KR20150006224A - 혼합 생약 추출물을 이용한 대사성질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혼합 생약 추출물을 이용한 대사성질환 예방 및 치료용 조성물 및 건강기능식품에 대한 것이다. 본 발명의 생약 추출물은 마우스 유래 지방세포인 3T3-L1 세포와 L6 근육세포에서 지방분화 억제 및 지방대사와 당대사를 개선시켜주는 효과가 있으므로 대사성질환 예방 및 치료용 약제 또는 건강기능식품에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

혼합 생약 추출물을 이용한 대사성질환 예방 및 치료용 조성물 {A composition comprising an extract of combined crude drugs for treating and preventing abnormal metabolic diseases}

본 발명은 혼합 생약 추출물을 이용한 대사성질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방 및 대사성질환의 개선 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

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본 발명은 혼합 생약 추출물을 이용한 대사성질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는, 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방 및 당 대사 개선 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

대사성 질환은 고열량, 고지방 및 고당질 식사에 의한 체내 에너지 대사의 불균형은 비만을 초래하고 인슐린 저항성과 대사성 염증을 유도하여 지질대사 이상 및 제2형 당뇨병 등 퇴행성 질환을 일으킬 수 있으므로, 생활습관성 질환이라고도 부른다. 최근 우리나라는 식생활의 서구화로 인해 가공식품과 동물성식품의 섭취 증가와 식물성식품 섭취 감소로 인한 식생활의 변화로 고혈압, 심장병, 동맥경화증 및 당뇨병 등의 만성퇴행성질환의 이환율이 높아지고 있다(Giliand SE et al. Health and nutritional benefits from lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 87:175-188. 1990 ; Annual report on the cause of death statistics. National Statistical Office, Republic of Korea. 2005).

미국내 당뇨병 유병율은 1988년 5.6백만 명에서 2008년 18.1백만명으로 3배나 증가했으며, 2010년 65세 이상 노령인구에서 10.9백만명으로 26.9%의 유병율 보이고 있으며, 또한 20세 이상 인구에서는 1.9백만명이 당뇨병으로 새롭게 진단 받고 있다(Ministry of Health and Welfare/Korean Health Industry Development. 2009 Korean national health and nutrition examination survey. pp256. 2010).

당뇨병의 경우 크게 인슐린 의존형 당뇨병(insulin dependent Diabetes Mellitus ; IDDM)인 제1형 당뇨병과 인슐린 비의존형 당뇨병(non-insulin dependent Diabetes Mellitus : NIDDM)인 제2형 당뇨병으로 나눌 수 있다. 제1형 당뇨병은 초기에 어느 정도 베타 세포가 남아 있어서 인슐린 합성이 분비되나 시간경과에 따라 베타 세포의 파괴가 진행되어 인슐린 합성 및 분비가 되지 않게 된다. 제2형 당뇨병은 인슐린이 어느 정도 분비되지만 인슐린에 대하여 세포가 반응하지 못하여 저항성 증가로 발생한다(손숙미 외 4. 임상영양학. 교문사. pp. 215, 216, 219. 2007). 하지만 병의 진전에 따라 이상이 생겨 제2형 당뇨병에서 제1형과 혼합되는 수도 많다 (Min HG. 1999. Clinical Endocrinology. Korea Medical Pub, Seoul).

