KR102533746B1 - 유근피 추출물 또는 이로부터 분리한 유효 단일물질을 포함하는 골 질환의 치료, 예방 및 개선용 조성물 - Google Patents

유근피 추출물 또는 이로부터 분리한 유효 단일물질을 포함하는 골 질환의 치료, 예방 및 개선용 조성물 Download PDF

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허철성
이창형
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Abstract

본 발명은 유근피 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물 및 이의 용도에 관한 것이다.
일 양상에 따르면, 본 발명의 유근피 추출물 또는 이로부터 분리된 유효물질은 파골세포 분화 억제능 및 항염증 효과가 우수함을 확인하였는 바, 이를 골 관련 질환의 치료 또는 예방 용도로 이용할 수 있다.

Description

유근피 추출물 또는 이로부터 분리한 유효 단일물질을 포함하는 골 질환의 치료, 예방 및 개선용 조성물 {A composition for treating, preventing and improving bone associated diseases containing an ulmus extracts or an effective single compound isolated therefrom}
본 발명은 유근피 추출물 또는 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물의 골 관련 질환 치료, 개선 및 예방 용도에 관한 것이다.
식품의약품안전처의 조사에 따르면 국내의 고령화 속도는 2010년 10.5%에서 2019년 14.9%로 가파른 증가현상을 보임과 동시에 이러한 고령화의 영향과 맞물려 건강기능 식품 시장 또한 2010년(17,875억원) 대비 2019년(37,257억원)로 증가하는 경향을 보이고 있다. 또한, 통계청 인구 분석에 따르면 현재 65세 이상 노인의 비율이 전체 인구 중 13.5%를 차지하고 있어 고령화 사회에 해당되며, 2040년에는 전체 인구의 32.3%로 예상되어 초고령화 사회(65세 이상 인구 20% 이상)가 될 것으로 예상된다. 이러한 사회 배경과 동향을 바탕으로 앞으로의 뼈/관절 기능성 시장은 지속적으로 확대될 것으로 추정된다.
유근피는 일반적으로 느릅나무속 식물의 뿌리 껍질을 지칭하고 민간에서는 물에 닿게 되면 코처럼 진액이 나온다 하여 코나무로도 불리고 있으며, 축농증, 위염, 위암과 욕창 등에 사용해 오고 있다. 유근피는 원물자체가 같은 느릅나무 속의 식물들을 구분하기 어려워 식품공전 및 대한민국 약전 외 한약(생약)규격집에서 규정한 왕느릅나무가 아닌 일반 느릅나무로 유통 및 연구가 진행되어 연구분야에서 조차 혼란을 야기하고 있다.
이러한 배경 하에, 유근피 추출물로부터 유효한 단일 화합물을 분리하였으며, 상기 유근피 추출물 및 단일 화합물의 우수한 효능을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-2334305호
일 양상은 유근피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 양상은 유근피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 유근피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 화학식 10으로 표현되는 화합물, 이의 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 화학식 10으로 표현되는 화합물, 이의 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 화학식 10으로 표현되는 화합물, 이의 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
일 양상은 유근피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 명세서에서의 용어 "유근피"는 느릅나무과(Ulmaceae)에 속하는 느릅나무의 코르크층을 벗긴 수피 또는 근피를 의미한다. 일반적으로 뿌리껍질을 사용하고 있지만 줄기 껍질의 경우에도 동일한 성분을 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 플라보노이드, 사포닌, 탄닌 및 점액질을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 구체적으로 상기 유근피는 왕느릅나무 (Ulmus macrocarpa)의 껍질(수피 또는 근피)을 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "추출물"은 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 또는 이들의 혼합물 등 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.
상기 추출물은 상기 해당 식물의 천연, 잡종 또는 변종 식물로부터 추출될 수 있고, 식물 조직 배양물로부터도 추출이 가능하다.
상기 추출물의 추출 용매는 양성자성 극성 용매 또는 비양성자성 극성 및 비극성 용매일 수 있다. 상기 양성자성 극성 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 또는 뷰탄올일 수 있다. 상기 비양성자성 극성 용매는 디클로로메탄, 테트라히드로퓨란, 에틸아세테이트, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭시드, 아세톤, 2-뷰탄온, 또는 헥사메틸포스포르아미드일 수 있다. 상기 비극성 용매는 펜탄, 헥산, 클로로포름, 또는 디에틸에테르일 수 있다. 상기 비극성 용매는 벤젠이 제외된다. 상기 용매는 C1-C6의 알콜, C3-C10의 에스테르, 예를 들면, C3-C10의 아세테이트, C3-C10의 케톤, C1-C6의 비치환 또는 할로겐화 탄화수소, C2-C10 고리 에테르, 이들의 혼합물 또는 상기 용매 중 하나 이상과 물의 혼합물일 수 있다. 상기 용매는 에탄올, 프로판올, 아세토니트릴, 에틸아세테이트, 아세톤, 2-뷰탄온, 클로로포름, 디클로로메탄, 헥산, 이들의 혼합물, 또는 상기 용매 중 하나 이상과 물의 혼합물인 것일 수 있다. 상기 탄화수소는 알칸, 알켄, 또는 알킨일 수 있다.
상기 추출물은 물; 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 뷰탄올(buthanol) 등의 C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린 (glycerine), 부틸렌글리콜 (butylene glycol), 프로필렌글리콜 (propylene glycol) 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트(methyl acetate), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 아세톤(acetone), 벤젠(bezene), 헥산(hexane), 디에틸에테르(diethyl ether), 디클로로메탄(dichloromethane) 등의 탄화수소계 용매로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출한 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 추출물은 물 및/또는 에탄올을 용매로 추출한 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 물을 용매로 추출한 것일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 유근피 추출물은 물, 에탄올 또는 에탄올과 물의 혼합물(70% 에탄올)을 용매로 사용하여 추출하였다.
상기 추출물은 감압고온 추출, 열탕 추출, 환류 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 상온 추출, 초음파 추출, 증기 추출 및 분획 추출로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 추출한 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이들의 조합 등이 있다.
상기 분획물을 얻는 데 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 등의 극성 용매; 헥산(Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(Dichloromethane) 등의 비극성 용매; 또는 이들의 혼합용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 따르면, 상기 분획물은 유근피 물 추출물(열수 추출물)을 탄소수 1 내지 4의 알코올로 분획한 것일 수 있으며, 구체적으로 뷰탄올로 분획한 것일 수 있다.
