KR20180024877A - 인간 잇몸-유래 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 형성된 세포 스페로이드 및 이로부터 혈관내피 성장인자의 생산량을 증가시키는 방법 - Google Patents
인간 잇몸-유래 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 형성된 세포 스페로이드 및 이로부터 혈관내피 성장인자의 생산량을 증가시키는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 잇몸-유래 줄기세포 및 골세포 전구체를 공동배양하여 줄기세포의 혈관내피성장인자 생산을 증가시키는 방법, 상기 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물 또는 골융합 촉진용 조성물, 및 잇몸-유래 줄기세포 및 골세포 전구체를 공동배양하여 세포 스페로이드를 형성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라 잇몸-유래 중간엽 줄기세포 및 골세포 전구체를 공동배양하여 줄기세포 유래의 VEGF 생산량을 증가시킬 수 있고, 상기 공동배양에 의해 세포 스페로이드를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 세포 스페로이드로부터 VEGF 함량이 향상된 배양액을 유효성분으로 포함하는 조성물을 사용하여 치아 내 골융합을 촉진시켜서 골질환을 효과적으로 치료할 수 있고, 허혈성 질환을 혈관신생 촉진에 의해 효과적으로 치료할 수 있다.
본 발명에 따라 잇몸-유래 중간엽 줄기세포 및 골세포 전구체를 공동배양하여 줄기세포 유래의 VEGF 생산량을 증가시킬 수 있고, 상기 공동배양에 의해 세포 스페로이드를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 세포 스페로이드로부터 VEGF 함량이 향상된 배양액을 유효성분으로 포함하는 조성물을 사용하여 치아 내 골융합을 촉진시켜서 골질환을 효과적으로 치료할 수 있고, 허혈성 질환을 혈관신생 촉진에 의해 효과적으로 치료할 수 있다.
Description
본 발명은 인간 잇몸-유래 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 형성된 세포 스페로이드 및 이로부터 혈관내피 성장인자(VEGF)의 생산량을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 잇몸-유래 줄기세포 및 골세포 전구체를 공동배양하여 줄기세포의 혈관내피성장인자 생산을 증가시키는 방법, 상기 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물 또는 골융합 촉진용 조성물, 및 잇몸-유래 줄기세포 및 골세포 전구체를 공동배양하여 세포 스페로이드를 형성하는 방법에 관한 것이다.
세포의 공동-배양은 줄기세포를 포함하는 세포 치료제의 개발에 오랫동안 사용되어 왔고 기능성을 향상시키는 것으로 알려져있다. 1차 간세포(primary hepatocyte)와 간 간성상세포(hepatic stellate cell)를 사용하여 형성된 스페로이드는 한 종류의 세포를 단일배양하여 형성시킨 세포 스페로이드에 비해 더 많은 알부민을 생산한다(비특허문헌 1). 부가적으로, 공동-배양된 이질적인 세포 스페로이드의 효소 활성이 단일 배양된 세포 스페로이드에 비해 높다. 췌장섬 유래 1차 세포 및 간세포는 3차원 공동-배양 모델 연구에 사용되어 왔으며, 다른 형태인 2 종류의 세포는 스페로이드 형태로서 서로의 기능성을 보완해 준다는 연구 결과가 보고되고 있으며 이러한 효과는 더 많은 수의 단일 세포 배양에 비해 높은 것으로 알려져 있다(비특허문헌 2).
최근에는, 줄기세포 자체보다는 줄기세포를 배양하여 생산되는 배양액 내 다양한 생리활성 인자가 포함되어 있음을 확인하여 이를 이용한 다양한 치료제가 개발 중이고(비특허문헌 3), 줄기세포에 대한 다양한 배양 조건(저산소 환경 배양, 세포 자극 인자의 처리 등)을 적용하여 배양액을 제조한 후 이의 질환 치료 효과에 대한 실험이 활발히 진행되고 있다. 또한, 줄기세포의 용도에 있어서 세포 재생뿐만 아니라 일시적인 파라크린(paracrine) 활성까지 확대되고 있다(비특허문헌 4). 중간엽 줄기세포는 성장인자, 사이토카인, 및 세포외 기질 금속단백분해효소를 포함하는 다양한 단백질을 분비하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 5). 혈관내피, 섬유아세포, 및 간세포 성장인자를 포함하는 다양한 성장인자들이 중간엽 줄기세포로부터 분비된다는 것이 알려져 있고(비특허문헌 6, 비특허문헌 7), 중간엽 줄기세포의 조정 배지(Conditioned medium)가 내피세포의 성장에 영향을 준다는 보고가 알려져 있다(비특허문헌 8). 특히, 혈관내피성장인자(VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor)의 분비는 중간엽 줄기세포-조정 배지의 분석에 의해 입증되었다(비특허문헌 9).
