KR102339786B1

KR102339786B1 - 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 병원성 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물

Info

Publication number: KR102339786B1
Application number: KR1020200034463A
Authority: KR
Inventors: 강소영; 임재웅; 이미경
Original assignee: 전남대학교산학협력단; 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2021-12-16
Also published as: KR20210117773A

Abstract

본 발명은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 병원성 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물 및 꾸지뽕으로부터 유래된 화합물을 유효성분으로 포함하는 병원성 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물에 관한 것이다.

Description

꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 병원성 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물 {Anti-Viral composition against fish Pathogenic Viral diseases comprising Cudrania tricuspidata Bureau extract or fraction as an active ingredient}

수산양식업에 있어 전 세계적으로 문제가 되고 있는 수산양식생물 질병의 국내 발생 현황을 살펴보면, 1990년대 전반의 발병률이 5% 미만에 불과하던 것이 1990년대 후반부터는 15% 내외로 증가하고 있으며, 고수온기에 주로 발생하던 질병들이 연중 발생하는 추세에 있다.

그 중에서도 난치성 바이러스성 전염병의 발생 증가에 의한 양식 어류의 피해가 증대되고 있으며, 약제 오남용에 의한 내성균의 출현 증가로 치료 효과가 저하되고 있는 실정이다. 특히, 최근에 들어서는 국외로부터의 양식용 종묘의 수입량 증가로 인하여 신종 외래 전염병의 유입 위험성이 증대되고 있으며, 감염 종묘의 이동에 의한 질병의 확산이 우려되고 있다.

특히, 연어 및 송어과 어류의 전염성조혈기괴사증바이러스 (Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; IHNV) 및 전염성췌장괴사증바이러스 (Infectious Pacreatic Necrosis Virus; IPNV)의 감염에 의한 피해는 1970년대 이후 지속적으로 발생되고 있으나, 그 치료를 위해 사용될 수 있는 적절한 약품의 개발은 국내외를 막론하고 없는 실정이다.

어류에 치사성을 가진 산업적으로 중요한 질병을 일으키는 바이러스 중에서 분리배양이 가능한 질병으로서는 연어과 어류의 전염성조혈기괴사증바이러스 가 원인이 되어지는 전염성조혈기괴사병 (Infectious Hematopoietic Necrosis Disease; IHND), 전염성췌장괴사증바이러스가 원인으로 작용하는 전염성췌장괴사병 (Infectious Pacreatic Necrosis Disease; IPND) 및 바이러스성출혈성폐혈증바이러스 (Viral Hemorhagic Septicemia Virus; VHSV)의 원인에 의한 바이러스성 출혈성 폐혈병 (Viral Hemorhagic Septicemia Disease; VHSD)이 가장 널리 알려져 있고 전 세계적으로 그 피해 또한 가장 심각한 질병으로 알려져 있다.

전염성조혈기괴사증바이러스는 1969년 Amend 등에 의해서 무지개송어에서 처음으로 분리 보고된 바이러스로서, 우리나라에서는 양식산 무지개송어 치어에서 1992년 처음 보고되었다. 병어의 신장과 비장, 특히 신장의 조혈조직에 심한 괴사가 주요 특징으로 원인바이러스는 포탄형의 형태를 보이고, 평균크기는 길이 160 내지 180 ㎚, 직경 80 내지 90 ㎚의 랩도바이러스과 (Rhabdoviridae) 노비랩도바이러스속 (Novirhabdovirus)으로 분류되어져있다. 전염성조혈기괴사증바이러스에 의한 사망률은 70 내지 80%에 달하며, 무지개송어, 산천어, 송어에 피해가 크다. 본 병은 발견당시 미국 서해연안의 홍연어 및 치눅 살몬 (chinook salmon)의 풍토병적인 성격을 갖는 것으로 생각했었지만, 무지개송어에서의 발증이 확인된 이후, 미국 각지에서 발생이 확인되어, 1970년대에 일본 및 대만, 1990년대에 유럽각지로 확대되었다.

바이러스성출혈성패혈증은 유럽, 북미, 아시아 지역에 매우 널리 발병하며, 무지개송어, 은연어, 강송어, 브라운송어, 스틸헤드 트로우트 (steelhead trout) 등의 연어과 어류뿐만 아니라 대구, 청어등과 같은 자연수계의 어류 및 넙치등과 같은 해산양식어류에서도 널리 발생하여 그 피해가 매우 심각히 우려되고 있다. 원인체인 바이러스성출혈성패혈증바이러스는 길이 160 내지 180 ㎚, 직경 70 내지 80 ㎚의 포탄형으로, ss-RNA바이러스로서 노비랩도바이러스속에 분류되어 있다. 폐사율은 조건에 따라 큰 폭으로 변하지만, 일반적으로 20-80%의 범위로 큰 피해를 입힌다.

연어과 어류의 주요 병원체인 전염성조혈기괴사증바이러스, 전염성췌장괴사증바이러스 및 바이러스성출혈성패혈증바이러스의 감염예방법의 일환으로 백신개발의 연구가 진행되어 불활화백신, 약독화생백신, 성분백신 그리고 DNA백신 등 활발한 연구가 진행되어 왔으며, 일부는 예방백신으로 적용되고 있다.

아울러 어체 바이러스 보유어가 존재하는 수계에서는 수평감염이 일어날 가능성이 있으므로 전파방지를 위해 시설의 소독과 바이러스가 없는 용수의 확보, 난의 소독 등이 연구되어 적용되고 있다. 하지만 감염어의 치료를 목적으로 적용될 수 있는 약제의 개발에는 큰 성과가 보고 되고 있지 않은 실정이다.

전염성조혈기괴사증바이러스 및 바이러스성출혈성패혈증바이러스의 화학요법에 관련해서는 항바이러스제인 소디움 벤지미다졸 (sodium benzimidazole)을 40 ㎍/㎖ 이상으로 처리하여 FHM (Fathead Minnow) 세포에서의 바이러스의 증식을 억제했지만, 인 비보 실험은 아직 실행되지 않았다. 또한, 양어지나 하천에서 분리한 세균의 배양액이나 허브, 한방생약에 항-IHNV 활성이 발견되었고, 인 비보 효과가 인정되었었지만 아직 실용화에 이르지는 못하였다. 1999년 Fabregas등은 수종의 해양미세조류배양농축액을 이용하여 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스의 증식저해를 조사하여 그 사용가능성을 제시한 예가 있으나 그 이후의 연구결과는 발표되고 있지 않는 것으로 사료된다.

꾸지뽕나무 (Cudrania tricuspidata Bureau)는 뽕나무과 (Moraceae)에 속하며, 한국, 일본, 중국 등 동아시아 전역에 널리 분포되어있는 낙엽 소교목 또는 관목이다. 꾸지뽕나무 잎과 열매는 식품원료로써 사용되며, 잎, 열매를 포함한 줄기 등 다른 부위는 약용으로도 사용되고 있다. 꾸지뽕나무 추출물은 항염증, 항고혈압, 항당뇨, 항산화, 항미생물활성 등이 알려져 있지만, 현재까지 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스 활성은 보고된 바가 없다.

