성용매가용추출물은 메틸렌클로라이드로 추출하였으며, 이 용매의 가용추출물 중 90 % 메탄올(MeOH)로 추출한 것이며, 상기 브로모페놀계열 화합물은 3-브로모-4,5-디하이드로실벤질 메틸에테르 (3-bromo-4,5-dihydroxybenzyl methyl ether)로 본 화합물 또는 이와 유사한 디-하이드실(di-hyroxy)기를 갖는 모노-브로모페놀(mono-bromophenol)계열 화합물을 포함하는 것으로, 어류병원성 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 나타내는 해조류 추출물 및 그로부터 분리된 화합물로서, 모로우 붉은실 추출물 또는 이로부터 분리한 브로모페놀계열 화합물을 함유하는 양어사료첨가물 또는 양어용 항바이러스제 등 약학적 용도의 조성물에 관한 것이다.

수산양식업에 있어 전 세계적으로 문제가 되고 있는 수산양식생물 질병의 국내 발생 현황을 살펴보면, 1990년대 전반의 발병률이 5% 미만에 불과하던 것이 1990년대 후반부터는 15% 내외로 증가하고 있으며, 고수온기에 주로 발생하던 질병들이 연중 발생하는 추세에 있다. 그 중에서도 난치성 바이러스성 전염병의 발생 증가에 의한 양식 어류의 피해가 증대되고 있으며, 약제 오남용에 의한 내성균의 출현 증가로 치료 효과가 저하되고 있는 실정이다. 특히, 최근에 들어서는 국외로부터의 양식용 종묘의 수입량 증가로 인하여 신종 외래 전염병의 유입 위험성이 증대되고 있으며, 감염 종묘의 이동에 의한 질병의 확산이 우려되고 있다. 특히, 연어 및 송어과 어류의 아이에치엔브이(infectious hematopoietic necrosis virus:IHNV), 아이피엔브이(infectious pacreatic necrosis virus:IPNV)의 감염에 의한 피해는 1970년대 이후 지속적으로 발생되고 있으나, 그 치료를 위해 사용되어질 수 있는 적절한 약품의 개발은 국내외를 막론하고 없는 실정이다.

어류에 치사성을 가진 산업적으로 중요한 질병을 일으키는 바이러스 중에서 분리배양이 가능한 질병으로서는 연어과 어류의 전염성조혈기 괴사 바이러스[infectious hematopoietic necrosis virus(IHNV)]가 원인이 되어지는 전염성 조혈기 괴사병 [infectious hematopoietic necrosis disease(IHND)], 전염성 췌장 괴사 바이러스[infectious pacreatic necrosis virus(IPNV)]가 원인으로 작용하는 전염성 췌장 괴사병[infectious pacreatic necrosis disease(IPND)]와 바이러스성 출혈성 폐혈 바이러스[viral hemorhagic septicemia virus(VHSV)]의 원인에 의한 바이러스성 출혈성 폐혈병[viral hemorhagic septicemia disease(VHSD)]가 가장 널리 알려져 있고 전 세계적으로 그 피해 또한 가장 심각한 질병으로 알려져 있다.

아이에치엔브이(IHNV)는 1969년 Amend 등에 의해서 무지개송어에서 처음으로 분리 보고되어진 바이러스로서 우리나라에서는 양식산 무지개송어 치어에서 1992년 처음 보고되어졌다. 병어의 신장과 비장, 특히 신장의 조혈조직에 심한 괴사가 주요 특징으로 원인바이러스는 포탄형의 형태를 보이고, 평균크기는 길이 160~180 nm, 직경 80~90 nm의 랩도바이러스과 노비랩도바이러스속으로 분류되어져있다(van Regenmortel et al., 2000). 아이에치엔브이(IHNV)에 의한 사망률은 70~80%에 달한다. 무지개송어, 산천어, 송어에 피해가 크다. 본 병은 발견당시 미국 서해연안의 홍연어 및 치눅 살몬(chinook salmon)의 풍토병적인 성격을 갖는 것으로 생각했었지만 무지개송어에서의 발증이 확인된 이후, 미국 각지에서 발생이 확인되어 1970년대에 일본 및 대만, 1990년대에 유럽각지로 확대되었다.

