KR20160008402A - 소청룡탕의 품질 판별 및 품질 표준화 방법 - Google Patents

소청룡탕의 품질 판별 및 품질 표준화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드를 표준물질로 하여 소청룡탕의 품질을 판별 및 품질을 표준화하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 소청룡탕의 품질을 판별하는 방법으로 소청룡탕 일부를 추출하여 소청룡탕 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 소청룡탕 추출물내 포함된 소청룡탕 표준물질의 함량을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 판별하고자 하는 품질은 소청룡탕의 항염증 효능이며, 상기 표준물질은 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드인 소청룡탕의 품질 판별 방법 및 이를 이용한 품질 표준화 방법을 제공한다. 또한 상기와 같은 품질 표준화 방법을 이용하여 제조한 항염증용 소청룡탕을 제공한다.

Description

소청룡탕의 품질 판별 및 품질 표준화 방법{Method for discriminant analysis and standardization of medicinal effect of So-Cheong-Ryoung-Tang}
본 명세서에 기재된 내용은 항염증 효능이 우수한 소청룡탕을 판별하고, 품질을 표준화하기 위한 방법에 관한 것이다.
평균 수명의 증가로 인해 고령화가 지속됨에 따라 만성질환 등의 수가 점차 늘어나고 있고 특히 기관지염 천식(asthma), 알레르기성 비염(allergic rhinitis) 등 만성 호흡기 질환(chronic respiratory diseases)은 산업화, 도시화에 따른 생활환경의 변화와 기후변화로 인해 점점 증가하고 있다. 세계보건기구(WHO)에 따르면 현재 전 세계적으로 3억 명의 사람들이 천식을 앓고 있으며, 2억 1000만명은 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)을 경험하고 있으며, 또한 수많은 사람들은 알레르기성 비염을 가지고 있다고 보고되었다. 우리나라의 경우 국민건강영양조사(2012)에 의하면, 19세 이상 연령층에서 의사진단 천식의 유병률은 2.7% 였으며, 한국인에서 발병되는 만성질환의 질병부감 순위가 5위로 나타났다. 기관지 천식(Bronchical asthma)이나 알레르기성 비염 등은 기도 염증(airway inflammation)에 의한 질환으로, 이는 호흡기 염증을 차단함으로써 호흡기 질환을 예방하거나 전문적인 치료 및 관리가 필요하여, 현재까지도 호흡기 염증성 질환을 예방하거나 치료할만한 새로운 치료법이나 약효를 가진 약재의 개발이 요구되고 있다.
염증을 유발하는 효소로 알려진 사이클로옥시제나아제(COX)에 의해 프로스타글란딘(prostaglandin)이 생성되게 되는데 이 COX 효소는 COX-1과 COX-2가 존재한다. 이러한 COX-1과 COX-2의 기능을 억제하기 위해 아스피린(Aspirin), 아세트아미노펜(acetaminophen) 등의 비스테로이드성 항염증제(non-steroidal anti inflammatory drugs)를 처방하는데, 이는 심장질환(cardiac disease)이나 위장질환(Gastrintestinal disease)의 부작용이 심각한 것으로 알려져 있다. 2000년대에 들어서 COX-2만을 선택적으로 억제하는 약물인 쎄레콕시브(celecoxib, celebrex®의 개발로 염증질환 등의 치료가 가속화되고 위장질환과 같은 부작용은 어느 정도 줄여주고 있긴 하지만 이 약물 역시 심장질환을 앓고 있는 환자들에게는 오히려 더 위험할 수 있는 문제점이 있다.
양약의 경우 하나의 유효성분이 특정 단백질이나, 수용체에 작용하는 접근법(mono-target approach)인 반면, 천연물로 이루어진 한약은 복합제제 형태로 여러 가지 작용점(multi-target approach)에 영향을 주며, 양약에 비해 종류가 다양하고 부작용이 보다 적으며 안정성이 좋기 때문에 전통적으로 질환예방 및 치료에 사용되어 왔다. 예를 들면 한약 중 소청룡탕은 전통적으로 상기와 같은 항염증 효능을 갖는 약으로서 처방되어 왔다.
