KR101403598B1 - 항산화 활성 및 간기능 개선효과를 가지는 비가열 동굴 숙성 옥매실 발효액 상품 제조방법 - Google Patents
항산화 활성 및 간기능 개선효과를 가지는 비가열 동굴 숙성 옥매실 발효액 상품 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 비가열 동굴 숙성 옥매실 발효액 상품의 제조방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 가열처리하지 않고 합성보존료를 사용하지 않고도 저장성을 향상시킬 수 있는 비가열 옥매실 발효액 상품의 제조방법과 그 방법으로 제조된 옥매실 발효액 상품의 항산화 활성 및 간기능 개선 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 비가열 동굴 숙성 옥매실 발효액 상품 제조방법은, 수세 건조한 옥매실과 당을 동량 혼합하여 전통옹기에 첨가하는 제1단계; 하절기에도 13~17℃가 유지되는 동굴에서 1~5년간 숙성하는 제2단계; 3~7℃ 냉장시설에서 숙성된 매실액에 자몽종자추출물(DF-100)을 숙성된 매실액 대비 0. 03~0.1중량% 첨가하여 30~1시간 교반하는 제3단계; 포장하는 제4단계;로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 여기서 상기 제4단계는 당도 50brix 이상, pH 3.1~3.5, 세균수 20CFU/ml 이하, 진균수 50CFU/ml 이하, 대장균군 음성, 타르색소 불검출, 보존료 불검출에 대한 품질검사를 실시하는 과정을 더 포함하면서 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 비가열 동굴 숙성 옥매실 발효액 상품 제조방법은, 수세 건조한 옥매실과 당을 동량 혼합하여 전통옹기에 첨가하는 제1단계; 하절기에도 13~17℃가 유지되는 동굴에서 1~5년간 숙성하는 제2단계; 3~7℃ 냉장시설에서 숙성된 매실액에 자몽종자추출물(DF-100)을 숙성된 매실액 대비 0. 03~0.1중량% 첨가하여 30~1시간 교반하는 제3단계; 포장하는 제4단계;로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 여기서 상기 제4단계는 당도 50brix 이상, pH 3.1~3.5, 세균수 20CFU/ml 이하, 진균수 50CFU/ml 이하, 대장균군 음성, 타르색소 불검출, 보존료 불검출에 대한 품질검사를 실시하는 과정을 더 포함하면서 이루어질 수 있다.
Description
본 발명은 항산화 활성 및 간기능 개선효과를 가지는 비가열 동굴 숙성 옥매실 발효액 상품의 제조방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 가열처리하지 않고 합성보존료를 사용하지 않고도 저장성을 향상시킬 수 있는 비가열 옥매실 발효액 상품의 제조방법에 관한 것이다.
매화나무(P. Mume Sieb. et Zucc)는 장미과(Rosaceae)에 속하는 낙엽활엽교목으로 이 나무의 핵과(核果)를 매실(梅實)이라 한다. 1~3월경에 꽃이 피고 열매를 맺어 5~6월경 청매(靑梅)로 수확한다. 원산지는 중국의 사천성과 호북성의 산간지로 알려져 있으며 한국, 중국 및 일본 등에 널리 분포하고 있다.
매실은 예로부터 술, 차, 장아찌 등 각종 식품으로 개발되어 왔으며 말린 매실은 오매라 하여 한방에서 해독 및 구충 등에, 또한 뿌리, 잎, 꽃, 미숙 과일은 건위, 지갈, 가담, 해독, 주독, 소독 등의 효과가 있어 약재로 널리 이용되고 있다. 매실은 풍부한 유기산과 당류 등의 성분을 다량 함유하고 있는 알칼리성 식품으로서 항균활성, 피로회복, 식욕증진 및 해독 등의 효과가 있어 민간약으로서의 이용성이 높아지고 있다.
최근 연구에서는 매실이 다른 한국산 다른 과일에 비한 유기산 함량, 성숙과정 중 품종별 매실의 크기 및 과육의 종자중의 성분변화, 매실의 중요 향기 성분으로 malic acid 등의 유기산 물질의 관련성, 매실과육의 향기성분으로 benzaldehyde, terpinen-4-ol, benzyl alcohol, hexadecanoic acid 등이 보고한 바 있다. 가공식품 개발을 위한 연구로는 매실과육과 매실 착즙박의 이화학적 특성, 매실의 숙성중 유기산, 유리당 및 유리아미노산의 변화, 매실 추출물을 함유한 기능성 음료 개발 등 많은 연구가 보고되고 있다. 효능에 관한 연구로는 혈중 유산농도 및 혈청 지질에 미치는 영향, 간장 장애 및 당뇨병에 미치는 영향, 식중독 유발 세균의 증식에 미치는 영향 등이 보고되었으며, in vitro에서 매실추출물의 항산화력 탐색을 항산화활성 물질에 관하여 보고하는 등 연구가 되어 있다.
또한, 매실은 생체의 저항성 및 지구력을 향상시키고 피로회복을 촉진시키며 항암 능력 및 생체기능 증진에 대한 연구가 이루어지고 있으며, 매실의 citric acid등 유기산과 무기성분이 체내에서 위액 분비를 촉진시켜 식욕을 돋구어 주며 소화흡수에 도움을 주고 간장활동을 왕성하게 하며 신진대사를 원활히 하여 피로회복에 큰 효과가 있다고 보고된 바 있다.