아이피엔브이(IPNV)는 1950년대에는 미국 동부, 1960년대에는 미국서부 및 프랑스 그리고 1970년대에는 덴마크 등의 유럽각국 및 일본(Sano, 1971)에서 발생이 확인되었다. 1980년대가 되어 한국, 대만, 중국 , 타이 및 라오스 등에서도 본병의 존재가 확인되었다. IPN은 강송어 및 무지개송어를 중심으로 연어과어류의 질병으로 등장했지만, 건강한 화이트 수커[white sucker(Catostomus commersoni)]로부터 아이피엔브이가 분리된 이래 (Sonstegard et al., 1972), 현재까지 80종이 넘는 수생동물로부터 아이피엔브이(IPNV)가 분리어지고 있다. 아이피엔브이(IPNV)는 1979년 Dobos 등에 의해 비루나바이러스과로 분류되어진 이래, 최근에는 Reno 등(1999)에 의해 아쿠아비루나바이러스과로 재분류되어 졌다. 직경 60mm의 외막을 갖지 않는 구형 (정 20면체)바이러스로 2중쇄, 2분절 RNA를 핵산으로 가지고 있고, 4개의 주요단백질로 구성되어져 있다. 다양한 어종에 감염이 일으키는 바이러스로 강송어나 무지개송어 등에 감염되었을 경우 심할 때는 100%의 폐사율을 기록하는 매우 위험한 병원체이다.

VHS에 관해서는 예전부터 무지개송어의 신종창(Nierenschwellung), 전염성 신종창간병성증(Infektiose Nierenschwellung und Leberdegeneration=INuL)등으로 불리어져왔다(Sch, 1954; Heutschmann, 1952). 1962년 국제수역기구(Office International des Epizooties:OIE)의 어병 심포지움에서 보고되었고(Jensen, 1963), 원인바이러스를 바이러스성 출혈성 폐혈 바이러스[Viral hemorrhagic septicemia virus(VHSV)]로 정하였다. VHS는 유럽, 북미, 아시아 지역에 매우 널리 발병하며, 무지개송어, 은연어, 강송어, 브라운송어, 스틸헤드 트로우트(steelhead trout) 등의 연어과 어류뿐만 아니라 대구, 청어등과 같은 자연수계의 어류 및 넙치등과 같은 해산양식어류에서도 널리 발생하여 그 피해가 매우 심각히 우려되어지고 있다. 원인체인 브이에치에스브이는 길이 160~180 nm, 직경 70~80 nm의 포탄형으로, ss-RNA바이러스로서 노비렙도바이러스속에 분류되어 있다(van Regenmortel et al., 2000). 폐사율은 조건에 따라 큰 폭으로 변하지만, 일반적으로 20~80%의 범위로 피해를 입힌다.

연어과어류의 주요 병원체인 아이에치엔브이, 아이피엔브이 및 브이에치에스브이의 감염예방법의 일환으로 백신개발의 연구가 진행되어 불활화백신, 약독화생백신, 성분백신 그리고 DNA백신 등 활발한 연구가 진행되어 왔으며(Fryer et al.(1976); Fukuda et al(1989a,b); Gilmore et al., 1988; LaPatra et al., 2002), 일부는 예방백신으로 적용되어지고 있다.

아울러 어체 바이러스 보유어가 존재하는 수계에서는 수평감염이 일어날 가능성이 있으므로 전파방지를 위해 시설의 소독과 바이러스가 없는 용수의 확보, 난의 소독 등이 연구되어 적용되어지고 있다(Amend and Pietsch 1972; 吉水, 笠井, 2002). 하지만 감염어의 치료를 목적으로 적용되어질 수 있는 약제의 개발에는 큰 성과가 보고 되어지고 있지 않은 실정이다.

아이에치엔브이, 아이피엔브이 및 브이에치에스브이의 화학요법에 관련해서는 항바이러스제인 소디움 벤지미다졸(sodium benzimidazole)을 40 ug/ml 이상으로 처리하여 에프에치엠[Fathead Minnow (FHM)]세포에서의 바이러스의 증식을 억제했지만(Amend, 1976), in vivo 실험은 아직 실행되지 않았다. 또한 양어지나 하천에서 분리한 세균의 배양액이나 허브, 한방생약에 항 아이에치엔브이활성이 발견되었고, in vivo에서도 효과가 인정되었었지만(Direkusarakom, 1996) 아직 실용화에 이르지는 못하였다. 1999년 Fabregas등은 수종의 해양미세조류배양농축액을 이용하여 브이에치에스브이의 증식저해를 조사하여 그 사용가능성을 제시한 예가 있으나 그 이후의 연구결과는 발표되어지고 있지 않는 것으로 사료된다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 종래의 여러 가지 문제점을 개선시키기 위하여 안출한 것으로, 본 발명은 모로우 붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey)의 추출물 또는 비극성용매가용추출물을 함유하는 양어용 사료첨가제 또는 항바이러스제제용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey)의 추출물 또는 비극성용매가용추출물을 함유하는 양어용사료첨가제 또는 항바이러스제제용 조성물을 제공한다.