상기 추출물 또는 이의 분획물은 하기 화학식 1 내지 9로 표현되는 화합물들로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물, 이의 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112022021113837-pat00001
[화학식 2]
Figure 112022021113837-pat00002
[화학식 3]
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[화학식 4]
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[화학식 5]
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[화학식 6]
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[화학식 7]
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[화학식 8]
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[화학식 9]
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본 명세서에서의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"이란, 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하는데, 통상적으로 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기 염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있다. 특히 바람직한 염으로는, 화합물이 그 내에 산성관능기를 가지는 경우, 알칼리 금속염 (예컨대, 나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염 (예컨대, 칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등) 등과 같은 무기염, 및 암모늄염과 같은 유기 염이 있으며, 화합물이 그 내에 염기성 관능기를 가지는 경우, 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과 같은 무기산과의 염, 아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등과 같은 유기산과의 염이 있다.
본 명세에서의 용어 "골 관련 질환"이란, 조골세포 및 파골세포의 불균형으로 인해 유발되어 골조직의 장애를 초래하거나 또는 골조직을 파괴하는 질환을 의미하는데, 상기 골 관련 질환은 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 골 관련 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골결손, 골위축(bone atrophy), 골괴사, 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 섬유성 골염, 페이젯병(Paget's disease), 칼슘 조절 이상 등의 대사성 골질환, 암세포의 골전이나 인공관절의 피로잔해(wear debris) 등에 의해 초래되는 뼈의 용해, 암(cancer)　관련 골재흡수 질병, 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 골절(fracture), 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis), 골형성 부전증(osteogenesis imperfecta), 구루병, 내분비 질환 또는 약물에 의한 이차성 골소실, 치주염(periodontitis)에 의한 치조골 결손 및 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 골 관련 질환은 파골세포 발현/활성 또는 파골세포 분화와 관련된 골 질환일 수 있으며, 구체적으로 파골세포 과발현 또는 과분화로 인해 발병하는 것일 수 있다.
상기 조성물, 추출물 또는 이의 분획물은 파골세포 분화 억제 또는 파골세포 발현/활성 억제 효과를 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "파골세포(osteoclast)"란, 파골세포 전구체(osteoclast precursor)로부터 분화되는 세포로서 파골세포 전구세포들은 M-CSF 및 RANKL 존재 하에서 파골세포로 분화되며, 융합을 통해 다핵 파골세포(multinucleated osteoclast)를 형성한다. 파골세포는 αvβ3 인테그린(integrin) 등을 통해 골(bone)에 결합하며 산성 환경을 조성하는 한편 각종 콜라게네이즈(collagenase) 및 프로테아제(protease)를 분비하여 골 흡수(bone resorption)를 일으킨다. 파골세포는 완전히 분화된 세포로 증식하지 않으며 약 2주간의 수명이 다하면 세포 사멸(apotosis)를 일으킨다.
상기 조성물, 추출물 또는 이의 분획물은 파골세포 분화 또는 발현 관련 마커의 발현 수준을 억제하는 것일 수 있으며, 구체적으로 NFATc1, OSCAR, DC-STAMP 및 CTSK으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 발현 수준을 억제하는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 유근피 물(열수) 추출물, 유근피 70% 에탄올 추출물 및 유근피 주정(100% 에탄올) 추출물의 경우 파골세포 분화 억제 효능이 우수한 것을 확인하였으며, 열수 추출물이 보다 우수한 효능을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 열수 추출물 및 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 골 관련 질환 치료제로 이용할 수 있다.
상기 추출물 또는 이의 분획물은 항염증 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "항염증"은 염증이 일어나는 과정 또는 이를 억제하는 성질이나 효능을 의미하는 것으로서, 상기 항염증은 염증성 질환의 개선(증상의 경감), 치료, 예방 그러한 질환의 발병 억제 또는 지연을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "염증성　질환 (inflammatory diseases)"은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭한다. 상기 염증성 질환은 천식, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 치주염, 피부염, 관절염, 퇴행성 관절염, 염증성 장질환, 강직성 척추염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위염, 신장염, 췌장염, 간염, 건염 및 건초염 중 하나 이상일 수 있다. 또한, 상기 염증성 장 질환은 소화관에 생기는 염증유발물질에 의해 유발되는 심각한 만성 염증으로서, 구체적으로 크론병, 궤양성 대장염, 장관 베체트병, 단순성 궤양, 방사선 장염 및 허혈성 장염으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "치료"는, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서의 용어 "예방"은, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골 관련 질환 또는 질환의 발병 가능성이 억제되거나 지연되는 모든 행위를 의미한다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용되는"의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 약학적 조성물에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 락토스, 덱스트로스, 말토 덱스트린, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 글리세롤, 에탄올, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물을 제제화할 경우, 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 약학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 골 관련 질환에 대한 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 성분과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
상기 약학적 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 성인 1인당 약 0.1ng 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 100 mg/kg로 투여할 수 있고, 본원의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량 또는 투여횟수는 어떠한 면으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.
다른 양상은 상기 골 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 관련 질환 치료 또는 예방 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "개체"는 골 관련 질환이 발병되거나 발병할 위험이 있는 개, 고양이, 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류, 파충류, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있으며, 상기 개체는 인간을 제외하는 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 주사제, 수액제(링겔), 캡슐제, 환제, 정제, 좌제 또는 패치의 형태로 제형화되어 투여할 수 있다. 상기 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피패치투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 제형화되지 않은 형태로도 투여할 수 있고, 위산에 의하여 상기 약학 조성물의 유효성분이 변성 또는 분해될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화된 형태 또는 경구용 패치형태로 구강내에 투여할 수도 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 양상은 유근피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
본 명세서에서의 용어 "개선"은, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 상기 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품 조성물은 골 관련 질환의 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강 식품, 건강 보조 식품의 용어는 혼용될 수 있다. 구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
상기 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 골 관련 질환의 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신 (niacin), 비오틴 (biotin), 폴레이트 (folate), 판토텐산 (panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제 (소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제 (표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제 (부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제 (타르색소 등), 발색제 (아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제 (아황산나트륨), 조미료 (MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료 (둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료 (바닐린, 락톤류 등), 팽창제 (명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물 (food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 ~ 0.03g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기 식품 조성물은 골 관련 질환의 개선 또는 예방 효과를 나타낼 수 있다면 본 발명의 추출물을 다양한 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 추출물을 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양상은 유근피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
본 명세서에서의 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 사료 조성물은 제제에 따라 골 관련 질환 개선 또는 예방을 위해 첨가 가능한 공지의 첨가물을 더 포함할 수 있다. 상기 사료 조성물은 고농축액, 분말 또는 과립 형태일 수 있다. 상기 사료 조성물은 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분을 더 포함할 수 있다. 상기 사료 조성물은 동물 사료에 침지, 분무, 또는 혼합으로 첨가하여 사용될 수 있다.