본 발명은 고가의 설비가 요구되는 고전압 펄스 전기장이나 초음파 등의 물리적 비가열 살균법이나 소비자의 거부감이 고조되고 있는 화학적 보존료 사용에 의한 비가열 살균법 대신에 다양한 생리적 활성을 가지는 천연항균성 물질을 사용하여 매실의 영양, 향미, 기능성, 기호성의 저하를 최소화시킬 수 있는 비가열 옥매실 발효액의 제조방법을 제공하고자 한다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 수세 건조한 옥매실과 당을 동량 혼합하여 전통옹기에 첨가하는 제1단계; 하절기에도 13~17℃가 유지되는 동굴에서 1~5년간 숙성하는 제2단계; 3~7℃ 냉장시설에서 숙성된 매실액에 자몽종자추출물(DF-100)을 숙성된 매실액 대비 0.03~0.1중량% 첨가하여 30분~1시간 교반하는 제3단계; 포장하는 제4단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는 비가열 동굴 숙성 옥매실 발효액 상품 제조방법을 제공한다. 여기서 상기 제4단계는 당도 50brix 이상, pH 3.1~3.5, 세균수 20CFU/ml 이하, 진균수 50CFU/ml 이하, 대장균군 음성, 타르색소 불검출, 보존료 불검출에 대한 품질검사를 실시하는 과정을 더 포함하면서 이루어질 수 있다. 또한 본 발명은 위와 같이 제조된 비가열 동굴 숙성 옥매실 발효액 상품에 대한 항산화 활성용도와 간기능 개선용도를 제공한다.
본 발명에 따르면 다음과 같은 효과를 기대할 수 있다.
첫째, 가열처리하지 않고 합성보존료를 사용하지 않고도 저장성을 향상시킬 수 있는 옥매실 발효액 상품을 제조 공급할 수 있다.
둘째, 본 발명에 따라 제조된 동굴숙성 옥매실 발효액 제품은 항산화 활성과 간기능 개선에 효과가 있는 것으로 확인되기 때문에, 우수한 기능성과 상품성의 제품으로 국민의 건강증진에 기여할 수 있다.
도 1은 숙성기간에 따른 옥매실 발효액의 총페놀 함량에 대한 측정결과 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 옥매실 발효액의 간세포 독성에 대한 측정결과 그래프이다.
도 3a 내지 도 3c는 t-BHP에 의한 산화적 스트레스로 증가된 간세포 독성측정을 위한 독성 유도조건과, 그 측정결과 그래프이다.
도 4는 t-BHP에 의한 산화적 스트레스로 증가된 간세포의 지질과산화에 대한 측정결과 그래프이다.
도 5는 t-BHP에 의한 산화적 스트레스로 증가된 간세포의 GSH 함량에 대한 측정결과 그래프이다.
도 6은 t-BHP에 의한 산화적 스트레스로 증가된 간세포의 ROS 생성량에 대한 측정결과 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 옥매실 발효액의 간세포 독성에 대한 측정결과 그래프이다.
도 3a 내지 도 3c는 t-BHP에 의한 산화적 스트레스로 증가된 간세포 독성측정을 위한 독성 유도조건과, 그 측정결과 그래프이다.
도 4는 t-BHP에 의한 산화적 스트레스로 증가된 간세포의 지질과산화에 대한 측정결과 그래프이다.
도 5는 t-BHP에 의한 산화적 스트레스로 증가된 간세포의 GSH 함량에 대한 측정결과 그래프이다.
도 6은 t-BHP에 의한 산화적 스트레스로 증가된 간세포의 ROS 생성량에 대한 측정결과 그래프이다.
본 발명은 가열처리하지 않고 합성보존료를 사용하지 않고도 저장성을 향상시킬 수 있는 비가열 동굴 숙성 옥매실 발효액 상품 제조방법에 관한 것으로, 수세 건조한 옥매실과 당을 동량 혼합하여 전통옹기에 첨가하는 제1단계; 하절기에도 13~17℃가 유지되는 동굴에서 1~5년간 숙성하는 제2단계; 3~7℃ 냉장시설에서 숙성된 매실액에 자몽종자추출물(DF-100)을 숙성된 매실액 대비 0.03~0.1중량% 첨가하여 30분~1시간 교반하는 제3단계; 포장하는 제4단계;로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 여기서 제4단계는, 당도 50brix 이상, pH 3.1~3.5, 세균수 20CFU/ml 이하, 진균수 50CFU/ml 이하, 대장균군 음성, 타르색소 불검출, 보존료 불검출에 대한 품질검사를 실시하는 과정을 더 포함하면서 이루어질 수 있다.
본 발명에서 자몽종자추출물은 합성보존료를 첨가하지 않고도 일정 이상의 저장성을 확보하는데 기여한다. 자몽종자추출물은 시중에서 판매하는 분말 상태의 것을 그대로 이용하면 되면 숙성된 매실액 중량대비 0.03~0.1중량%가 저장성에 대한 기여도를 고려할 때 적당하며, 0.1중량%를 초과하면 자몽종자추출물의 떫고 쓴맛으로 기호성을 저해할 우려가 있다.
이렇게 제조된 옥매실 발효액 제품은 출하 단계를 거쳐 시중에서 냉장 유통 상품으로 상품화할 수 있다.