상기 모로우붉은실 비극성용매가용추출물은 메틸렌클로라이드로 추출한 것 또는 바람직하게는 이 용매의 가용추출물 중 90 % 메탄올로 추출한 것을 포함한다.

상기 브로모페놀계열 화합물은 3-브로모-4,5-디하이드록실벤질 메틸에테르(3-bromo-4,5-dihydroxybenzyl methyl ether)로 본 화합물 또는 이와 유사한 디-하이드록실(di-hyroxy)기를 갖는 모노-브로모페놀(mono-bromophenol)계열 화합물을 포함한다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용에 대하여 아래 실시예 및 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명의 권리범위가 아래 실시예 및 실험예에만 한정되어지는 것은 아니며, 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능하다.

[ 실시예 1] 모로우 붉은실 추출물의 제조

본 발명에 사용한 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey)은 여수 돌산도 연 안에서 채집하여 사용하였으며, 모로우붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey)은 증류수로 세척하였고, 동결 건조 후, 마쇄하여 얻은 분말 200g에 80 % 메탄올 1 ℓ를 넣고 80℃에서 1시간씩 25회 반복 추출하였다. 추출된 추출액을 감압여과 후, 여과된 추출액을 40℃에서 감압 농축하였으며. 농축된 잔사로서 모로우붉은실 추출물을 42 g수득하였다.

[ 실시예 2] 모로우 붉은실 메틸렌클로라이드 가용 추출물의 제조

상기 [실시예 1]에서 얻은 모로우 붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey) 추출물 42 g을 800ml 물에 현탁 시킨 후, 2ℓ 분획깔때기에 넣고 동량의 메틸렌클로라이드를 가하여 잘 혼합한 후 분획을 실시하였다. 이 분획과정을 12회 반복 실시 후, 모아진 메틸렌클로라이드 가용성 분획물 9ℓ를 얻은 후, 이를 감압농축하여 메틸렌클로라이드 가용 추출물 8.9 g을 수득하여 시료로 사용하였다.

[실시 예 3] 모로우 붉은실 90 % 메탄올 가용 추출물의 제조

상기 [실시예 2]에서 얻은 모로우 붉은실(Polysiphonia morrowii Harvey) 메틸렌클로라이드 가용 추출물 8.9 g을 메탄올:물=9:1의 비율로 혼합한 90 % 메탄올(MeOH)용매에 400ml에 현탁시킨 후, 1ℓ 분획깔때기에 넣고 동량의 헥산(Hexane)을 가하여 잘 혼합한 후 분획을 실시하였다. 이 분획과정을 12회 반복 실시 후 하층에 남아있는 90 % 메탄올(MeOH) 가용성 분획물을 감압농축하여 90 % 메탄올(MeOH)가용 추출물 4.7 g을 수득하여 시료로 사용하였다.

[실시 예 4] 브로모 페놀 계열 화합물의 분리

상기 [실시예 3]에서 얻은 90 % 메탄올(MeOH)가용 추출물 4.7 g에 대하여 gradient 역상 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하였다. 이때 전개용매로서 물:메탄올 = 90:10 비율의 혼합한 용매로 시작하여 80:20, 70:30, 60:40, 40:60, 30:70, 20:80, 물:메탄올 = 0:100 혼합용매까지 총 8종의 혼합용매에 대하여 각 10 ℓ의 용출액을 사용하였고 감압농축하여 8 개의 소분획물을 획득하였다. 8개의 소분획물 중 물:메탄올 = 90:10으로 용출된 4번째 소분획물 70mg을 메탄올에 녹여 원심분리 후, 상층액 52.4mg에 대하여 세파텍스(Sephadex)-LH20 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 이때 전개용매로서 메탄올을 사용하였으며, “[화합물 1]” 을 분리하였다.