당뇨병의 병증은 한의학의 여러 문헌에서 찾아볼 수 있으며, 소갈(消渴) 피부소양(皮膚瘙痒) 조(燥) 풍비(風痺) 위(胃) 이양병(二陽病) 옹저(癰疽) 안혼(眼昏) 비통(痺痛) 등의 범주에 속하는데, 가장 유사한 병증은 소갈이다. 소갈의 원인과 분류에 대하여는 문헌에 따라 다양하게 나타나고 있는데, 소갈증이란 음식소화가 잘 되고 배고프기를 잘하고 목이 말라 물을 많이 찾게 되는 증이라 설명하고 있다. 소갈의 원인으로는 선천적으로 오장(五臟)이 약하여 소갈이 되기도 하고, 대장과 위의 진액과 혈액이 부족하여 내부가 건조하고 열이 많아져서 뭉치게 되면 소갈이 된다고 설명하고 있다. 혹은 원기가 허약하여 몸에 한기(寒氣)가 왕성하여 생기는 것과, 병적인 열이 지나치게 많아서 생기는 것으로 분류하기도 한다. 소갈의 치료는 열을 식혀 주고 음기(陰氣)를 보충하여 주는 것을 기본으로 하며, 여기에 상소에 대해서는 열을 식혀 주는 것을 주로 하는데 백호가인삼탕(白虎加人蔘湯)류를 쓰고, 중소는 위장의 열을 식혀 주고 건조한 것을 부드럽게 하는데 조위승청탕(調胃升淸湯)류를 쓰며, 하소는 음기를 보충하여 주고 신장기능을 증대시켜 주는 육미지황환(六味地黃丸)류를 쓴다(남상민, 한방으로 풀어보는 당뇨병. 매일건강신문사출판부. pp.24-27, 2002).

당뇨병 치료제의 세계시장 규모는 약 300억달러(2025년)로 추정이 되며, -약물 치료를 받고 있는 당뇨병 환자 중 58%가 경구용 혈당제를 복용하고 있으며, 환자의 총 경제적 비용은 1740억 달러로 치료에 필요한 직접비용이 비당뇨병자에 비해 2.3배가 높게 지출되고 있는 실정이다. 또한 부작용에 대한 의문도 제기되고 있으므로 안전하게 혈당을 강하하기 위해서 식이요법, 운동요법 및 행동요법을 포함하는 다각적 접근방법이 권장되고 있다.

상엽 (Mori Folium)은 소산풍열, 청폐윤조, 청간명목하는 효능이 있으며 두통, 목적, 구갈, 폐열로 인한 해수, 풍비, 담마진을 치료한다(The Korean Medical Dictionary Compliation Committee. The Korean Medical Dictionary. Seoul : Jungdam.1998 : 727.). 상엽에는 flavones, steroids, triterpenes, 아미노산, 비타민 및 다량의 미네랄 성분, 칼슘, 칼륨 등의 전해질과 펙틴, 셀룰로오스 등의 식이섬유, 아미노산 및 단백질 등이 함유되어 있다(kim CM, Shin MG, An DG, Lee KS. The chinese herbal Dictionary. Seoul : Jungdam, pp.2817-21, 1998). 상엽의 생리활성에 대한 연구로는 혈중 중성지방과 콜레스테롤 저하작용 동맥경화증 및 고지혈증 등의 치료에 효과가 있다는 것이 확인되었으며(이주선, 뽕나무잎의 혈당강하활성, 경희대학교 석사학위 논문), 상엽의 수용성분획물의 혈압강하, 혈액 유동성향상, 중금속의 흡착과 해독효과 등의 여러 가지 효능이 밝혀지고 있다.

사삼은 도라지과(Campanulaceae)에 속하는 잔대(Adenophora triphylla var. japonica Hara)의뿌리로 폐, 위로 귀경하며 성미는 달고 쓰다. 약리작용으로는 강심작용, 혈류량증가 작용, 항진균 작용, 거담작용 등이 있으며, 기존 연구들은 면역 조절작용, 항진균작용, 항암효과 등 생리활성 효과에 대해 이루어져 있다(김대근 외 5, 본초생약학, 신일북스, pp.394-395, 2008). 동물실험에서 carbohydrase 저해 및 탄수화물의 장흡수 억제에 의한 항비만효과와 콜레스테롤 생합성과정의 후반부에 관여하는 효소들을 억제함으로서 콜레스테롤 저하효과를 나타내고 α-glucosidase나 α-amylase와 같은 탄수화물 분해효소를 저해하여 고혈당증을 억제한다(Chang DJ. Adenophora triphylla extract and composition containing the same for suppressing obesity. Korean Kongkae Taeho Kongbo. pp.749-774, 2003). 사삼 추출물은 동물시험에서도 항비만 효과가 입증이 되었고 부작용이 없이 인체에서도 유익한 효과가 기대되는 한약재이다.