하지만, 소청룡탕과 같은 한약의 약제는 식물에서 유래하기 때문에 그 활성성분들이 일정하게 분포하고 있지 않으며, 식물의 기원, 수확 지역 및 시기, 기온 등 외부적인 환경에 대해 그 활성성분들이 변화하여 약리 활성에도 영향을 미친다. 따라서 동일한 종류의 한약재를 사용하더라도 그 효능이 일관되지 않아, 복합 천연물제제인 한약재의 품질을 확보할 수 없고, 재현이 어렵다는 문제가 있었다.
대한민국등록특허공보 제10-0825041호 대한민국특허공개공보 제10-2013-0068317호 대한민국특허공개공보 제10-2011-0121487호
본 발명은 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드((2E,4E,8Z,10E)-N-isobutyldodeca-2,4,8,10-tetraenamide)가 소청룡탕내 항염증 유효성분임을 발견하고, 이를 표준물질로 하여 소청룡탕의 항염증 품질을 판별 및 분석하고, 품질을 표준화할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 구현예들은 소청룡탕의 품질을 판별하는 방법으로, 소청룡탕 일부를 추출하여 소청룡탕 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 소청룡탕 추출물내 포함된 소청룡탕 표준물질의 함량을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 판별하고자 하는 품질은 소청룡탕의 항염증 효능이며, 상기 표준물질은 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드 ((2E,4E,8Z,10E)-N-isobutyldeca-2,4,8,10-tetraenamide)인 소청룡탕의 품질 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예들은 상기 방법에 의해 마황(Ephedra Sinica), 작약(Paeonia Lactiflora), 오미자(Schisandra Chinensis), 반하(Pinellia Ternate), 세신(Asiasarum Heterotropoides), 건강(Zingiberis Officinale), 계지(Cinnamomum cassia) 및 감초(Glycyrrhiza Uralensis)의 혼합물인 소청룡탕의 품질을 판별한 결과 소청룡탕의 표준물질의 함량이 기준치보다 낮은 것으로 판별되면, 상기 소청룡탕에 혼합되는 세신을 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드를 더 많이 포함하는 것으로 교체하는 단계를 포함하는 소청룡탕의 품질 표준화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 구현예들은 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드((2E,4E,8Z,10E)-N-isobutyldeca-2,4,8,10-tetraenamide)을 소청룡탕 총 중량에 대하여 0.15 중량% 이상으로 포함하는 항염증용 소청룡탕을 제공한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 구현예들은 소청룡탕의 품질을 판별하는 방법으로, 소청룡탕 일부를 추출하여 소청룡탕 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 소청룡탕 추출물내 포함된 소청룡탕 표준물질의 함량을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 판별하고자 하는 품질은 소청룡탕의 항염증 효능이며, 상기 표준물질은 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드((2E,4E,8Z,10E)-N-isobutyldeca-2,4,8,10-tetraenamide)인 소청룡탕의 품질 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예들은 상기 방법에 의해 마황(Ephedra Sinica), 작약(Paeonia Lactiflora), 오미자(Schisandra Chinensis), 반하(Pinellia Ternate), 세신(Asiasarum Heterotropoides), 건강(Zingiberis Officinale), 계지(Cinnamomum cassia) 및 감초(Glycyrrhiza Uralensis)의 혼합물인 소청룡탕의 품질을 판별한 결과 소청룡탕의 표준물질의 함량이 기준치보다 낮은 것으로 판별되면, 상기 소청룡탕에 혼합되는 세신을 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드를 더 많이 포함하는 것으로 교체하는 단계를 포함하는 소청룡탕의 품질 표준화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 구현예들은 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드((2E,4E,8Z,10E)-N-isobutyldeca-2,4,8,10-tetraenamide)을 소청룡탕 총 중량에 대하여 0.15 중량% 이상으로 포함하는 항염증용 소청룡탕을 제공한다.