(1) 화합물 1 : 3-bromo-4,5-dihydroxybenzyl methyl ether

○ 물질의 성상 : 적갈색 분말

○ 물질의 분자식 : C₈H₉O₃Br

○ EIMS m/z (rel. int.) : 234 (75), 232 (M⁺, 76), 203 (98), 201 (100), 153 (66)

○ ¹H NMR (CD₃OD, 500MHz) : 6.91(d, 1.75, H-2) 6.73(d, 1.75, H-6),

4.27(br s, H-7), 3.30(-OCH₃, 용매 signal과 겹침)

○ ¹³C NMR(CD₃OD, 100MHz) : 147.2(C-5), 143.7(C-4), 131.6(C-1), 123.9(C-2),

115.0(C-6), 110.3(C-3), 74.4(C-7), 57.8(-OCH₃)

[ 실험예 1] 모로우붉은실 추출물의 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스 활성

1) 주화세포 배양

바이러스 배양을 위한 어류주화세포는 씨에치에스이-214[Chinook Salmon Embryo-214(CHSE-214)]와 에프에스피[Flounder Spleen(FSP)] 세포를 최소기초배지[Eagle's minimum essential medium(MEM)]에 100 IU/ml의 페니실린(penicillin), 100 ug/ml의 스트렙토마이신(streptomycin)과 에프비에스[Fetal Bovine Serum(FBS)]가 10% 첨가된 배양액을 사용하여 각 플라스크에 2.5×10⁵/ ml로 맞추어 20℃에서 6시간 동안 배양한 후 바이러스 접종에 사용하였다.

2) 바이러스 배양

실험에 사용한 바이러스주는 아이에치엔브이 (에치브이-1), 아이피엔브이(VR-299) 및 브이에치에스브이 (오마바25) 표준주를 사용하였다. 바이러스는 stock을 위해 씨에치에스이-214 cell line에 엠오아이[Multiplicity Of Infection (M.O.I)]가 0.01로 되게 접종하고 20℃에서 5일간 배양하면서 세포변성효과[Cytopathic effect (CPE)]를 관찰 한 후 상등액을 마이크로튜브에 분주하여 실험에 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

3) 모로우 붉은실 추출물의 세포독성

96-well cell culture plate에 씨에치에스이-214 및 에프에스피 주화세포를 배양하여 추출물을 가한 후 48시간동안 배양하여 엠티티[Model Transformation Tools(MTT)]로 세포독성을 측정하였다. 그 결과, 100 μg/ml 이하에서는 전혀 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다.

4) 모로우 붉은실 추출물의 항바이러스 활성

씨에치에스이(CHSE)-214 및 에프에스피 주화세포를 사용하여 항바이러스 활성을 조사하였다. 항바이러스 활성은 96-well cell culture plate를 이용한 티씨아이디 50[Tissue Culture Infectious Dose(TCID₅₀)]법을 사용하여 추출물의 ① 전처리 (pretreatment) 후 virus에 의한 씨피이(CPE)의 감소 효과 및 ② direct virucidal activity를 측정하였다.

즉, ① pretreatment 법에서는 96-well cell culture plate에 주화세포를 배양한 후 각 well에 모로우붉은실 추출물을 100mg/ml의 농도로 가하고 24시간동안 배양하였다. 이후 배양액을 제거하고 완충액(Buffer)으로 씻어낸 후, 10배 희석법에 의해 희석된 각 바이러스액를 100㎕씩 접종하고, 15 ℃에서 7일간 배양하였다. 씨피이의 발현을 확인하고 10%의 포르말린으로 세포를 고정하여 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 각 well 내의 세포를 관찰하였다. 각각의 바이러스 특유의 세포변성을 확인하고, Reed and Muench (1938)의 방법으로 티씨아이디50(TCID₅₀)치를 계산하였다.

② 중화반응 (direct virucidal activity) 측정법에서는 10배 희석법에 의해 희석된 각 바이러스액과 모로우붉은실 추출물을 1:1의 비율로 혼합하여 1, 3, 6, 12, 24시간동안 20℃에서 반응 시킨 후 주화세포가 배양된 96-well cell culture plate에 100 ul씩 접종하고 15 ℃에서 7일간 배양하였다. 이후의 과정은 ① pretreatment 법에서와 동일하게 수행하였다.