하지만, 중간엽 줄기세포로부터 혈관내피성장인자의 분비를 증가시키는 세포의 공동배양 방법에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.
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본 발명은 상기와 같은 종래의 기술 상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 3차원 세포 배양방법에 근거하여 줄기세포와 골전구체 세포를 마이크로웰에서 공동배양하여 세포 스페로이드를 구축하고, 줄기세포의 파라크린 효과를 향상시켜서 줄기세포 유래의 VEGF 분비량을 증가시키는 방법을 제공하는데 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 잇몸-유래 줄기세포와 골전구체 세포를 다양한 비율로 공동-배양하여 세포 스페로이드를 형성하였고, 상기 세포 스페로이드로부터의 VEGF 생산량을 측정하여 줄기세포 비율 증가에 따른 VEGF 생산량 증가를 검증하였다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 발명의 목적은 잇몸-유래 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 3차원 형태로 형성된 세포 스페로이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 잇몸-유래 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포의 혼합 비율을 조절하여 공동배양함으로써 VEGF 분비량이 향상된 세포 스페로이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 VEGF 함량이 증가된 세포 스페로이드 배양액을 유효 성분으로 포함하는 골 융합 촉진용 조성물 또는 허혈성 질환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 중간엽 줄기세포의 성장인자 단백질 생산을 증가시키는 방법을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 잇몸 유래의 줄기세포이고, 상기 공동배양에 의한 성장인자 단백질의 생산량은 중간엽 줄기세포 단독배양에 의한 생산량에 비해 증가되었으며, 상기 성장인자 단백질의 생산량은 골전구체 세포에 대한 중간엽 줄기세포의 비율(중간엽 줄기세포: 골전구체 세포)에 따라 증가하며, 상기 비율은 1:3 내지 3:1이며, 상기 성장인자 단백질은 혈관내피성장인자(VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor), 섬유아세포 성장인자(FGF, Fibroblast Growth Factor), 및 간세포 성장인자(HGF, Hepatocyte Growth Factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 중간엽 줄기세포의 성장인자 단백질 생산을 증가시키는 방법을 제공하였다.
본 발명의 다른 구체예에서, 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 획득한 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 줄기세포 배양액은 혈관내피성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 및 간세포 성장인자(HGF)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 성장인자 단백질을 포함하고, 상기 허혈성 질환은 허혈성 뇌질환, 허혈성 신질환, 허혈성 폐질환, 사지의 허혈성 질환, 버거스병, 하지동맥 폐색증, 뇌졸중, 뇌경색, 허혈성 심근증, 심근경색증, 허혈성 심부전 및 폐색성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하였다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 획득한 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 치아 내 골융합 촉진용 조성물을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 줄기세포 배양액은 혈관내피성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 및 간세포 성장인자(HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 성장인자 단백질을 포함하는 것인, 치아 내 골융합 촉진용 조성물을 제공하였다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 중간엽 줄기세포 및 골전구체(osteoprecursor) 세포를 혼합하여 공동배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포가 결합된 세포 스페로이드(cell spheroid)의 제조 방법을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 중간엽 줄기세포는 잇몸 유래이고, 상기 중간엽 줄기세포 및 골전구체(osteoprecursor) 세포의 혼합 비율은 1:3 내지 3:1이며, 상기 세포 스페로이드는 줄기세포능(stemness)을 유지하고 있으며, 상기 공동배양은 오목한 표면에서 실시하는 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포가 결합된 세포 스페로이드(cell spheroid)의 제조 방법을 제공하였다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부 외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부 외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부 외용제에 사용되는 성분, 예를 들어 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 중점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종 생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산 인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류 등도 적절하게 배합할 수 있다.
