KR20140088969A

KR20140088969A - 갈근엑스 발효물을 함유한 간손상 보호용 조성물

Info

Publication number: KR20140088969A
Application number: KR1020120158204A
Authority: KR
Inventors: 조정희; 함성호; 김준호; 김명석; 신지은; 김성빈
Original assignee: 재단법인 전남생물산업진흥원; 조정희
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2012-12-31
Publication date: 2014-07-14
Also published as: KR101651082B1

Abstract

본 발명은 갈근엑스 발효물을 함유하는 간질환 보호용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 갈근엑스 발효물은 갈근을 물로 추출한 다음 유산균 유래 효소로 처리한 후, 멸균, 건조 공정을 통해 수득한 갈근엑스 발효물이 간손상 모델에서 강력한 간손상 억제 효능을 발휘하는 것을 확인하였고, 또한 장내 미생물을 통한 생물전환 기술은 장내 미생물에 의해 분해 및 흡수되는 정도의 차이를 극복하여 체내에서 흡수되기 용이한 대사산물로 전환시켜 간손상 질환의 치료 및 예방용 식품, 의약품, 외약외품 등의 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

갈근엑스 발효물을 함유한 간손상 보호용 조성물 {A Composition Comprising the Fermentate of Puerariae Radix extract for protecting liver damage}

본 발명은 갈근엑스 생물전환물을 대상으로 한 갈근엑스 발효물을 함유한 간손상 보호용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] 허준. 동의보감, 남산당, 서울, 1984, Vol. 3

[문헌 2] 이시진, 본초강목. 고문사, 서울, 1980 Vol. 18.

[문헌 3] Ji X, Tan BK, Zhu YC, Linz W, Zhu YZ. Comparison of cardioprotective effects using ramipril and danshen for the treatment of acute myocardial infarction in rats. Life Sci. 73: 1413-1426. 2003.

[문헌 4] Murota K, Shimizu S, Miyamoto S, Izumi T, Obata A, Kikuchi M, Terao J. Unique uptake and transport of isoflavone aglycones by human intestinal caco-2 cells: Comparison of isoflavonoids and flavonoids. J. Nutr. 132: 1956-1961. 2002.

[문헌 5] Pyo YH, Lee TC, Lee YC. Effect of lactic acid fermentation on enrichment of antioxidant properties and bioactive isoflavones in soybean. J. Food Sci. 70: S215-S220. 2005.

[문헌 6] Eum HA, Lee JH, Yang MC, Shim KS, Lee JH, Ma JY. Protective effect of ssanghwa-tang fermented by Lactobacillus fermentum against carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in rats. Afr. J. Tradit. Complement. Altern. Med. 8: 312-321

[문헌 7] Ji X, Tan BK, Zhu YC, Linz W, Zhu YZ. Comparison of cardioprotective effects using ramipril and danshen for the treatment of acute myocardial infarction in rats. Life Sci. 73: 1413-1426. 2003.

[문헌 8] Miura, K., Takeda， R., Nakamoto， H. and Saito, H. The chemical and pharmacological study of Puerariae radix. J. Appl. Pharmacol., 5, 247. 1971.

[문헌 9] Ha BJ, Ku CS, Bae DJ, Hwang KS, Kim CH, Jang DI, io-conversion of liquiritin and liquiritin apioside from Glycyrrhiza uralensis root to liquiritigenin during nuruk fermenation 한국생물 공학회 국제 심포지움, 한국생물공학회, 2009.

[문헌 10] Walsh KR, Failla ML. Transport and metabolism of equol by Caco-2 human intestinal cells. J. Agr. Food Chem. 57:8297-8302. 2009.

[문헌 11] Kim EY, Baik IH, Kim JH, Kim SR, and Rhyu MR. Screening of the antioxidant activity of some medicinal plants. Korean J Food Sci Technol. 2004, 36(2) : 333-8.

[문헌 12] Havsteen BH. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Parmacol Ther. 2002, 96(2-3) : 67-202.

[문헌 13] Gumpricht E. et al., Licorice compounds puerarin and 18beta-glycyrrhetinic acid are potent modulators of bile acid-induced cytotoxicity in rat hepatocytes, J Biol Chem. 2005 Mar 18;280(11):10556-63. Epub 2005 Jan 10.

[문헌 14] Koga K. et al., Novel formulations of a liver protection drug puerarin, Yakugaku Zasshi, 2007 Jul;127(7):1103-14.

