CN103636555A

CN103636555A - 小鼠去势高铁骨质疏松模型构建方法

Info

Publication number: CN103636555A
Application number: CN201310556517.4A
Authority: CN
Inventors: 王啸; 徐又佳; 刘禄林; 李光飞; 高超
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-11-11
Filing date: 2013-11-11
Publication date: 2014-03-19

Abstract

本发明公开了一种小鼠去势高铁骨质疏松模型构建方法：取8周龄ICR雌性小鼠，行双侧卵巢切除术；术后1周开始腹腔注射枸橼酸铁铵（FAC），7周后得到小鼠去势高铁骨质疏松模型。目前临床绝经妇女多见铁蓄积，近来许多研究认为铁蓄积是骨质疏松的高危因素，而传统去势骨质疏松模型铁水平正常，不能完全模拟绝经妇女，本发明建立的模型较传统模型更贴近临床现象。

Description

小鼠去势高铁骨质疏松模型构建方法

技术领域

本发明涉及医学技术领域，具体涉及动物实验模型的构建方法，尤其涉及小鼠去势高铁骨质疏松模型构建方法。

背景技术

铁元素在机体内的吸收过程相当复杂，食物中的三价铁在小肠中由肠细胞色素B（Dcytb）还原为二价铁，再通过二价阳离子转运蛋白1（DMT1）转运至小肠绒毛上皮细胞内，此时二价铁可在细胞基底部经由膜铁转运蛋白1（FPN1）转运至血液中，同时由膜铁转运辅助蛋白（Hp）氧化为三价，与血液中转铁蛋白结合。该结合的复合体随血液运至各组织器官，并与组织内的细胞作用，由胞内steap3还原为二价铁发挥其生物效应。近年来越来越多的研究显示铁代谢与骨代谢之间有着密切的关系，2010年美国Huang申请了铁调素作为骨质疏松治疗药物的专利，并于2012年在Endocrinology和Gene上报道铁在离体环境中对骨代谢的影响；不仅在基础研究，临床研究也显示铁代谢与骨代谢的关联，2012年，韩国一项回顾性队列研究中，针对健康体检的940名绝经女性进行了为期三年的随访，发现在正常人群当血清铁蛋白水平升高时，骨量呈剂量一致性的丢失加速。这项研究结论表明铁蓄积可能是骨质疏松的独立危险因素，该研究发表在骨质疏松一区杂志JBMR上，并被Nature评论为新的亮点。

骨质疏松在绝经女性群体高发，据统计，女性高于50岁后有约50%将发生骨质疏松。在女性，体内铁离子平衡的一个重要“降铁途径”是月经排血，从45岁围绝经期开始到60岁绝经后，当随着雌激素减少、月经逐渐停止，宫血排出也减少，这段期间铁蛋白水平升高约2～3倍。我们团队在2012年和2013年分别在骨质疏松2区杂志IOF与Bone上提及铁对骨质疏松的促进作用，因此女性绝经后骨质疏松除了与雌激素减少有关，还可能与体内铁水平升高有关系。

临床资料显示，多数患有骨质疏松疾病的绝经妇女体内铁水平偏高，其原因主要在于绝经后，女性不再有月经血排出体外，而月经血的排出又恰恰是铁排泄的重要途径，这就导致体内铁失衡，排出减少导致铁蓄积。大量文献报道：雌性小鼠去除卵巢后，与假手术组相比，去势组血清铁、胫骨铁含量平均值低于假手术组。这说明小鼠与人不一样，由于小鼠本来就没有月经，单纯的去势骨质疏松模型体内铁并不增高。所以传统的小鼠去势骨质疏松模型不能贴切的反应绝经后妇女的高铁状态。其他骨质疏松模型也不理想，如比格犬，尽管有排经，但是频次为2次/年，经血太少，去势停经后对体内铁水平影响不大；再如食蟹猴，排经情况最接近人类，但是去势停经后造成高铁状态需时太长，要一年及以上，性价比不高。高铁水平是骨质疏松症的独立危险因素，而传统去势模型不能很好的反应该危险因素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题于克服上述现有技术的缺点，提供一种成本低，见效快，模型性能稳定，适用性广的小鼠去势高铁骨质疏松模型构建方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：小鼠去势高铁骨质疏松模型构建方法，包括以下步骤：

