KR101732022B1

KR101732022B1 - 지유 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스 조성물

Info

Publication number: KR101732022B1
Application number: KR1020150086844A
Authority: KR
Inventors: 강소영; 서중경; 도청이
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2015-06-18
Filing date: 2015-06-18
Publication date: 2017-05-12
Also published as: KR20160150177A

Abstract

본 발명은 지유(Sanguisorba officinalis L.) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 상기 항바이러스 조성물은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus; VHSV) 및 전염성 조혈 괴저 바이러스(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; IHNV)에 대하여 우수한 항바이러스 활성을 나타낸다.

Description

지유 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스 조성물{Anti-Viral Compositions against Fish Pathogenic Virus comprising Extract or Fractions from Sanguisorba officinlis as Active Ingredient}

본 발명은 지유(Sanguisorba officinalis L.) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스 조성물에 관한 것이다.

수산양식업에 있어 전 세계적으로 문제가 되고 있는 수산양식생물 질병의 국내 발생 현황을 살펴보면, 1990년대 전반의 발병률이 5% 미만에 불과하던 것이 1990년대 후반부터는 15% 내외로 증가하고 있으며, 고수온기에 주로 발생하던 질병들이 연중 발생하는 추세에 있다. 그 중에서도 난치성 바이러스성 전염병의 발생 증가에 의한 양식 어류의 피해가 증대되고 있으며, 약제 오남용에 의한 내성균의 출현 증가로 치료 효과가 저하되고 있는 실정이다. 특히, 최근에 들어서는 국외로부터의 양식용 종묘의 수입량 증가로 인하여 신종 외래 전염병의 유입 위험성이 증대되고 있으며, 감염 종묘의 이동에 의한 질병의 확산이 우려되고 있다. 특히, 연어 및 송어과 어류의 전염성 조혈 괴저 바이러스(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; IHNV) 및 전염성 췌장 괴저 바이러스(Infectious Pacreatic Necrosis Virus; IPNV)의 감염에 의한 피해는 1970년대 이후 지속적으로 발생되고 있으나, 그 치료를 위해 사용되어질 수 있는 적절한 약품의 개발은 국내외를 막론하고 없는 실정이다.

어류에 치사성을 가진 산업적으로 중요한 질병을 일으키는 바이러스 중에서 분리배양이 가능한 질병으로서는 연어과 어류의 전염성 조혈 괴저 바이러스가 원인이 되어지는 전염성 조혈 괴사병(Infectious Hematopoietic Necrosis Disease; IHND), 전염성 췌장 괴사 바이러스가 원인으로 작용하는 전염성 췌장 괴사병(Infectious Pacreatic Necrosis Disease; IPND) 및 바이러스성 출혈성 폐혈증 바이러스(Viral Hemorhagic Septicemia Virus; VHSV)의 원인에 의한 바이러스성 출혈성 폐혈병(Viral Hemorhagic Septicemia Disease; VHSD)가 가장 널리 알려져 있고 전 세계적으로 그 피해 또한 가장 심각한 질병으로 알려져 있다.

전염성 조혈 괴사 바이러스는 1969년 Amend 등에 의해서 무지개송어에서 처음으로 분리 보고되어진 바이러스로서, 우리나라에서는 양식산 무지개송어 치어에서 1992년 처음 보고되어졌다. 병어의 신장과 비장, 특히 신장의 조혈조직에 심한 괴사가 주요 특징으로 원인바이러스는 포탄형의 형태를 보이고, 평균크기는 길이 160-180 ㎚, 직경 80-90 ㎚의 랩도바이러스과(Rhabdoviridae) 노비랩도바이러스속(Novirhabdovirus)으로 분류되어져있다(van Regenmortel et al., 2000). 전염성 조혈 괴사 바이러스에 의한 사망률은 70-80%에 달한다. 무지개송어, 산천어, 송어에 피해가 크다. 본 병은 발견당시 미국 서해연안의 홍연어 및 치눅 살몬(chinook salmon)의 풍토병적인 성격을 갖는 것으로 생각했었지만 무지개송어에서의 발증이 확인된 이후, 미국 각지에서 발생이 확인되어 1970년대에 일본 및 대만, 1990년대에 유럽각지로 확대되었다.