[문헌 15] B. Tang et al., puerarin attenuates endotoxininduced acute liver injury after partial hepatectomy in rats, Brazilian Journal of Medical and Biological Research (2007) 40: 1637-1646..

[문헌 16] Hong, Sung Wook, Lae Kyun You, Byung Moon Jung, Wan Sik Kim, and Sub Chung. 2009. Characterization of α-galactosidase and β-glucosidase by Weissella cibaria. kor. J. Food Sci. Technol. 37(3):204-212.

[문헌 17] Marta Avila, Maria Hidalgo, Concepcion Sanchez-Moreno, Carmen Pelaez, Teresa Requena, Sonia de Pascual-Teresa. 2009. Bioconversion of anthocyanin glycosides by Bifidobacteria and Lactobacillus. Food Research International 42:1453-.1461

[문헌 18] Asl MN, Hosseinzadeh H., eview of pharmacological effects of Glycyrrhiza sp, and its bioactive compounds Phytother Res., 2008, 22:709-724

[문헌 19] NK, Plumb GW, Berrin JG, Juge N, Jacob R, Naim HY, Williamson G, Swallow DM, Kroon PA, eglycosylation by small intestinal epithelial cell beta-glucosidases is a critical step in the absorption and metabolism of dietary flavonoid glycosides in human Eur J Nutr., 2003, 42:29-42.

[문헌 20] McCay PB, Lai EK, Poyer Jl, DuBose CM, Janzen EG. 1993. Oxygen and carbon-centered free radical formation during carbon tetrachloride metabolism. Observation of lipid radicals in vivo and in vitro. J Biol Chem 259: 2135-2143.

간은 인체에서 대사, 분비, 저장, 해독기능을 담당하는 핵심기관이며, 간 손상은 이러한 간 기능의 손상을 의미하는 것이다. 간질환은 주로 독성화합물, 알코올 과다섭취, 감염 및 자가 면역질환이 원인이며, 지방과다섭취, 피로, 과음 또는 스트레스에 의해 유도되는 만성 간질환인 지방간이나 간경변은 간암으로까지 이행된다.

최근 간염 백신의 개발로 인하여 간염에 대한 효과적인 예방은 실시되고 있으나, 간염 바이러스에만 특이적으로 작용 할 수 있는 약물의 개발에는 현실적인 어려움이 있어 손상된 간세포의 부활, 인체의 면역기능 및 간기능을 증진시켜 간접적으로 간염을 치료하려는 시도가 이루어지고 있다. 이들 중 갈근으로부터 분리 된 puerarin은 만성 감염 치료제로 사용되고 있으며, 이 외에도 다양한 생약제들로 부터 간기능 보호제 개발연구가 보고되고 있다. 이때 간 독성 유발약물로 주로 CCL4와 LPS, D-galactosamine 등이 주로 사용되고 있다(E. A. Wilheim et al., Exp. Mol. Pathol., 87, 20-26(2009)).

한편 장내 세균의 구성은 체질, 식습관, 항생 물질의 복용 및 스트레스 등의 영향을 받기 쉬워서 배당체를 가수분해하는 능력은 현저한 개인차를 보인다. 따라서 배당체의 흡수에서도 현저한 차이가 발생하게 되고 이것이 약효에 있어서 개인차가 나타나는 한 원인으로 알려져 있다 (Hasegawa H. et al., Planta Medica, 64, pp.436-440, 1997). 이는 마우스를 이용한 암전이 실험으로도 뒷받침되는데, 장내 세균의 배당체 가수분해 능력에 따라 각각의 마우스에서 인삼의 항전이 효과가 다르게 나타나는 것에서 배당체 가수분해 능력이 약효에 큰 영향을 미치는 요인임을 알 수 있다 (Hasegawa H. et al., Planta Medica, 63, pp.696-700, 1998).

또한, 발효란 미생물이나 효소 등이 어떤 물질을 분해하고 변형시키는 과정을 말하며, 그 과정을 통해 미생물이 또 다른 물질을 생산해 내기도 한다.

최근 웰빙과 더불어 발효에 대한 관심이 점차 증가하고 있다. 이러한 기술은 체내 장내미생물에 의해 분해 및 흡수되는 정도의 차이를 극복하여 체내에서 수되기 용이한 대사산물로 전환시키기 위한 중요한 기술로 최근에는 많은 한약에 적용하고 있다. 또 생리활성물질이 풍부해 생체 이용률이 높고, 약효성분이 많아 추출되어 한약재가 절약되고 부작용 또한 거의 없을 뿐 아니라 농약과 중금속으로부터 비교적 안전한 장점을 갖고 있다.