상기 사료 조성물은 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 나타내는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
상기 사료 조성물은 포유류, 가금류를 포함하는 다수의 동물 식이 즉, 사료 및 음용수에 적용할 수 있다.
상기 사료 조성물은 사료에 첨가되는 물질 (즉, 사료 첨가제), 사료 원료 또는 개체에 급여되는 사료 자체를 모두 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 하기 화학식 10으로 표현되는 화합물, 이의 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다:
[화학식 10]
Figure 112022021113837-pat00010
R1 내지 R3은 각각 독립적으로 H 또는 OH이고,
R4는 H 또는
Figure 112022021113837-pat00011
이고,
R5는 OH,
Figure 112022021113837-pat00012
또는
Figure 112022021113837-pat00013
이고,
X는 상기
Figure 112022021113837-pat00014
가 단일결합인 경우 H이고, 상기
Figure 112022021113837-pat00015
가 이중결합인 경우 O이고,
A-B는 단일결합(CH-CH) 또는 이중결합(C=C)의 탄화수소이다.
상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
상기 화학식 10의 화합물은 상기 화학식 1 내지 9로 표현되는 화합물들로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 화합물, 이의 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물은 유근피 추출물 또는 이의 분획물에서 유래된 것일 수 있다.
상기 조성물은 화학식 10의 화합물을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 화학식 1, 3, 7, 8 및 9로 표현되는 화합물들로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 화합물 8 및 9로 표현되는 화합물들로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 유근피 추출물로부터 유래된 화합물 1 내지 9의 경우 파골세포 분화 억제 효능이 우수한 것을 확인하였으며, 특히 화합물 2, 3, 7, 8 및 9이 보다 우수한 효능을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 화합물들을 유효성분으로 포함하는 조성물을 골 관련 질환 치료제로 이용할 수 있다.
상기 화학식 10의 화합물은 파골세포 분화 억제 또는 파골세포 발현/활성 억제 효과를 갖는 것일 수 있으며, 파골세포 분화 또는 발현 관련 마커의 발현 수준을 억제하는 것일 수 있다. 구체적으로 NFATc1, OSCAR, DC-STAMP 및 CTSK으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 발현 수준을 억제하는 것일 수 있다.
상기 화학식 10의 화합물은 항염증 활성을 갖는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 화학식 10으로 표현되는 화합물, 이의 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
또 다른 양상은 화학식 10으로 표현되는 화합물, 이의 유도체, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는, 골 관련 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
일 양상에 따르면, 본 발명의 유근피 추출물 또는 이로부터 분리된 유효물질은 파골세포 분화 억제능이 우수함을 확인하였는 바, 이를 골 관련 질환의 치료 또는 예방 용도로 이용할 수 있다.
도 1은 유근피 추출물 및 이로부터 분리된 유효물질 제조 공정을 나타낸 도면이다.
도 2는 화합물 1의 분리/동정 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 화합물 2의 분리/동정 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 화합물 3의 분리/동정 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 화합물 4의 분리/동정 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 화합물 5의 분리/동정 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 화합물 6의 분리/동정 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 화합물 7의 분리/동정 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 화합물 8의 분리/동정 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 화합물 9의 분리/동정 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 유근피 추출물의 파골세포 분화 억제능 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 12은 유근피 추출물로부터 분리된 단일 화합물의 파골세포 분화 억제능 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 화합물 8 처리에 따른 파골세포 분화 마커의 발현 수준을 나타낸 도면이다 (대조군: DMSO, *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001).
도 14는 유근피 추출물의 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 유근피 추출물로부터 분리된 단일 화합물의 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 유근피 추출물로부터 분리된 단일 화합물의 NO 어세이 결과를 나타낸 도면이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 유근피 추출물 제조
본 발명에서 유근피 추출물 및 이의 분획물을 수득하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 10kg의 왕느릅나무 (Ulmus macrocarpa)의 껍질을 증류수에서 1일간 추출하고 감압건조를 시킨 후 H20 (water)과 DCM (dichloromethane)층으로 분획을 실시하였다. 다음으로, 상기 H20층을 다시 H20층과 EA(ethyl acetate)층으로 분획하였다. 이후 분획된 물층에 BuOH을 첨가하여 재분획시킨 후, BuOH층을 shepadex LH-20에 MeOH을 용매로 size exclusion chromatography를 진행하여 1-46번까지의 분획물을 만들었다. 이후 나온 분획물 중에 7-8 fraction 및 9-12 fraction을 각각 다시 모아 C-18 culomn chromatography를 이용하여 더 세분하게 분획한 후에 HPLC를 이용하여 단일물질 단위까지 분리를 진행하였다. 이렇게 분리된 화합물 중 유효성분 및 지표성분으로 선정이 가능할 만큼의 양이 존재하는 화합물 목록을 추려내었고 총 9가지 물질의 구조 규명 및 물질동정을 진행하였다 (도 1).
실시예 2: 화합물 분리 및 동정
2-1: (2S)-naringenin-6-C-β-D-glucopyranoside (화합물 1)
상기 실시예 1의 방법으로 제조한 유근피 추출물의 1-46번까지의 분획물 중, 7-8번 분획물을 sillica column chromatography를 통해 MeOH과 H2O의 농도 gradient를 거쳐 MeOH 100%에 시작하여 5%의 농도 감소를 1L씩 진행하여 분리하였다. MeOH 30%용매를 사용하여 column chromatography 했을 때 나온 분획물을 HPLC equipped with a Phenomenex Luna C18 column (5 μm, 100 Α, 250 × 100 mm, UV = 280 nm, 2.0 mL/min, 용매: 40% MeOH)를 이용해 단일 compound(17.2min peak)로 분리하였다. 이후 MS를 통하여 분자량 434 M.W를 확인하였고, CD, H-NMR, C-NMR, MS을 통해 compound 1의 단일 물질 동정을 진행하였다. 동정결과로 도 2와 같이 (2S)-naringenin-6-C-β-D-glucopyranoside을 확인하였다. 상기 화합물 1은 본 명세서에서 화학식 1로 표현된다.