죽엽(Phyllostachyos Folium, 대나무잎)은 솜대(Phyllostachys nigra var. henonis Stapf.)의 잎으로 성미는 辛(맵고), 苦(쓰고), 淡(담담하고), 甘(달다)하다. 귀경은 심(心), 폐(肺), 위(胃), 담(膽)으로 두통, 후비(喉痺), 목적(目赤), 심번불매(心煩不寐)를 치료하고 열병으로 인한 번열구갈(煩熱口渴), 심화상염(心火上炎)을 치료한다. 18종의 유리 아미노산이 검출되는데 그 중 세린(serine)이 가장 많으며, 수산과 헤모젠티식 에시드(homogentisic acid)가 아린 맛의 원인이 되고 있다 (김대근 외 5, 본초생약학, 신일북스, pp.90-91, 2008).

진피(Citri Pericarpiurn)는 귤(Citrus unshiu Markovich) 또는 기타 동속 근연식물(산초과 Rutaceae)의 성숙한 과피로써 11월에 채취하여 건(乾)하여 사용한다(김대근 외 5, 본초생약학, 신일북스, pp.220-221, 2008). 진피의 약리작용으로 위장평활근 이완작용, 위액분비 촉진작용, 항위궤양 작용, 이담 작용, 거담평천 작용, 소염 작용, 자궁억제 작용이 있으며 이기조중(理氣調中), 조습화담(燥濕化談), 건비화중(建碑和中)하는 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 동의보감에서는 ‘진피는 가슴에 기가 뭉친 것을 풀리게 하고, 입맛을 당기게 하며, 소화를 잘 시키고, 이질을 멎게 해준다. 구역질을 그치게 하며, 대소변을 잘 보게 한다. 또한 가래를 삭히고 기침을 낫게 한다’고 기술하고 있다. 또한 진피는 flavonoid, alkaloid, lignin,monoterpenoid, sesquiterpenoid, triterpenoid 등 다양한 성분을 함유하고 있다.

그러나, 상기 문헌의 어디에도 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피로 구성된 혼합생약추출물이 대사성 질환의 치료효과에 대하여 개시되거나 교시된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 대사성 질환인 당뇨에 효과적인 치료제를 개발하기 위한 연구의 일환으로 상엽, 사삼, 죽엽, 진피 추출물의 혈당을 억제할 수 있는 기능성을 찾기 위해 지방세포인 3T3-L1와 근육세포인 L6에서 지방대사 관련 인자와 당대사 관련 인자에 대한 미치는 영향을 관찰한 결과, 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피의 추출물의 복합조성물이 개별 추출물에 비해 혈당 증가 및 지방세포 분화 및 지질 축적 저해에 탁월한 상승효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 해결하기 위해 본 발명은 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성질환의 예방 및 치료용 약학물 조성을 제공한다.

또한, 본 발명은 상엽, 사삼, 죽엽, 진피의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 혼합 생약의 바람직한 중량 배합비로는 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피의 중량 혼합비(w/w)가 1-20 : 1-20 : 1-20 : 1-20 (w/w), 보다 바람직하게는 1-10 : 1-10 : 1-10: 1-10(w/w), 보다 더 바람직하게는 1-5 : 1-5 : 1-5 : 1-5(w/w)의 배합비로 배합된 배합물을 포함하는 것임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로, 바람직하게는 물 또는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 대사성 질환은 당질 및 지방대사 장애로 인한 고혈당, 내당능장애, 체지방증가, 당뇨, 비만증, 고지혈증, 지방간 등을 말하며, 바람직하게는, 고혈당 또는 비만증을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 혼합 생약 추출물은 먼저, 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피 개개 생약을 상기에서 제조된 배합물을 하기와 같은 통상의 추출과정을 통하여 혼합 생약 추출물을 수득가능하다.