세포 배양은 바이오 연구 분야에서 가장 기본이 되는 연구 방법으로서 생명체의 기능 연구뿐만 아니라 인체 질환의 연구에까지 광범위하게 이용되고 있다. 현재까지 가장 흔히 사용되고 있는 세포 배양 방법은 2차원 표면에서 세포를 배양하는 것이다. 하지만, 단층 세포 배양 방법은 2차원적 세포배양법에 의해 성장하는 세포는 세포외기질(extracellular matrix)에 부착되어 3차원적 생체조직 환경에서 성장하는 세포와 많은 차이점을 나타낸다. 따라서, 2차원적 및 3차원적 세포배양은 전반적인 형태학적 차이를 나타내며, 또한 통상적인 2차원적 세포배양을 통하여 일어나는 수용체의 발현, 유전자의 전사조절, 세포의 이동 및 세포자멸사(apoptosis) 등 많은 복잡한 생명 현상이 실제 생체 조직 환경에서 일어나는 현상과 크게 다르므로, 2차원적 세포배양 방법은 3차원 상에서 세포가 성장하는 생체의 생리적 환경을 정확히 반영할 수 없다는 문제점을 나타내고 있다. 특히, 세포가 생체 내와 동등한 3차원 조직을 구축할 수 없고, 세포가 체내에서 갖고 있는 특이적인 기능을 장시간 유지할 수 없다. 이와 같은 2차원적 세포배양에서 나타나는 문제점을 해결하기 위하여 생체 내와 동등한 기능을 갖는 세포의 3차원 조직인 스페로이드의 배양이 주목을 받고 있다. 특히, 줄기세포 기술이 발전함에 따라 배아줄기세포를 3차원으로 스페로이드 배양하여 각종 분화 기전의 연구에 응용하기 위한 여러가지 방법이 시도되고 있다.
출원서 내 특별한 정의가 없으면 본 출원서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명에서 "2차 배양"은 줄기세포 배양에 통상적으로 사용하던 방식으로서 배양 접시(페트리 디쉬) 상에서 줄기세포를 배양하는 것으로서 단일층 배양(monolayer culture)으로도 불리고, "3차 배양"은 배양 접시가 아닌 배양 배지가 담긴 플라스크에서 적절한 교반 하에 배양하는 것으로서, 스피너 배양(spinner culture)으로도 불린다.
본 발명에서 "세포 스페로이드"는 세포 배양시 세포들이 3차원 형태로 뭉쳐서 형성된 세포의 집합체이다. 최근에는 생체 내와 동등한 기능을 갖는 3차원 세포 조직인 스페로이드(spheroid)의 배양이 주목을 받고 있다. 암을 모사하기 위한 세포 응집(cell aggregation)을 유도하기도 하고, 당뇨 치료를 위한 인슐린의 정상분비를 유도하기 위해서 췌도 세포를 이식함에 있어 응집된 세포를 이식하는 방법 등이 쓰이고 있어 스페로이드의 대량 생산이 요구되고 있다. 또한, 줄기세포 연구가 성숙됨에 따라 배아 줄기세포를 3차원 배양하여 각종 분화 기전의 연구에 응용하기 위한 여러 가지 방법이 시도되고 있다.
한편, 줄기세포를 배양하게 되면 줄기세포는 배양액 내로 다양한 물질들을 분비한다. 이러한 줄기세포 배양액은 줄기세포가 분비하는 물질의 총칭으로 다양한 성장인자 단백질을 포함하는 다양한 물질을 포함하고 있으며, autocrine, paracrone, 및 endocrine 등의 기능을 통해 세포 치료에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 이 배양액은 여러 연구에서 상당한 생화학적 활성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 최근에는 이와 같이 줄기세포를 배양하여 유효물질을 극대화시킨 줄기세포 배양액을 이용한 다양한 용도의 개발이 시도되고 있다. 현재까지 의약품 및 화장료 조성물에 많이 사용되고 있는 인간 유래 지방줄기세포 배양액 추출물(Human adipocyte conditioned media extracts)은 지방조직에서 지방을 제거한 세포를 여러 세대 배양해 줄기세포를 분리해 낸 후, 줄기세포 배양액으로부터 줄기세포가 만들어낸 단백질을 얻을 수 있다. 이 단백질 혼합물에는 VEGF(혈관내피성장인자), TGF(형질전환성장인자), HGF(간세포증식인자), FGF(섬유아세포성장인자), IGF(인슐린유사성장인자) 등 150여 가지의 성장인자(growth factor) 단백질 성분을 포함하고 있는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 지방유래 줄기세포로부터 필요한 활성 단백질 성분의 함량을 증가시키는 다양한 종류의 배양 방법에 대한 개발이 활발히 진행되고 있다.