(2S)-naringenin-6-C-β-D-glucopyranoside (1): white amorphous powder; [α]20D +18.6 (c 0.20, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 220, 291, 330; ECD (1.2 × 10-3 M, MeOH) λmax (△ε) 289 nm (-6.09), 217 nm (+6.92); 1H NMR (methanol-d4, 700 MHz) δ 7.30 (d, J = 8.5 Hz, H-2'/6'), 6.81 (d, J = 8.5 Hz, H-3'/5'), 5.94 (s, H-8), 5.34 (dd, J = 12.6, 2.9 Hz, H-2), 4.79 (d, J = 9.9 Hz, H-1''), 4.14 (t, J = 9.9 Hz, H-2''), 3.85 (dd, J = 12.1, 2.2 Hz, H-6''a), 3.71 (dd, J = 12.1, 5.5 Hz, H-6''b), 3.44 (m, H-4''), 3.43 (m, H-3''), 3.37 (m, H-5''), 3.11 (dd, J = 17.1, 12.6 Hz, H-3a), 2.73 (dd, J = 17.1, 3.1 Hz, H-3a); 13C NMR (methanol-d4, 175 MHz) δ 197.7 (C-4), 168.6 (C-7), 164.4 (C-5), 164.2 (C-9), 159.0 (C-4'), 131.0 (C-1'), 129.0 (C-2'/6'), 116.3 (C-3'/5'), 106.1 (C-6), 103.0 (C-10), 96.7 (C-8), 82.5 (C-5''), 80.4 (C-2), 80.3 (C-3''), 75.3 (C-1''), 72.6 (C-2''), 71.8 (C-4''), 62.9 (C-6''), 43.9 (C-3); ESIMS m/z 435 [M + H]+, 433 [M - H]-; HRESIMS m/z 435.1295 [M + H]+ (calcd for C21H23O10, 435.1291).
2-2: (2R)-naringenin-6-C-β-D-glucopyranoside (화합물 2)
상기 실시예 1의 방법으로 제조한 유근피 추출물의 1-46번까지의 분획물 중, 7-8번 분획물을 sillica column chromatography를 통해 MeOH과 H2O의 농도 gradient를 거쳐 MeOH 100%에 시작하여 5%의 농도 감소를 1L씩 진행하여 분리하였다. MeOH 30%용매를 사용하여 column chromatography 했을 때 나온 분획물을 HPLC(5 μm, 100 Α, 250 × 100 mm, UV = 280 nm, 2.0 mL/min, 용매: 40% MeOH)를 이용해 단일 compound(17.8min peak)로 분리하였다. 이후 MS를 통하여 분자량 434 M.W를 확인하였고, CD, H-NMR, C-NMR, MS을 통해 compound 2의 단일 물질 동정을 진행하였다. 동정결과로 도 3과 같이 (2R)-naringenin-6-C-β-D-glucopyranoside을 확인하였다. 상기 화합물 2은 본 명세서에서 화학식 2로 표현된다.
(2R)-naringenin-6-C-β-D-glucopyranoside (2): white amorphous powder; [α]20D +13.8 (c 0.50, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 220, 291, 330; ECD (0.9 × 10-3 M, MeOH) λmax (△ε) 290 nm (+5.48), 216 nm (-6.91); 1H NMR (methanol-d4, 700 MHz) δ 7.30 (d, J = 8.6 Hz, H-2'/6'), 6.81 (d, J = 8.6 Hz, H-3'/5'), 5.89 (s, H-8), 5.33 (dd, J = 12.6, 3.0 Hz, H-2), 4.78 (d, J = 9.9 Hz, H-1''), 4.19 (t, J = 9.9 Hz, H-2''), 3.84 (dd, J = 12.1, 2.0 Hz, H-6''a), 3.71 (dd, J = 12.1, 5.7 Hz, H-6''b), 3.46 (m, H-4''), 3.43 (m, H-3''), 3.37 (m, H-5''), 3.08 (dd, J = 17.1, 12.6 Hz, H-3a), 2.71 (dd, J = 17.1, 3.1 Hz, H-3a); 13C NMR (methanol-d4, 175 MHz) δ 196.8 (C-4), 170.9 (C-7), 164.5 (C-5), 164.1 (C-9), 159.0 (C-4'), 131.2 (C-1'), 129.0 (C-2'/6'), 116.3 (C-3'/5'), 106.4 (C-6), 102.3 (C-10), 97.5 (C-8), 82.4 (C-5''), 80.4 (C-3''), 80.1 (C-2), 75.4 (C-1''), 72.3 (C-2''), 71.8 (C-4''), 62.9 (C-6''), 43.8 (C-3); ESIMS m/z 435 [M + H]+, 433 [M - H] -; HRESIMS m/z 435.1288 [M + H]+ (calcd for C20H23O10, 423.1291).
2-3: (2R,3S)-catechin-7-O-β-D-xylopyranoside (화합물 3)
상기 실시예 1의 방법으로 제조한 유근피 추출물의 1-46번까지의 분획물 중, 7-8번 분획물을 sillica column chromatography를 통해 MeOH과 H2O의 농도 gradient를 거쳐 MeOH 100%에 시작하여 5%의 농도 감소를 1L씩 진행하여 분리하였다. MeOH 15%용매를 사용하여 column chromatography 했을 때 나온 분획물을 HPLC(5 μm, 100 Α, 250 × 100 mm, UV = 280 nm, 2.0 mL/min, 용매: 20% MeOH)를 이용해 단일 compound(12min peak)로 분리하였다. 이후 LC/MS를 통하여 분자량 422 M.W를 확인하였고, CD, H-NMR, C-NMR, MS을 통해 compound 3의 단일 물질 동정을 진행하였다. 동정결과로 도 4와 같이 catechin-7-O-b-D-xylopyranoside을 확인하였다. 상기 화합물 3은 본 명세서에서 화학식 3으로 표현된다.