한편 본 발명에서는 비가열 동굴 숙성 옥매실 발효액의 항산화 활성과 간기능 개선활성을 확인하였는바, 본 발명에 따른 제조된 비가열 동굴 숙성 옥매실 발효액 제품은 항산화 활성 내지 간기능 개선활성용 기능성 상품으로 제공할 수 있다.
이하에서는 실시예에 의거하여 본 발명을 상세히 살펴본다. 다만, 하기의 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이로써 한정되는 것은 아니다.
[
실시예1
]
옥매실
발효액의 제조
수세 건조한 옥매실과 유기농 설탕을 동량 혼합하여 전통옹기에 골고루 첨가한 후, 하절기에도 15℃가 유지되는 창원시 진전면 소재 80m 동굴에서 1, 2, 3, 4, 5년간 숙성하였다.
[
실시예2
]
옥매실
발효액의 성분분석
1. 실험방법
식품의약품안정청이 규정하고 있는 식품공전과 건강기능식품공전에 준하여 [실시예1]에 따라 제조된 옥매실 발효액에 대해 이화학적 특성을 조사하였다.
2. 일반성분
숙성기간(1, 2, 3, 4, 5년)별 동굴 옥매실 100g에 대한 일반성분을 조사한 결과는 아래 [표 1]과 같다.
| 구분 | 숙성기간별 일반성분 함량(%) | ||||
| 1년 | 2년 | 3년 | 4년 | 5년 | |
| 열량(Kcal) | 218.3 | 215.6 | 221.8 | 222.3 | 217.5 |
| 탄수화물 | 55.4 | 54.7 | 57.3 | 56.5 | 55.8 |
| 조지방 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | 0.2 |
| 조단백질 | 0.5 | 0.6 | 0.4 | 0.3 | 0.3 |
| 회분 | 0.3 | 0.3 | 0.2 | 0.3 | 0.3 |
| 수분 | 43.6 | 44.3 | 42.0 | 42.7 | 43.4 |
숙성기간별 매실의 일반성분 변화는 거의 없는 것으로 나타났으며, 다만 숙성기간이 연장될수록 조단백질 함량이 약간 감소하는 특징을 보였다. 이것은 다른 질소화합물로 전환된 것으로 추측된다.
3. 무기질
숙성기간별 옥매실의 무기질 함량은 아래 [표 2]와 같은데, 보는 바와 같이 Ca, Mg, Na, Fe, Mn, Zn 순으로 높았으며, 다만 숙성연도별 함량 차이는 미미한 수준이었으나 숙성 5년차 옥매실에서 Ca함량이 7.41mg%로서 높게 검출되었다.
| 구분 | 숙성기간별 무기질 함량(mg/100g) | ||||
| 1년 | 2년 | 3년 | 4년 | 5년 | |
| Ca | 4.03 | 3.07 | 3.35 | 2.96 | 7.41 |
| Mg | 4.19 | 4.21 | 3.25 | 3.14 | 4.17 |
| Na | 3.26 | 2.21 | 2.21 | 3.78 | 3.31 |
| Fe | 0.47 | 0.43 | 0.39 | 0.30 | 0.47 |
| Mn | 0.05 | 0.08 | 0.04 | 0.11 | 0.06 |
| Zn | 0.03 | 0.05 | 0.03 | 0.03 | 0.04 |
4. 식이섬유
숙성기간별 옥매실의 식이섬유 함량은 아래 [표 3]과 같으며, 보는 바와 같이 식이섬유 함량은 숙성기간에 따라 유의적인 차이는 없었고, 3.6%에서 4.6%를 유지하였다.
| 숙성기간 | 함량 (%) |
| 1년 | 4.3 |
| 2년 | 4.5 |
| 3년 | 5.7 |
| 4년 | 3.6 |
| 5년 | 4.6 |
5. 포화지방, 트랜스지방 및 콜레스테롤 함량
숙성기간별 포화지방, 트랜스지방 및 콜레스테롤 함량은 아래 [표 4]와 같이 전혀 검출되지 않았다.
| 구분 | 숙성연도별 포화지방, 트랜스지방 및 콜레스테롤 함량 (mg) | ||||
| 1년 | 2년 | 3년 | 4년 | 5년 | |
| 포화지방 | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ |
| 트랜스지방 | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ |
| 콜레스테롤 | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ |
| ○ : 불검출 | |||||
6. 유기산
매실의 자극적인 신맛과 향미성분으로서 중요한 역할을 하는 유기산을 숙성연도별로 분석한 결과는 아래 [표 5]와 같다.
| 구분 | 숙성연도별 유기산 함량 (mg) | ||||
| 1년 | 2년 | 3년 | 4년 | 5년 | |
| Citric acid | 12.5 | 13.3 | 10.8 | 10.3 | 10.4 |
| Malic acid | 8.2 | 9.7 | 9.1 | 9.6 | 8.5 |
| Acetic acid | 0.9 | 0.6 | 0.7 | 0.7 | 0.4 |
| Lactic acid | 2.6 | 2.5 | 2.6 | 3.1 | 2.4 |
위에서 보는 바와 같이 Citric acid가 10.4~12.5mg, Malic acid가 8.5~9.7mg으로서 가장 높았고, 다음으로 Lactic acid, Acetic acid 순으로 나타났다. 또한 숙성기간이 연장되면서 Citric acid 함량은 12.5mg에서 10.4mg으로 감소하였고, 다른 유기산은 큰 변화가 없었다. 감소된 Citric acid는 다른 향기성분으로 전환한 것으로 추측되며, 숙성이 길어질수록 온화한 신맛을 내는데 기여하는 것으로 파악된다.