그 결과, 다음 표1과 2에서 나타난 바와 같이, 모로우붉은실 추출물은 pretreatment 시 각 바이러스에 의한 씨피이의 발현을 99% 이상 억제하였고, 바이러스와의 중화반응에서도 80~90%이상의 씨피이 발현 억제효과를 나타내었다. 이러 한 결과로부터 모로우붉은실 추출물이 어류병원성 바이러스에 대한 높은 항바이러스 활성을 보유함을 확인하였다.

표 1. 모로우붉은실 추출물의 어류병원성 바이러스에 대한 항바이러스 활성*

농도	CPE inhibition (%)
농도	IPNV	IHNV	VHSV
100 mg/ml	99.0	99.7	99.7

*pretreatment법에 의하여 측정되었음.

표 2. 모로우 붉은실 추출물의 아이피엔브이 및 브이에치에스브이에 대한 중화반응*

	CPE inhibition (%)
(100 mg/ml)	1hr	3hr	6hr	12hr	24hr
IPNV	88	88	88	88	44
VHSV	78.5	90	98.3	88	88

* direct virucidal activity 측정법으로 실시되었음.

[ 실험예 2] 모로우 붉은실 추출물의 90 % 메탄올 가용추출물의 항바이러스 활성

1) 90% 메탄올 가용추출물의 세포독성

씨에치에스이-214 및 에프에스피 어류주화세포계를 이용하여 세포독성을 측정하고 항바이러스 활성 검증을 위한 적용농도를 검토한 결과, 100 μM 이하의 농도범위에서는 48시간 동안 배양 후 세포독성이 전혀 나타나지 않음을 확인하였다.

2) 90% 메탄올 가용추출물의 항바이러스 활성

에프에스피 cell line을 계대배양하여 24 well plate에 1.0 × 10⁶ cell/ml을 1 ml 씩 분주하여 20℃에서 20시간 배양 후 [실험예 1]에서와 같은 paradigm으로 항바이러스 활성을 측정하였다. 즉, ① pretreatment 법에서는 90% 메탄올 가용추출물을 배양된 세포에 0 μg, 3 μg, 10 μg과 30 μg을 pretreatment하여 20℃에서 24시간 배양한 후 배양액을 제거하고 씻어낸 후 바이러스를 접종하고 20℃에서 1시간 바이러스를 세포에 흡착반응을 시켰다. 이후 HBSS로 3차례 행구어 내고 메틸셀루로즈 (methylcellurose) MEM을 각 well에 1 ml씩 중층시켜 20℃에서 7일간 배양하면서 씨피이를 확인 후, 10% 포르말린으로 세포를 고정하고 0.1% 크리스탈 바이오렛으로 염색하여, 각 well 내의 플라크 수를 측정하는 plaque forming unit assay를 실시하였고, ② 중화실험(direct virucidal activity) 측정을 위해서는 계대배양 후 20시간 된 세포에 90% 메탄올 가용추출물과 아이피엔브이를 1:1의 비율로 혼합하여 1시간동안 20℃에서 반응 시킨 후 세포에 100 ul씩 접종하였다. 세포에 흡착반응 이후의 과정은 ①에서와 동일하게 수행하였다.

그 결과, 다음 표 3 및 도 3에서 볼 수 있듯이, 90% 메탄올 가용추출물을 배양된 세포에 24시간 pretreatment 후 아이피엔브이를 접종한 실험에서는 0 mg에서 plaque가 3 well 평균 116개, 3 mg에서 평균 85.3개, 10 mg에서 평균 75.0개와 30 mg에서는 평균 81.5개의 플라크를 형성하여 바이러스 증식억제율로는 3 mg에서 26.5%, 10 mg에서 35.4%와 30 mg에서 29.8%로 3 mg 이상에서 유의성 있는 바이러스 증식억제활성이 확인되었다.(표 3과 도 3)

표 3. 아이피엔브이에 대한 90% 메탄올 가용추출물의 항바이러스 활성[(%) 바이러스 증식 억제율]

	Virus titer (PFU/ml)
	90% 메탄올 가용추출물의 농도
	0 μg/ml	3 μg/ml	10 μg/ml	30 μg/ml
IPNV	1160	853 (26.5%)	750 (35.4%)	815 (29.8%)