본 발명에 따른 소청룡탕의 품질 판별 방법에서 표준물질로 사용되는 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드는 세포독성이 없는 범위의 마우스 대식세포주 모델에서 COX-2를 발현 및 PGE2 생성을 동시에 억제하는 성분이므로, 분석 표준물질로서 유용하다. 따라서, 본 발명에 따른 소청룡탕의 품질 판별 방법은 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드의 함량을 분석함으로써 항염증 치료에 보다 효과적인 소청룡탕을 판별하고, 이를 조절함으로써 소청룡탕의 품질을 표준화할 수 있다. 또한, 상기 유효성분을 대량화하면 우수한 염증 개선 및 치료 효과를 갖는 항염증용 소청룡탕을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 소청룡탕 표준물질로서 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드가 적합한지 여부를 판단한 방법을 단계별로 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 초고속 액체크로마토그래피와 연결된 질량분석기를 이용하여 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드의 검출을 나타낸 크로마토그램이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 추출방법에 따른 소청룡탕 추출물 내의 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드 함량을 비교한 크로마토그램이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 추출방법에 따른 소청룡탕 추출물 내의 전체 유효성분 함량과 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드의 함량을 비교하여 나타낸 그래프이다. y축은 70% 에탄올 추출물의 전체 유효성분을 총 100%로 보았을 때, 전체유효성분과 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드의 함량을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에서 70% 에탄올 추출물의 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드 농도를 100%로 보았을 때, 이에 대한 증류수 환류 추출물 및 약탕기 추출물에 함유된 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드의 함량%를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에서 농도를 달리하여 ((2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드를 처리했을 때, COX-2의 양을 웨스턴 블랏 방법으로 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 2에서 농도를 달리하여 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드를 처리했을 때, PGE2의 분비량을 비교하여 나타낸 것이다.
본 명세서에서 "표준물질 (standard reference material)"이라 함은, 소청룡탕의 항염증 효능정도를 평가하는데 척도가 되는, 표준으로 사용하는 물질을 의미한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 구현예들은 소청룡탕의 품질을 판별하는 방법으로, 소청룡탕 일부를 추출하여 소청룡탕 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 소청룡탕 추출물내 포함된 소청룡탕 표준물질의 함량을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 판별하고자 하는 품질은 소청룡탕의 항염증 효능이며, 상기 표준물질은 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드((2E,4E,8Z,10E)-N-isobutyldeca-2,4,8,10-tetraenamide)인 소청룡탕의 품질 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 구현예들에 따른 상기 "소청룡탕(So-Cheong-Ryoung-Tang, Sho-seiryu-to, Xial-Qing-Long-Tang)"은 감기, 알레르기성 비염, 기관지염이나 천식 등에 널리 처방되고 있는 대표적인 한방 의약품으로, 약 백 년 전부터 동아시아 지역을 중심으로 사용되어 왔다. 마황(Ephedra Sinica), 작약(Paeonia Lactiflora), 오미자(Schisandra Chinensis), 반하(Pinellia Ternate), 세신(Asiasarum Heterotropoides), 건강(Zingiberis Officinale), 계지(Cinnamomum cassia) 및 감초(Glycyrrhiza Uralensis)로 이루어진 한약재의 혼합물이다. 소청룡탕의 효과를 입증하기 위해 생체내 및 생체외 실험이 진행되고 있지만 소청룡탕의 약물학적인 매커니즘(Pharmacologic mechanism)은 아직 자세하게 밝혀지지 않았다. 상기 소청룡탕에 포함되는 세신의 함량은 소청룡탕 총 중량에 대하여 8~12 중량%로 포함할 수 있고, 구체적으로는 9~11중량%, 보다 구체적으로는 10 중량%로 포함할 수 있으나, 통상적으로 소청룡탕을 제조할 때 포함되는 함량이라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 일 구현예에 따른 마황, 작약, 오미자, 반하, 세신, 건강, 계지 및 감초의 혼합비(소청룡탕 총 중량에 대한 중량%)는 12~18 : 12~18 : 12~18 : 12~18 : 8~12 : 8~12 : 8~12 : 8~12, 보다 구체적으로는 15:15:15:15:10:10:10:10이나, 통상적으로 소청룡탕을 제조할 때의 비율이라면 이에 제한되지 않고 배합이 가능하다.