갈근(葛根; Puerariae Radix)은 콩과(Leguminosae)의 덩굴나무인 칡(Pueraria lobata (Willd.) Ohwi.)의 뿌리로 약용 및 식용으로 이용하는데 식품으로는 칡뿌리죽, 미숫가루, 칡차 등으로 이용된다. 한방에서는 고혈압, 관상동맥 경화증, 협심증, 당뇨병 완화효과, 숙취제거 효과와 혈압강하, 지방산화 억제, 항염, 해독, 항산화 및 보간작용이 있는 것으로 알려져 있다(중약대사전).

갈근은 갈근의 주요 구성성분으로는 이소플라본(isoflavone)인 푸에라린(puerarin), 다이드진(daidzin) 등과 그 외에 D-만니톨(mannitol), 숙신산(succinic acid), 미크로에스트롤(microestrol) 및 전분(starch) 등이 있다(현대생약학, 학창사).

위에서 언급한 바와 같이 한의학 분야에서는 갈근을 전통적으로 물로 추출하여 한의학적 용도로 사용해왔으나 최근 과학적 연구에 따르면 그 구성 성분들이 장내 미생물의 영향을 받아 치료효과가 사람마다 서로 상이하게 나타나고 재현성이 적어 이를 극복하기 위한 노력이 필요함을 알 수 있다.

이에 본 발명인들은 갈근에 대해 전통적인 추출방법으로 한의학적 효력을 유지하면서도 재현성이 있는 효력을 발휘하게 하기 위한 방법으로 갈근을 먼저 물로 추출한 다음 이를 가지고 발효물을 개발하여 실험동물을 이용하여 혈중 GOT, GPT, 감마(gamma)-GTP, BUN, 빌리루빈(Bilirubin), 담즙산(bile acid) 활성을 등을 측정해 본 결과, 간보호 효과가 탁월함을 확인하여, 본 발명의 갈근엑스 발효물이 간질환의 치료 및 예방에 유용함을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 수행하기 위하여, 본 발명은 갈근엑스 발효물을 유효성분으로 함유하는 간손상 질환의 치료 및 예방용 약학 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 간손상 질환은 알코올성 또는 비알콜성 지방간, 알코올성 또는 비알콜성 급성 또는 만성 간염, 알코올성 또는 비알콜성 간경변증, 바람직하게는 알코올성 또는 비알콜성 지방간, 알코올성 또는 비알콜성 급성 또는 만성 간염을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 갈근엑스 발효물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본원에서 정의되는 갈근엑스 발효물은 갈근을 열수추출한 다음 추출액을 얻어 고온멸균하고 30℃로 냉각하여 시료로 한다. 따로 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus breivis, KCTC3498, 한국생명공학연구원 생명자원센터) 및 비피도박터리움 롱검(Bifidobacterium longum, KCTC3128, 한국생명공학연구원 생명자원센터)을 함께 배양하여 얻은 효소액을 시료부피대비 0.120%, 바람직하게는, 150%, 보다 바람직하게는, 520%(v/v%)로 접종하고, 발효 온도 150℃, 바람직하게는,2050℃, 보다 바람직하게는, 2040℃에서 수분함유 상대습도 2090%, 바람직하게는, 4080%, 보다 바람직하게는, 5070%로, 발효시간 1시간 내지 1주일간, 바람직하게는 1일 내지 5일간 동안 발효하고 멸균한 후 건조하고 분말화하는 단계를 포함하는 공정을 통하여 수득한 갈근엑스 발효물을 포함한다.

상기 발효균주는 MRS broth 배지 등의 발효배지에서 20 내지 50℃, 바람직하게는, 30 내지 40℃에서 배양 한 후, 배양액을 0 내지 20℃, 바람직하게는, 1 내지 8℃에서 약 10000g 내지 30000g로 1분 내지 30분, 바람직하게는 5분 내지 20분 동안 원심분리하여 상징액을 취한 후, 상기 상징액에 1배 내지 20배, 바람직하게는 2배 내지 8배 용량의 냉에탄올을 첨가하여 충분히 혼합시킨 후에, 0 내지 5℃에서 1분 내지 30분, 바람직하게는 5분 내지 20분 동안 방치하여 단백질을 응고시키고 다시 0 내지 20℃, 바람직하게는, 1 내지 8℃에서 약 5000g 내지 20000g, 바람직하게는 8000g 내지 12000g로 1분 내지 60분, 바람직하게는 20분 내지 50분 간 원심분리 후 상층액은 버리고 침전물은 정제수 또는 완충액에 용해시켜 효소액으로 사용함을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명은 상기 제조방법 및 상기 제조방법으로 만든 발효물을 유효성분으로 함유하는 간손상 보호용 조성물을 제공한다.