바이러스성 출혈성 패혈증에 관해서는 예전부터 무지개송어의 신종창(Nierenschwellung), 전염성 신종창간병성증(Infektiose Nierenschwellung und Leberdegeneration=INuL)등으로 불리어져왔다(Sch, 1954; Heutschmann, 1952). 1962년 국제수역기구(Office International des Epizooties:OIE)의 어병 심포지움에서 보고되었고(Jensen, 1963), 원인바이러스를 바이러스성 출혈성 폐혈증 바이러스로 정하였다. 바이러스성 출혈성 패혈증는 유럽, 북미, 아시아 지역에 매우 널리 발병하며, 무지개송어, 은연어, 강송어, 브라운송어, 스틸헤드 트로우트(steelhead trout) 등의 연어과 어류뿐만 아니라 대구, 청어등과 같은 자연수계의 어류 및 넙치등과 같은 해산양식어류에서도 널리 발생하여 그 피해가 매우 심각히 우려되어지고 있다. 원인체인 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스는 길이 160-180 ㎚, 직경 70-80 ㎚의 포탄형으로, ss-RNA바이러스로서 노비랩도바이러스속에 분류되어 있다(van Regenmortel et al., 2000). 폐사율은 조건에 따라 큰 폭으로 변하지만, 일반적으로 20-80%의 범위로 피해를 입힌다.

연어과 어류의 주요 병원체인 전염성 조혈 괴사 바이러스, 전염성 췌장 괴사 바이러스 및 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 감염예방법의 일환으로 백신개발의 연구가 진행되어 불활화백신, 약독화생백신, 성분백신 그리고 DNA백신 등 활발한 연구가 진행되어 왔으며(Fryer et al.(1976); Fukuda et al(1989a,b); Gilmore et al., 1988; LaPatra et al., 2002), 일부는 예방백신으로 적용되어지고 있다.

아울러 어체 바이러스 보유어가 존재하는 수계에서는 수평감염이 일어날 가능성이 있으므로 전파방지를 위해 시설의 소독과 바이러스가 없는 용수의 확보, 난의 소독 등이 연구되어 적용되어지고 있다(Amend and Pietsch 1972; 吉水, 笠井, 2002). 하지만 감염어의 치료를 목적으로 적용되어질 수 있는 약제의 개발에는 큰 성과가 보고 되어지고 있지 않은 실정이다.

전염성 조혈 괴사 바이러스 및 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 화학요법에 관련해서는 항바이러스제인 소디움 벤지미다졸(sodium benzimidazole)을 40 ㎍/㎖ 이상으로 처리하여 FHM(Fathead Minnow) 세포에서의 바이러스의 증식을 억제했지만(Amend, 1976), 인 비보 실험은 아직 실행되지 않았다. 또한 양어지나 하천에서 분리한 세균의 배양액이나 허브, 한방생약에 항-IHNV 활성이 발견되었고, 인 비보 효과가 인정되었었지만(Direkusarakom, 1996) 아직 실용화에 이르지는 못하였다. 1999년 Fabregas등은 수종의 해양미세조류배양농축액을 이용하여 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 증식저해를 조사하여 그 사용가능성을 제시한 예가 있으나 그 이후의 연구결과는 발표되어지고 있지 않는 것으로 사료된다.

지유(地楡, Sanguisorbae Radix)는 오이풀(Sanguisorva officinalis Linne, Rosaceae) 및 동속 근연식물의 뿌리와 근경이다. 봄 발아 전 또는 가을에 잎과 줄기가 마른 다음에 뿌리는 캐서 가는 줄기와 수염뿌리를 제거하고 깨끗이 씻어서 햇볕에 말린다. 지유에서 분리 및 보고된 물질로는 탄닌(tannin), 트리테르페노이드(triterpenoid) 및 이의 배당체 형태인 사포닌(saponin)이 있다. 트리테르페노이드는 포몰산(pomolic acid) 및 이의 유도체들이 있으며, 이의 사포닌으로 지유글리코시드(ziyuglycoside) I, II 등이 보고되었다. 그 생리 활성으로는 항균, 항바이러스, 항산화, 항염증, 면역조절 등 다양한 생리활성이 지유 추출물과 이로부터 분리된 다양한 화합물에 대하여 보고되어 있다. 그러나, 현재까지 지유 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물들의 어류병원성바이러스에 대한 항바이러스 활성은 보고된 바 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 수산양식업에 있어 문제가 되고 있는 어류병원성 바이러스에 대한 항바이러스 조성물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 천연물인 지유로부터 추출한 추출물 및 이의 분획물의 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 어류병원성 바이러스에 의한 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 어류병원성 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 갖는 어류 사료 또는 어류 사료 첨가용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 어류 면역증강활성을 갖는 어류 사료 및 어류사료 첨가용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 지유(Sanguisorba officinalis L.) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 수산양식업에 있어 문제가 되고 있는 어류병원성 바이러스에 대한 항바이러스 조성물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 천연물인 지유로부터 추출한 추출물 및 이의 분획물의 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 규명하였다.