상기 단계에서 얻은 건조생약재료인 상엽, 사삼, 죽엽, 진피를 세척하여, 상엽, 사삼, 죽엽, 진피의 중량 혼합비(w/w)가 1-20 : 1-20 : 1-20 : 1-20 (w/w), 보다 바람직하게는 1-10 : 1-10 : 1-10: 1-10(w/w), 보다 더 바람직하게는 1-5 : 1-5 : 1-5 : 1-5(w/w)의 배합비로 배합하고 상기 시료의 1 내지 20배 (w/v) 중량, 바람직하게는 1 내지 10배 (w/v) 중량의 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물로 50 내지 120℃, 바람직하게는 약 80-100℃에서 1시간 내지 5시간, 바람직하게는 2시간 내지 4시간 동안 열수 추출법, 냉침 추출법 또는 초음파 추출법, 바람직하게는 열수 추출법을 수행한 후에 얻어진 추출액을 여과지로 여과한 후에 얻어진 여과물을 동결건조, 상온건조 또는 열풍건조, 바람직하게는 동결건조를 수행하여 본 발명의 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피로 구성된 혼합 생약 추출물을 수득할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기의 제조방법 및 상기 제조공정으로 얻어진 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.

상기에서 수득된 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피 생약 추출물은 in vitro 실험에서 근육세포주인 L6세포에서 혈당강하효과를 관찰 하였으며, 지방세포주인 3T3-L1세포에서 지방 분화를 억제시켜 주었으며, 지방축적을 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 생약 추출물을 0.01 내지 99% 중량으로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 그러므로 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 및 직장, 또는 정맥 등의 방법을 통하여 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 비만에 대하여 탁월한 억제효과를 갖는 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 및 당 대사 질환 예방 및 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 대사성 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량백분율로 포함한다.

또한, 비만증의 예방 및 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

또한, 본 발명은 지방 및 대사성질환에 효과를 나타내는 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피의 혼합 생약 추출물을 주성분으로 함유하는 건강보조식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 건강보조식품중 주성분은 전체 조성물 중량대비 활성성분의 함량이 약 30% 내지 99% 범위, 바람직하게는, 50% 내지 99% 범위, 보다 바람직하게는 70% 내지 99% 범위임을 의미한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1~20 g, 바람직하게는 약 5~12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명의 추출물은 대사성 질환 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖을 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명은 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피의 혼합생약 추출물을 이용하여 대사성 질환인 당뇨 및 비만에 효과적인 치료제를 개발하기 위한 연구의 일환으로 실시하였다. 즉, 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피 추출물의 지방세포인 3T3-L1의 분화 억제능 및 근육세포인 L6에서 지방 대사와 당대사 관련 인자를 확인함으로써 대사성질환 및 치료를 위한 약학조성물, 건강기능식품 및 건강보조식품에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 지방세포의 cell line인 3T3-L1 및 근육세포의 cell line인 L6 cell에서 MTT assay를 통한 상엽, 사삼, 죽엽, 진피의 복합추출물(MAPC)의 효과를 나타낸 도이며,
도 2는 지방세포의 cell line인 3T3-L1의 Oil Red-O staining에 대한 단일 추출물의 효과를 나타낸 도이며,
도 3은 상엽, 사삼, 죽엽, 진피의 복합추출물(MAPC)이 3T3-L1 cell에서 Oil Red-O staining을 통한 지방축적에 미치는 영향을 나타낸 도이며,
도 4는 상엽, 사삼, 죽엽, 진피의 복합추출물(MAPC)이 3T3-L1 cell에서 AMPK, ACC, PPARγ, C/EBPα 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며,
도 5는 상엽, 사삼, 죽엽, 진피의 복합추출물(MAPC)이 L6 cell에서 Glut-4 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기 참고예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 혼합생약 추출물 (MAPC) 제조

남경약업사(대구)로부터 영천산을 구입하여 대구한의대 본초학교실에서 감별, 엄선한 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피 각 1 kg을 각각 증류수로 깨끗하게 세척한 후 이물질을 제거한 다음 10배 부피(v)의 증류수를 가한 후 96℃로 상승 후 8시간 열수추출하였다. 추출 후 침전물을 거름종이(Advantec, 71101903)를 이용하여 여과한 다음 이 여과액을 회전 진공증류기(EYELA, A-1000s)에서 감압 농축 하였다. 상기 농축액을 -70℃ 저온 냉동기(deep freezer)에서 12시간 방치하고, 72시간 동안 냉동 건조기(freeze dryer)로 건조하여 혼합된 추출물 분말 148 g(수득율 14.8 %)을 수득하였다(이하 혼합 추출물 'MAPC'이라 명명함).