국내공개특허 10-2017-0133292 (2017.12.05) 국내공개특허 10-2004-0097445 (2004.11.18)

이에 본 발명자들은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물이 어류에서 높은 폐사를 유발하는 병원성 바이러스에 대하여 우수한 항바이러스 활성이 있으며, 특히 항생제 내성 어병 바이러스에 대해서도 우수한 항바이러스 활성을 보유하고 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 바이러스 활성을 갖는 어류 사료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 바이러스 활성을 갖는 어류 사료 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 이용한 어류 바이러스성 질병의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물의 어류 바이러스성 질병의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 수산양식업에 있어 문제가 되고 있는 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스 조성물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 천연물인 꾸지뽕으로부터 추출한 추출물 및 이의 분획물의 어류 병원성 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 규명하였다.

본 발명은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물 및 꾸지뽕으로부터 유래된 화합물을 유효성분으로 포함하는 어류 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물에 관한 것이다.

꾸지뽕의 수피는 갈색 또는 회갈색으로 세로로 얕게 갈라지며, 가지에 껍질눈이 발달한다. 잎 겨드랑이에 잔가지가 변한 굵고 날카로운 가시가 있다. 어긋나게 달리는 잎은 난형으로 가장자리가 밋밋하며, 2 내지 3 갈래로 갈라지기도 한다. 양면에 털이 있으며, 잎자루에도 털이 있다. 암수딴그루로 5 내지 6월에 잎 겨드랑이에 연한 노란색의 꽃이 모여 달린다. 수꽃이삭은 둥글며 연한 털이 덮이고 수꽃에는 3 내지 5개의 화피조각과 수술이 4개가 있다. 암꽃이삭은 타원형으로 암꽃에는 암술대 2개가 실처럼 갈라진다. 열매는 취과로 단단하고 초록색이었다가 9 내지 10월에 약간 물렁해지면서 붉은색으로 익는다. 잎을 자르면 흰 액이 나오고 열매는 단맛이 난다. 우리나라 중부 이남의 산지 양지 바른 곳에서 자라는 낙엽활엽소교목 또는 관목이다.

본 발명에 있어서 용어 "꾸지뽕"은 꾸지뽕나무를 의미하는 것으로 "꾸지뽕"과 "꾸지뽕나무"는 동일한 의미인 것으로 해석한다.

본 발명에 있어서 꾸지뽕은 뿌리, 줄기, 잎 및 열매를 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 열매 또는 잎인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 꾸지뽕 열매는 미숙과 또는 성숙과인 것일 수 있으며, 예를 들어, 성숙과인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 용어 '미숙과'는 일반적으로 9월경에 채취하는 것으로, 색차계로 측정 시 redness(a*) -5 전후인 것을 의미한다.

본 발명에 있어서 용어 '성숙과'는 일반적으로 10월경에 채취하는 것으로 색차계로 측정 시 redness(a*) 25 전후인 것을 의미한다.

본 발명의 꾸지뽕 추출물을 꾸지뽕에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다.

본 발명에 있어서 추출용매는 극성 용매 또는 비극성 용매인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 극성 용매는 물, 알코올, 아세트산, 디메틸 포름아미드 (dimethyl formamide; DMFO) 및 디메틸술폭시드 (dimethyl sulfoxide; DMSO)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 알코올은 탄소수 1 내지 5개의 직쇄 또는 분지형 알코올인 것일 수 있으며, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 및 에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 추출용매로 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에는 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50%이상 내지 100%(v/v)미만, 10 내지 90%(v/v), 20 내지 90%(v/v), 30 내지 90%(v/v), 40 내지 90%(v/v), 50 내지 90%(v/v), 10 내지 80%(v/v), 20 내지 80%(v/v), 30 내지 80%(v/v), 40 내지 80%(v/v), 50 내지 80%(v/v)의 알코올 수용액인 것일 수 있으며, 예를 들어, 50%(v/v)의 탄소수 1 내지 5개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 비극성 용매는 메틸렌 클로라이드, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 추출용매 및/또는 분획용매는 탄소수 1 내지 5의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 물, 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 꾸지뽕 추출물은 에탄올 수용액을 추출용매로하여 수득한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물 (crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다.

따라서, 본 발명의 꾸지뽕 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예를 들어, 꾸지뽕 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 꾸지뽕 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명의 꾸지뽕 추출물은 감압 증류, 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 꾸지뽕 추출물은 상기한 추출용매뿐만 아니라, 다른 추출용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 본 발명의 추출물이 얻어질 수 다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

본 발명의 꾸지뽕 추출물은 추출용매와 함께 초음파 처리를 하여 추출물을 수득한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 하기의 꾸지뽕 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함된 꾸지뽕 추출물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명에 따른 꾸지뽕 추출물은 용매 조추출물을 추가의 용매로 분획한 용매 분획물일 수 있으며, 예를 들어, 꾸지뽕 용매 조추출물에 에틸에테르, 아세트산에틸, 부탄올 및 디클로로메탄으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있며, 예를 들어, 디클로로메탄을 용매로 사용한 용매 분획물인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 어류는 양식어류 또는 관상어인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 양식어류는 넙치, 우럭, 참돔, 돌돔, 능성어, 숭어, 농어, 전어, 가자미, 복어, 고등어, 노래미, 다랑어, 민어, 방어, 전갱이, 잉어, 연어, 무지개 송어, 향어, 뱀장어, 메기, 미꾸라지 및 붕어로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 넙치 (Paralichthys olivaceus)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 관상어는 잉어류, 메기류, 금붕어류, 카라신류, 송사리류, 씨클리드류, 아나반티스류 및 난두스기수어류로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 어류병원성 바이러스는 바이러스성 출혈성 패혈증 바이러스 (Viral Hemorrhagic Septicemia Virus; VHSV), 전염성조혈기괴사증바이러스 (Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; IHNV), 전염성췌장괴사증바이러스(Infectious Pancreatic Necrosis Virus; IPNV), 해양 아쿠아비알엔에이 바이러스(Marine Aquabirnavirus; MABV), 신경 괴사 바이러스 (Nervous Necrosis Virus; NNV), 전염성 연어 빈혈 바이러스 (Infectious Salmon Anemia Virus; ISAV), 연어 췌장 질환 바이러스 (Salmon Pancreas Disease Virus; SPDV), 참돔이리도바이러스 (Red Sea Bream Iridovirus), 수면병 바이러스(Sleeping Disease Virus; SDV), 잉어봄바이러스병바이러스(Spring Viremia of Carp Virus; SVCV), 유행성조혈기괴사증바이러스 (Epizootic hematopoietic necrosis virus; EHNV), 드워프 구라미 이리도바이러스 (Dwarf Gourami Iridovirus; DGIV), 심근증 증후군 바이러스 (Cardiomyopathy Syndrom Virus; CMSV) 및 잉어허피스바이러스 (Koi Herpes Virus; KHV)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 바이러스성출혈성패혈증바이러스 또는 전염성조혈기괴사증바이러스인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 바이러스성출혈성패혈증바이러스는 담수 무지개송어 (Oncorhynchys mykiss)에 심각한 바이러스성 질병이었지만, 담수어류뿐만 아니라 해산어류에도 감염을 일으켰으며, 자연산 대구 (Gadus morhua), 청어 (Clupea harengus) 및 양식된 터봇 (Scophthalmus maximus) 등 다양한 해산어류에서도 VHSV가 분리되었다.