본 발명의 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스 조성물은 지유 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 지유 추출물은 지유에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 추출용매로서 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(본 발명의 일 구현예에 따르면, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 메틸렌 클로라이드, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (b) 물, (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 메틸렌 클로라이드, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 추출물은 물, 메탄올 또는 이의 조합을 지유에 처리하여 수득한 것이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 지유 추출물은 메탄올로 추출한 지유 추출물이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 지유 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 지유 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명에서 이용되는 지유 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

한편, 본 발명의 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 본 발명의 추출물이 얻어질 수 다는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 또한, 상기 추출 용매와 함께 초음파 처리를 하여 추출물을 수득할 수 있다.

본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 하기의 지유 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함된 지유 추출물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 지유 추출물 또는 분획물은 트리테르페노이드(triterpenoids)계 화합물 또는 그 유도체를 포함한다.

본 발명은 지유 메틸렌클로라이드 분획물로부터 크로마토그래피를 통해 활성물질을 분리하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 트리테르페노이드계 화합물 또는 그 유도체는 3,3',4'-Ο-트리메틸엘라그산(3,3',4'-Ο-trimethylellagic acid), 포몰산(pomolic acid), 지유글리코사이드Ⅰ(ziyuglycoside Ⅰ), 포몬산(pomonic acid), 11-옥소-포몬산(11-oxo-pomonic acid), 2-하이드록시포몰산(2-hydroxypomolic acid), 28-Ο-β-D-글루코피라노실-포몰산 에스테르(28-Ο-β-D-glucopyranosyl pomolic acid ester) 및 지유글리코사이드 Ⅱ로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물이다.

상기 화합물의 구조식은 다음 표와 같다:

화합물명	구조식
3,3',4'-Ο-트리메틸엘라그산
포몰산
지유글리코사이드Ⅰ
포몬산
11-옥소-포몬산
2-하이드록시포몰산
28-Ο-β-D-글루코피라노실-포몰산 에스테르
지유글리코사이드 Ⅱ

본 발명은 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 어류는 양식어류 또는 관상어이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 양식어류는 넙치, 우럭, 돔, 능성어, 숭어, 농어, 전어, 가자미, 복어, 고등어, 노래미, 다랑어, 민어, 방어, 전갱이, 잉어, 숭어, 향어, 뱀장어, 메기, 미꾸라지, 붕어로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 어류이며, 상기 관상어는 잉어과, 메기과, 금붕어, 카라신과, 송사리과, 씨클리드과, 아나반티스과 및 난두스기수어과로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 관상어이며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 양식어류는 넙치(Paralichthys olivaceus)이다.

본 발명의 항바이러스 조성물은 양식어류에 대한 어류병원성 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 어류병원성 바이러스는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus; VHSV), 전염성 조혈 괴저 바이러스(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; IHNV), 전염성 췌장 괴저 바이러스(Infectious Pancreatic Necrosis Virus; IPNV), 해양 아쿠아비알엔에이 바이러스(Marine Aquabirnavirus; MABV), 신경 괴사 바이러스(Nervous Necrosis Virus; NNV), 전염성 연어 빈혈 바이러스(Infectious Salmon Anemia Virus; ISAV), 연어 췌장 질환 바이러스(Salmon Pancreas Disease Virus; SPDV), 수면병 바이러스(Sleeping Disease Virus; SDV), 봄 바이러스 혈증 카프 바이러스(Spring Viremia of Carp Virus; SVCV), 유행성 조혈 괴사 바이러스(Epizootic hematopoietic necrosis virus; EHNV), 드워프 구라미 이리도바이러스(Dwarf Gourami Iridovirus; DGIV), 심근증 증후군 바이러스(Cardiomyopathy Syndrom Virus; CMSV) 및 잉어허피스바이러스(Koi Herpes Virus; KHV)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이러스이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 어류병원성 바이러스는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 또는 전염성 조혈 괴저 바이러스이다.