소청룡탕에서 알레르기성 비염 등의 항염증성 효과는 감초(Glycyrrhiza Uralensis)의 유효성분인 글리시리직 애씨드(glycyrrhizic acid)가 효능을 나타내며 스테로이드호르몬을 비 활성화시키는 △4β-리덕타제(reductase)의 활성을 경쟁적으로 억제함으로써 코르티솔(cortisol)의 작용을 강화시킨다고 보고되어 있다. 소청룡탕에 포함되는 또다른 한약재인 세신(Asiasarum Heterotropoides)은 해열, 진정, 진통, 국소마취, 면역억제작용과 항염증 반응에 기여하며, 세신의 유효성분 중 유제놀(eugenol), 메틸유제놀(methyleugenol) 등이 5-리폭시제나제(5-lipoxygenase)와 COX-2의 저해를 활성하여 항염증 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 본 발명은 현재까지 알려진 성분이 아닌 세신에서 새로이 발견된 유효성분인 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드가 효과적으로 염증을 억제시킴을 밝혀내고, 이를 효능의 척도가 되는 표준물질로 이용하여 소청룡탕의 처방전에 해당 소청룡탕의 항염증 효능정도를 예측할 수 있는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 구현예들에 따른 표준물질인 상기 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드는 소청룡탕에 포함되는 구성 약재중 하나인 세신에 포함된 유효성분으로, 그 구조는 하기와 같다.
Figure pat00001
상기 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드는 세포독성이 없는 범위의 마우스 대식세포주 모델에서 COX-2의 발현을 억제함과 동시에 PGE2 생성을 억제하여, 염증의 억제 및 개선에 우수한 효과를 제공할 수 있다.
일 구현예에 따르면 상기 소청룡탕 추출물을 제조하는 단계는 소청룡탕을 유기용매, 구체적으로 저급 알코올 및 물의 혼합용매를 추출용매로 하는 추출법, 물을 추출용매로 하는 추출법 및 약탕기 추출법에서 선택된 방법으로 추출하는 것을 포함할 수 있다. 저급 알코올 및 물의 혼합용매를 추출용매로 하는 추출법의 저급 알코올은 탄소수가 1 내지 5인 알코올을 의미하며, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 알코올 및 물의 혼합용매 또는 70% 에탄올을 추출용매로 하여 환류 추출하는 것을 예로 들 수 있다. 물을 추출용매로 하는 추출법은 100℃의 고온의 증류수에서 환류 추출하는 것을 포함할 수 있다. 약탕기 추출법은 추출대상을 약탕기에 넣고 초탕한 후 여과하지 않고 얻은 약액과 물을 혼합하여 재탕하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 일 구현예에 따르면 상기 표준물질의 함량은 질량분석기를 사용하여 측정할 수 있으며, 보다 구체적으로는 초고속 액체크로마토그래피와 연결된 질량분석기를 이용하여 소청룡탕 추출물에 포함된 표준물질의 함량을 정성 분석할 수 있다.
본 발명의 구현예들에 따른 품질 판별 방법은 상기 함량을 측정하는 단계 후, 측정된 함량이 기준치 이상이면 품질을 '적합', 기준치 미만이면 '부적합'으로 소청룡탕의 품질을 판별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 구현예에 따른 상기 기준치는 소청룡탕 총 중량에 대한 표준물질의 함량이 0.10~0.20중량%, 보다 구체적으로는 0.15중량%인 것을 예로 들 수 있다.