최근에는 일본과 우리나라 양식된 넙치에서 VHS에 의한 대량 폐사가 발생하였고, 자연산 넙치 (Paralichithys olivaceus)에서 MABV 및 VHSV 분리된 것이 보고되었으며, 또한 국내에서는 부산인근 해역의 숭어 (Mugil cephalus)와 포항 인근 해역의 고등어 (Scomber japonicus)에서 VHSV가 보고되었다. 따라서, 병원성 바이러스인 VHSV가 넓은 숙주역을 가지고 있으며 유럽뿐만 아니라 아시아의 다양한 해산어류에 발병의 가능성을 내재하고 있다.

본 발명에 있어서 어류 바이러스성 질병은 원인체가 랍도바이러스인 것일 수 있으며, 예를 들어, 전염성조혈기괴사병(IHN) 및/또는 바이러스성출혈성패혈증(VHS)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 꾸지뽕으로부터 유래된 화합물은 플라보노이드계 (flavonoids) 또는 잔톤계 (xanthones)화합물, 또는 이의 유도체인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 꾸지뽕으로부터 유래된 화합물은 하기의 화학식 1 내지 화학식 17로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 유도체인 것일 수 있다.

본 발명에 일 구체예에 있어서, 본 발명의 조성물은 하기의 화학식 1 내지 화학식 17로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 유도체를 포함하는 것일 수 있다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R₁은 -H 또는 -OH이고,

R₂는 -OH 또는 -OCH₃이고,

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 -H,

또는

이다.

[화학식 2]

상기 화학식 2에서,

R₁은 -H 또는 -OH이고,

R₂는 -OH 또는 -OCH₃이고,

R₃은 -H 또는

이다.

[화학식 3]

상기 화학식 3에서,

R₁은 -H 또는 -OH이고,

R₂는 -OH이고,

R₃은 -H 또는

이다.

[화학식 4]

상기 화학식 4에서,

R₁은 -H 또는 -OH이고,

R₂는 -OH 또는 -OCH₃이고,

R₃은 -H 또는 -OCH₃이고,

R₄는-H 또는

이다.

[화학식 5]

[화학식 6]

상기 화학식 6에서, R은 -H 또는 -OH이다.

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]

[화학식 12]

[화학식 13]

[화학식 14]

[화학식 15]

[화학식 16]

[화학식 17]

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 1에서 R₁은 -OH이고, R₂는 -OH이고, R₃및R₄는 -H인, 오로볼 (orobol)인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 1에서 R₁은 -H이고, R₂는 -OCH₃이고, R₃은

이고, R₄는 -H인, 잔카오닌 A (Gancaonin A)인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 1에서 R₁은 -H이고, R₂는 -OH이고, R₃및R₄는

인, 6,8-디프레닐제니스테인 (6,8-Diprenylgenistein)인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 1에서 R₁은 -OH이고, R₂는 -OH이고, R₃및R₄는

인, 6,8-디프레닐오로볼 (6,8-Diprenylorobol)인 것일 수 있다.

이고, R₄는 -H인, 5,7-Dihydroxy-6-(2'''-hydroxy-3''-methylbut-3''-enyl)-4'-methoxylisoflavone인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 1에서 R₁은 -H이고, R₂는 -OH이고, R₃은

이고, R₄는

인, Isoerysenegalensein E인 것일 수 있다.

이고, R₄는 -H인, Wighteone인 것일 수 있다.

이고, R₄는

인, Erysenegalensein E인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 1에서 R₁은 -OH이고, R₂는 -OH이고, R₃은

이고, R₄는

인, Millewanin H인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 2에서 R₁은 -H이고, R₂는 -OCH₃이고, R₃은 -H인, 4'-O-Methylalpinumisoflavone인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 2에서 R₁은 -OH이고, R₂는 -OH이고, R₃은 -H인, 5,3',4'-Trihydroxy-6'',6''-dimethylpyrano-[2'',3'';7,6]isoflavone인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 2에서 R₁은 -OH이고, R₂는 -OCH₃이고, R₃은 -H인, 3'-Hydroxy-4'-O-methylalpinumisoflavone인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 2에서 R₁은 -H이고, R₂는 -OH이고, R₃은

인, Euchrenone b8인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 3에서 R₁은 -H이고, R₂는 -OH이고, R₃은 -H인, Derrone인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 3에서 R₁은-OH이고, R₂는 -OH이고, R₃은

인, 5, 3',4', 2'''-Tetrahydroxy-2'', 2''-dimethylpyrano-(5''6'':7,8)-6-(3'''-methyl-3'''-butenyl)isoflavone인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 4에서 R₁은 -H이고, R₂는-OCH₃이고, R₃은 -H이고, R₄는-H인, 4'-O-Methylerythrinin C인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 4에서 R₁은 -H이고, R₂는 -OH이고, R₃은 -OCH₃이고, R₄는-H인, (±)-1"-O-Methylerythrinin F인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 4에서 R₁은 -H이고, R₂는 -OH이고, R₃은 -H이고, R₄는

인, Euchrenone b10인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 4에서 R₁은 -OH이고, R₂는 -OH이고, R₃은 -H이고, R₄는

인, Furowanin A인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 화학식 5의 화합물은 4'-O-Methyl-2''-hydroxydihydroalpinumisoflavone인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 6에서 R은 -H인, Senegalensin인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 6에서 R은 -OH인, Furowanin B인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 7은 Macluraxanthone B인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 8은 Cudratricusxanthone A인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 9는 Gerontoxanthone I인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 10은 Macluraxanthone C인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 11은 Cudracuspixanthone E인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 12는 Alvaxanthone인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 13은 Cudraxanthone L인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 14는 Cudraxanthone M인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 15는 Aromadendrin인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 16은 8-prenylnaringenin인 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 17은 Cudraflavanone A인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 약제학적으로 허용되는 담체는 조제 시 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명에 있어서 약제학적 조성물의 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 예를 들어, 경구 투여로 투여하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 동물의 수령, 체중, 성, 병적 상태, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들면, 생체 1 ㎏ 당 본 발명의 조성물을 유효성분 함량 1 내지 300 ㎎이 되도록 하여 1 내지 10일에 1 내지 5회씩 복강주사 또는 경구 투여하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균 활성을 갖는 어류 사료용 조성물 또는 어류 사료 첨가용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 어류 사료 또는 어류 사료 첨가용 조성물은 통상적으로 이용되는 다양한 성분과 함께 제조될 수 있다. 예를 들어, 해양 단백질 (예를 들어, 어분 또는 크릴밀), 식물성 단백질 (예를 들어, 콩분말, 밀 글루텐, 옥수수 글루텐, 루핀 분말, 완두콩 분말 또는 해바라기씨 분말), 혈분 및 골분을 포함하는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질원을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 어류 사료 또는 어류 사료 첨가용 조성물은 어류 기름 (예를 들어, 오징어간유) 또는 식물성 기름 (예를 들어, 평지씨 기름, 콩기름, 대두유)를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 에너지원, 비타민 혼합물 및 무기질 혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물, 사료용 조성물 및 어류 사료 첨가용 조성물은 상기 항바이러스 조성물을 포함하므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명에 또 다른 일 양태는 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 제조 방법을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다:

꾸지뽕을 준비 하는 꾸지뽕 준비 단계; 및

꾸지뽕에 추출용매를 가하여 추출하는 용매추출 단계.