상기 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스는 담수 무지개송어(Oncorhynchys mykiss)에 심각한 바이러스성 질병이었지만, 담수어류 뿐만 아니라 해산어류에도 감염을 일으켰으며(Mortensen et al., 1999; Smail, 1999), 자연산 대구(Gadus morhua), 청어Clupea harengus) 및 양식된 터봇(Scophthalmus maximus) 등 다양한 해산어류에서도 VHSV가 분리되었다(Schlotfeldt et al., 1991; Ross et al., 1994; Mortenson et al., 1999; Mayers et al., 1999). 최근에는 일본과 우리나라 양식된 넙치에서 VHS에 의한 대량 폐사가 발생하였고(Isshiki et al., 2001 ; Kim et al., 2003), Takano et al. (2000, 2001)은 자연산 넙치(Paralichithys olivaceus)에서 MABV 및 VHSV 분리를 보고하였으며, 또한 국내에서는 부산인근 해역의 숭어(Mugil cephalus)와 포항 인근 해역의 고등어(Scomber japonicus)에서 VHSV가 보고되었다(Kim and Park, 2004). 따라서, 병원성 바이러스인 VHSV가 넓은 숙주역을 가지고 있으며 유럽 뿐만 아니라 아시아의 다양한 해산어류에 발병의 가능성을 내재하고 있다.

이러한 근거로, 본 발명의 어류병원성 항바이러스 조성물은 우수한 항바이러스 활성을 나타내며 이러한 효과가 본 발명의 실시예의 넙치 뿐만이 아니라, 다양한 어류, 양식어류에 대하여 유효하다는 것은 당업계의 통상의 기술자에게 자명하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 지유 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류병원성 바이러스에 의한 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 조제 시 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. 본 발명에 의한 약제학적 조성물은 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에 의한 항바이러스 조성물(또는 예방 또는 치료용 약제학적 조성물)은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다. 하기 실시예에서는 빠른 실험결과를 얻기 위하여 복강 주사방법을 적용하였으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 동물의 수령, 체중, 성, 병적 상태, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들면, 생체 1 ㎏ 당 본 발명의 조성물을 유효성분 함량 1 내지 300 ㎎이 되도록 하여 1 내지 10일에 1 내지 5회씩 복강주사 또는 경구투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 지유 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류병원성 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 갖는 어류 사료 또는 어류 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 어류 사료 또는 어류 사료 첨가용 조성물은, 통상적으로 이용되는 다양한 성분과 함께 제조될 수 있다. 예를 들어, 해양 단백질(예컨대, 어분 또는 크릴밀), 식물성 단백질(예컨대, 콩분말, 밀 글루텐, 옥수수 글루텐, 루핀 분말, 완두콩 분말 또는 해바라기씨 분말), 혈분 및 골분을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질원, 어류 기름(예컨대, 오징어간유) 또는 식물성 기름(예컨대, 평지씨 기름, 콩기름, 대두유)를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 에너지원, 비타민 혼합물 및 무기질 혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 어류병원성 바이러스에 의한 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 어류병원성 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 갖는 어류 사료 또는 어류 사료 첨가용 조성물은 상기 항바이러스 조성물을 포함하므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 지유 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 면역증강용 어류 사료 및 어류사료 첨가용 조성물을 제공한다.

상기 어류 면역증강용 어류 사료 및 어류사료 첨가용 조성물은 IL-1β, TNF-α 및 IL-8과 같은 염증성 사이토카인의 유전자 및 IFNγ, Mx 및 ISG15와 같은 항바이러스 관련 유전자의 발현을 증가시킨다.

본 명세서에서 용어 “면역”은 동물 체내에 존재하는 자기방어 체계로서, 외부로부터 침입해 오는 각종 물질이나 생명체를 자기자신과 구별해내어 이 침입자를 제거하는 생물학적 현상이다.

본 명세서에서 용어 “면역 증강”은 숙주의 특이 또는 비특이, 세포성 및 체액성 면역반응을 상승시키는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 면역이 억제된 상태에서 대상에 투여하여 면역 증강 효과를 나타낸다. 이러한 면역 증강을 통해 종국적으로 어류 병원성 바이러스 감염 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 어류병원성 바이러스에 대한 항바이러스 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 어류병원성 바이러스에 대한 항바이러스 조성물은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus; VHSV) 및 전염성 조혈 괴저 바이러스(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; IHNV)에 대하여 우수한 항바이러스 활성을 나타낸다.

(c) 본 발명의 어류병원성 바이러스에 대한 항바이러스 조성물은 천연물 유래로 친환경적 장점을 갖는다.