(2R,3S)-catechin-7-O-b-D-xylopyranoside (3): white amorphous powder; [α]20D -15.6 (c 0.50, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 203, 279; ECD (2.6 × 10-3 M, MeOH) λmax (△ε) 276 nm (-1.33), 215 nm (-5.06); 1H NMR (methanol-d4, 700 MHz) δ 6.83 (d, J = 1.8 Hz, H-2'), 6.76 (d, J = 8.1 Hz, H-5'), 6.72 (dd, J = 8.1, 1.8 Hz, H-6'), 6.17 (d, J = 2.2 Hz, H-6), 6.11 (d, J = 2.2 Hz, H-8), 4.76 (d, J = 7.1 Hz, H-1''), 4.60 (d, J = 7.4 Hz, H-2), 4.00 (m, H-3), 3.90 (dd, J = 11.5, 5.4 Hz, H-5''a), 3.54 (m, H-4''), 3.39 (m, H-3''), 3.38 (m, H-2''), 3.32 (overlapped with solvent peaks, H-5''b), 2.86 (dd, J = 16.3, 5.4 Hz, H-3a), 2.54 (dd, J = 16.3, 8.0 Hz, H-3b); 13C NMR (methanol-d4, 175 MHz) δ 158.5 (C-7), 157.6 (C-5), 156.8 (C-9), 146.29 (C-4'), 146.26 (C-3'), 132.1 (C-1'), 120.0 (C-6'), 116.1 (C-5'), 115.2 (C-2'), 103.7 (C-10), 102.9 (C-1''), 97.4 (C-6), 97.0 (C-8), 82.9 (C-2), 77.8 (C-3''), 74.7 (C-2''), 71.0 (C-4''), 68.6 (C-3), 66.9 (C-5''), 28.5 (C-4); ESIMS m/z 423 [M + H]+, 421 [M - H]-; HRESIMS m/z 423.1289 [M + H]+ (calcd for C21H23O10, 423.1291).
2-4: (2R,3R)-Aromadendrin-6-C-β-D-glucopyranoside (화합물 4)
상기 실시예 1의 방법으로 제조한 유근피 추출물의 1-46번까지의 분획물 중, 6번 분획물을 HPLC(5 μm, 100 Α, 250 × 100 mm, UV = 280 nm, 2.0 mL/min, 용매: 35% MeOH)를 이용해 단일 compound(12.5min peak)로 분리하였다. 이후 LC/MS를 통하여 분자량 450 M.W를 확인하였고, CD, H-NMR, C-NMR, MS을 통해 compound 4의 단일 물질 동정을 진행하였다. 동정결과로 도 5와 같이 (2R,3R)-Aromadendrin-6-C-β-D-glucopyranoside을 확인하였다. 상기 화합물 4는 본 명세서에서 화학식 4로 표현된다.
(2R,3R)-aromadendrin-6-C-β-D-glucopyranoside (4): white amorphous powder; [α]20D +34.1 (c 0.50, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 197, 226, 294, 330; ECD (1.2 × 10-3 M, MeOH) λmax (△ε) 293 nm (-7.45), 256 nm (+1.25),, 235 nm (+2.85), 217 nm (+9.62); 1H NMR (methanol-d4, 700 MHz) δ 7.34 (d, J = 8.5 Hz, H-2'/6'), 6.83 (d, J = 8.5 Hz, H-3'/5'), 5.92 (s, H-8), 4.97 (d, J = 11.4 Hz, H-2), 4.79 (d, J = 9.9 Hz, H-1''), 4.53 (d, J = 11.4 Hz, H-3), 4.14 (t, J = 9.1 Hz, H-2''), 3.85 (dd, J = 12.1, 2.2 Hz, H-6''a), 3.71 (dd, J = 12.1, 5.5 Hz, H-6''b), 3.45 (m, H-4''), 3.44 (m, H-3''), 3.37 (m, H-5''); 13C NMR (methanol-d4, 175 MHz) δ 198.3 (C-4), 169.3 (C-7), 164.2 (C-5), 163.8 (C-9), 159.0 (C-4'), 130.3 (C-1'), 129.3 (C-2'/6'), 116.2 (C-3'/5'), 106.5 (C-6), 101.3 (C-10), 96.9 (C-8), 84.9 (C-2), 82.5 (C-5''), 80.3 (C-3''), 75.2 (C-1''), 73.6 (C-3), 72.5 (C-2''), 71.8 (C-4''), 62.9 (C-6''); ESIMS m/z 451 [M + H]+, 449 [M - H]-; HRESIMS m/z 451.1235 [M + H]+ (calcd for C21H23O11, 451.1240).
2-5: Kaempferol 6-C-glucoside (Kaempferol 6-C β-D-glucopyranoside) (화합물 5)
상기 실시예 1의 방법으로 제조한 유근피 추출물의 1-46번까지의 분획물 중, 9-12번 분획물을 sillica column chromatography를 통해 MeOH과 H2O의 농도 gradient를 거쳐 MeOH 100%에 시작하여 5%의 농도 감소를 1L씩 진행하여 분리하였다. MeOH 40%용매를 사용하여 column chromatography 했을 때 나온 분획물을 HPLC(5 μm, 100 Α, 250 × 100 mm, UV = 280 nm, 2.0 mL/min, 용매: 25% MeOH)를 이용해 단일 compound(26min peak)로 분리하였다. 이후 MS를 통하여 분자량 448 M.W를 확인하였고, C-NMR을 통해 compound 5의 단일 물질 동정을 진행하였다. 동정결과로 도 6과 같이 Kaempferol 6-C-glucoside을 확인하였다. 상기 화합물 5는 본 명세서에서 화학식 5로 표현된다.