참고예 1. 실험재료의 준비

3T3-L1 마우스유래 배아섬유아세포와 L6 근육세포는 미국 세포주은행(American Type Culture Collection; ATCC, CL-173TM)에서 구입하였으며, Dulbeccos modified Eagles media (DMEM, SH30243.01), Bovine calf serum (BCS, SH30401.01), Fetal bovine serum (FBS, SH30396.03) 및 페니실린과 스트렙토마이신(penicillin/streptomycin; PS)은 하이클론(SV30010, Hyclone, USA)에서 구입하였다. 인슐린(Insulin, 090-03446)과 디메칠술폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO, D2650), 오일레드오(Oil Red-O, O0625-25), 덱사메타손(dexamethasone, DEX, D4902-100MG)과 이소부칠메틸잔틴(isobutylmethylxanthine (IBMX, I5879-250MG)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich company, St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

참고예 2. 3T3-L1 세포배양

3T3-L1 마우스유래 배아섬유아세포(mouse embryo fibroblast)를 하기와 같은 실험방법으로 배양하였다(Lin. J. et al., Green tea polyphenol epigallocatechin gallate inhibits adipogenesis and induces apoptosis in 3T3-L1 adipocytes, Obesity Research, 13(6), pp.982-990, 2005).

먼저, 10% 우태아 혈청(bovine calf serum)을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)로 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다(Day 0). 8일 동안 배양한 다음에 전지방세포(preadipocyte)를 10% fetal bovine serum (FBS)을 함유한 DMEM 배지(167 nM insulin, 0.5μΜ isobutylmethylxanthine, 1μΜ dexamethasone 첨가)로 옮겨 2일간 배양하였다(Day 2). 167 nM 인슐린이 있는 배지에서 2일간 더 배양한 다음에 10% FBS/DMEM 배지에서 4일 동안 배양하여 성숙한 지방세포(adipocytes)로 만들었다.

참고예 3. L6 세포배양

L6 근육세포(myocytes)를 하기와 같은 실험방법으로 배양하였다(Bergeron S. et. al., Inhibition of the protein tyrosine phosphatase SHP-1 increases glucose uptake in skeletal muscle cells by augmenting insulin receptor signaling and GLUT4 expression. Endocrinology. 152(12) : 4581-8. 2011).

먼저, 10% fetal bovine serum (FBS)을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)로 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다(Day 0). 4일 동안 배양한 다음에 10% fetal bovine serum(FBS)을 함유한 DMEM 배지(167 nM insulin, 0.5μΜ isobutylmethylxanthine, 1μΜ dexamethasone 첨가)로 옮겨 2일간 배양하였다(Day 2). 167 nM 인슐린이 있는 배지에서 2일간 더 배양한 다음에 Sampling하여 분석에 사용하였다.

참고예 4. 통계처리

실험성적의 통계적 유의성은 SPSS 프로그램(Version 14.01)의 투웨이(Two-way) ANOVA와 LSD 사후검정을 이용하여, P<0.05 인 경우에 유의한 것으로 인정하였으며, 정상군과의 통계학적 유의성(#) 및 고지방식이투여군(HF)과의 통계학적 유의성(*)을 도면 및 표에 각각 표기하였다.

실험예 1. 세포독성( MTT assay )

상기 실시예의 복합 추출물이 3T3-L1 세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT검정법(methylthiazol tetrazolium bromide)을 이용하여 측정하였다(Lin J. et al., Green tea polyphenol epigallocatechin gallate inhibits adipogenesis and induces apoptosis in 3T3-L1 adipocytes, Obesity Research 13(6), pp.982-990, 2005).