7. 색도
숙성기간별 옥매실 발효액의 색도를 측정한 결과 아래 [표 6]과 같다.
| 구분 | L*(D65) | a*(D65) | b*(D65) |
| 1년 | 34.745 | 0.395 | 15.01 |
| 2년 | 35.445 | -0.07 | 12.69 |
| 3년 | 36.145 | -0.165 | 14.095 |
| 4년 | 35.215 | 0.985 | 20.47 |
| 5년 | 30.185 | 3.865 | 26.795 |
위 [표 6]에서와 같이 명도를 나타내는 L값은 담금 시간에 따라 증가하는 양상을 보이다가 3년차에 36.145로 가장 높은 수치를 기록하였고, 그 이후 다시 감소하는 경향을 나타냈다. 적색도를 나타내는 a 값은 5년차에 3.865로 가장 높은 수치를 나타내었고, 4년 이하 담금된 옥매실 발효액에 대한 수치는 ±1.5미만의 차이로 유의적인 변화가 없는 것으로 파악된다. 황색도를 나타내는 b 값은 1년 담금 이후 다소 감소하였다가 다시 담금 시간에 따라 증가하는 양상을 나타내었고, 5년차에 26.795로 가장 높은 수치를 나타냈다.
[
실시예3
]
옥매실
발효액의 항산화 활성
1. 총페놀 함량
(1)실험방법
페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 한 개 이상의 수산기로 치환된 방향족 환을 가지는 식물성분이며, 다양한 구조와 분자량을 가진다. 이들은 Phenolic hydroxy기를 가지기 때문에 단백질 및 기타 거대분자들과 쉽게 결합하여 항암, 항고혈압, 항염증 및 항산화 등의 다양한 생리활성 기능을 가진다. 일반적으로 페놀성 화합물이 항산화작용을 하는 대표적인 물질로 보고되어 있다.
총 페놀 함량은 Folin-Denis법에 따라 옥매실 발효액을 증류수에 10배 희석한 후 그 시료 1ml에 D.W. 2ml. Foline-Ciocalteau 시약 0.5ml 및 10% Na2CO3 용액을 1ml씩 차례로 가한 다음 실온에서 1시간 정치하여 700nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준품으로 gallic acid를 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 검량선으로부터 총 페놀 함량을 산출하였다.
(2)실험결과
페놀화합물 함량을 측정한 결과는 도 1과 같다. 도 1에서와 같이 숙성기간별 매실추출액 중의 총페놀 함량은 17.3mg/ml에서 18.9mg/ml로 숙성기간이 길어질수록 약간 증가하는 특징을 보였다.
2. Free radical 소거활성
(1)실험방법
Free radical 소거활성은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH, Wako) 라디칼에 대한 전자공여효과에 나타나는 시료의 환원력으로 측정하였다. Solid-phase extraction(SPE)법을 사용하여 당을 제거한 옥매실 발효액을 농도별 500μm DPPH 용액 1㎖를 첨가해 교반한 후, 37℃ 암소에서 30분간 반응시켰다. 반응용액은 517nm의 흡광도를 측정하여, radical scavenging activity를 계산하였다.
Free radical scvenging activity(%) = (1-A/B)×100
A:시료첨가 흡광도 B: 시료무첨가 흡광
(2)실험결과
숙성기간별 옥매실 발효액의 DPPH 소거능을 측정한 결과 아래 [표 7]과 같이 나타냈다. 보는 바와 같이 6.25㎍/㎎에서 23~29%, 25㎍/㎎에서 67%이상, 50㎍/㎎에서 80%이상의 소거능을 보였다. 숙성기간이 길어질수록 Free radical 소거활성은 약간씩 증가하였으며, 특히 5년 숙성시킨 옥매실 발효액은 50㎍/㎎ 농도에서 90% 이상의 소거활성을 보였다.