본 발명에 있어서 꾸지뽕은 뿌리, 줄기, 잎 및 열매를 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 열매 또는 잎인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다

본 발명에 있어서 준비 단계는 꾸지뽕을 절단하는 단계, 세척하는 단계 및 건조하는 단계로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 추출용매는 꾸지뽕 중량에 대하여 10 내지 50 부피배, 15 내지 50 부피배, 20 내지 50 부피배, 25 내지 50 부피배, 10 내지 45 부피배, 15 내지 45 부피배, 20 내지 45 부피배, 25 내지 45 부피배, 10 내지 40 부피배, 15 내지 40 부피배, 20 내지 40 부피배, 25 내지 40 부피배, 10 내지 35 부피배, 15 내지 35 부피배, 20 내지 35 부피배, 25 내지 35 부피배, 예를 들어, 30 부피배의 추출용매로 추출하는 것일 수 있다.

본 발명의 꾸지뽕 추출물은 꾸지뽕에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다.

본 발명에 있어서 극성 용매는 물, 알코올, 아세트산, DMFO (dimethyl-formamide) 및 DMSO (dimethyl sulfoxide)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 알코올은 탄소수 1 내지 5개의 직쇄 또는 분지형 알코올인 것일 수 있으며, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 및 에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 에탄올인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 추출용매로 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에는 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50%이상 내지 100%(v/v)미만, 10 내지 90%(v/v), 20 내지 90%(v/v), 30 내지 90%(v/v), 40 내지 90%(v/v), 50 내지 90%(v/v), 10 내지 80%(v/v), 20 내지 80%(v/v), 30 내지 80%(v/v), 40 내지 80%(v/v), 50 내지 80%(v/v)의 알코올 수용액인 것일 수 있으며, 예를 들어, 50%(v/v)의 알코올 수용액 (예를 들어, 에탄올 수용액)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 사용된 용매추출은 통상적으로 사용되는 모든 방법일 수 있으며, 예를 들어, 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 또는 환류 냉각 추출법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 용매추출 단계의 수행 온도는 20 내지 100 ℃, 20 내지 95 ℃, 20 내지 90 ℃, 20 내지 85 ℃, 20 내지 80 ℃, 25 내지 100 ℃, 25 내지 95 ℃, 25 내지 90 ℃, 25 내지 85 ℃, 25 내지 80 ℃, 30 내지 100 ℃, 30 내지 95 ℃, 30 내지 90 ℃, 30 내지 85 ℃, 30 내지 80 ℃, 35 내지 100 ℃, 35 내지 95 ℃, 35 내지 90 ℃, 35 내지 85 ℃, 35 내지 80 ℃, 40 내지 100 ℃, 40 내지 95 ℃, 40 내지 90 ℃, 40 내지 85 ℃, 40 내지 80 ℃, 45 내지 100 ℃, 45 내지 95 ℃, 45 내지 90 ℃, 45 내지 85 ℃, 45 내지 80 ℃, 50 내지 100 ℃, 50 내지 95 ℃, 50 내지 90 ℃, 50 내지 85 ℃, 50 내지 80 ℃, 55 내지 100 ℃, 55 내지 95 ℃, 55 내지 90 ℃, 55 내지 85 ℃, 55 내지 80 ℃, 60 내지 100 ℃, 60 내지 95 ℃, 60 내지 90 ℃, 60 내지 85 ℃, 60 내지 80 ℃, 65 내지 100 ℃, 65 내지 95 ℃, 65 내지 90 ℃, 65 내지 85 ℃, 65 내지 80 ℃, 70 내지 100 ℃, 70 내지 95 ℃, 70 내지 90 ℃, 70 내지 85 ℃, 70 내지 80 ℃, 75 내지 100 ℃, 75 내지 95 ℃, 75 내지 90 ℃, 75 내지 85 ℃, 75 내지 80 ℃, 예를 들어, 80 ℃인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 용매추출 단계의 수행 시간은 5 내지 10 시간, 6 내지 10 시간, 7 내지 10 시간, 5 내지 9 시간, 6 내지 8 시간, 7 내지 10 시간, 5 내지 9 시간, 6 내지 8 시간, 7 내지 8 시간, 예를 들어, 7.5 시간인 것일 수 있다.

추출공정은 1회 또는 수회 반복할 수 있으며, 본 발명의 한 바람직한 예에서는 1차 추출 후 다시 재추출하는 방법을 채택할 수 있는데, 이는 생약추출물을 대량 생산하는 경우 효과적으로 여과를 한다 하더라도 생약 자체의 수분 함량이 높기 때문에 손실이 발생하게 되어 1차 추출만으로는 추출효율이 떨어지므로 이를 방지하기 위함이다. 또한, 각 단계별 추출효율을 검증한 결과 2차 추출에 의해 전체 추출량의 80 내지 90% 정도가 추출되는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 일 예에서, 추출 단계를 2회 반복하는 경우, 상기 얻어진 잔사에 다시 추출용매 10 내지 50 부피배, 15 내지 50 부피배, 20 내지 50 부피배, 25 내지 50 부피배, 10 내지 45 부피배, 15 내지 45 부피배, 20 내지 45 부피배, 25 내지 45 부피배, 10 내지 40 부피배, 15 내지 40 부피배, 20 내지 40 부피배, 25 내지 40 부피배, 10 내지 35 부피배, 15 내지 35 부피배, 20 내지 35 부피배, 25 내지 35 부피배, 예를 들어, 30 부피배로 환류 추출하는 것일 수 있다.

본 발명에 일 예에서, 추출 후 여과하고 이전에 얻어진 여과액과 합쳐서 감압농축을 하여 꾸지뽕 추출물을 제조한다. 이와 같이 2차에 걸친 추출 및 각각의 추출 후 얻어진 여과액을 혼합함으로써 추출 효율을 높일 수 있으나, 본 발명의 추출물이 추출 회수에 한정되는 것은 아니다.