본 발명의 다른 구현예들은 상기와 같은 소청룡탕의 품질 반별 방법에 의해 소청룡탕의 품질을 판별한 결과, 소청룡탕의 표준물질의 함량이 기준치보다 낮은 것으로 판별되면, 상기 소청룡탕에 혼합되는 세신을 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드를 더 많이 포함하는 것으로 교체하는 단계를 포함하는 소청룡탕의 품질 표준화 방법을 제공한다. 일 구현예로서 상기 기준치는 표준물질의 함량이 0.10~0.20중량%, 보다 구체적으로는 0.15중량%인 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 구현예들은 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드를 소청룡탕 총 중량에 대하여 0.15 중량% 이상으로 포함하는 항염증용 소청룡탕을 제공할 수 있다. 일 구현예로서 상기 소청룡탕은 상기 기재된 품질 표준화 방법에 의해 품질이 표준화된 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예를 통하여 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 하기의 실시예의 범위로 제한되는 것은 아니다.
또한, 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자이면 누구나 이 발명의 기술 사상의 범주를 이탈하지 않고 첨부한 특허청구범위 내에서 다양한 변형 및 모방이 가능함은 명백한 사실이다.
[실시예1] 소청룡탕의 표준물질로서 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드의 적합성 판단
소청룡탕 추출물의 제조
먼저, 소청룡탕에 포함되는 한약재 8가지, 마황, 작약, 오미자, 반하, 세신, 건강, 계지 및 감초를 각각 다른 구입처(n) 3곳 또는 4곳에서 구입하고, 하기 표 1 및 2에 나타낸 바와 같이 각 유효성분의 함량의 순서대로 각 약재의 상, 중 하를 정하고, 각 약재의 상품끼리, 중품끼리, 하품끼리 3 :3 :3 :3 :2 :2 :2 :2 (마황: 작약: 오미자: 반하: 세신: 건강: 계지: 감초) 의 혼합비로 혼합하고 혼합 약재 100g을 취하여 이를 70% 에탄올, 물로 각각 환류추출, 그리고 약탕기를 사용하여 추출하여 소청룡탕의 70% 에탄올 추출물, 물 추출물, 약탕기 추출물을 제조하였다.
Figure pat00002
Figure pat00003
이때 추출방법은 다음과 같다.
물을 추출용매로 하는 추출은 혼합약재를 3차 증류수에 2시간 동안 100℃에서, 저급 알코올 및 물의 혼합용매로서 70% 에탄올을 추출용매로 하는 추출은 혼합약재를 70% 에탄올에 2시간 동안 80℃에서 환류 추출하였다. 상기 각 추출용매의 양은 한약재의 무게의 10배의 용매(mg)를 처리하였다. 그 다음, 20호 정성(qualitative) 필터 여과지(Whatman사)을 이용해 진공상태에서 각각 여과한 후, 여액을 코니컬 튜브에 담아 4℃에 보관하였다. 약탕기추출은 혼합약재를 호전기약탕기(대웅, 한국)에 넣고 정수 700 mL를 붓고 2시간 동안 초탕한 후 여과하지 않고 얻은 약액을 제조하고, 상기 약액에 정수 300 mL을 붓고 1시간 재탕한 후 여과하지 않고 얻은 약액을 섞어 최종 소청룡탕 추출물을 제조하였다. 제조된 상기 소청룡탕 추출물은 사용할 때까지 영하 20℃에 보관하였다(도 1의 1 참조).
소청룡탕 추출물의 성분분석
상기 제조된 각 소청룡탕 추출물을 초고속액체크로마토그램-질량분석기(ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry; UPLC-QTOF-MS)를 사용하여, ESI(electrospray ionization)의 포지티브 모드(positive mode)와 네거티브 모드(negative mode)에서 각각 MSE 모드로 분석하였다. 또한 검출기로 PDA를 이용하여 230에서 280nm까지 자외선으로 분석하였다. 분석 컬럼은 UPLC용 컬럼으로 ACQUITY BEH C18(2.1×100 mm, 1.7㎛)를 사용하였고, 컬럼 온도와 오토-샘플러(auto-sampler) 온도는 각각 50℃, 4℃로 설정하였다. 이동상으로는 0.1% 포름산(formic acid)이 포함된 1% 아세트나이트릴(이동상 A)와 0.1% 포름산(formic acid)이 포함된 99% 아세트나이트릴(이동상 B)을 사용하여 그래디언트 조건(gradient condition)으로 분석하였다.