（1）用水合氯醛腹腔注射小鼠进行麻醉，切开腹腔找出双侧卵巢，在输卵管上结扎，并彻底切除卵巢，最后缝合；

（2）术后1周，对小鼠腹腔注射枸橼酸铁铵（FAC），剂量为0.05g/kg，每周2次，饲养7周后得到小鼠去势高铁骨质疏松模型。

本发明的一优选技术方案，步骤（1）后小鼠肌注青霉素5万U/d，持续3d，预防感染。

本发明的一优选技术方案，步骤（1）中用3.6%水合氯醛（10ml/kg）腹腔内注射麻醉。

本发明中相关术语的说明及解释

根据本发明，术语“去势”是指双侧卵巢切除。

根据本发明，术语“骨质疏松”是指是骨代谢过程中骨吸收和骨形成的偶联出现缺陷，体内的钙磷代谢不平衡，使骨密度逐渐减少而引起的症状。

根据本发明，术语TRAP-5b是指抗酒石酸酸性磷酸酶-5b，是由骨吸收的破骨细胞分泌至血液中的有活性的酶，是常用的骨吸收生化指标。一型胶原C端肽（CTX）是骨骼更新时，一型胶原降解后进入血液的C端短肽片段，是反应骨吸收的生化指标。术语核因子κB受体活化因子配体（RANKL）是一种Ⅱ型跨膜蛋白，能与破骨细胞前体细胞膜上的RANKL受体-RANK结合，刺激前体细胞分化发育为成熟破骨细胞。术语骨保护素（OPG）能与RANKL竞争性结合RANK，从而阻断骨吸收信号的传递；它们的比值能反应骨吸收的能力。术语骨碱性磷酸酶（BALP）是由骨质中分泌出来，当骨头中钙盐沉淀不足时，该酶分泌增多，骨中钙盐充足时就分泌减少，所以用来帮助检查有无钙吸收不足，常用来反应骨形成能力。术语骨钙素（BGP）又称骨γ-羧谷氨酸包含蛋白(bone gamma-carboxyglutamic-acid-containingproteins,)，是成骨细胞合成并分泌的，比较稳定，不受骨吸收因素的影响。该蛋白在骨矿化峰期之后才出现积聚。通过血清骨钙素可以了解成骨细胞，特别是新形成的成骨细胞的活动状态，也是常用的检测骨形成的生化指标。

根据本发明，术语降钙素受体CTR是在破骨细胞(osteoclasts,OC)上发现最早的一种受体，为OC的特征性标志之一，CTR基因位于OC细胞膜，分子量为85000～90000，其氨基酸序列形成7个跨膜区及连接这些跨膜区的4个细胞外功能区（e1～e4）和4个细胞内功能区（i1～i4）。术语组织蛋白酶K（CTK）被认为是破骨细胞特异性表达的产物，其基因定位于1q21.2，转录产物长1.7kb，翻译产物为前组织蛋白酶原K，属于溶酶体半胱氨酸蛋白酶中的番木瓜蛋白酶超家族。术语骨钙蛋白（OCN）又称骨钙素（BGP），主要反应成骨活性。术语基质金属蛋白酶9（MMP9）是由破骨细胞分泌的，又称92-kDⅣ型胶原酶和明胶酶B，在破骨细胞中呈高表达，该酶在正常骨改建和病理性骨吸收过程中发挥重要作用，MMP9基因位于染色体20q11.1～13.1，26～27kbp，具有13个外显子和9个内含子。术语抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）是位于第19号染色体P13.2～13.3处的一个基因编码的单一同工酶。该酶是一种结构高度保守的含铁糖蛋白，分子量约30～40kD，是反应骨吸收和破骨细胞活性最重要的标志物。

本发明的有益效果是：该模型在去势小鼠基础上进行高铁干预，来模拟女性绝经后铁蓄积现象，旨在模拟临床上高铁绝经女性，该模型建立迅速、稳定，更好的贴近临床现象。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为各组实验各组肝脏普鲁士蓝铁染色。