도 1은 지유(Sanguisorba officinalis) 유래 추출물의 제조하는 과정을 나타낸다.7
도 2는 지유의 메틸렌클로라이드 분획물로부터 활성물질의 분리 과정을 나타낸다.
도 3은 지유의 메틸렌클로라이드 분획물로부터 분리된 활성물질인 컴파운드1 내지 8의 구조식을 나타낸다.
도 4는 지유의 메틸렌클로라이드 분획물 중 대표적 활성물질의 함량을 분석한 결과를 나타낸다.
도 5a 내지 5f는 지유의 메틸렌클로라이드 분획물로부터 분리된 활성물질의 세포변성 감소효과를 나타낸다. 도 5a는 무처리 FHM 세포이고, 도 5b는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus; VHSV)를 감염시킨 FHM 세포이며, 도 5c는 VHSV 및 컴파운드3(30 μM)을 처리한 세포이고, 도 5d는 VHSV 및 컴파운드4(30 μM)을 처리한 세포이며, 도 5e는 VHSV 및 컴파운드5(30 μM)을 처리한 세포이고, 도 5f는 VHSV 및 리바비린(ribavirin; 3 μM)을 처리한 세포의 세포변성에 대한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 6은 지유 메틸렌클로라이드 분획물(SOMC)의 인 비보 항바이러스 활성을 나타낸다. 무처리 대조구, VHSV 감염 대조구 및 지유 메틸렌클로라이드 분획물을 30, 10 또는 3 ㎎/㎏/일 투여한 실험구의 누적폐사율을 나타낸다.
도 7은 지유 부탄올 분획물(n-BuOH)의 인 비보 항바이러스 활성을 나타낸다. 무처리 대조구, VHSV 감염 대조구 및 지유 부탄올 분획물을 100, 30 또는 10 ㎎/㎏/일 투여한 실험구의 누적폐사율을 나타낸다.
도 8은 지유 메틸렌클로라이드 분획물의 넙치에서의 면역 증강 활성을 나타낸다. 넙치에 지유 메틸렌클로라이드 분획물 30 ㎎/㎏/일을 투여한 후 IL-1β, TNF-α 및 IL-8과 같은 염증성 사이토카인 및 IFNγ, Mx 및 ISG15와 같은 항바이러스 관련 유전자의 발현 변화를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 지유 추출 및 분획

건조 조말한 지유(Sanguisorba officinalis의 뿌리 및 뿌리줄기, Rosaceae)(850 g)을 80% MeOH로 초음파 추출하여 추출액(Total extract)을 모아 진공 증발기로 감압 농축하였다. 80% MeOH 추출물(401.2 g)은 물에 현탁하여 메틸렌클로라이드(CH₂Cl₂)로 분획하고 감압농축 및 동결건조 후 CH₂Cl₂ 분획물 15.2 g 및 물 분획물을 수득하였고, 물 분획물은 다시 수포화 부탄올(n-BuOH)로 분획하여 수포화 부탄올(n-BuOH) 분획물 287.2 g을 수득하였다(도 1).

실시예 2: 메틸렌클로라이드 분획물(SOMC)로부터 활성화합물의 분리 및 구조동정

VHSV 및 IHNV의 두 바이러스에 대하여 모두 우수한 항바이러스 활성을 나타낸 메틸렌클로라이드 분획물로부터 활성 화합물의 분리를 실시하였다. 상기 메틸렌클로라이드 분획물 15.0 g에 대하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(Chlorform:MeOH=100:0->0:100)를 실시하여 TLC 결과에 따라 주요 스팟(spot)을 중심으로 9개의 소분획물로 나누었다. 각 소분획물로부터 아래와 같은 방법으로 화합물을 분리하였다.

① 소분획물 Ⅰ

소분획물 I(782 ㎎) 중 500 ㎎을 이용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(Chlorform:MeOH=100:0->0:100 column; 2×70 ㎝)를 실시하여 이로부터 얻은 하위분획물에 대한 Sephadex LH-20 CC(n-hexane:dichloromethane:MeOH=5:5:1)를 실시하여 컴파운드4(8.8 ㎎)를 분리하였다. 컴파운드4에 대한 NMR 및 MS 등의 분광학적 분석을 실시하고 그 결과를 문헌치와 비교하여 포몬산(pomonic acid)(컴파운드4)로 동정하였다(도 2 및 도 3).

② 소분획물 Ⅱ

소분획물 Ⅱ(409 ㎎)에 대한 MeOH을 이용한 재결정을 실시하여 컴파운드 1(33.4 ㎎)을 수득하였다. 컴파운드1에 대한 NMR 및 MS 등의 분광학적 분석을 실시하고 그 결과를 문헌치와 비교하여 3,3',4'-O-trimethylellagic acid(컴파운드1)로 동정하였다(도 2 및 도 3).