또한, 90% 메탄올 가용추출물의 바이러스에 대한 중화실험(direct virucidal activity)를 측정한 실험에서, 아이피엔브이와 1시간 중화반응 후 접종한 실험에서는 0 mg에서 plaque가 3 well 평균 91.6개, 3 mg에서 평균 4.3개, 10 mg에서 평균 5.0개와 30 mg에서는 평균 8.5개의 플라크를 형성하여 바이러스 증식억제율로는 3 mg에서 95.3%, 10 mg에서 94.5%와 30 mg에서 90.7%로 3 mg 이상에서 바이러스 증식억제에 대한 유의성이 인정됨 (표 4와 도 4).

표 4. 90% 메탄올 가용추출물에 대한 아이피엔브이의 중화반응[ (%) 바이러스 증식 억제율]

	Virus titer (PFU/ml)
	[화합물 1]의 농도
	0 μg/ml	3 μg/ml	10 μg/ml	30 μg/ml
IPNV	916	43 (95.3%)	50 (94.5%)	85 (90.7%)

[ 실험예 3] 브로모페놀계열 화합물의 항바이러스 활성

1) [화합물 1]의 세포독성

2) [화합물 1]의 항바이러스 활성

씨에치에스이-214 및 에프에스피 cell line을 계대배양하여 24 well plate에 1.0 × 10⁶ cell/ml을 1 ml 씩 분주하여 20℃에서 20시간 배양 후 [실험예 1]에서와 같은 paradigm으로 항바이러스 활성을 측정하였다.

즉, ① pretreatment 법에서는 [화합물 1]을 배양된 세포에 0 μM, 3 μM, 10 μM과 30 μM을 pretreatment하여 20℃에서 24시간 배양한 후 배양액을 제거하고 씻어낸 후, 바이러스를 접종하고 20℃에서 1시간 바이러스를 세포에 흡착반응을 시켰다. 이후 HBSS로 3차례 행구어 내고 메틸셀루로즈 MEM을 각 well에 1 ml씩 overlayer 시켜 20℃에서 7일간 배양하면서 씨피이를 확인 후, 10% 포르말린으로 세포를 고정하고 0.1% 크리스탈 바이오렛으로 염색하여, 각 well 내의 플라크수를 측정하는 plaque forming unit assay를 실시하였고,

② 중화실험(direct virucidal activity) 측정을 위해서는 계대배양 후 20시간 된 세포에 [화합물 1]과 아이에치엔브이 또는 아이피엔브이를 1:1의 비율로 혼합하여 1시간동안 20℃에서 반응 시킨 후 세포에 100 ul씩 접종하였다. 이후의 과정은 ① 에서와 동일하게 수행하였다.

그 결과, 다음 표 5 및 도 5에서 볼 수 있듯이, [화합물 1]을 배양된 세포에 24시간 pretreatment 후 아이에치엔브이(IHNV)를 접종한 실험에서는 0 mM에서 플라크가 3 well 평균 128.5개, 3 mM에서 평균 124.3개, 10 mM에서 평균 107.6개와 30 mM에서는 평균 64개의 플라크를 형성하여 바이러스 증식억제율로는 3 mM에서 3.3%, 10 mM에서 16.3%와 30 mM에서 50.2%로 30 mM에서 유의성 있는 가장 높은 바이러스 증식억제활성이 확인되었다. 또한, 아이피엔브이를 접종한 실험에서는 0 mM에서 플라크가 3 well 평균 120.6개, 3 mM에서 평균 119.0개, 10 mM에서 평균 113.0개와 30 mM에서는 평균 66.6개의 플라크를 형성하여 바이러스 증식억제율로는 3 mM에서 1.3%, 10 mM에서 6.4%와 30 mM에서 44.8%로 아이피엔브이(IPNV)도 30 mM에서 유의성 있는 가장 높은 바이러스 증식억제활성이 확인되었다.