본 발명에서 "골전구체 세포(osteoprecursor)"는 골(bone)을 형성하는데 도움을 주는 모든 세포로 분화될 수 있는 세포를 의미하며, 바람직하게는 골재생에 사용될 수 있는 세포를 의미하며, 더욱 바람직하게는 치아 내 골재생에 영향을 주는 세포를 의미한다.
본 발명에서 "혈관내피 성장인자(VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor)"는 중간엽 줄기세포가 분비하는 주요한 혈관신생 인자로서, 내피 세포의 생존, 분화 및 혈관 형성을 조절하는 기능을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. VEGF는 저산소상태 및 TGF, 인터루킨, PDGF와 같은 세포성장인자들의 자극에 의해 혈관내피세포, 조혈세포, 기질세포에서 주로 생성된다. 조직 내에서 VEGF의 발현이 증가되면 혈관 신생 촉진을 유도함으로써 세포 및 조직의 재생이 활발해지는 것이다.
혈류공급의 영향을 비교적 많이 받는 근골격계에서도 혈관생성의 중요성이 부각되면서 치료성 혈관신생이 각광을 받기 시작하였고, 골유합, 골형성, 골이식, 국소 허혈성 골괴사 등에서 이미 혈관형성의 촉진이 치료에 도움을 주는 것으로 알려져 활용되고 있는 실정이다(비특허문헌 10). 모세혈관에서 혈장단백질의 투과를 증가시키는 사이토카인(cytokine)으로서, 세포의 분열과 이동을 촉진하고 세포소멸의 억제를 통해 새로 형성된 혈관의 생존을 유지시키며, 혈관세포의 이동을 촉진시켜 새로운 세포의 발생 및 분화를 촉진시키는 VEGF는 최근 연구에서 뼈 성장의 조절에 대한 역할에 많은 관심이 집중되고 있고, BMP-2보다 조골세포의 증식에 더 강력한 유도활성을 갖는다고 보고되었다(비특허문헌 11). 특히, 치아 내 골재생에 사용하는 치조골 재생용 조성물에 VEGF를 추가하면 종래 뼈를 주성분으로 하는 치조골 재생용 조성물에 비해 현저히 치조골의 재생 속도 및 치아 내 골융합 속도를 향상시킬 수 있다(특허문헌 1, 특허문헌 2).
본 발명에서 "허혈성 질환(Ischemic disease)"은 몸의 각 기관에 혈류를 공급하는 혈관에 다양한 형태의 병리학적 이상이 발생되어, 국소적으로 정상적 혈류의 장애를 초래하게 되는 질환을 의미한다. 혈관을 통한 혈액의 공급은 상처 치유나 조직 재생에 필수적인 현상이라 할 수 있는데, 동맥 경화증, 심근경색 및 협심증과 같은 질병은 원활하지 못한 혈액 공급이 원인이 되고 있다.
한편, 혈관신생을 이용한 생체 질환의 치료를 혈관신생요법이라 하는데, 이미 VEGF와 같은 혈관신생인자는 중증의 국소 빈혈을 위한 치료제로 사용되고 있다. 또한, FGF, 표피성장인자(EGF, Epithermal Growth Factor) 및 혈소판-유도 내피 성장인자(PDEGF, Platelet-Derived Endothelial Growth Factor) 등의 혈관신생인자들도 임상 치료를 위하여 연구되고 있다. 하지만, 상기 인자들은 단백질로서 분리 및 정제가 어렵고, 고가이므로 임상 적용에 어려움이 있다.