| 농도(㎍/㎎) | 숙성기간별 소거능(%) | ||||
| 1년 | 2년 | 3년 | 4년 | 5년 | |
| 0 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
| 6.25 | 23.54 | 24.38 | 24.56 | 25.34 | 29.26 |
| 12.5 | 45.61 | 46.13 | 44.29 | 52.48 | 54.73 |
| 25 | 67.50 | 67.29 | 72.30 | 75.29 | 75.42 |
| 50 | 81.77 | 82.13 | 81.75 | 88.26 | 90.13 |
| 100 | 88.65 | 89.38 | 87.26 | 89.26 | 93.25 |
3. SOD(Superoxide dismutase) 유사활성 측정
(1)실험방법
산화적 스트레스 증가는 비효소적 당화(nonenzymatic glycosylation)와 자동산화적 당화(autooxidative glycosylation)의 증가, 항산화 방어계(antioxidative defense system)의 변화 등으로 인하여 나타난다고 보고된다. 이러한 산화적 스트레스로 인해 생체대사 과정 중에 free radical이나 지질과산화물이 끊임없이 생성되는데, 생체에는 이들의 축적을 방지하기 위해 가동되는 여러 가지 종류의 산화 방어작용이 있다. 생체 내의 분해경로에서 생성된 전자가 cytochrome 호흡 chain을 거쳐서 최종 전자 수용체인 분자상 산소에 1개의 전자가 결합하면 superoxide radical(O2 -)이 생성되는데, 이러한 superoxide radical(O2 -)과 반응하여 hydroxy radical(·OH), singlet oxygen(O2 1)등을 생성한다. SOD는 superoxide radical을 환원시켜 H2O2로 전환시키며, 이때 생성된 H2O2 등은 GSHpx, catalase 등의 작용에 의해 H2O로 무독화됨으로서 산소독으로부터 생체를 보호하게 되는 것이다. SOD 유사 활성 물질은 효소는 아니지만 SOD와 유사한 역할을 하는 저분자 물질로 주로 phytochemical에 속하며 superoxide의 반응성을 억제하여 superoxide로부터 생체를 보호하는 것으로 보고된다. 따라서 SOD 유사활성 물질의 섭취로 인해 인체 내의 superoxide를 제거함으로써 산화적 장애를 방어하고 노화 억제의 효과를 기대할 수 있을 것으로 보고된다.
당이 제거된 옥매실 발효액을 50% DMSO로 용해시켜 시료용액으로 하였다. SOD 유사활성은 SOD 활성 검출 kit(Wako)를 이용하여 NBT(Nitro blue tetrazolium) 환원법에 의해 측정하였다. 일정농도의 시료에 0.1M phosphate buffer(pH8.0), 0.2mM xanthine, 0.24mM NO2-TB의 발색시약 1.0㎖과 0.049 Unit/ xanthine oxidase 1㎖를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 69mM NaDS 2㎖로 반응을 정지시키고, 560nm에서 흡광도를 측정하여 SOD 유사활성을 계산하였다.
(2)실험결과
숙성기간별 옥매실 발효액의 SOD 유사활성을 측정한 결과 아래 [표 8]과 같이 농도의존적으로 활성이 증가하고, 특히 5년 숙성시킨 것이 약간 높게 나타났다.
| 농도(㎍/㎎) | 숙성연도별 SOD유사활성 (%) | ||||
| 1년 | 2년 | 3년 | 4년 | 5년 | |
| 0 | - | - | - | - | - |
| 25 | 24.73 | 23.42 | 24.85 | 25.15 | 24.13 |
| 50 | 47.12 | 48.25 | 49.33 | 50.19 | 48.36 |
| 100 | 51.18 | 54.32 | 52.14 | 54.25 | 56.34 |
4. Tyrosinase 저해효과
(1)실험방법
피부가 자외선에 노출되면 tyrosinase의 작용으로 melanosome에서 멜라닌 생합성이 촉진되어 피부노화, 색소침착, 피부암을 발생시킨다. 이와 같이 tyrosinase의 활성 억제는 free radical의 생성을 저해하여 멜라닌 물질의 생성을 감소시켜 피부미백제 개발에 유용한 평가법으로 인정된다.
Tyrosinase 저해효과는 50mM phosphate buffer(pH6.8) 750에 10mM L-tyrosine 100㎕와 각각의 농도별 시료용액(옥매실 발효액 원액) 50㎕를 첨가하여 37℃에서 5분간 정치 후, mushroom tyrosinase 400Unit/ 100㎕를 첨가하여 37℃에서 반응시켰다. 15분 후 100㎎/㎖ albutin 20㎕로 반응을 정지시킨 후 476nm에서 흡광도를 측정하였다.
(2)실험결과
숙성기간별 옥매실 발효액을 농도별로 첨가하여 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과, 아래 [표 9]에서와 같이 농도의존적으로 유의성이 인정되었다. 숙성기간이 길어질수록 활성이 다소 증가하였고, 특히 100㎎/㎎ 농도에서 44~50% 저해율을 보였다.
| 농도(㎍/㎎) | 숙성기간별 저해율 (%) | ||||
| 1년 | 2년 | 3년 | 4년 | 5년 | |
| 25 | 11.75 | 12.39 | 12.87 | 12.85 | 12.91 |
| 50 | 32.42 | 34.18 | 34.29 | 35.27 | 36.87 |
| 100 | 44.50 | 45.21 | 46.48 | 48.94 | 50.13 |
5. 아질산염 소거능 측정
(1)실험방법
Nitrosamine은 체내에서 diazoalkane(CnH2nN2)으로 변화하여 핵산이나 단백질 또는 세포 내의 성분을 alkyl화함으로써 암을 유발한다고 하며, 또한 아질산염은 그 자신이 독성이 있기 때문에 일정한 농도 이상 계속 섭취시 혈액 중의 헤모글로빈을 산화시켜 메트헤모글로빈증(methemoglobinemia)을 유발한다.
아질산염 소거능 측정은 옥매실 발효액이 발암성 nitrosamine 생성의 전구물질인 아질산염을 소거하거나 또는 분해하는 작용을 알아보기 위하여 1mM NaNO2 용액 1㎖에 시료용액(옥매실 발효액 원액) 1㎖를 첨가하고, 0.1N HCl을 사용하여 반응용액의 pH를 1.2로 조정한 다음 총량을 10㎖로 하였다. 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 1㎖를 취하여 여기에 2% 초산 용액을 5㎖을 첨가하고 Griss 시약(30% 초산으로 1% sulfanilic acid와 1% naphthylamine을 각각 조제하여 1:1의 비율) 0.4㎖를 가하여 실온에서 15분 동안 방치한 후, 520nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염의 양을 산출하였다. 대조구는 시료 대신 증류수를 1㎖ 가하여 상기와 같은 방법으로 실시하며, 아질산염 소거능은 추출액을 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우의 아질산염 백분율(%)로 나타내었다.