③ 소분획물 Ⅲ

소분획물 Ⅲ(995 ㎎) 중 500 ㎎을 사용하여 ODS MPLC (ACN:water=10:90->100:0)을 실시하여 TLC 결과에 따라 13개 하위 분획물로 나눈 후 이 중 Ⅲ-8(82.6 ㎎)에 대하여 Sephadex LH-20 CC(EtOH)로 정제를 실시하여 컴파운드5(6.5 ㎎)을 수득하였다. Ⅲ-12(76.3 ㎎)에 대한 Sephadex LH-20 CC (n-hexane:dichloromethane:MeOH=5:5:2)로 정제를 실시하여 컴파운드2(10.1 ㎎)을 수득하였다. 분리된 화합물들에 대한 NMR 및 MS 등의 분광학적 분석을 실시하고 그 결과를 문헌치와 비교하여 각각 포몰산(컴파운드2) 및 11-옥소포몬산(oxopomonic acid; 컴파운드5)로 동정하였다(도 2 및 도 3).

④ 소분획물 Ⅴ

소분획물 Ⅴ(233 ㎎)은 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(n-hexane:dichloromethane:MeOH=3:3:1)를 실시하였으며, 이로부터 컴파운드6(7.6 ㎎)를 수득하였다. 컴파운드6에 대한 NMR 및 MS 등의 분광학적 분석을 실시하고 그 결과를 문헌치와 비교하여 2-hydroxypomolic acid(컴파운드6)로 동정하였다(도 2 및 도 3).

⑤ 소분획물 Ⅶ

소분획물 Ⅶ(1113 ㎎) 중 500 ㎎에 대한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(Chlorform:MeOH=85:15->0:100 column: 2×70 ㎝)를 실시하여 얻은 하위분획물 VII-2(168 ㎎)에 대한 Sephadex LH-20 CC(n-hexane:dichloromethane:MeOH=5:5:3)를 이용한 정제를 통하여 컴파운드3(73.4 ㎎), 컴파운드7(13 ㎎) 및 컴파운드8(11 ㎎)을 분리하였다. 분리된 화합물들에 대한 NMR 및 MS 등의 분광학적 분석을 실시하고 그 결과를 문헌치와 비교하여 각각 지유글리코사이드(ziyuglycoside) Ⅰ(컴파운드3), 28-O-b-D-glucopyranosyl-pomolic acid ester(컴파운드7) 및 지유글리코사이드 Ⅱ(컴파운드8)로 동정하였다 (도 2 및 도 3).

실시예 3: 메틸렌클로라이드 분획물(SOMC) 중 주요 활성화합물의 함량분석

분석조건

분석장비로는 Agilent 1260 series 및 Agilent 6460-triple quadrupole MS를 사용하였다. 분석 컬럼은 agilent사의 Poroshell 120 EC-C₁₈(50×4.6 ㎜, 2.7 ㎛)을 사용하였으며 컬럼 오븐을 이용하여 30℃가 유지되도록 설정하였다. 용매는 HPLC급 아세토나이트릴(acetonitrile)과 0.1% 포름산(formic acid)이 첨가된 물을 표 2의 기울기 조건을 이용하여 유속 0.5 ㎖/분으로 분석하였으며 분석시간은 45분이다. 분석 시 시료와 표준용액은 10 ㎕ 주입하였고, 이온 소스(ion source)로 전기 분무(Electrospray Ion; ESI) 양이온 모드(ziyuglycoside I) 및 음이온 모드(3-옥소포몰산, 3-oxopomolic acid)를 사용하였다. 기기 파라미터는 모세관전압(capillary voltage) 5000 볼트, 가스 온도 350℃, 가스 유속 10 L/분, 네뷸라이저 압력(nebulizer pressure) 35psi이다. 지유글리코사이드 I(컴파운드3)의 Q1 mass는 789 m/z 이었으며 Q3 mass 는 627, 184.7 m/z 이었으며 3-옥소포몰릭산(컴파운드4)의 Q1 mass는 469 m/z 이었으며 Q3 mass는 451, 407 m/z 이었다(도 4 및 표 2). 충돌 에너지는 45 eV(ziyuglycoside I) 및 30 eV(3-oxopomolic acid)로 하였다.