MTT 검정법은 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 생성된 blue formazan 결정을 DMSO (dimethyl sulfoxide)로 녹여서 발색시켜 그 흡광도를 측정하는 방법이다. 참고예 1에서 배양한 3T3-L1 cell line을 사용하였으며, 실험에는 지수적 성장기에 있는 세포를 사용하였다. 즉, 5 X 10⁴ cells/ml을 일정기간 아무처치 없이 동량의 5% tryphan으로 잘 섞어 살아있는 세포수를 측정하였고, 생존능 실험은 모두 3개 well의 평균가를 이용하여 평가하였다. Well당 MTT 용액(2 mg/ml)을 50 ㎕씩 넣어 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 2시간 반응시킨 후 배지는 제거하고 DMSO를 well당 100 ㎕씩 넣어 5분간 plate shaker에서 blue formazan 결정을 용해시킨 다음에 ELISA reader (Techan, Germany) 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 대조군(Control), 복합 추출물(MAPC)를 농도별(0.05 ~ 1 ㎎/㎖)로 24시간 처리하여 MTT assay를 실험한 결과 대조군에 비해 시료 농도에 의존적으로 지방세포의 생존율이 감소하는 것으로 관찰되었으나, 처리농도 범위에서 세포에 큰 영향을 주지 않는 것으로 보였다.

실험예 2. 세포를 이용한 oil red -O 염색

상기 실시예 3T3-L1 세포에서 지방세포 분화 및 지방 생성에 복합 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 Oil Red-O 염색 실험을 수행하였다(Lin J. et al., Green tea polyphenol epigallocatechin gallate inhibits adipogenesis and induces apoptosis in 3T3-L1 adipocytes, Obesity Research 13(6), pp.982-990, 2005).

Oil Red-O 염색법은 분화된 3T3-L1 세포에 Oil Red-O 시약으로 염색하여 세포내 생성된 지방을 측정하는 방법이다. 분화된 세포의 배지를 제거하고 D-PBS (DPBS, SH30028.03)로 세포를 세척하고 pH 7.2 Cacodylate buffer로 2시간 고정하고 Oil red-O Solution으로 염색하였다. 세포 염색이 끝난 후 40% Isopropyl alcohol (2-Propanol,67-63-0)로 3번 세척 후 건조하여 세포 내 지방의 크기를 광학현미경(AE 31, Motic, USA)으로 관찰하였다.

실험결과, 도 2에 나타나는 바와 같이, 각각의 한약재 추출물을 현미경 및 육안으로 관찰한 결과 단일 한약재(상엽, 사삼, 죽엽, 진피)추출물 처리군 중에서 죽엽추출물이 CON군에 비해 53.3%의 지방축적 저해효능을 보여 가장 뛰어난 효과를 나타내었으며, 도 3에 나타나는 바와 같이, 혼합 한약재 추출물(MAPC)이 단일 한약재 추출물 보다 지방축적 저해효과가 뛰어났으며, 농도의존적으로 지방세포의 분화 및 지방축적을 억제하였고, 고농도의 한약재 추출물 처리군에서는 양성대조군인 당뇨치료제인 Rosiglitazone 군보다 우세하게 지방세포의 분화 및 지방축적을 저해하였다.

실험예 4. 3 T3 - L1 Cell 에서의 Western 방법

상기 실시예의 복합 추출물이 AMPK와 ACC 인산화 및 지방합성 전사인자인 C/EBPα, PPARγ의 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 3T3-L1 Cell 에서 Western을 수행하였다 (Huang B. et, al, Cinnamaldehyde prevents adipocyte differentiation and adipogenesis via regulation of peroxisome proliferator-activated receptor-γ(PPARγ) and AMP-activated protein kinase (AMPK) pathways, J Agric Food Chem, Apr 27;59(8), pp.3666-73, 2011).