본 발명에 따라 잇몸-유래 중간엽 줄기세포 및 골세포 전구체를 공동배양하여 줄기세포 유래의 VEGF 생산량을 증가시킬 수 있고, 상기 공동배양에 의해 세포 스페로이드를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 제조된 세포 스페로이드로부터 VEGF 함량이 향상된 배양액을 유효성분으로 포함하는 조성물을 사용하여 치아 내 골융합을 촉진시켜서 골질환을 효과적으로 치료할 수 있고, 허혈성 질환을 혈관신생 촉진에 의해 효과적으로 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 세포 공동배양 및 분석 방법의 개요에 관한 것이다.
도 2는 줄기세포 및 골전구체(osteoprecursor) 세포를 2차원 배양하여 3일째 관찰한 결과에 관한 것이다.
도 3은 줄기세포 및 골전구체(osteoprecursor) 세포를 3차원 배양하여 3일째 관찰한 결과에 관한 것이다.
도 4는 본 발명에 따라 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 형성된 세포 스페로이드의 생존율에 관한 것이다.
도 5는 본 발명에 따라 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 형성된 세포 스페로이드의 줄기세포능(stemness)에 관한 것이다.
도 6은 본 발명에 따라 줄기세포 및 골전구체 세포를 2차원 배양하여 혈관내피성장인자(VEGF) 분비를 비교한 결과에 관한 것이다.
도 7은 본 발명에 따라 줄기세포 및 골전구체 세포를 3차원 배양하여 형성된 세포 스페로이드 유래의 혈관내피성장인자(VEGF) 분비를 비교한 결과에 관한 것이다.
도 2는 줄기세포 및 골전구체(osteoprecursor) 세포를 2차원 배양하여 3일째 관찰한 결과에 관한 것이다.
도 3은 줄기세포 및 골전구체(osteoprecursor) 세포를 3차원 배양하여 3일째 관찰한 결과에 관한 것이다.
도 4는 본 발명에 따라 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 형성된 세포 스페로이드의 생존율에 관한 것이다.
도 5는 본 발명에 따라 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 형성된 세포 스페로이드의 줄기세포능(stemness)에 관한 것이다.
도 6은 본 발명에 따라 줄기세포 및 골전구체 세포를 2차원 배양하여 혈관내피성장인자(VEGF) 분비를 비교한 결과에 관한 것이다.
도 7은 본 발명에 따라 줄기세포 및 골전구체 세포를 3차원 배양하여 형성된 세포 스페로이드 유래의 혈관내피성장인자(VEGF) 분비를 비교한 결과에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
잇몸-유래 줄기세포의 분리 및 배양
잇몸(Gingiva)-유래 줄기세포는 선행문헌(비특허문헌 12)에 기재된 방법에 따라 수득하였다. 잇몸 조직은 탈-상피화(de-epithelialize)시키고, 갈아서(mince) 1~2 mm2의 단편으로 만든 후, 1 ㎎/㎖의 디스파제(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 및 2 ㎎/㎖의 콜라게네이즈 IV(Sigma-Aldrich Co.)를 포함하는 알파-변형된 최소 배지(α-MEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 분해시켰다. 세포는 5% CO2 및 95% O2로 가습된 인큐베이터 내에서 배양하였다. 비부착 세포는 인산-완충-식염수(PBS; Welgene, 대구)를 사용하여 세척하였고 신선한 배지로 교환하였다. 배지는 2-3일마다 교환하였다.
줄기세포 및
골전구체
(
osteoprecursor
) 세포의 공동-배양(2차원 배양)
잇몸-유래 줄기세포 및 골전구체 세포(MC3T3-E1 세포, ATCC CRL-2593)는 6×105의 양으로 24웰 플레이트에 시딩하였고 성장 배지(α-MEM)를 사용하여 배양하였다. 줄기세포와 골전구체 세포의 비율은 0:4(그룹 1), 1:3(그룹 2), 2:2(그룹 3), 및 3:1(그룹 4)로 조합하여 배양하였다.
골전구체 세포의 형태는 3일째에 섬유아세포와 유사한 형태를 나타내었다(도 2A). 잇몸-유래 줄기세포 및 골전구체 세포의 다른 비율(group 2, 1:3; group 3, 2:2; 및 group4, 3:1)로 배양시 형태학적으로 유의한 차이점이 관찰되지 않았다(각각 도 2B, 도 2C, 및 도 2D).