아질산염소거능(%) = (1-시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100
(2)실험결과
숙성기간별 옥매실 발효액의 아질산염 소거능을 측정한 결과는 아래 [표 10]과 같다.
| pH | 숙성연도별 아질산염 소거능 (%) | ||||
| 1년 | 2년 | 3년 | 4년 | 5년 | |
| 1.2 | 38.27 | 39.25 | 39.13 | 40.27 | 41.15 |
| 3.0 | 15.26 | 15.13 | 16.75 | 16.25 | 17.23 |
| 6.0 | 8.23 | 8.21 | 8.57 | 8.77 | 9.31 |
상기 두 시료 250㎍/㎎을 가하여 pH1.2, 3.0 및 6.0에서 아질산염에 대한 소거율은 pH가 낮을수록 pH 의존적으로 활성이 약 38% 높게 나타났다. 아질산염이 식품 중에 존재하는 아민류와 반응하여 nitrosamine과 같은 발암물질을 생성하는 조건이 산성일수록 용이한데, 상기 결과는 산성 조건에서 nitrosamine 생성억제에 활용 가치가 있을 것으로 사료된다.
[
실시예3
]
비가열 저장성 실험
1. 생육저해활성
(1)실험방법
자몽종자추출물인 DF-100을 [실시예1]의 5년 숙성 옥매실에 0%, 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3% 씩 가한 후 30℃에서 1시간, 5시간, 10시간, 24시간 처리하였다. 처리된 시료는 tryptic soy agar배지와 potato dextrose agar 배지에 0.1ml 씩 도말한 후 30℃에서 각각 2일과 3~5일간 배양하였다. 생육저해활성은 DF-100 처리구 대비 DF-100 미처리구 colony 형성수를 비교하여 측정하였다.
(2)실험결과
생육저해활성을 측정한 결과는 아래 [표 11] 및 [표 12]와 같다. 보는 바와 같이 자몽종자추출물을 0.03% 이상 첨가하여 1시간 이상 처리하면 옥매실 발효액 속에 존재하는 미생물의 생육이 완전히 억제되는 것을 확인할 수 있었고, 또한 곰팡이와 효모 등 진균류에 대한 자몽종자추출물의 항진균활성은 세균보다 높아 0.1% 농도에서 5시간 이상 처리 시에 균의 생육이 완전히 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
| DF-100 농도(%) | 처리조건별 미생물 수 (CFU) | ||||
| 무처리 | 1시간 | 5시간 | 10시간 | 24시간 | |
| 0 | 38 | 6 | 41 | 5 | 148 |
| 0.01% | 8 | 4 | 24 | 6 | 20 |
| 0.02% | 9 | 9 | 1 | - | - |
| 0.03% | 6 | 1 | 1 | - | 10 |
| 0.04% | 6 | - | - | 1 | - |
| 0.05% | 9 | - | - | - | - |
| 0.06% | 7 | - | - | - | - |
| 0.07% | 1 | - | - | - | - |
| 0.08% | 1 | - | - | - | - |
| 0.09% | 1 | - | - | - | - |
| 0.1% | 1 | - | - | - | - |
| 0.2% | 1 | - | - | - | - |
| 0.3% | 1 | - | - | - | - |
| 0.5% | 0 | - | - | - | - |
| DF-100 농도(%) | 처리조건별 미생물 수 (CFU) | ||||
| 무처리 | 1시간 | 5시간 | 10시간 | 24시간 | |
| 0 | 218 | 199 | 206 | 308 | 500 |
| 0.01% | 88 | 141 | 144 | 110 | 65 |
| 0.02% | 64 | 84 | 183 | 198 | 95 |
| 0.03% | 47 | 209 | 150 | 163 | 85 |
| 0.04% | 67 | 149 | 83 | 120 | 79 |
| 0.05% | 44 | 137 | 80 | 110 | 72 |
| 0.06% | 20 | 104 | 91 | 55 | 60 |
| 0.07% | 23 | 91 | 79 | 15 | 55 |
| 0.08% | 8 | 67 | 25 | 4 | 31 |
| 0.09% | 5 | 26 | 21 | 1 | 1 |
| 0.1% | 5 | 11 | - | - | - |
| 0.2% | 5 | - | - | - | - |
| 0.3% | 4 | - | - | - | - |
| 0.5% | 3 | - | - | - | - |
3. 최소저해활성
(1)실험방법
최소저해활성(MIC : Minimum Inhibition Concentration)은 DF-100을 농도별로 첨가한 Tryptic soy broth와 potato dextrose broth 9.5ml에 [실시예1]의 5년 숙성 옥매실 발효액 0.5ml을 접종하고 30℃에서 2~3일간 배양한 후 Tryptic soy agar배지와 PDA배지에 0.1ml씩 도말하여 생육여부를 확인함으로써 MIC값을 구하였다.