본 발명의 간질환의 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 발효물을 포함된다.

본 발명의 발효물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 발효물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제로 사용될 수 있으며, 또한 본 발명의 발효물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 외용제제에는 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 발효물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 갈근엑스 발효물을 유효성분으로 함유하는 간손상 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

따라서, 또한, 본 발명은 간손상의 보호 효과를 갖는 상기 갈근엑스 발효물을 유효성분으로 함유하는 식품 및 식품첨가제를 제공한다.

본 발명의 발효물을 포함하는 조성물은 간질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 발효물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 캔디류의 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 발효물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 발효물은 간질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 발효물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 발효물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 갈근엑스 발효물은 실험동물을 이용하여 혈중 GOT, GPT, 감마(gamma)-GTP, BUN, 빌리루빈(Bilirubin), 담즙산(bile acid) 활성을 등을 측정해 본 결과, 간보호 효과가 탁월함을 확인하였고, 또한 장내 미생물 유래 효소를 이용한 발효 기술은 장내 미생물에 의해 분해 및 흡수되는 정도의 차이를 극복하여 체내에서 흡수되기 용이한 대사산물로 전환시켜 간손상 보호 및 치료 약물 또는 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 각 미생물들에 대한 β-글루코시다제 활성을 나타낸 도이며;
도 2는 갈근 엑스산 생물전환물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 도이며((A) 공시험액 (B) 반응직후 (C) 효소반응 24h시간 후를 의미함);
도 3은 D-GalN/LPS로 간손상을 유도한 렛트에서 GOT 활성 평가 결과를 나타낸 도이며;
도 4는 D-GalN/LPS로 간손상을 유도한 렛트에서 GPT 활성 평가 결과를 나타낸 도이며;
도 5은 D-GalN/LPS로 간손상을 유도한 렛트에서 gamma-GTP 활성 평가 결과를 나타낸 도이며;
도 6은 D-GalN/LPS로 간손상을 유도한 렛트에서 BUN 활성 평가를 나타낸 도이며;
도 7는 D-GalN/LPS로 간손상을 유도한 렛트에서 TBIL 활성 평가를 나타낸 도이며;
도 8은 D-GalN/LPS로 간손상을 유도한 렛트에서 bile acid 활성 평가 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 실시 예 및 실험 예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시 예 및 실험 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 시료의 제조

1-1. 효소의 분리

락토바실러스 브레비스(Lactobacillus breivis, KCTC3498, 한국생명공학연구원 생명자원센터) 및 비피도박터리움 롱검(Bifidobacterium longum, KCTC3128, 한국생명공학연구원 생명자원센터)을 함께 MRS broth 배지(Difco Co., Cat No. 288130)를 사용하여 37℃에서 배양 한 후, 배양액을 4℃에서 15,000 g 로 10분 동안 원심분리하여 상징액을 취한다. 상징액에 4배 용량의 냉에탄올을 첨가하여 충분히 혼합시킨 후 0℃에서 40분 방치하여 단백질을 응고시키고 다시 4℃에서 10,000 g 로 40 분간 원심분리 후 상층액은 버리고 침전물은 정제수나 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0)에 용해 시켜 효소액으로 사용하였다.

1-2. 분리효소의 역가 평가

효소 분리 과정을 거친 효소액은 문헌(Hong et al)의 방법을 일부 변형한 β-glucosidase 및 glucuronidase activity assay 법을 이용 하여 그 활성도를 확인 하였다.

β-glucosidase activity는 다음 과정을 통하여 확인하였다. 효소액 1 mL에 50mM 초산완충액(pH 5.0)에 용해시킨 5mM 4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (p-NPG, sigma N7006) 1 mL 넣고 30℃ water bath에서 10분 간 반응시켰다. 여기서 glucuronidase activity는 4-Nitrophenyl β-D-glucuronide(Sigma, 73677)을 기질로 이용하여 동일한 방법으로 시험했다. 그 후 반응이 완료 되면 1 M sodium carbonate을 넣어 반응을 종결시킨 다음 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 1은 흡광도 분석기(Tecan Instr. Co., Infinite 200 PRO)를 통하여 405 nm에서 OD 값을 측정하여 β-glucosidase activity 측정한 결과로서 각각의 미생물을 이용하여 얻은 조효소액에 비하여 약 1.8배나 활성이 강한 것을 볼 수 있다.