Kaempferol 6-C β-D-glucopyranoside (5): white amorphous powder; UV (MeOH) λmax (log ε) 198, 269, 368; 1H NMR (methanol-d4, 700 MHz) δ 8.08 (d, J = 8.5 Hz, H-2'/6'), 6.90 (d, J = 8.5 Hz, H-3'/5'), 6.45 (s, H-8), 4.91 (d, J = 9.9 Hz, H-1''), 4.19 (t, J = 9.9 Hz, H-2''), 3.88 (dd, J = 12.2, 2.2 Hz, H-6''a), 3.74 (dd, J = 12.2, 5.4 Hz, H-6''b), 3.48 (m, H-4''), 3.48 (m, H-3''), 3.42 (m, H-5''); 13C NMR (methanol-d4, 175 MHz) δ 177.5(C-4), 164.9 (C-7), 161.3 (C-5), 160.6 (C-4'), 157.6 (C-9), 148.0 (C-2), 137.2 (C-3), 130.2 (C-2'/6'), 123.6 (C-1'), 116.0 (C-3'/5'), 108.4 (C-6), 104.4 (C-10), 95.3 (C-8), 83.0 (C-5''), 80.6 (C-3''), 75.7 (C-1''), 72.9 (C-2''), 72.2 (C-4''), 62.9 (C-6''); ESIMS m/z 435 [M + H]+, 433 [M - H] -; HRESIMS m/z 435.1288 [M + H]+ (calcd for C20H23O10, 423.1291)
2.6: (2R,3S)-catechin-7-O-β-D-apiofuranoside (화합물 6)
상기 실시예 1의 방법으로 제조한 유근피 추출물의 1-46번까지의 분획물 중, 9-12번 분획물을 sillica column chromatography를 통해 MeOH과 H2O의 농도 gradient를 거쳐 MeOH 100%에 시작하여 5%의 농도 감소를 1L씩 진행하여 분리하였다. MeOH 25%용매를 사용하여 column chromatography 했을 때 나온 분획물을 HPLC(5 μm, 100 Α, 250 × 100 mm, UV = 280 nm, 2.0 mL/min, 용매: 25% MeOH)를 이용해 단일 compound (30min peak)로 분리하였다. 이후 LC/MS를 통하여 분자량 422 M.W를 확인하였고, CD, H-NMR, C-NMR, MS을 통해 compound 6의 단일 물질 동정을 진행하였다. 동정결과로 도 7과 같이catechin-7-O-b-D-apiofuranoside을 확인하였다. 상기 화합물 6은 본 명세서에서 화학식 6으로 표현된다.
(2R,3S)-catechin-7-O-b-D-apiofuranoside (6): white amorphous powder; [α]20D -90.7 (c 0.50, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 203, 280; ECD (1.9 × 10-3 M, MeOH) λmax (△ε) 276 nm (-1.16), 212 nm (-5.95); 1H NMR (methanol-d4, 700 MHz) δ 6.83 (d, J = 1.9 Hz, H-2'), 6.76 (d, J = 8.1 Hz, H-5'), 6.71 (dd, J = 8.1, 1.9 Hz, H-6'), 6.13 (d, J = 2.3 Hz, H-6), 6.07 (d, J = 2.3 Hz, H-8), 5.48 (d, J = 2.9 Hz, H-1''), 4.60 (d, J = 7.4 Hz, H-2), 4.13 (d, J = 2.9 Hz, H-2''), 4.08 (d, J = 9.7 Hz, H-4''a), 3.99 (m, H-3), 3.84 (d, J = 9.7 Hz, H-4''b), 3.62 (d, J = 11.4 Hz, H-5''a), 3.59 (d, J = 11.4 Hz, H-5''b), 2.85 (dd, J = 16.3, 5.5 Hz, H-3a), 2.54 (dd, J = 16.3, 8.0 Hz, H-3b); 13C NMR (methanol-d4, 175 MHz) δ 158.2 (C-7), 157.6 (C-5), 156.9 (C-9), 146.27 (C-4'), 146.25 (C-3'), 132.1 (C-1'), 120.0 (C-6'), 116.1 (C-5'), 115.2 (C-2'), 108.7 (C-1''), 103.2 (C-10), 97.3 (C-6), 96.9 (C-8), 82.9 (C-2), 80.3 (C-3''), 78.3 (C-2''), 75.4 (C-4''), 68.6 (C-3), 64.9 (C-5''), 28.4 (C-4); ESIMS m/z 423 [M + H]+, 421 [M - H]-; HRESIMS m/z 423.1285 [M + H]+ (calcd for C21H23O10, 423.1291).
2.7: (2R,3R)-Taxifolin-6-C-β-D-glucopyranoside (화합물 7)
상기 실시예 1의 방법으로 제조한 유근피 추출물의 1-46번까지의 분획물 중, 7-8번 분획물을 sillica column chromatography를 통해 MeOH과 H2O의 농도 gradient를 거쳐 MeOH 100%에 시작하여 5%의 농도 감소를 1L씩 진행하여 분리하였다. MeOH 15%용매를 사용하여 column chromatography 했을 때 나온 분획물을 HPLC(5 μm, 100 Α, 250 × 100 mm, UV = 280 nm, 2.0 mL/min, 용매: 20% MeOH)를 이용해 단일 compound(10.5min peak)로 분리하였다. 이후 LC/MS를 통하여 분자량 466 M.W를 확인하였고, CD, H-NMR, C-NMR, MS을 통해 compound 7의 단일 물질 동정을 진행하였다. 동정결과로 도 8과 같이 (2R,3R)-Taxifolin-6-C-β-D-glucopyranoside을 확인하였다. 상기 화합물 7은 본 명세서에서 화학식 7로 표현된다.
(2R,3R)-taxifolin-6-C-β-D-glucopyranoside (7): white amorphous powder; [α]20D +17.3 (c 0.50, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 200, 221, 290, 332; ECD (2.8 × 10-3 M, MeOH) λmax (△ε) 333 nm (+2.20), 297 nm (-6.98), 218 nm (+7.99); 1H NMR (methanol-d4, 700 MHz) δ 6.95 (d, J = 1.9 Hz, H-2'), 6.84 (d, J = 8.1 Hz, H-5'), 6.80 (dd, J = 8.1, 1.9 Hz, H-6'), 5.93 (s, H-8), 4.92 (d, J = 11.3 Hz, H-2), 4.80 (d, J = 9.9 Hz, H-1''), 4.50 (d, J = 11.3 Hz, H-3), 4.14 (t, J = 8.8 Hz, H-2''), 3.86 (dd, J = 12.1, 2.2 Hz, H-6''a), 3.71 (dd, J = 12.1, 5.5 Hz, H-6''b), 3.44 (m, H-4''), 3.43 (m, H-3''), 3.38 (m, H-5''); 13C NMR (methanol-d4, 175 MHz) δ 198.4 (C-4), 168.6 (C-7), 164.2 (C-5), 163.8 (C-9), 147.2 (C-4'), 146.3 (C-3'), 129.8 (C-1'), 120.4 (C-6'), 116.1 (C-5'), 115.8 (C-2'), 106.4 (C-6), 101.5 (C-10), 96.7 (C-8), 85.1 (C-2), 82.5 (C-5''), 80.2 (C-3''), 75.2 (C-1''), 73.6 (C-3), 72.6 (C-2''), 71.8 (C-4''), 62.9 (C-6''); ESIMS m/z 467 [M + H]+, 465 [M - H]-; HRESIMS m/z 467.1182 [M + H]+ (calcd for C21H23O12, 467.1190).