(2)실험결과
자몽종자추출물의 옥매실 발효액에 대한 최소저해농도는 아래 [표 13]에서와 같이 세균은 0.04%, 진균류는 0.1% 이상인 것으로 나타났다.
| 미생물 종류 | 최소저해농도 |
| 세균 | 0.04% |
| 진균류 | 0.1% |
4. 보존성 실험
(1)실험방법
생육저해활성실험과 최소저해활성실험 결과를 기초로 5년 숙성 옥매실 발효액 100ml에 DF-100을 0.07, 0.09 0.1% 첨가한 후 1,3,5,10,15,20,25,30일 동안 5℃와 30℃에서 배양하면서 TSA세균배지와 PDA진균 평판 배지에 도말하여 미생물생육 정도를 colony forming unit로 조사하였다.
(2)실험결과
미생물생육 정도를 확인한 결과 아래 [표 14] 및 [표 15]와 같이 나타냈다. 보는 바와 같이 세균은 0.07%에서, 진균류는 0.09% 농도에서 미생물 생육이 억제되었다.
| 보존 온도 |
농도(%) | 보존기간(일) 별 미생물 수 (CFU/100ml) | |||||||
| 1일 | 3일 | 5일 | 10일 | 15일 | 20일 | 25일 | 30일 | ||
| 5℃ | 0.07 | 14 | 4 | 15 | 24 | 8 | 15 | 17 | 12 |
| 0.09 | 1 | 1 | - | - | - | - | - | - | |
| 0.1 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 30℃ | 0.07 | 1 | 1 | 2 | - | - | - | - | - |
| 0.09 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 0.1 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 보존 온도 |
농도(%) | 보존기간(일) 별 미생물 수 (CFU/100ml) | |||||||
| 1일 | 3일 | 5일 | 10일 | 15일 | 20일 | 25일 | 30일 | ||
| 5℃ | 0.07 | 69 | 49 | 40 | 59 | 5 | 1 | 40 | 9 |
| 0.09 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 0.1 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 30℃ | 0.07 | 23 | 1 | 1 | - | - | - | - | - |
| 0.09 | 3 | - | - | - | - | - | - | - | |
| 0.1 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
[실시예4] 간기능 개선 활성
1. 실험개요
간세포는 Dickins와 Peterson의 방법에 따라 collagenase perfusion 방법으로 분리하였으며 perfusion 완충용액으로는 HBSS를 사용하였다. 100mg의 collagenase를 perfusion 완충용액에 녹여서 간세포로 환류시킴으로써 간을 완전히 녹였다. 녹인 간을 50㎖의 perfusion 완충용액이 든 용기에 옮겨 간의 capsule에서 간세포를 유리시킨 뒤에 간세포 현탁액을 250μm의 pore size를 갖는 nylon mesh를 통과시켜 단일 세포를 얻었다. 이렇게 얻은 여과액을 멸균된 tube에 옮겨서 50xg에서 4분간 3회 원심분리하여 간 실질세포만을 얻었고, 최종적으로 단일세포를 배양용 배지(Williams' E)에 현탁시켰다. 세포농도는 1×106 cells/㎖이 되도록 조정하고 collagen(Collagen corp., USA)이 코팅된 배양용 용기에 세포를 넣고 배양하였다. 간세포는 온도 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였고, 배양시작 후 3-4시간 후에 새로운 배지로 교환하여 배양용기 바닥에 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 새로운 배지로 교환한 다음 24시간 후에 다시 새로운 배지로 교환하면서 간손상 유발물질 내지 시료를 처리하였다. 간기능 개선 실험에는 간손상 유발물질로 t-BHP를 사용하고, 시료로 [실시예1]에 따라 제조한 옥매실 발효액을 당을 제거하여 사용하였다.
2. 옥매실 발효액의 간세포 독성 측정
(1)실험방법
간세포는 48well plate에 세포농도 5×106 cells/㎖로 조절하여 300㎕씩 well에 넣은 다음 시료를 농도별로 처리한 다음 6시간 배양하였다. 배양액을 교환한 후 MTT labeling reagent에 electron coupling reagent를 첨가하여 준비한 MTT labeling mixture를 각 well당 30㎕씩 (최종농도 0.5㎎/㎖) 4시간 처리한 후 550nm 파장에서 흡광도를 이용하여 세포독성을 조사하였다.
또한 시료의 간세포 손상에 대한 영향을 조사하기 위하여 배지 내의 LDH 활성을 측정하고자 기질 pyruvate가 lactate로 감소되는 정도를 조사하여 LDH 활성을 측정하였다. 0.1M potassium phosphate buffer(pH 7.5) 2.7㎖을 cuvette에 넣고 0.1㎖ culture media를 첨가하고, 0.02M sodium pyruvate 0.1㎖을 넣은 후, NADH (0.2㎎) 0.1㎖을 첨가하여 잘 섞어준 후 340nm 흡광도에서 2분 동안 흡광도를 측정하였다. LDH활성의 감소는 reduced NADH가 산화되고, 340nm에서 최대 흡광도를 나타낸다.