图2为各组酶联免疫吸附法检测各组血清铁蛋白水平。

图3为各组Micro-CT扫描实验各组小鼠的股骨下端的三维图像。

图4为各组小鼠双侧胫骨PCR相关骨代谢基因检测对比。

图5A-5E为分别为酶联免疫吸附法检测各组血清骨代谢指标（TRAP-5b、CTX、RANKL/OPG、BALP、BGP）的差异示图。

图6为各组小鼠破骨原代细胞TRAP染色结果。与SHAM组相比，#P<0.05，与OVX组相比，*P<0.05。

图7为各组小鼠破骨原代细胞计数结果。与SHAM组相比，#P<0.05，与OVX组相比，*P<0.05。

具体实施方式

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。

一.仪器、材料

本发明的SPF级雌性ICR小鼠由苏州大学实验动物中心提供，动物使用许可证号为：SCXK(苏)2007-0035。

Micro-CT(SKYSCAN，1176型)，酶标仪(Bio-tech公司，Synergy2)，PCR扩增仪（ABI公司，System9700），高速冷冻离心机（贝克曼库尔德公司，Beckman AvantiJ-30I），电泳仪（Bio-Rad生物公司，PowerPPAC200），细胞培养箱（Heal Force，HF100），倒置相差显微镜（Olympus公司，CKX31），超净工作台（苏净集团安泰公司，SW-CJ-1F）

细胞培养皿（Corning生物公司），96孔板（Corning生物公司），抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒（Sigma公司），枸橼酸铁铵（Sigma公司），水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)，生理盐水(中国大冢制药有限公司)，ELISA试剂盒（R＆D生物公司），α-MEM培养基（Gibco生物技术公司），新生胎牛血清（Gibco生物技术公司），胰蛋白酶（碧云天生物技术公司）。

二.模型建立方法

选取8周龄SPF级ICR雌性小鼠30只，随机分为FAC+OVX，OVX，SHAM三组，每组10只；FAC+OVX组为去势高铁骨质疏松组，OVX组为去势骨质疏松组，SHAM组为假手术组。

FAC+OVX组为去势高铁骨质疏松组，本组小鼠用3.6%水合氯醛（10ml/kg）腹腔内注射麻醉后，逐层切开皮肤、肌层，进入腹腔，找出双侧卵巢，在输卵管上结扎，并彻底切除卵巢，分层缝合。术后所有小鼠肌注青霉素5万U/d，持续3d，预防感染。术后1周开始腹腔注射枸橼酸铁铵（FAC），剂量为0.05g/kg，每周2次，给药剂量每周按体重调整一次，7周后得到小鼠去势高铁骨质疏松模型。OVX组小鼠仅行双侧卵巢切除术，术后一周用等量同频次生理盐水腹腔注射7周。SHAM组小鼠用同样的方法进入腹腔，找出双侧卵巢，仅切除卵巢周围部分腹内脂肪后逐层缝合，术后一周用等量同频次生理盐水腹腔注射7周。

三.模型建立的评价方法与结果

（一）评价指标

1.血清铁离子指标检测

造模7周后以4%水合氯醛以0.1ml/100g剂量麻醉小鼠，采取双侧眼球摘除取血法收集小鼠全血1ml，3000r/min离心10min，吸取上层血清，分装于小EP管中，冻存于-80℃冰箱中，用于检测。采用自动生化分析仪检测血清铁离子水平。

2.肝脏铁水平检测

小鼠处死后行肝脏门静脉生理盐水灌洗，至肝脏变大，发白为止。取肝脏一叶浸泡于福尔马林中固定，4周后取出，观察大体颜色并行普鲁士蓝铁染色，光镜下观察铁蓝染颗粒。

3.血清铁蛋白水平检测

血清稀释40倍后，用酶联免疫吸附法（Elisa）检测各组铁蛋白水平差异。酶标仪读出各组OD值，并按照标准孔绘制浓度曲线，根据各标本OD值计算相应的铁蛋白浓度。

4.Micro-CT扫描

用Skyscan1172Mciro-CT对小鼠股骨标本远端松质骨进行扫描并进行三维重建和数据分析。扫描条件是59KV、127uA，精密度为9um。松质骨的感兴趣区域（ROI）为股骨远端生长板以下60层面开始数100层，这100层扫描图片用于松质骨三维重建及数据分析。

5.骨代谢相关基因检测

取小鼠双侧胫骨置于研钵中，加入少量液氮迅速研磨成粉（边研磨边加液氮），取粉末置入离心管，以经典Trizol法提取RNA，再逆转录成cDNA，-80度保存。半定量PCR检测骨代谢相关基因（CTR，CTK，RANKL，OPG，OCN，MMP9，TRAP）各组表达差异。