이와 같이 얻어진 여과된 추출물은 원료로 사용하기에 적합하도록 잔존하는 저급 알코올의 함량을 조절하기 위하여 농축물 총량의 약 10 내지 30배, 바람직하게는 15 내지 25배, 보다 바람직하게는 약 20 중량배의 물로 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 3회 공비 농축하고 재차 동량의 물을 가하여 균질 하게 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말상태의 꾸지뽕 추출물로서 제조될 수 있다.

본 발명은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물 및 꾸지뽕으로부터 유래된 화합물을 유효성분으로 포함하는 어류 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물에 관한 것으로, 어류에서 높은 폐사를 유발하는 병원성 바이러스에 대하여 우수한 항바이러스 활성이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 꾸지뽕나무 잎의 추출 및 용매 분획을 보여주는 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 꾸지뽕나무 미숙과 열매의 추출 및 용매 분획을 보여주는 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 꾸지뽕나무 성숙과 열매의 추출 및 용매 분획을 보여주는 그림이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 구조별 항바이러스 활성 상관관계를 보여주는 그림이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 구조별 항바이러스 활성 상관관계를 보여주는 그림이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 구조별 항바이러스 활성 상관관계를 보여주는 그림이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 꾸지뽕나무 뿌리에서 분리된 화합물의 구조를 보여주는 그림이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 꾸지뽕나무에서 분리된 화합물의 구조에 따른 항바이러스 활성 모식도이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 꾸지뽕나무 부위별 추출물 제조

건조된 꾸지뽕나무 (Cudrania tricuspidata Bureau) 뿌리(CTR), 잎(CTL), 줄기(CTS), 성숙과(CTF), 미숙열매(CTU)를 분쇄하여 각 1g을 취해 실온에서 100% MeOH 10mL로 추출하여 회전 감압 농축기로 농축 후 사용하였다.

제조예 2. 꾸지뽕나무 부위별 분획물의 제조

2-1. 꾸지뽕나무 잎

2-1-1. 추출 및 용매 분획

건조된 꾸지뽕나무 잎 0.8 kg을 실온에서 100% 메탄올로 2회 반복 추출하였다. 그 다음, 추출액을 여과한 후에 여액을 회전 감압 농축기로 농축하여 100% 메탄올 추출물 102.4 g을 수득하였다. 이를 증류수에 현탁 한 후 n-헥산, CH₂Cl₂, 에틸 아세테이트, n-부탄올 순서로 분획하여, n-헥산 분획물 12.2 g, CH₂Cl₂ 분획물 15.2g, 에틸 아세테이트 분획물 4.7g 및 n-부탄올 분획물 17.7 g을 수득하였다. (도 1)

2-1-2. 성분 분리

CH₂Cl₂분획층을 실리카겔 C.C. (CH₂Cl₂:MeOH=100:1~1:1, step gradient)를 시행하여 총 10개의 분획 (CTL-M-1 내지 CTL-M-10)으로 구분하였다. CTL-M-4 분획은 세파덱스 LH-20 (CH₂Cl₂:MeOH = 1:1)를 수행하여 총 5개의 소분획 (CTL-M-4-1 내지 CTL-M-4-5)을 얻었다. 이 중 CTL-M-4-2분획을 세파덱스 LH-20 (n-hexane:CH₂Cl₂:MeOH = 10:10:1)를 수행하여 총 8개의 소분획 (CTL-M-4-2-1 내지 CTL-M-4-2-8)을 얻었다. 이 중 CTL-M-4-2-3분획을 반-분취 (semi-preparative) HPLC (MeCN:H₂O=45:55)를 사용하여 화합물 CTL-37을 얻었고, CTL-M-4-2-6분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H₂O=60:40)를 사용하여 화합물 CTL-45를 얻었다.

CTL-M-4-4분획은 세파덱스 LH-20 (n-hexane:CH₂Cl₂:MeOH = 10:10:1)를 수행하여 총 12개의 소분획 (CTL-M-4-4-1 내지 CTL-M-4-4-12)을 얻었다. 이 중 CTL-M-4-4-2분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H₂O = 60:40)를 사용하여 화합물 CTL-19를 얻었고, CTL-M-4-4-4분획을 반-분취 HPLC (MeCN : H2O=60:40)를 사용하여 화합물 CTL-53 및 54를 얻었다.

CTL-M-4-4-9분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H₂O = 60:40)를 사용하여 화합물 CTL-40을 얻었고, CTL-M-4-4-10분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H₂O = 55:45)를 사용하여 화합물 CTL-28, 55, 56을 얻었고, CTL-M-4-4-11분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H₂O = 55:45)를 사용하여 화합물 CTL-32를 얻었다.

2-2. 꾸지뽕나무 미숙과 열매

2-2-1. 추출 및 용매분획

신선한 꾸지뽕나무 미숙과 열매 2.8 kg을 실온에서 75% 에탄올로 2회 반복 추출하였다. 그 다음, 추출액을 여과한 후에 여액을 회전 감압 농축기로 농축하여 75% 에탄올 추출물 508.2 g을 얻었으며, 이를 증류수에 현탁 한 후 n-헥산, CH₂Cl₂, 에틸 아세테이트, n-부탄올 순서로 분획하여 n-헥산 (30.1 g), CH₂Cl₂ (44.6 g), 에틸 아세테이트 (7.5 g), n-부탄올 (35.8 g)을 얻었다. (도 2)

2-2-2. 성분 분리

CH₂Cl₂ 분획층을 실리카겔 C.C. (n-hexane:EtOAc = 50:1 내지 0:100, step gradient)를 시행하여 총 11개의 분획 (CTU-M-1 내지 CTU-M-11)으로 구분하였다. CTU-M-1분획을 defating (CH₂Cl₂:MeOH=1:1 add 0.1% H2O)를 수행하여 총 2개의 소분획(CTU-M-1MC, CTU-M-1M)을 얻었다. 이 중 CTU-M-1M분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H₂O=90:10)를 사용하여 화합물 CTU-33을 얻었다. CTU-M-6분획을 MPLC (CH₂Cl₂:MeOH=50:1 내지 0:100, step gradient)를 수행하여 총 11개의 소분획(CTU-M-6-1 내지 CTU-M-6-11)을 얻었다. 이 중 CTU-M-6-4분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H2O=57:43)를 사용하여 화합물 CTU-37을 얻었다.

CTU-M-7분획은 재결정과 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)을 수행하여 4개의 소분획 (CTU-M-7-1 내지 CTU-M-7-4)을 얻었다. 이 중 CTU-M-7-3분획은 반-분취 HPLC (MeCN:H2O=55:45)를 사용하여 CTU-M-7-3-1 소분획과 화합물 CTU-18, 43을 얻었다. CTU-M-8분획은 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)을 수행하여 총 4개의 소분획 (CTU-M-8-1 내지 CTU-M-8-4)을 얻었다. 이 중 CTU-M-8-3분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H2O=55:45)를 사용하여 화합물 CTU-34를 얻었다.