세포
스페로이드
(spheroid) 형성(3차원 배양)
줄기세포 스페로이드를 형성하기 위해, 마이크로웰에 배지(α-MEM)를 넣고 기포를 제거하기 위해 피펫팅(pipetting)을 신중하게 실시하였다. 기포가 다 제거되면 세포를 잘 섞어 디쉬(dish) 위에 로딩(loading)하였다. 줄기세포 스페로이드는 폴리디메틸실록산에 기반한 오목한 마이크로몰드(Prosys® StemFit 3D, Prodizen Inc., 서울) 내에서 직경 600 ㎛ 크기로 형성되었다. 잇몸-유래 줄기세포 및 골전구체 세포는 4가지 비율(그룹 1 내지 그룹 4)로 조합하여 공동배양을 실시하였다(도 1 참조). 세포 응집 및 세포-스페로이드 형성은 역상 현미경(Leica DM IRM, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)를 사용하여 관찰하였고, 촬영된 이미지를 저장하였다.
공동-배양 3일째의 스페로이드 형태는 도 3에 나타내었다. 골전구체 세포는 오목한 마이크로웰 내에서 스페로이드를 형성하였다(도 3A). 잇몸-유래 줄기세포 및 골전구체 세포를 조합한 그룹도 스페로이드를 형성하였다(도 3B-3D). 골전구체 세포에 대한 줄기세포 비율의 증가(Group 2, 1:3; Group 3, 2:2; Group4, 3:1)에 따라 형성된 스페로이드에 대한 형태학적 관찰에서 어떠한 유의한 변화도 관찰되지 않았다(각각 도 3B, 3C, 및 3D).
세포 생존율 측정
세포 스페로이드의 생존율은 공동-배양 3일째에 Live/Dead Kit(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하여 정성적으로 분석하였다. 세포 스페로이드는 PBS를 사용하여 2회 세척하였고, 이후에 2㎕의 50mM 칼세인 아세톡시메틸 에스테르(calcein acetoxymethyl ester) 워킹 용액 및 4㎕의 2mM 에디티움 동형이량체-1(Ethidium homodimer-1)을 포함하는 1㎖의 α-MEM으로 상온에서 15분간 부유시켰다. 칼세인 아세톡시메틸 에스테르 및 에티디움 동형이량제-1으로 염색된 스페로이드는 형광 현미경(Axiovert 200; Zeiss, Germany)을 사용하여 관찰하였다. 생존한 세포는 강하고 동일한 녹색 형광을 나타내었고, 죽은 세포는 적색 형광을 나타내었다(도 4).
줄기세포능
(
stemness
) 측정
세포 스페로이드는 공동-배양 3일째에 회수하여 줄기세포능을 측정하였다. 세포 스페로이드는 1x 농도로 희석시킨 NHL493(녹색)에 접합된 인간 SSEA-4 항체(Clone MC-813-70; R&D Systems, McKinley Place, NE, USA) 및 NL557(적색)에 접합된 인간 TRA-1-60(R) 항체(Clone TRA-1-60; R&D Systems)을 사용하여 배양하였다. 스페로이드 내 항원들(SSEA-4, TRA-1-60(R))은 형광 현미경(Axiovert 200; Zeiss, Germany) 상에서 시각화하였다. 상기 항원들은 인간 줄기세포의 양성 표지자로서 사용하였다.
스페로이드 내 대부분의 세포는 녹색 형광을 발산하였고, 적은 비율의 적색 형광이 관찰되었다(도 5). 줄기세포 없이 형성된 스페로이드는 줄기세포 마커인 SSEA-1 및 TRA-1-60(R)에 대하여 음성 결과를 나타내었다(도 5A-5C). 줄기세포를 포함하는 스페로이드는 줄기세포 마커인 SSEA-1 및 TRA-1-60(R)에 대하여 양성 결과를 나타내었다(도 5D-5L).
혈관내피성장인자(
VEGF
, Vascular Endothelial Growth Factor)의 분비
상기 실시예 2 및 실시예 3(2차원 및 3차원 배양)에 따른 공동배양 시스템으로부터의 인간 혈관내피성장인자의 분석은 통상적으로 사용 가능한 키트(Quantikine® ELISA, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 실시하였다. 모든 시약 및 시료는 매뉴얼에서 추천한 바에 따라 준비하였다.