2.8: Ulmoside A [(2S,3S)-taxifolin-6-C-β-D-glucopyranoside] (화합물 8)
상기 실시예 1의 방법으로 제조한 유근피 추출물의 1-46번까지의 분획물 중, 7-8번 분획물을 sillica column chromatography를 통해 MeOH과 H2O의 농도 gradient를 거쳐 MeOH 100%에 시작하여 5%의 농도 감소를 1L씩 진행하여 분리하였다. MeOH 15%용매를 사용하여 column chromatography 했을 때 나온 분획물을 HPLC(5 μm, 100 Α, 250 × 100 mm, UV = 280 nm, 2.0 mL/min, 용매: 20% MeOH)를 이용해 단일 compound(11min peak)로 분리하였다. 이후 LC/MS를 통하여 분자량 466 M.W를 확인하였고, CD, H-NMR, C-NMR, MS을 통해 compound 8의 단일 물질 동정을 진행하였다. 동정결과로 도 9와 같이 Ulmoside A((2S,3S)-taxifolin-6-C-β-D-glucopyranoside)을 확인하였다. 상기 화합물 8은 본 명세서에서 화학식 8로 표현된다.
(2S,3S)-taxifolin-6-C-β-D-glucopyranoside (8): white amorphous powder; [α]20D -7.3 (c 0.50, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 200, 221, 290, 332; ECD (2.1 × 10-3 M, MeOH) λmax (△ε) 331 nm (-0.67), 297 nm (+4.65), 227 nm (-6.82), 206 nm (-6.23); 1H NMR (methanol-d4, 700 MHz) δ 6.95 (d, J = 1.9 Hz, H-2'), 6.84 (d, J = 8.1 Hz, H-5'), 6.80 (dd, J = 8.1, 1.9 Hz, H-6'), 5.95 (s, H-8), 4.93 (d, J = 11.3 Hz, H-2), 4.80 (d, J = 9.9 Hz, H-1''), 4.50 (d, J = 11.3 Hz, H-3), 4.13 (t, J = 8.8 Hz, H-2''), 3.86 (dd, J = 12.1, 2.2 Hz, H-6''a), 3.71 (dd, J = 12.1, 5.5 Hz, H-6''b), 3.44 (m, H-4''), 3.43 (m, H-3''), 3.38 (m, H-5''); 13C NMR (methanol-d4, 175 MHz) δ 198.7 (C-4), 167.9 (C-7), 164.1 (C-5), 163.8 (C-9), 147.2 (C-4'), 146.3 (C-3'), 129.7 (C-1'), 120.8 (C-6'), 116.1 (C-5'), 115.9 (C-2'), 106.3 (C-6), 101.7 (C-10), 96.5 (C-8), 85.0 (C-2), 82.5 (C-5''), 80.2 (C-3''), 75.2 (C-1''), 73.6 (C-3), 72.5 (C-2''), 71.8 (C-4''), 62.9 (C-6''); ESIMS m/z 467 [M + H]+, 465 [M - H]-; HRESIMS m/z 467.1196 [M + H]+ (calcd for C21H23O12, 467.1190).
2.9: (2R,3R)-Epicatechin-7-O-β-D-apiofuranoside (화합물 9)
상기 실시예 1의 방법으로 제조한 유근피 추출물의 1-46번까지의 분획물 중, 13-46번 분획물을 HPLC(5 μm, 100 Α, 250 × 100 mm, UV = 280 nm, 2.0 mL/min, 용매: 35% MeOH)를 이용해 단일 compound(11min peak)로 분리하였다. 이후 LC/MS를 통하여 분자량 422 M.W를 확인하였고, CD, H-NMR, C-NMR, MS을 통해 compound 9의 단일 물질 동정을 진행하였다. 동정결과로 도 10과 같이 (2R,3R)-epicatechin-7-O-beta-D-apiofuranoside을 확인하였다. 상기 화합물 9는 본 명세서에서 화학식 9로 표현된다.
(2R,3R)-epicatechin-7-O-beta-D-apiofuranoside (9): white amorphous powder; [α]20D -19.6 (c 0.52, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 203, 278; 1H NMR (methanol-d4, 700 MHz) δ 6.98 (d,J = 1.7 Hz, H-2'), 6.80 (dd, J = 8.1, 1.7 Hz, H-6'), 6.76 (d,J = 8.1 Hz, H-5'), 6.14 (d, J = 3.8 Hz, 1H, H6), 6.14 (d, J = 3.8 Hz, 1H, H8),4.82 (br s, H-2), 4.19 (m, H-3), 2.88 (dd, J = 16.8, 4.4 Hz, H-4a), 2.74 (dd, J = 16.8,2.6 Hz, H-4b), 2.88 (H-4a), 2.74 (H-4b), 2.86 (H-4a), 2.54 (H-4b), 5.49 (d, J = 2.9 Hz, H-1"), 4.14 (d, J = 2.9 Hz, H-2"), 4.09 (m, H-4"a), 3.85 (d, J = 9.7 Hz, H4"b), 3.62 (m, H-5"), 5.49 (d, J = 2.9 Hz, H-1") ; 13C NMR (methanol-d4, 175 MHz) δ 108.72 (C-1"),79.94 (C-3"), 78.27 (C-2"), 75.40 (C-4"), 64.96 (C-5"), 158.01 (C-7), 157.95 (C-9), 157.31 (C-5), 145.95 (C-4'), 145.83 (C3'),132.15 (C-1'), 119.36 (C-6'), 115.90 (C-5'), 115.28 (C-2'), 102.51 (C-10), 97.40 (C-6), 97.17 (C-8), 80.29 (C-2), 67.29 (C-3), 29.27 (C4) ; ESIMS m/z 423 [M + H]+, 421 [M - H]-.
실시예 3: 유근피 추출물의 파골세포 억제능 확인
유근피 추출물의 파골세포 억제 효능을 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 왕느릅나무 (Ulmus macrocarpa)의 껍질 건조원물 10g을 이용하여 유근피의 열수, 70% EtOH, 100% 주정의 추출물을 각각 제작하였다.