CTU-M-9분획은 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)을 수행하여 총 4개의 소분획 (CTU-M-9-1 내지 CTU-M-9-4)을 얻었다. 이 중 CTU-M-9-2분획을 세파덱스 LH-20 (CH₂Cl₂:MeOH=1:1)를 수행하여 총 2개의 소분획(CTU-M-9-2-1 내지 CTU-M-9-2-2)을 얻었다. 이 중 CTU-M-9-2-2분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H₂O=57:43)를 사용하여 화합물 CTU-21을 얻었다. CTU-M-9-4분획은 반-분취 HPLC (MeCN:H₂O=45:55)를 사용하여 화합물 CTU-36, 46을 얻었다.

2-3. 꾸지뽕나무 성숙과 열매

2-3-1. 추출 및 용매분획

신선한 꾸지뽕나무 성숙과 열매 1.2 kg을 실온에서 100% MeOH로 2회 반복 추출하였다. 추출액을 여과한 후에 여액을 회전 감압 농축기로 농축하여 100% MeOH 추출물 486.5 g을 얻었으며, 이를 증류수에 현탁 한 후 n-헥산, CH₂Cl₂, 에틸 아세테이트, n-부탄올 순서로 분획하여 n-헥산 (8.8 g), CH₂Cl₂ (14.4 g), 에틸 아세테이트 (4.3 g), n-부탄올 (19.5 g)을 얻었다. (도 3)

2-3-2. 성분 분리

CH₂Cl₂ 분획층을 실리카겔 C.C. (n-hexane:EtOAc=20:1 내지 0:100 내지 EtOAc:MeOH=100:0 내지 0:100, step gradient)를 시행하여 총 11개의 분획(CTF-M-1 내지 CTF-M-11)으로 구분하였다. CTF-M-7분획과 CTF-M-8분획은 각각 재결정을 통해서 화합물 CTF-11, 10을 얻었다. CTF-M-10분획은 세파덱스 LH-20(CH₂Cl₂:MeOH=1:1)을 수행하여 총 5개의 소분획 (CTF-M-10-1 내지 CTF-M-10-5)을 얻었다. 이 중 CTF-M-10-4분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H₂O=80:20)를 사용하여 화합물 CTF-12를 얻었다.

에틸 아세테이트 분획층을 RP-MPLC (MeOH:H2O=50:50 내지 100:0, step gradient)를 수행하여 총 5개의 분획(CTF-E-1 내지 CTF-E-5)으로 구분하였다. CTF-E-1분획을 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)를 수행하여 총 5개의 소분획(CTF-E-1-1 내지 CTF-E-1-5)을 얻었다. 이 중 CTF-E-1-5분획은 재결정을 통해서 화합물 CTF-2를 얻었다.

2-4. 꾸지뽕나무 뿌리

2-4-1. 추출 및 용매분획

건조된 꾸지뽕나무 뿌리 7.5 kg을 실온에서 80% 메탄올로 2회 반복 추출하였다. 추출액을 여과한 후에 여액을 회전 감압 농축기로 농축하여 80% 메탄올 추출물 461.4 g을 얻었으며, 이를 증류수에 현탁 한 후 n-헥산, CH₂Cl₂, 에틸 아세테이트, n-부탄올 순서로 분획하여 n-헥산 (1.2 g), CH₂Cl₂ (66.9 g), 에틸 아세테이트 (69.4 g), n-부탄올 (130.1 g)을 얻었다.

2-4-2. 성분 분리

CH₂Cl₂ 분획층을 실리카겔 C.C. (n-hexane > CH₂Cl₂ > MeOH gradient)를 시행하여 총 17개의 분획 (C-1 내지 C-17)으로 구분하였다. 이 중 C-15 분획을 MPLC (n-hexane:CH₂Cl₂, gradient)를 수행하여 총 5개의 소분획 (C15A 내지 C15E)을 얻었으며, C15B 분획을 RP-MPLC (MeOH:H₂O = 45:55, MeOH gradient)를 수행하여 총 14개의 소분획 (C15B1 내지 C15B14)을 얻었다.

소분획 중 C15B9를 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)을 수행하여 총 5개의 소분획 (C15B9A 내지 C15B9E)을 얻었다. 이 중 C15B9D를 반-분취 HPLC (MeCN:0.1% 아세트산 수용액 = 65:35)를 사용하여 화합물 CTR-X13, F36을 얻었다.

소분획 중 C15B10 분획을 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)을 수행하여 총 5개의 소분획(C15B10A 내지 C15B10E)을 얻었으며, C15B10E 분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H₂O with 0.1% acetic acid=60:40)을 사용하여 화합물 CTR-X14, 15, 17, 19를 얻었다.

소분획 중 C15B12 분획을 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)을 수행하여 총 4개의 소분획(C15B12A 내지 C15B12D)을 얻었으며, C15B12B 분획을 MPLC (CH₂Cl₂:MeOH)를 수행하여 총 3개의 소분획 (C15B12B1 내지 C15B12B3)을 얻었다. 이 중 C15B12B2 분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H2O with 0.1% acetic acid=60:40)를 사용하여 화합물 CTR-X16을 얻었다.

C-16 분획을 MPLC (CH₂Cl₂:MeOH=90:1, gradient)를 수행하여 총 5개의 소분획(C16A 내지 C16E)을 얻었으며, 이 중 C16B 분획을 RP-MPLC (MeOH:H2O=1:1)를 수행하여 총 18개의 소분획(C16B1 내지 C16B18)을 얻었다.

소분획 중 C16B12을 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)을 수행하여 총 9개 소분획 (C16B12A 내지 C16B12I)을 얻었으며, C16B12F 분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H₂O=45:55)를 사용하여 화합물 CTR-F38을 얻었다.

소분획 중 C16B17을 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)을 수행하여 총 5개의 소분획(C16B12A 내지 C16B12E)을 얻었으며, C16B12E 분획을 세파덱스 LH-20 (CH₂Cl₂:MeOH = 1:1)을 수행하여 총 2개의 소분획 (C16B12E1 내지 C16B12E2)으로 나누었다. C16B12E2 분획을 semi-preparetive HPLC (MeCN:H₂O = 80:20)를 사용하여 화합물 CTR-X11. 23을 얻었다.

에틸 아세테이트 분획층을 실리카겔 C.C. (CH₂Cl₂:MeOH=90:1, gradient)를 시행하여 총 7개의 분획 (E1 내지 E7)을 얻었으며, 이 중 E4 분획을 RP-MPLC (MeOH:H₂O =20:80)를 수행하여 7개의 소분획 (E4A 내지 E4G)을 얻었다. 소분획 중 E4C를 재결정을 통해서 화합물 CTR-F40을 얻었다.

실험예 1. 항바이러스 활성 측정

FHM (fathead minnow) 세포주를 이용하여 주요 어류 병원성 바이러스인 바이러스성 출혈 패혈증 바이러스 (viral hemorrhagic septicemia virus; 이하, VHSV), 조형 괴저성 바이러스 (infectious hematopoietic necrosis virus; 이하, IHNV) 및 전염성 췌장 바이러스 (infectious pancreatic necrosis virus; 이하, IPNV)에 대한 항바이러스 활성 실험을 수행하였다.