시간(분)	A(%)	B(%)
0:00	80	20
4:00	50	50
14:00	50	50
18:00	15	85
25:00	15	85
35:00	0	100
45:00	0	100

(A : 0.1% 포름산 in water, B : 아세토나이트릴)

LC/MS/MS를 이용하여 이의 활성물질 중 주요물질인 지유글리코사이드 I(컴파운드3) 및 포몬산(pomonic acid, 4, 3-oxopomolic acid)를 동시 정량하였다. 정량 결과, SOMC는 지유글리코사이드 I(3)를 평균 20.97%, 포몬산(컴파운드4)를 평균 1.83% 함유하고 있는 것으로 나타났다(표 3). 정량에 사용된 분석법은 방법 밸리데이션을 통하여 충분한 신뢰성이 확보되었음을 확인하였다.

실험예 1: 지유 추출물 및 분획물 in vitro 항바이러스 활성

주화세포배양

바이러스 배양을 위한 어류주화세포는 CHSE-214(Chinook Salmon Embryo-214)와 FHN(Fathead minnow) 세포를 최소기초배지(Eagle's minimum essential medium; MEM)에 100 IU/㎖의 페니실린(penicillin), 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)과 우태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS)가 10% 첨가된 배양액을 사용하여 각 플라스크에 1×10 /㎖로 맞추어 20℃에서 20시간 동안 배양한 후 바이러스 접종에 사용하였다.

바이러스 배양

실험에 사용한 바이러스주는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스(Viral Hemorhagic Septicemia Virus; VHSV, Wando 2005) 및 전염성 조혈 괴사 바이러스(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; IHNV)를 사용하였다. 바이러스는 저장을 위해 FHM 세포주에 바이러스 100 ㎕를 75F 플라스크에 접종하고 15℃에서 10일 동안 배양하면서 세포변성효과(Cytopathic effect; CPE)를 관찰 한 후 상등액을 마이크로튜브에 분주하여 실험에 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

항바이러스 활성 측정

CPE(cytopathic effect) 감소 분석법을 이용하여 시료의 항바이러스 활성을 측정하였다. 간략히 설명하면, 96웰 플레이트에 배양된 세포에 바이러스 희석액과 시료를 1:1로 섞어 4세트로 접종하고 15℃에서 1시간 배양하였다. 3-4일 이후 바이러스 대조구에서 바이러스에 의한 세포변성(CPE)이 모든 웰에서 고르게 나타나게 되면 배양을 중지하고 그 때의 각 시료구의 CPE를 현미경으로 관찰하여 바이러스 대조구의 CPE와 비교하여 점수화 하였다. CPE를 50% 감소시키는 농도(EC50)은 각 농도별 CPE 감소율(%)를 그래프에 플로팅(plotting) 하여 구하였다.

지유 추출물과 이의 유기용매 분획물들에 대하여 항바이러스 활성을 측정한 결과, 지유의 80% 메탄올추출물의 EC₅₀ 값은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 및 전염성 조혈 괴사 바이러스에 대하여 각각 8.1 및 20.6 ㎎/㎖로 나타났다. 이의 유기용매 분획물인 메틸렌클로라이드 분획물은 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 및 전염성 조혈 괴사 바이러스에 대하여 물 분획물보다 우세한 항바이러스 활성을 나타내었다(표 4 및 5).

상기 표 4의 첨자 a는 50% 세포독성 농도이고, 첨자 b는 세포변성을 50%을 나타내는 농도이며,첨자 c는 ‘Selective Index’로 CC₅₀/EC₅₀의 값을 의미한다.

상기 표 5의 첨자 a는 최대 비-세포변성 농도(Maximal non-cytotoxic Concentration)을 의미한다.

실험예 2: 지유 메틸렌클로라이드 분획물에서 분리된 화합물들의 인 비트로 항바이러스 활성

항바이러스 활성실험은 상기 실험예 1에서와 동일하게 실시하였다.

실험결과, 표 6 및 도 5에서와 같이 VHSV에 대하여 컴파운드3, 4, 5 및 7이 각각 19.9, 5.0, 6.0 및 19.0 의 EC₅₀값을 나타내며 우수한 항바이러스 활성을 나타내었다. 현재 인체용 항바이러스약물로 사용 중인 리바비린(ribavirin)을 양성 대조구으로 함께 시험하여 그 효과를 비교하였다. 그 결과, 본 발명에서 제시한 트리테르페노이드들의 항바이러스 활성은 리바비린과도 견줄 만 하며, 리바비린의 세포독성을 감안해 본다면, 본 발명에서 제시한 트리테르페노이드들의 항바이러스 활성이 더 우수한 것으로 판단된다.