1-3. 갈근엑스의 발효

갈근 물엑스는 식품의약품안전청 고시 제 2007-25(2007. 5. 1) : 대한약전외 의약품등 기준”의 “갈근엑스산”의 제조 조건에 따라 물로 추출하여 만들고 고온고압멸균 조건으로 멸균한 다음 33～35 ℃로 냉각하여 이 액 10리터에 상기의 조효소액 1 리터를 가하여 33～35 ℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 즉시 55∼60℃에서 감압농축하고 다시 동결건조하여 갈근 발효 건조물(이하, PRF라 함)을 조제하였다.

1-4. 발효물의 HPLC 분석

도 2는 위 과정을 거친 발효물의 HPLC분석을 통하여 생물전환의 유무 등을 확인한 것이다. 그 결과, 효소반응을 통한 갈근엑스산의 발효물은 전환 전에 비하여 푸에라린(puerarin)과 다이드진(daidzin)의 함량이 현저히 줄어들고 그의 대사체인 다이드제인(daidzein)이 큰 폭으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

참고예 1. 효력실험

1-1. 실험동물의 준비

본 연구에 사용한 실험동물은 다물사이언스 (대전, 한국)에서 구입한 6주령의 수컷 Spragque-Dawley (SD) 계통의 특정병원균 부재 (SPF) 랫드로 실험동물 사육장에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였으며. 실험 시작 전 12시간 절식 후 본 실험에 사용하였다. 실험 기간 중 고형사료와 물은 자유로이 섭취시켰으며 사육질의 온도(22±2℃), 상대습도(60±5%)와 명암은 12시간 주기를 유지하였다. 대조군과 각 실험군은 6마리씩 구성하였으며, 위 실험은 동물실험윤리위원회의 사전심의를 받아 동물실험윤리위원회 규정에 따라 수행되었다.

1-2. 실험 투여 용량의 설정

갈근 엑스는 사람에게 적용되는 “갈근엑스산(이하, PRW라 함)”의 상용량에 대응하는 엑스량으로 환산하여 투여하였으며, 사람 상용량(mg/kg)의 2. 10, 50배량에 해당하는 양을 물 1 ml에 현탁하여 경구로 투여하였다. 또한 발효물도 수율을 고려하여 황금엑스와 대응하는 양을 산출하여 같은 방법으로 투여하였다.

실험예 1. 간보호 효과 측정

상기 실시예 시료의 간보호효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 D-GalN/LPS로 간손상이 유도된 렛트에서 갈근엑스산 및 갈근엑스 발효물의 투여 후 생존율, GOT, GPT, γ-GTP, Bilirubin, bile acid, BUN 등의 간손상 지표에 대한 활성을 확인하였다(E. A. Wilheim et al., Exp. Mol. Pathol., 87, 20-26(2009)).

1-1. 실험 군 분리 및 간손상 유발

수컷 SD rat를 정상군(N), D-galactosamine과 lipopolysaccharide 주사군(C), 대조약으로 BDD(biphenyl dimethyl dicarboxylate, Sigma Chem. Co., 437905) 투여군(RD), GalN과 LPS주사-약물군, GalN과 LPS주사-발효물 투여군으로 나누어 GalN과 LPS 주사 24시간 전에 약물을 1회 경구로 투여하였다. 간독성 유발군은 GalN 500mg/kg과 LPS 50ug/kg용량으로 모두 PBS에 녹여 복강내(interperitoneal, i.p)로 주사하였다.

1-2. 간손상에 대한 보호 확인

간 손상을 유발한지 24시간 후에 동물을 희생하여 GOT, GPT, γ-GTP, Bilirubin, bile acid, BUN 활성을 평가하였다.

그 결과 갈근 엑스산과 발효물 모두 대조군에 비해 투여량이 증가함에 따라 표 1과 같이 생존률이 증가하였다. 또한 혈중 생화학수치인 GOT, GPT, γ-GTP, Bilirubin, bile acid, catalase 수치 역시 정상범위로 회복되었다. 특히 생물전환물 투여량에 따라 그 회복 정도가 더 큰 것을 확인 할 수 있었다.(도 3 내지 도 8 참조)

D-GalN/LPS로 간손상이 유도된 렛트에서 갈근엑스산 및 생물전환물의 생존율.