구체적으로, 1 X 10⁶ cell/ml로 96웰 플레이트에 배양한 세포를 이용하여 CPE (cytopathic effect) reduction assay (감염가: 200TCID₅₀/ml)를 통해 50% 유효 농도 (effective concentration; EC₅₀)을 결정하였다. 세포독성은 1 X 10⁶ cell/ml로 96웰 플레이트에 배양한 세포를 이용하여 Neutral red uptake assay로 평가 후 CC₅₀값을 구하거나 현미경에 의한 관찰로 MNCC (minimal non-cytotoxic concentration)을 결정하였다.

1-1. 추출물의 항바이러스 활성

Sample	EC₅₀(㎍/ml) for VHSV	EC₅₀(㎍/ml) for IHNV	EC₅₀(㎍/ml) for IPNV	CC₅₀(㎍/ml) for FHM cell line	MNTC	SI for VHSV	SI for IHNV
CTR	1.63±1.32	0.89±0.46	NE	20.37±0.00	-	12.50	22.89
CTF	7.22±1.46	22.50±4.08	NE	61.42±6.84	-	8.51	2.73
CTL	3.76±2.02	1.94±0.25	NE	85.80	-	22.82	44.23
CTS	NE	40% (100㎍/ml)	NE	-	30	-
CTU	NE	NE	NE	-	100	-
Ribavirin (μM)	2.16±0.70	0.92±0.62	0.48±0.18	-	0.3	-
Cell No. (cell/ml)	^1*106	1*10⁶	1*10⁶	^1*106

NE, no effect; MNTC, maximum non toxic concentration; SI, selective index (CC₅₀/EC₅₀)

표 1에서 확인할 수 있듯이, 꾸지뽕나무 각 부위별 추출물의 VHSV와 IHNV에 대한 항바이러스 활성은 뿌리, 잎, 성숙과 순으로 좋은 것으로 확인되었으나 줄기와 미성숙과는 활성이 없었다. IPNV의 경우 5종 추출물 모두 항바이러스 활성이 관찰되지 않았다. 활성에 따라 FHM 세포에 대한 세포독성 또한 높은 것으로 확인되었으며, SI값을 비교해보면 잎, 뿌리, 열매 순으로 정리가 되지만, 뿌리의 경우 5종의 각 부위별 추출물 중 가장 세포독성이 강한 것으로 확인되었다. 따라서, 세포독성이 상대적으로 낮으면서, 항바이러스 활성이 우수한 것을 고려하였을 때, 잎과 성숙과의 가능성이 높은 것으로 판단되었다.

1-2. 각 부위에서 분리된 화합물들의 항바이러스 활성

Sample	EC₅₀(㎍/ml) for VHSV	EC₅₀(㎍/ml) for IHNV	EC₅₀(㎍/ml) for IPNV	CC₅₀(㎍/ml) for FHM cell line	MNTC	SI for VHSV	SI for IHNV
Genistein	15% (0.3㎍/ml)	5% (0.3㎍/ml)	15% (0.3㎍/ml)	-	0.3	-	-
CTF-2	30% (3㎍/ml)	40% (3㎍/ml)	10%(1㎍/ml)	>10	-	-	-
CTF-10	6.21	9.36	NE	>10	-	-	-
CTF-11	1.03±0.69	2.44	10% (3㎍/ml)	6.49±0.07	-	6.32	2.66
CTF-12	0.74	0.14±0.09	20%(0.3㎍/ml)	-	3	-	-
CTU-18	35% (10㎍/ml)	10% (3㎍/ml)	20%(3㎍/ml)	>10	-	-	-
CTU-21	0.71±0.36	45% (3㎍/ml)	NT	6.20±0.10	-	8.73	-
CTL-19	1.34±0.52	0.92	10%(3㎍/ml)	-	3	-	-
CTL-28	0.99±0.76	0.94±0.61	5%(3㎍/ml)	6.92±0.44	-	6.99	7.36
CTL-32	0.79±0.43	0.74±0.33	NE	9.18±0.93	-	11.69	12.41
Ribavirin (μM)	2.16±0.70	0.92±0.62	0.46±0.16	-	0.3	-	-
Cell No. (cell/ml)	^1*106	1*10⁶	1*10⁶	^1*106

NE, no effect; NT, not tested; MNTC, maximum non toxic concentration; SI, selective index (CC₅₀/EC₅₀)

표 2에서 확인할 수 있듯이, 추출물의 항바이러스 활성과 유사하게 뿌리, 성숙과 및 잎에서 분리된 화합물들의 항바이러스 활성 또한 우수하였으며, 마찬가지로 활성이 있는 화합물의 경우 세포독성 또한 강한 것으로 확인되었다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, 이를 구조별로 살펴보면 기본구조인 제니스테인 (genistein) 활성은 0.3 ㎍/ml에서 15% CPE 감소를 보였으나, F11 F12 U21 L19, 28, 32를 보면 기본 구조에서 R3, 4자리에 프레닐화되면 활성이 증가한다는 것을 알 수 있으며, 또한 F11, 12 및 L28, 32에서 R1 위치에 OH가 붙음으로 활성이 다소 증가하는 형태를 보이나 큰 차이는 없었다. R2 위치에 OH기가 OCH₃로 치환되면 활성이 낮아지는 것으로 확인되었다.

Sample	EC₅₀(㎍/ml) for VHSV	EC₅₀(㎍/ml) for IHNV	EC₅₀(㎍/ml) for IPNV	CC₅₀(㎍/ml) for FHM cell line	MNTC	SI for VHSV	SI for IHNV
CTU-33	NE	30% (10㎍/ml)	35% (3㎍/ml)	>10	-	-	-
CTU-36	0.50	<0.3	10%(0.3㎍/ml)	9.81±0.40	-	19.61	>32.7
CTU-37	NE	15% (3㎍/ml)	20%(3㎍/ml)	7.03±0.22	-	-	-
CTU-43	NE	20% (3㎍/ml)	35%(1㎍/ml)	6.53±0.62	-	-	-
CTU-34	NE	NE	10%(0.3㎍/ml)	-	1	-	-
CTU-46	2.00	0.49±0.14	NE	-	3	-	-
Ribavirin (μM)	2.16±0.70	0.92±0.62	0.46±0.16	-	0.3	-	-
Cell No. (cell/ml)	^1*106	1*10⁶	1*10⁶	^1*106

표 3 및 도 5에서 확인할 수 있듯이, 7번 자리의 OH와 6번 자리의 프레닐이 고리화를 이루는 경우 활성이 낮아지는 것을 확인하였으며 (CTU-33 (NE)과 CTF-10 (6.21㎍/ml)/CTU-43(NE)와 CTL-28 (0.99㎍/ml)의 비교), 여기서도 마찬가지로 R2자리가 OCH₃로 치환되면 활성이 낮아지는 것으로 확인되었다. 항바이러스 활성과 대조적으로 고리화된 형태에서는 프레닐기 보다 R1자리의 OH가 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. U36 (0.5㎍/ml)의 경우에는 L19번과 비교가능하며 6번자리의 프레닐기가 고리화를 이루어도 R1자리에 OH기가 치환될 경우 활성이 높아지는 것으로 확인되었다.