(2)실험결과
세포독성을 측정한 결과 도 2a 및 도 2b와 같이 나타냈다. 보는 바와 같이 모든 시험구에서 200㎍/㎖ 까지는 세포 독성이 없는 것을 MTT 및 LDH 분석을 통해 확인하였다
3. t-BHP에 의한 산화적 스트레스로 증가된 간세포 독성 측정
(1)실험방법
간세포를 배양한 지 4시간 후 새로운 배양액으로 갈아준 다음 24시간 동안 세포를 배양한 후 100mM과 250mM t-BHP를 6시간 처리하여 앞서 옥매실 발효액의 간세포 독성 측정 실험에서 살펴본 MTT 및 LDH 분석방법에 따라 실시하여 t-BHP에 의한 간세포 독성 유도 조건을 도 3a과 같이 확립하였다. 이 결과를 토대로 간세포를 배양한 지 4시간 후 새로운 배양액으로 교환한 다음 당이 제거된 옥매실 발효액을 24시간 전처리한 후 t-BHP를 6시간 처리하였을 때의 MTT 및 LDH 분석을 동일한 방법으로 실시하였다.
(2)실험결과
도 3b 및 도 3c에서와 같이 t-BHP에 의한 간세포 손상으로 증가된 독성이 옥매실 발효액의 농도에 의존하여 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 5년 숙성 매실에서 효과가 가장 우수한 것으로 확인할 수 있었다.
4. t-BHP에 의한 산화적 스트레스로 증가된 간세포의 지질과산화 측정
(1)실험방법
간손상 유발물질 및 시료를 농도별로 처리한 다음 6시간 배양한 후, 수확한 간세포를 Tris-HCl buffer(pH 7.4)에 넣은 후 균질화시킨 다음 과산화지질의 분해 생성물인 malondialdehyde(MDA)와 2-Thiobarbituric acid(TBA)를 100℃에서 20분간 가열 반응시켜 생긴 TBA pigment를 532nm에서 흡광을 측정하였다.
(2)실험결과
t-BHP에 의한 산화적 스트레스로 증가된 간세포 내 MDA(malondialdehyd) 양을 TBA법을 이용하여 측정한 결과, 도 4에서와 같이 t-BHP에 의해 증가된 간세포 내의 지질과산화가 옥매실 발효액의 농도 의존적으로 감소는 것을 확인할 수 있었다.
5. t-BHP에 의한 산화적 스트레스로 증가된 간세포의 GSH 측정
(1)실험방법
간 손상 유발물질 및 시료를 농도별로 처리한 다음 6시간 배양한 후, 간세포 내의 GSH 함량을 측정하였다. 수확한 간세포를 Tris-HCl buffer(pH 7.4)에 넣은 후 균질화시킨 다음 수용액을 12,000rpm에서 30분간 원심분리한 후 상등액 100μl을 취하였다. 이 상등액에 1.8ml phospate-EDTA buffer와 O-Phthaldiadehyde 100μl를 넣은 후 15분 후에 (Ex: 420nm, Em: 350nm)에서 형광을 측정하였다.
(2)실험결과
t-BHP에 의한 산화적 스트레스로 감소된 간세포 내 GSH 함량을 측정한 결과, 도 5에서와 같이 t-BHP에 의해 감소된 간세포내의 GSH 함량이 옥매실 발효액의 농도 의존적으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
6. t-BHP에 의한 산화적 스트레스로 증가된 간세포의 ROS 생성량 측정
(1)실험방법
간세포 내 ROS의 양은 형광 probe인 DCF-DA를 사용하여 측정하였다. 배양액에 DCF-DA를 well당 25μM로 처리하여 15분간 배양한 후 시료와 세포 내 ROS를 유발시키는 t-BHP(0.25 mM)를 처리하고 형성된 세포 내 과산화물은 Ex : 485nm, Em : 530nm에서 형광을 측정하였다.
(2)실험결과
t-BHP에 의한 간세포의 산화적 스트레스 유발로 증가된 간세포 내의 ROS 생성량은 도 6에서와 같이 옥매실 발효액의 농도에 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있다.
Claims (5)
- 수세 건조한 옥매실과 당을 동량 혼합하여 전통옹기에 첨가하는 제1단계;
하절기에도 13~17℃가 유지되는 동굴에서 1~5년간 숙성하는 제2단계;
3~7℃ 냉장시설에서 숙성된 매실액에 자몽종자추출물을 숙성된 매실액 대비 0.03~0.1중량% 첨가하여 30분~1시간 교반하는 제3단계;
포장하는 제4단계;
로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 간기능 개선효과를 가지는 비가열 동굴 숙성 옥매실 발효액 상품 제조방법. - 제1항에서,
상기 제4단계는, 당도 50brix 이상, pH 3.1~3.5, 세균수 20CFU/ml 이하, 진균수 50CFU/ml 이하, 대장균군 음성, 타르색소 불검출, 보존료 불검출에 대한 품질검사를 실시하는 과정을 더 포함하면서 이루어지는 것을 특징으로 하는 항산화 활성 및 간기능 개선효과를 가지는 비가열 동굴 숙성 옥매실 발효액 상품 제조방법. - 삭제
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| KR20100093355A (ko) * | 2009-02-16 | 2010-08-25 | 김이교 | 농축매실엑기스의 제조방법 |
| KR20100127537A (ko) * | 2009-05-26 | 2010-12-06 | 김원규 | 콜라겐, 아티초크추출물, ｌ-시스틴, 비타민 ｃ, 매실농축액, 폴리덱스트로스를 함유하는 기능성 음료조성물 |
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2012
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