상기 소청룡탕 배합약재와 각 한약재들의 유효성분을 확인하기 위해 마커링스(MarkerLynx) 프로그램(Waters 사)을 사용하였다. 이때 상기 한약재는 산지가 다른 각 한약재들을 3차 증류수에 1000배, 100배, 10배로 계단희석하여 최종 50μg/mL로 프로파일링 하였다. 내부표준물질(Internal standard, IS)로는 10μg/mL 파클리탁셀(paclitaxel)을 사용하였다. 소청룡탕 배합약재와 상기 한약재의 TIC(total ion chromatogram)에서 유효성분의 정확한 질량(exact mass)값을 탐색하였고, XIC(extract ion chromatogram)를 확인한 후, 스펙트럼으로 질량(mass)값이 일치하는지 확인하였다. 이 유효성분을 정량하여 상, 중, 하로 나누었다(도 1의 2 참조).
그 다음, 상기 소청룡탕 추출물들을 한약재 각각의 기존에 알려진 유효성분 (표1에 기재된 유효성분)의 함량이 가장 높은 약재를 취합하여 8가지 유효성분의 함량이 모두 가장 많이 포함된 순서대로 등급을 매겨, 등급이 가장 좋은 소청룡탕 배합 추출물(상)과 중간(중)과 가장 낮은 등급(하)을 부여하였다(하기 표 3 및 도 1의 3 참조).
추출 방법 추출방법에 따른 등급
70% 에탄올 환류추출 상
증류수 환류추출 중
약탕기추출 하
상기 3가지의 추출방법 중 70% 에탄올 추출에서 유효성분의 함량이 가장 많았고, 그 다음으로 물과 약탕기추출 순이었다. 또한 각 추출방법에 따른 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드의 함량도 상 중 하의 등급이 유효성분의 등급과 일치하였다. (표 4 참조)
다음으로, 상기 소청룡탕의 한약재 중 세신의 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드만의 피크면적(peak area)을 분석하여 그 함량을 비교하고(도 2 참조), 그 함량에 따라 등급을 상, 중, 하로 정하였다(도 1의 4 참조)
그러나 70% 에탄올 추출물 내에서 상, 중, 하 등급, 물 추출물 내에서 상, 중, 하 등급 그리고 약탕기 추출물 내에서 상, 중, 하 등급의 유효성분의 총량은 소청룡탕 혼합 전의 유효성분 함량인 상, 중, 하의 등급과 맞지 않았으며, 혼합 약재 중 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드의 비율도 총 유효성분의 등급과 같지 않았다(하기 표 4 참조). 그러나 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드가 적절히 추출된 것으로 보이는 70% 에탄올 추출물에서는 혼합 전 구성약재의 유효성분 함량의 합에 따른 소청룡탕의 등급이 혼합 후 소청룡탕 약재 중량에 대한 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드 함량에 따른 등급과 일치하였다. 이는 유효성분 중 유일하게 항염증 작용이 있음이 입증된 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드로 소청룡탕의 품질을 판별할 수 있음을 의미한다(하기 표 5 참조).
또한, 하기 표 4에 나타난 바와 같이 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드가 적절히 추출된 것으로 보이는 70% 에탄올 추출물의 경우 소청룡탕 총 중량에 대한 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드의 함량이 약 0.15중량% 이상인 것으로 나타났다. 따라서, 소청룡탕의 품질의 적합성을 판별함에 있어 본 발명의 일구현예에 따른 기준치를 0.15중량%로 정하였다.