실험예 3: 지유 메틸렌클로라이드분획물 ( SOMC )의 in vivo 항바이러스 활성

SOMC 분획물 첨가사료제작 및 투여

2일 동안 순치 후 SOMC 분획물을 감압 농축하여 분말형태로 제작 후 고순도 에틸알코올에 녹여 어체중의 1%를 투여 시 3, 10 및 30 ㎎/㎏/일의 용량이 되도록 제작하고 매일 1회 2주동안 경구투여 하였다. 경구투여 기간 중 매일 모니터링 하였으며, 실험중의 수온은 15-20℃ 유지되었다.

공격감염

2주 동안 SOMC 분획물 첨가사료를 투여한 넙치에 TCID₅₀/㎖ 농도의 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스를 복강 내 주사로 100 ㎕씩 접종하였다. 접종 후 29일 동안 모니터링 하였으며, 항바이러스 활성은 누적폐사율로 확인하였다. 실험 중의 수온은 15±1℃로 유지하였다.

결과

공격감염 후 29일 동안 누적폐사율을 관찰한 결과, 바이러스 대조구는 85.5%의 누적폐사율을 나타낸 반면, SOMC 투여구들에서는 농도의존적 경향을 나타내며 30 ㎎/㎏/일 실험구에서 40.5%의 누적폐사율을 나타내어 가장 높은 항바이러스 효과를 나타내었다(도 6).

실험예 4: 지유 수포화부탄올 분획물 (n- BuOH )의 in vivo 항바이러스 활성

실험은 실험예 3과 같은 방법으로 실시하였다.

결과

공격감염 후 29일 동안 누적폐사율을 관찰한 결과, 바이러스 대조구는 85.5%의 누적폐사율을 나타낸 반면, n-BuOH 분획물 투여구들에서는 10 및 30 ㎎/㎏/일 실험구에서 45-50%의 누적폐사율을 나타내어 가장 높은 항바이러스 효과를 나타내었다(도 7).

실험예 5: 지유 메틸렌클로라이드분획물(SOMC)의 넙치에서의 면역 증강 활성

SOMC 분획물 첨가 사료제작 및 투여는 실험예 3에서와 동일하게 실시하였다. 투여 시작 후 1, 2, 4, 7 및 14일째에 비장을 채취하여 RNA 추출, cDNA로 변환 등 일련의 과정 후 실시간 qPCR을 실시하여 면역관련 유전자들의 발현을 측정, 비교하였다.

넙치에 2주 동안 SOMC 분획물 30 ㎎/㎏/일로 투여한 결과, 투여 4일 이후부터 IL-1b, TNF-a 및 IL-8 등의 염증성 사이토카인 유전자의 발현이 5배 이상 증가되었고, 7일 이후부터는 IFNγ, Mx 및 ISG15 등의 항바이러스 관련 유전자의 발현이 5배 이상 증가되었음을 확인하였다(도 8). 따라서, 이러한 면역증강 활성이 SOMC 분획물 투여구에서의 항-VHSV 효과로 나타난 것으로 사료된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

지유(Sanguisorba officinalis L.) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 랩도바이러스과(Rhabdoviridae) 노비랩도바이러스속(Novirhabdovirus)에 포함되는 바이러스에 대한 항바이러스 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 지유 추출물 또는 분획물은 하기 화학식 1 내지 8의 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물 및 상기 화합물에 당이 결합된 당화유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 바이러스는 랩도바이러스과 노비랩도바이러스속에 포함되는 바이러스는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus; VHSV), 전염성조혈기괴사증 바이러스(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; IHNV), 히라메 랍도바이러스 (Hirame rhabdovirus; HIRV) 및 스네이크헤드 랍도바이러스 (snakehead rhabdovirus; SHRV)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이러스인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 바이러스는 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 또는 전염성조혈기괴사증 바이러스인 것을 특징으로 하는 조성물.
지유(Sanguisorba officinalis L.) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 랩도바이러스과(Rhabdoviridae) 노비랩도바이러스속(Novirhabdovirus)에 포함되는 바이러스에 의한 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
지유(Sanguisorba officinalis L.) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는랩도바이러스과(Rhabdoviridae) 노비랩도바이러스속(Novirhabdovirus)에 포함되는 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 갖는 어류 사료 또는 어류 사료 첨가용 조성물.
하기 화학식 1 내지 8의 화합물로 구성된 군으로부터 하나 이상의 화합물을 포함하는 지유 비극성용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 면역증강활성을 갖는 어류 사료 및 어류사료 첨가용 조성물.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]