농도별로 처리된 3T3-L1 cell을 D-PBS (DPBS, SH30028.03)로 세척(washing) 한 후, 1mM EDTA가 포함된 50 mM tris-HCl (pH 7.5) buffer 첨가하여 스크레이퍼(scrapfer)를 이용하여 세포를 떼어낸 후 용해(lysis)하였다. 13,000 rpm 4℃에서 5분간 원심분리한 후에 20 ㎍의 동일한 양의 단백질을 변성(denature)시키고 8% 또는 10% SDS-PAGE를 분리한 후, PVDF membrane으로 transfer시킨다. membrane을 TBS-T로 용해한 5% skim milk로 2시간 동안 blocking 한 다음에, rabbit polyclonal anti-PPARγ(sc-7196, Santa-Cruz Biotechnology, USA), C/EBPα(sc-365318, Santa-Cruz Biotechnology, USA), AMPK(#2532, Cell Signaling, USA), ACC(#3662, Cell Signaling, USA) antibody로 하룻밤(overnight) 처리하였다. TBS-T로 세척한 후에 horseradish peroxidase인 2차 항체(sc-47778, Santa-Cruz Biotechnology, USA)로 2시간 동안 처리하여 다시 TBS-T로 washing 한 후 ECL detection 시약(#34079, Amersham Biosciences, USA)으로 immunorective bands를 관찰하였다.

실험결과, 도 4에 나타나는 바와 같이, 혼합 한약재 추출물(MAPC)이 3T3-L1에서 CON군에 비해 AMPK와 ACC의 인산화 활성을 증가시켰다. 3T3-L1에서는 혼합 한약재 추출물(MAPC) 처리군에서 지방세포의 분화과정 중에 발현되는 지방합성 전사인자인 C/EBPα, PPARγ 단백질 발현 정도를 확인한 결과 각각 3T3-L1 cell에서 혼합 한약재 추출물(MAPC)이 CON군에 비해 약간 증가하는 경향을 나타내었으나, 양성대조군인 로지글리타존군 (Rosiglitazone, R2408, Sigma- Aldrich, St Louis, MO, USA) 보다는 감소하는 양상을 보였다. 그러므로 혼합 한약재 추출물(MAPC)는 지방산 산화를 촉진시키고, 세포내로 유입된 당질로 부터 유래하는 과도한 지방합성은 억제시킴으로써 체지방 축적을 억제할 것으로 보인다.

실험예 5. L6 Cell 에서의 Western 방법

상기 실시예의 복합 추출물이 당대사에 관련이 있는 Glut4의 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 L6 Cell에서 Western을 수행하였다 (Susan J. et, al, Glut4 glucose transporter expression in rodent brain: effect of diabetes. Brain Research 797, pp.1-11, 1988).

먼저 배지(Media)를 충분히 잘 제거시키고 무혈청(serum free)상태에서 10시간동안 혈청을 제거시킨 다음, 복합 추출물(MAPC) 및 인슐린(insulin)을 처리하고 1시간동안 Glut4의 translocation을 유도한다. 그 다음 버퍼액 (0.25M sucrose, 50 mM Tris-HCL, 5 mM MgCl₂, 25 mM KCl (pH 7.4))을 넣고 균질화 하였다. 균질액은 500×g, 4℃에서 10분동안 원심분리하여 그 상층액을 취한 다음, 다시 112,000×g, 4℃에서 1시간동안 원심분리하여 그 상층액을 원심분리하여 얻어진 pellet을 버퍼로 재현탁시킨 다음 15,000×g, 4℃에서 15분동안 원심분리 하여 그 상층액을 사용하였다. 단백질 정량은 Bradford시액(Bio-Rad, Richmond, USA)를 사용하여 측정하였다. 50 ㎍의 동일한 양의 단백질을 변성(denature)시키고 8% 또는 10% SDS-PAGE를 분리한 후, PVDF membrane으로 transfer시킨다. membrane을 TBS-T로 용해한 5% skim milk로 2시간 동안 blocking 한 다음에, Glut-4(sc-7938, Santa-Cruz Biotechnology, USA) 항체(antibody)로 하룻밤(overnight) 처리하였다. TBS-T로 세척한 후에 horseradish peroxidase인 2차 항체(sc-47778, Santa-Cruz Biotechnology, USA)로 2시간 동안 처리하여 다시 TBS-T로 세척(washing) 한 후 ECL detection 시약(#34079, Amersham Biosciences, USA)으로 immunorective bands를 관찰하였다.