추출용매 혼합전 각 약재의 유효성분 함량의 합에 따른 소청룡탕의 등급 혼합 후 약재 중량에 대한 총 유효성분 양 (%) 유효성분에 따른 등급 총 유효성분 양 중 (2E,4E,8Z,10E)N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드 함량 (%) 혼합 후 소청룡탕 약재 중량에 대한 (2E,4E,8Z,10E)N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드 함량 (%) 혼합 후 소청룡탕 약재 중량에 대한 (2E,4E,8Z,10E)N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드 함량에 따른 등급
70% 에탄올 상 0.109 상 1.552 0.228 상
중 0.088 하 2.016 0.177 중
하 0.091 중 1.684 0.153 하
물 상 0.052 상 0.383 0.020 하
중 0.057 하 0.728 0.041 상
하 0.056 중 0.680 0.038 중
약탕기추출 상 0.0148 상 0 -
중 0.0089 중 0 -
하 0.0087 하 0 -
분류 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드 함량(ng) 소청룡탕 속 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드 등급 소청룡탕의 등급
70% 에탄올 환류추출 86.88 상 상
증류수 환류추출 16.91 중 중
약탕기추출 - 하 하
도 3은 크로마토그램에서 검출된 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드 피크를 나타낸 것으로, 상기 표 3의 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드의 함량값은 추출방법에 따른 세신 내에 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드의 함량을 도 3에 나타난 피크의 면적으로 나타낸 것이다.
도 4는 상기 추출방법에 따른 소청룡탕 추출물 내의 전체 유효성분 함량과 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드의 함량을 비교하여 나타낸 그래프이다. 이때 y축은 70% 에탄올 추출물의 전체 유효성분을 총 100%로 보았을 때, 전체유효성분과 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드의 함량을 나타낸 것이다. 도 5는 상기 70% 에탄올 추출물의 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드 농도를 100%로 보았을 때, 이에 대한 증류수 환류 추출물 및 약탕기 추출물에 함유된 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드의 함량%를 나타낸 것이다.
상기 결과는 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드를 표준물질로 하여 소청룡탕의 항염증 효능을 예측하고 소청룡탕의 품질을 판별할 수 있음을 의미한다. 또한 이를 기초로 소청룡탕을 염증성 질환에 대한 치료 및 예방에 유용하도록 품질을 표준화할 수 있는 방법을 제시할 수 있다.
[실시예 2] (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드의 항염증 효능 확인
소청룡탕 분획물 중 유효분획 및 구조 확인
상기 실시예 1에서 제조된 소청룡탕의 70% 에탄올 추출물을 소분획화 하는 sepbox 시스템을 활용하여 13개의 분획으로 나누었고, 이 중 10번 분획에서만 (S10) 마우스 대식세포주 모델(RAW264.7 cells)에서 각 분획물을 10, 30 μg/mL을 처리했을 때의 COX-2 발현억제 및 PGE2 생성억제 효과를 확인하였다. 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 은 10% 우태아혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지에서 배양하였다.
따라서 종합적으로 COX-2 및 프로스타글란딘 억제분획으로 Deoxyshizandrin, gomisin N, (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드가 포함된 분획인 S10을 소청룡탕의 유효분획으로 결정하였다. 이 유효분획의 구조를 규명할 결과 상기 화학식 1과 같은 구조를 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드임을 확인하였으며 이미 염증 작용을 하는 것으로 알려진 glycyrrhizic acid는 분획에서 전혀 검출되지 않았으며, Deoxyshizandrin, gomisin N, (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드가 검출되었고 이 중 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드만이 COX-2 발현억제 및 PGE2 생성억제 효과를 나타내었다, 이를 아래에 기술하였다.