표 5. 아이에치엔브이와 아이피엔브이에 대한 화합물 1의 항바이러스 활성[(%) 바이러스 증식 억제율]

	Virus titer (PFU/ml)
	[화합물 1]의 농도
	0 μM	3 μM	10 μM	30 μM
IHNV	1285	1243 (3.3%)	1076 (16.3%)	640 (50.2%)
IPNV	1206	1190 (1.3%)	1130 (6.4%)	666 (44.8%)

또한, [화합물 1]의 바이러스에 대한 중화실험(direct virucidal activity)를 측정한 실험에서, 아이에치엔브이(IHNV)와 1시간 중화반응 후 접종한 실험에서는 0 mM에서 plaque가 3 well 평균 233.6개, 3 mM에서 평균 108.0개, 10 mM에서 평균 85.0 개와 30 mM에서는 평균 65.3개의 플라크를 형성하여 바이러스 증식억제율로는 3 mM에서 53.8%, 10 mM에서 63.7%와 30 mM에서 72.1%로 3 mM 이상에서 바이러스 증식억제에 대한 유의성이 인정됨.

아이피엔브이(IPNV)를 접종한 실험에서는 0 mM에서 플라크가 3 well 평균 124.6개, 3 mM에서 평균 50.6개, 10 mM에서 평균 66.6개와 30 mM에서는 평균 57.6개의 플라크를 형성하여 바이러스 증식억제율로는 3 mM에서 59.4%, 10 mM에서 46.6%와 30 mM에서 53.8%로 아이피엔브이도 3 mM에서 바이러스 증식억제에 대한 유의성이 인정됨 (표 6과 도 6).

표 6. 화합물 1에 대한 아이에치엔브이와 아이피엔브이의 중화반응[(%)바이러스 증식 억제]

	Virus titer (PFU/ml)
	[화합물 1]의 농도
	0 μM	3 μM	10 μM	30 μM
IHNV	2336	1080 (53.8%)	850 (63.7%)	653 (72.1%)
IPNV	1246	506 (59.4%)	666 (46.6%)	576 (53.8%)

상기의 결과를 정리하면,

건조된 모로우붉은실 시료에 80% 메탄올을 첨가하여 열탕 추출하여 얻은 모로우붉은실 80% 메탄올 추출물과, 상기의 모로우붉은실의 80% 메탄올 추출물에 메틸렌클로라이드(CH₂Cl₂) 가하여 분획한 메틸렌클로라이드 가용추출물에 90% 메탄올을 첨가 하여 추출된 모로우붉은실의 90% 메탄올 가용추출물이 항바이러스활성을 가진 것을 특징으로 하며, 상기 모로우붉은실의 90% 메탄올가용추출물에서 브로모페놀계열 화합물로서, [화합물 1]은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤질 메틸에테르(3-bromo-4,5-dihydroxybenzyl methyl ether)로 항바이러스활성이 있는 것임을 특징으로 하는 양어용 항바이러스제 조성물 및 사료 첨가제 등에 사용 가능하였다.

이상에서와 같이 본 발명은 비록 상기의 실시예에 한하여 설명하였지만 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다.

이상에서 보여준 바와 같이, 본 발명의 모로우붉은실 추출물, 비극성 용매 가용추출물 또는 그로부터 분리된 브로모페놀계열 화합물은 국내 어류양식에서 큰 피해를 입히고 있는 질병의 원인이 되는 바이러스인 브이에치에스브이, 아이피엔브이 및 아이에치엔브이에 대한 항바이러스활성을 보유하므로, 양어사료첨가제용 또는 항바이러스제의 활성조성물로서 사용할 수 있는 유용한 효과를 가진다.

Claims

모로우붉은실을 80% 메탄올로 열탕 추출하여 얻은 모로우붉은실 추출물(1)이 항바이러스활성이 있는 것임을 특징으로 하는 어류 바이러스 억제용 조성물.
제 1항에 있어서 모로우붉은실을 80% 메탄올로 열탕 추출하여 얻은 모로우붉은실 추출물(1)에, 메틸렌클로라이드를 가하여 분획한 메틸렌클로라이드 가용추출물(2)에 90% 메탄올을 가하여 분획한 90% 메탄올 가용추출물(3)이 항바이러스활성이 있는 것임을 특징으로 하는 어류 바이러스 억제용 조성물.
제 2항에 있어서, 90% 메탄올 가용추출물(3)의 주요 활성물질은 브로모페놀계열 화합물로서, 3-브로모-4,5-디하이드록시벤질 메틸에테르(3-bromo-4,5-dihydroxybenzyl methyl ether)를 주성분으로 하고 항바이러스활성이 있는 것임을 특징으로 하는 어류 바이러스 억제용 조성물.