구분		투여량 (mg/kg)	생존수/총개체수(24h)	생존율 24h(%)
정상군(Normal)		-	6/6	100
발병군 (Control)	D-GalN + LPS	500+ 0.05	2/6	33.3
대조약(RD)	phenyl dimethyl dicarboxylate	1.25	6/6	100
물엑스(PRW)		26	1/6	16.7
		132	3/6	50
		658	4/6	66.7
생물전환물 (PRF)		26	1/6	16.7
		132	4/6	66.7
		658	6/6	100

본 발명의 추출물들을 포함하는 조성물의 제제 예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

PRF ------------------------------------------- 20 ㎎

유당 ------------------------------------------ 100 ㎎

탈크 ------------------------------------------ 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

PRF ------------------------------------------- 10 ㎎

옥수수전분 ------------------------------------ 100 ㎎

유당 ------------------------------------------ 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 --------------------------- 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

PRF ------------------------------------------- 10 ㎎

결정성 셀룰로오스 ----------------------------- 3 ㎎

락토오스 -------------------------------------- 14.8 ㎎

마그네슘 스테아레이트 ------------------------- 0.2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

PRF ------------------------------------------- 10 ㎎

만니톨 ---------------------------------------- 180 ㎎

주사용 멸균 증류수 ---------------------------- 2974 ㎎

Na2HPO4·12H2O -------------------------------- 26 ㎎

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

PRF ------------------------------------------- 20 ㎎

이성화당 -------------------------------------- 10 g

만니톨 ---------------------------------------- 5 g

정제수 ---------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

PRF ------------------------------------------- 1000 ㎎

비타민 혼합물 --------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 --------------------------- 70 ㎍

비타민 E -------------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B1 ------------------------------------- 0.13 ㎎

비타민 B2 ------------------------------------- 0.15 ㎎

비타민 B6 ------------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B12 ------------------------------------ 0.2 ㎍

비타민 C -------------------------------------- 10 ㎎

비오틴 ---------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 -------------------------------- 1.7 ㎎

엽산 ------------------------------------------ 50 ㎍

판토텐산 칼슘 --------------------------------- 0.5 ㎎

무기질 혼합물 --------------------------------- 적량

황산제1철 ------------------------------------- 1.75 ㎎

산화아연 -------------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘 ---------------------------------- 25.3 ㎎

제1인산칼륨 ----------------------------------- 15 ㎎

제2인산칼슘 ----------------------------------- 55 ㎎

구연산칼륨 ------------------------------------ 90 ㎎

탄산칼슘 -------------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 ---------------------------------- 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

PRF ------------------------------------------- 100 ㎎

비타민 C -------------------------------------- 15 g

비타민 E(분말) -------------------------------- 100 g

젖산철 ---------------------------------------- 19.75 g

산화아연 -------------------------------------- 3.5 g

니코틴산아미드 -------------------------------- 3.5 g

비타민 A -------------------------------------- 0.2 g

비타민 B1 ------------------------------------- 0.25 g

비타민 B2 ------------------------------------- 0.3g

물 -------------------------------------------- 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

갈근엑스 발효물을 유효성분으로 함유하는 간손상 질환의 치료 및 예방용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 간손상 질환은 알코올성 또는 비알콜성 지방간, 알코올성 또는 비알콜성 급성 또는 만성 간염, 알코올성 또는 비알콜성 간경변증인 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 갈근엑스 발효물은 물로 추출하여 얻은 고형분 0.1% 이상의 갈근엑스에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus breivis , KCTC3498, 한국생명공학연구원 생명자원센터) 및 비피도박터리움 롱검(Bifidobacterium longum , KCTC3128, 한국생명공학연구원 생명자원센터)을 함께 배양하여 얻은 효소액을 0.120%(v/v%)로 혼합하고, 발효 온도 150℃에서 발효시간 1시간 내지 1주일간 동안 발효하고 멸균한 후 건조하고 분말화하는 단계를 포함하는 공정을 통하여 수득한 갈근엑스 발효물임을 특징으로 하는 약학조성물.
갈근엑스 발효물을 유효성분으로 함유하는 간손상 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 4항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태인 건강기능식품.