6.1. 2차원 공동배양에서의 혈관내피성장인자(VEGF) 분비
2차원 공동-배양에서 혈관내피성장인자의 분비는 그룹 2, 3, 및 4에서 유의하게 차이점이 관찰되었다. 혈관내피성장인자의 분비는 줄기세포 비율의 증가에 비례하여 증가하였다(도 6). 대조군(배지 단독 그룹)과 비교했을 시 혈관내피성장인자 분비에 대한 통계적으로 유의한 증가는 그룹 3 및 그룹 4에서 관찰되었다(P<0.05).
6.2. 3차원 공동배양된 세포 스페로이드에서의 혈관내피성장인자(VEGF) 분비
세포 스페로이드로부터의 혈관내피성장인자 분비는 그룹 2, 3, 및 4에서 유의하게 차이점이 관찰되었다. 혈관내피성장인자의 분비는 줄기세포 비율의 증가에 비례하여 증가하였다(도 7). 대조군(배지-단독 그룹)과 비교하여 그룹 2, 3, 및 4에서 통계적으로 유의한 차이점(*, 대조군과 비교한 통계적 차이점; **, 그룹 2와 비교한 통계적 차이점)이 관찰되었다.
줄기세포 및 골전구체 세포의 공동배양시 줄기세포 단독 배양에 비해 VEGF 생산이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
통계 분석
실험 결과는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 사후검증(post hoc test)을 포함하는 스튜던트 테스트(student’s t test) 또는 2원 변량 분석(ANOVA)을 실시하여 4 그룹 간의 차이점을 상업적으로 허용되는 프로그램(SPSS 12 for Windows, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)에 의해 분석하였다. 유의수준은 0.05이다.
상기 결과들을 통하여, 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 세포 스페로이드를 제조하면, 중간엽 줄기세포 단독 배양에 의해 형성된 세포 스페로이드에 비해 VEGF 생산량이 향상됨을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 증가된 VEGF 및 골전구체 세포로부터 생성된 다양한 골 재생 인자들을 포함하는 조성물을 이용하여 골 융합 촉진 용도 및 허혈성 질환의 치료 용도로 사용할 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 참조문헌, 기사, 공보 및 특허 및 특허 출원이 온전히 본 명세서에 참조로 병합되어 있다. 따라서, 하기 청구의 범위의 진의 및 범주는 상기한 바람직한 실시형태의 설명에 제한되어서는 안 된다.
Claims (13)
- 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 중간엽 줄기세포의 성장인자 단백질 생산을 증가시키는 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 인간 잇몸 유래의 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포의 성장인자 단백질 생산을 증가시키는 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포의 혼합 비율은 1:3 내지 3:1인 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포의 성장인자 단백질 생산을 증가시키는 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 성장인자 단백질은 혈관내피성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 및 간세포 성장인자(HGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포의 성장인자 단백질 생산을 증가시키는 방법.
- 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 획득한 줄기세포 배양액 을 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 5항에 있어서,
상기 줄기세포 배양액은 혈관내피성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 및 간세포 성장인자(HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 성장인자 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 5항에 있어서,
상기 허혈성 질환은 허혈성 뇌질환, 허혈성 신질환, 허혈성 폐질환, 사지의 허혈성 질환, 버거스병, 하지동맥 폐색증, 뇌졸중, 뇌경색, 허혈성 심근증, 심근경색증, 허혈성 심부전 및 폐색성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 획득한 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 치아 내 골융합 촉진용 조성물.
- 제 8항에 있어서,
상기 줄기세포 배양액은 혈관내피성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 및 간세포 성장인자(HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 성장인자 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 치아 내 골융합 촉진용 조성물.
- 중간엽 줄기세포 및 골전구체(osteoprecursor) 세포를 혼합하여 공동배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포가 결합된 세포 스페로이드(cell spheroid)의 제조 방법.
- 제 10항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 잇몸 유래인 것을 특징으로 하는, 세포 스페로이드의 제조 방법. - 제 10항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포 및 골전구체(osteoprecursor) 세포의 혼합 비율은 1:3 내지 3:1인 것을 특징으로 하는, 세포 스페로이드의 제조 방법.
- 제 10항에 있어서,
상기 공동배양은 오목한 표면에서 실시하는 것을 특징으로 하는, 세포 스페로이드의 제조 방법.
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