유효한 분획물의 항염증 효능 확인
웨스턴 블롯 분석은 6 웰 세포배양접시에 1X10^6 개로 세포를 분주하고 혈청이 없는 배지로 교체한 후 약물을 처리하고 30분이 지난 후 LPS 0.1 μg/ml 농도가 되도록 처리하고 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 상등액을 제거하고 차가운 인산염 완충액으로 세척 후 Lysis 버퍼 (10 mM Tris-Cl (pH 7.1), 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10% 글리세롤, 0.5% Triton X-100, 프로테아제 억제제(protease inhibitor; cat. 11697498001, Roche))를 1시간 동안 처리하여 세포를 용해시킨 후 원심분리하고 상등액을 취하였다. 얻은 상등액은 10% SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 이동시켜 COX-2 항체 (cat. sc1745, Santa crus) 및 Actin 항체(A5316, Sigma) 와 반응시킨 후 HRP 효소와 반응을 LAS-3000 mini (FUJIFILM) 장비를 이용하여 측정하였다. PGE2 정량하기 위하여 6 웰 세포배양접시에 1X106 개로 세포를 분주하고 혈청이 없는 배지로 교체한 후 약물을 처리하고 30분이 지난 후 LPS 0.1μg/ml 농도가 되도록 처리하고 37℃에서 18시간 동안 배양하여 얻은 세포상등액 100 마이크로리터를 이용하여 효소면역정량키트(cat. ADI-900-001, Enzo life science)를 수행하였다. (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드를 0.3, 1 그리고 3 μM농도로 처리한 결과, 도 6 및 7에 나타난 바와 같이 COX-2와 PGE2의 생성이 농도에 따라 억제되는 것을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 소청룡탕의 품질을 판별하는 방법으로,
    소청룡탕 일부를 추출하여 소청룡탕 추출물을 제조하는 단계; 및
    상기 소청룡탕 추출물내 포함된 소청룡탕 표준물질의 함량을 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 판별하고자 하는 품질은 소청룡탕의 항염증 효능이며,
    상기 표준물질은 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드((2E,4E,8Z,10E)-N-isobutyldeca-2,4,8,10-tetraenamide)인 소청룡탕의 품질 판별 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 함량을 측정하는 단계 후, 측정된 함량이 기준치 이상이면 품질을 '적합', 기준치 미만이면 '부적합'으로 소청룡탕의 품질을 판별하는 단계를 더 포함하는 소청룡탕의 품질 판별 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 기준치는 소청룡탕 총 중량에 대한 표준물질의 함량이 0.15 중량%인 소청룡탕의 품질 판별 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 소청룡탕 추출물을 제조하는 단계는 소청룡탕을 저급 알코올 및 물의 혼합용매를 추출용매로 하는 추출법, 물을 추출용매로 하는 추출법 및 약탕기 추출법에서 선택된 방법으로 추출하는 것을 포함하는 소청룡탕의 품질 판별 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 소청룡탕은 마황(Ephedra Sinica), 작약(Paeonia Lactiflora), 오미자(Schisandra Chinensis), 반하(Pinellia Ternate), 세신(Asiasarum Heterotropoides), 건강(Zingiberis Officinale), 계지(Cinnamomum cassia) 및 감초(Glycyrrhiza Uralensis)의 혼합물인 소청룡탕의 품질 판별 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드는 세신에 포함된 유효성분인 소청룡탕의 품질 판별 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 하나의 방법에 의해 마황(Ephedra Sinica), 작약(Paeonia Lactiflora), 오미자(Schisandra Chinensis), 반하(Pinellia Ternate), 세신(Asiasarum Heterotropoides), 건강(Zingiberis Officinale), 계지(Cinnamomum cassia) 및 감초(Glycyrrhiza Uralensis)의 혼합물인 소청룡탕의 품질을 판별한 결과 소청룡탕의 표준물질의 함량이 기준치보다 낮은 것으로 판별되면, 상기 소청룡탕에 혼합되는 세신을 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드를 더 많이 포함하는 것으로 교체하는 단계를 포함하는 소청룡탕의 품질 표준화 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 기준치는 소청룡탕 총 중량에 대한 표준물질의 함량이 0.15중량%인 소청룡탕의 품질 표준화 방법.
  9. (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드((2E,4E,8Z,10E)-N-isobutyldeca-2,4,8,10-tetraenamide)를 소청룡탕 총 중량에 대하여 0.15 중량% 이상으로 포함하는 항염증용 소청룡탕.
  10. 제 7 항의 방법에 의해 품질이 표준화하여 (2E,4E,8Z,10E)-N-이소부틸도데카-2,4,8,10-테트라엔아마이드((2E,4E,8Z,10E)-N-isobutyldeca-2,4,8,10-tetraenamide)를 소청룡탕 총 중량에 대하여 0.15 중량% 이상으로 포함하는 항염증용 소청룡탕.
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