Sample	EC₅₀(㎍/ml) for VHSV	EC₅₀(㎍/ml) for IHNV	EC₅₀(㎍/ml) for IPNV	CC₅₀(㎍/ml) for FHM cell line	MNTC	SI for VHSV	SI for IHNV
CTL-37	NE	NE	NE	>10	-	-	-
CTL-40	NE	5% (10㎍/ml)	NE	>10	-	-	-
CTL-53	NE	NE	10%(3㎍/ml)	5.87±0.29	-	-	-
CTL-55	1.39±0.49	0.48±0.03	10%(1㎍/ml)	-	3	-	-
CTL-45	NE	NE	NE	>10	-	-	-
CTL-54	NE	<0.3	15% (1㎍/ml)	6.58	-	-
CTL-56	2.35	0.65±0.00	NE	8.97±1.39	-	3.82	13.80
Ribavirin (μM)	2.16±0.70	0.92±0.62	0.46±0.16	-	0.3	-
Cell No. (cell/ml)	^1*106	1*10⁶	1*10⁶	^1*106

표 4 및 도 6에서 확인할 수 있듯이, 앞선 고리화된 형태와 마찬가지로 고리화되면 활성이 최소 3배 이상 낮아지는 것을 확인하였으며 (CTL-53(NE)과 CTU-21(0.71㎍/ml)/CTL-45(NE)와 CTU-18(35%, 10㎍/ml)/CTL-56(2.35㎍/ml)과 CTL-32(0.79㎍/ml)/CTL-54(NE)와 CTL-28(0.99㎍/ml) 비교), 또한 마찬가지로 고리화된 경우에는 프레닐기 보다 R1자리의 OH기의 유무에 따라 활성이 달라지는 것을 알 수 있다.

Sample	EC₅₀(㎍/ml) for VHSV	EC₅₀(㎍/ml) for IHNV	EC₅₀(㎍/ml) for IPNV
CTR-X11	2.89±0.72	1.05±0.11	5% (3㎍/ml)
CTR-X13	0.65±0.00	0.48±0.03	NE
CTR-X14	20% (3㎍/ml)	1.65	NE
CTR-X15	30% (3㎍/ml)	0.85±0.18	15% (1㎍/ml)
CTR-X16	20% (3㎍/ml)	0.53±0.04	20% (1㎍/ml)
CTR-X17	1.21±0.24	0.25±0.08	10% (3㎍/ml)
CTR-X19	0.25±0.07	0.22±0.01	NE
CTR-X23	0.24±0.08	0.18±0.01	NE
CTR-F36	NE	NT	5% (10㎍/ml)
CTR-F38	2.63±0.53	2.35	9.24
CTR-F40	0.29±0.10	0.67±0.00	NE
Ribavirin (μM)	2.16±0.70	0.92±0.62	0.46±0.16
Cell No. (cell/ml)	^1*106	1*10⁶	1*10⁶

NE, no effect; NT, not tested

표 5 및 도 6에서 확인할 수 있듯이, 꾸지뽕나무 뿌리에서는 prenylated xanthone 및 prenylated flavonoid 화합물들이 다수 분리되었으며 0.3 내지 3.4 ㎍/ml의 EC₅₀을 나타내었다.

Claims

꾸지뽕 (Cudrania tricuspidata Bureau) 잎 또는 성숙과 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 바이러스성출혈성패혈증바이러스 (Viral Hemorrhagic Septicemia Virus; VHSV) 또는 전염성조혈기괴사증바이러스 (Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; IHNV)에 의한 어류 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물.
삭제
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제1항에 있어서, 상기 추출물은 탄소수 1 내지 5의 무수 또는 함수 저급 알코올, 물, 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출된 것인, 어류 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물.
제1항에 있어서, 상기 분획물은 꾸지뽕 용매 조추출물에 에틸에테르, 아세트산에틸, 부탄올 및 디클로로메탄으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물인 것인, 어류 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물.
제1항에 있어서, 상기 어류는 양식어류 또는 관상어인 것인, 어류 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물.
제6항에 있어서, 상기 양식어류는 넙치, 우럭, 참돔, 돌돔, 능성어, 숭어, 농어, 전어, 가자미, 복어, 고등어, 노래미, 다랑어, 민어, 방어, 전갱이, 연어, 무지개 송어, 잉어, 향어, 뱀장어, 메기, 미꾸라지 및 붕어로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 어류 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 조성물은 하기의 화학식 1 내지 17로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 포함하는 것인, 어류 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 조성물:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
R₁은 -H 또는 -OH이고,
R₂는 -OH 또는 -OCH₃이고,
R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 -H,
또는
이다.
[화학식 2]

상기 화학식 2에서,
R₁은 -H 또는 -OH이고,
R₂는 -OH 또는 -OCH₃이고,
R₃은 -H 또는
이다.
[화학식 3]

상기 화학식 3에서,
R₁은 -H 또는 -OH이고,
R₂는 -OH이고,
R₃은 -H 또는
이다.
[화학식 4]

상기 화학식 4에서,
R₁은 -H 또는 -OH이고,
R₂는 -OH 또는 -OCH₃이고,
R₃은 -H 또는 -OCH₃이고,
R₄는-H 또는
이다.
[화학식 5]

[화학식 6]

상기 화학식 6에서, R은 -H 또는 -OH이다.
[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]

[화학식 12]

[화학식 13]

[화학식 14]

[화학식 15]

[화학식 16]

[화학식 17]

.
꾸지뽕 (Cudrania tricuspidata Bureau) 잎 또는 성숙과 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 바이러스성출혈성패혈증바이러스 (Viral Hemorrhagic Septicemia Virus; VHSV) 또는 전염성조혈기괴사증바이러스 (Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; IHNV)에 의한 어류 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
꾸지뽕 (Cudrania tricuspidata Bureau) 잎 또는 성숙과 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 바이러스성출혈성패혈증바이러스 (Viral Hemorrhagic Septicemia Virus; VHSV) 또는 전염성조혈기괴사증바이러스 (Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; IHNV)의 어류 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 어류 사료용 조성물.
꾸지뽕 (Cudrania tricuspidata Bureau) 잎 또는 성숙과 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 바이러스성출혈성패혈증바이러스 (Viral Hemorrhagic Septicemia Virus; VHSV) 또는 전염성조혈기괴사증바이러스 (Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; IHNV)의 어류 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 어류 사료 첨가용 조성물.
꾸지뽕 (Cudrania tricuspidata Bureau) 잎 또는 성숙과 추출물 또는 분획물을 이용한 바이러스성출혈성패혈증바이러스 (Viral Hemorrhagic Septicemia Virus; VHSV) 또는 전염성조혈기괴사증바이러스 (Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; IHNV)에 의한 어류 바이러스성 질병의 예방 또는 치료방법.