실험결과 도 5에서 나타난 바와 같이, 세포에서 막 단백질을 분리하여 Glut4의 이동성을 살펴보면 L6 cell에서 아무것도 처리하지 않은 CON군에 비하여 양성대조군인 로지글리타존(Rosiglitazone, R2408, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 및 혼합 한약재 추출물(MAPC) 처리군에서 증가한 것으로 나타났다. Glut4는 지방세포와 근육세포에서 주로 발현되는 포도당 수용체로 세포질에 분포하고 있다가 인슐린이 존재할 때 세포막으로 이동하여 glucose uptake를 원활하게 일어나도록 하는 역할을 하여 지방세포의 분화와 지방축적에 이어 포도당 유입은 중요한 반응으로 당 흡수를 증가시킴으로써 혈당을 강하시키는데 영향을 주는 것으로 보인다.

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제 예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

혼합 생약 추출물 (MAPC) --------------------------------- 20 mg

유당 --------------------------------------------------- 100 mg

탈크 ---------------------------------------------------- 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

혼합 생약 추출물 (MAPC) -------------------------------- 10 mg

옥수수전분 -------------------------------------------- 100 mg

유당 -------------------------------------------------- 100 mg

스테아린산 마그네슘 ------------------------------------- 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

혼합 생약 추출물 (MAPC) -------------------------------- 10 mg

결정성 셀룰로오스 --------------------------------------- 3 mg

락토오스 --------------------------------------------- 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 --------------------------------- 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

혼합 생약 추출물 (MAPC) -------------------------------- 10 mg

만니톨 ------------------------------------------------ 180 mg

주사용 멸균 증류수 ----------------------------------- 2974 mg

Na₂HPO₄,12H2O ------------------------------------------- 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

혼합 생약 추출물 (MAPC) --------------------------------- 20 mg

이성화당 ------------------------------------------------- 10 g

만니톨 ---------------------------------------------------- 5 g

정제수 --------------------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

혼합 생약 추출물 (MAPC) ------------------------------- 1000 ㎎

비타민 혼합물 -------------------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 ------------------------------------- 70 ㎍

비타민 E ----------------------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B1 --------------------------------------------- 0.13 ㎎

비타민 B2 --------------------------------------------- 0.15 ㎎

비타민 B6 ---------------------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B12 --------------------------------------------- 0.2 ㎍

비타민 C ------------------------------------------------ 10 ㎎

비오틴 -------------------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 ----------------------------------------- 1.7 ㎎

엽산 ---------------------------------------------------- 50 ㎍

판토텐산 칼슘 ------------------------------------------ 0.5 ㎎

무기질 혼합물 -------------------------------------------- 적량

황산제1철 --------------------------------------------- 1.75 ㎎

산화아연 ---------------------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘 ------------------------------------------ 25.3 ㎎

제1인산칼륨 --------------------------------------------- 15 ㎎

제2인산칼슘 --------------------------------------------- 55 ㎎

구연산칼륨 ---------------------------------------------- 90 ㎎

탄산칼슘 ----------------------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 ------------------------------------------ 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

혼합 생약 추출물 (MAPC) --------------------------------- 1000㎎

구연산 ------------------------------------------------- 1000 ㎎

올리고당 ------------------------------------------------- 100 g

매실농축액 ------------------------------------------------- 2 g

타우린 ----------------------------------------------------- 1 g

정제수를 가하여 ------------------------------------ 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (7)

1. 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방 및 대사성질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 혼합 생약의 바람직한 중량 배합비로는 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피의 중량 혼합비(w/w)가 1-10 : 1-10 : 1-10 : 1-10 (w/w)의 배합비로 배합된 배합물임을 특징으로 하는 약학 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매에 가용한 추출물임을 특징으로 하는 약학 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 대사성질환은 당질 및 지방대사 장애로 인한 고혈당, 내당능장애, 체지방증가, 당뇨, 비만증, 고지혈증, 또는 지방간임을 특징으로 하는 약학 조성물.
5. 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피의 혼합생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방 및 대사성질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
6. 제 1항에 있어서, 상기 건강기능식품은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 티백제, 침출차, 또는 건강 음료 형태인 건강기능식품.
7. 대사성질환에 효과를 나타내는 상엽, 사삼, 죽엽 및 진피의 혼합생약 추출물을 주성분으로 함유하는 건강보조식품.

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