6.血清骨代谢指标（TRAP-5b、CTX、RANKL/OPG、BALP、BGP）检测方法同铁蛋白检测。

7.骨髓源性破骨细胞培养

血清收集完成后，将每只小鼠浸泡于75%酒精中5分钟以充分消毒。于无菌操作台中进行以下操作。将小鼠下肢在髋关节处离断，暴露出股骨。用注射器吸取含有10%血清的α-MEM将骨髓细胞冲到培养皿中。24小时后收集非贴壁细胞重新种植，此时换成30ng/ml M-CSF的培养基培养3天。3天后，胰酶消化贴壁细胞，将获得的细胞以每孔4000的密度接种到96孔板中。用含有50ng/ml RANKL和30ng/ml M-CSF的培养基培养8天，每2天换液一次，8天后进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色。

8.统计学分析

利用SPSS19.0统计软件进行方差分析，所有数据均以M±SD表示。以P<0.05为有统计学意义。

（二）：结果

1.血清铁离子指标

表1各组小鼠血清铁浓度（与Sham组比较，*P<0.05）

造模7周后采取双侧眼球摘除取血法收集小鼠血清，利用自动生化分析仪检测血清铁离子水平，研究发现，FAC+OVX组血清铁较SHAM组升高（P<0.05），而去势组血清铁水平有所下降（P<0.05）。

2.肝脏铁水平检测

大体观下很明显发现，FAC+OVX组颜色更黄，更深，而SHAM组和OVX组肝脏均为白色。普鲁士蓝染色结果与大体观察结果一致，FAC+OVX组蓝染颗粒较SHAM组和OVX组多。

3.血清铁蛋白水平检测

经过OD值得转换计算，铁蛋白含量FAC+OVX组明显高于SHAM组和OVX组（P<0.01），而SHAM组与OVX组无明显差异（见图1）。

4.Micro-CT分析

离体测量发现，小鼠股骨远端松质骨骨密度（BMD），OVX组较SHAM组低（P<0.05），而FAC+OVX组最低（P<0.05）。体视学参数分析进一步表明，OVX组骨体积比（BV/TV），骨小梁数量（Tb.N），骨小梁厚度（Tb.Th）均低于同期SHAM组（P<0.05），FAC+OVX组仍然最低（P<0.05）。而骨表面体积比（BS/TV）和骨小梁分离度（Tb.Sp）恰恰相反，FAC+OVX组高于OVX组（P<0.05），OVX组高于SHAM组（P<0.05）（结果见表2和图3）。

表2各组Micro-CT分析参数（与SHAM组相比，*P<0.05，与OVX组相比，^#P<0.05）

5.骨代谢相关基因分析

半定量PCR检测结果显示，FAC+OVX组破骨相关基因CTR，CTX，TRAP条带亮度明显加强，而成骨相关基因OPG，OCN则有不同程度减弱（见图4）。

表3各组RT-PCR基因检测结果分析（与SHAM组相比，*P<0.05，**P<0.01，与OVX组相比，^#P<0.05）

组别	SHAM组	FAC+OVX组	OVX组
				CTR	0.272±0.031	0.710±0.040^**#	0.414±0.039^**
CTK	0.311±0.033	0.661±0.042^**	0.430±0.047^*
				RANKL	0.118±0.045	0.377±0.043^*	0.347±0.036^*
OPG	0.399±0.041	0.089±0.031^**#	0.249±0.035^*
				OCN	0.312±0.036	0.271±0.048	0.287±0.042
MMP9	0.301±0.049	0.345±0.042	0.380±0.040
				TRAP	0.097±0.027	0.554±0.044^**	0.501±0.045^**

6.血清骨代谢指标检测结果

数值前期处理与铁蛋白相同，结果显示：BALP和BGP含量，FAC+OVX组较SHAM组及OVX组低（P<0.05）；TRAP-5b、CTX、RANKL/OPG含量，各组分布趋势为：FAC+OVX组>OVX组>SHAM组（P<0.05）（见图5）。

7.原代破骨细胞TRAP染色结果

抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果显示OVX组破骨细胞较SHAM组显著增加（P<0.05），FAC+OVX组破骨细胞最多（P<0.05）（图6、图7）。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.小鼠去势高铁骨质疏松模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）术后1周，对小鼠腹腔注射枸橼酸铁铵FAC，剂量为0.05g/kg，每周2次，饲养7周后得到小鼠去势高铁骨质疏松模型。

2.根据权利要求1所述的方法，步骤（1）中用3.6%水合氯醛10ml/kg腹腔内注射麻醉。

3.根据权利要求1所述的方法，步骤（1）后小鼠肌注青霉素5万U/d，持续3d，预防感染。