다음으로, 파골세포 억제 효능을 확인하기 위해, 파골세포 분화 및 TRAP 염색 기법을 이용하였다. 구체적으로, 5주령 ICR 마우스의 대퇴골과 경골로부터 골수 세포(bone marrow cell, BMC)를 분리했다. 상기 분리된 BMC를 10ng/mL의 M-CSF(R&D Systems) 및 10% 소 태아 혈청(Invitrogen Life Technologies)이 함유된 α-MEM을 이용하여 하루 동안 7 ℃, 5% CO2 세포 배양기로 배양했다. 배양 후 부유 세포를 제거하고 BMC의 분화를 유도하기 위해 1Х104개/웰의 세포를 M-CSF(30ng/mL) 및 RANKL(10ng/mL, R&D Systems)과 함께 3일 동안 배양하여 전골세포(preosteoclasts)로 분화시켰다. 상기 전골세포에 M-CSF (30 ng/mL)로 30분간 처리하여 자극을 준 후, 상기에서 제작한 유근피 추출물(열수, 70% EtOH, 100% 주정) 또는 비히클을 30분동안 처리하였다. 이 후, RANKL(10ng/mL)로 배양하여 성숙한 TRAP+-MNC(tartrate-resistant acid phosphatase-positive multinucleated cell)로 분화시켰다. 1일 후 상기 세포를 3.7% 포름알데히드로 5분간 고정하고, 0.1% Triton X-100으로 5분간 투과화한 후, 백혈구산 포스파타제 키트 387-A를 사용하여 염색하여 분화 정도를 확인하였다.
그 결과, 상기 유근피의 열수, 70% EtOH, 100% 주정 추출물의 경우 모두 파골세포 분화 억제능이 우수한 것을 확인하였으며, 특히 열수 추출물의 효능이 우수한 것을 확인하였다 (도 11).
실시예 4: 유근피 추출물로부터 분리된 단일 화합물의 파골세포 억제능 확인
4.1: Tartrate-Resistant Acid Phosphatase (TRAP) 염색법
유근피 추출물로부터 분리된 화합물의 파골세포 억제 효능을 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2에서 분리 동정한 유근피 추출물 유래 단일 화합물을 상기 실시예 3에 기재된 방법과 동일하게 농도별로 M-CSF (30 ng/mL) 및 RANKL (10 ng/mL; R&D Systems)에 의해 유도된 파골세포(mouse macrophage)에 처리하여, 파골세포의 분화 억제능을 측정하였다.
그 결과, 상기 단일 화합물 모두 파골세포 분화 억제 효능을 나타내는 것을 확인하였으며, 특히 화합물 2, 3, 7, 8 및 9의 효능이 우수한 것을 확인하였다 (도 12).
4.2: 파골세포 분화 마커 발현수준 분석
유근피 추출물로부터 분리된 화합물의 파골세포 억제 효능을 분자생물학적 기법으로 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 4.1에서 우수한 효능을 나타내는 화합물 중 대표예로서 화합물 8를 선택하였으며, 전사 인자 NFATc1 및 파골세포-특이적 인자/유전자(OSCAR, DC-STAMP 및 CTSK)에 대한 화합물 8의 억제 효과를 실시간 PCR (real-time PCR) 분석을 통해 확인하고자 하였다. NFATc1는 파골세포 형성의 마스터 조절자(regulator), OSCAR(osteoclast-associated receptor)는 중요한 골면역학적 매개체(osteoimmunological mediator), DC-STAMP (dendritic cell-specific transmembrane protein) 및 CTSK (cathepsin K)는 각각 융합 및 골 흡수 활성에 관여하는 것으로 알려져 있다.
먼저, BMC의 분화를 유도하기 위해 1Х104개/웰의 세포를 M-CSF(30ng/mL) 및 RANKL(10ng/mL, R&D Systems)과 함께 화합물 8의 존재 하에 1일, 2일 또는 3일 동안 배양하여 파골세포로 분화시켰다. TRIzol 시약(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)을 사용하여 상기 분화된 세포로부터 총 RNA를 분리하였고, M-MLV cDNA 합성 키트(Enzynomics, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad)에서 TOPreal qPCR 2x PreMIX(Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 PCR을 수행했습니다. 유전자의 mRNA 수준은 2-△△CT 방법을 사용하여 결정되었다. GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 내부 표준물질로 사용하였으며, 상기에서 사용한 프라이머 정보는 하기 표 1에 기재하였다.
유전자 프라이머 서열 (5'- 3') 서열번호
NFATc1 (정방향) GGGTCAGTGTGACCGAAGAT 1
(역방향) GGAAGTCAGAAGTGGGTGGA 2
CTSK (정방향) GGCCAACTCAAGAAGAAAAC 3
(역방향) GTGCTTGCTTCCCTTCTGG 4
OSCAR (정방향) CTGCTGGTAACGGATCAGCTC 5
(역방향) CCAAGGAGCCAGAACCTT 6
DC-STAMP (정방향) CCAAGGAGTCGTCCATGATT 7
(역방향) GGCTGCTTTGATCGTTTCTC 8
GAPDH (정방향) AACTTTGGCATTGTGGAAGG 9
(역방향) ACACATTGGGGGTAGGAACA 10
그 결과, RANKL 처리 3일 동안 대조군에서 NFATc1의 mRNA 발현 수준이 활성화되었으며, 화합물 8 처리군의 경우에는 NFATc1의 발현 수준이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, OSCAR, DC-STAMP 및 CTSK의 mRNA 발현 수준 또한 화합물 8 처리군에서 유의하게 감소되는 것을 확인하였다 (도 13).
상기 결과를 토대로, 유근피 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물의 경우에는 NFATc1 발현의 하향 조절을 통해 파골세포 분화를 억제하는 것임을 알 수 있다.
실시예 5: 유근피 추출물 및 이로부터 분리된 단일 화합물의 세포 독성 평가
상기 실시예 3 및 4에서 실험을 수행한 유근피 추출물 및 이로부터 분리된 단일 화합물의 세포 독성을 평가하기 위해, 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 어세이를 수행하였다.
구체적으로, 세포 생존률은 상기의 유근피 추출물 및 이로부터 분리된 단일 화합물을 처리하고 72시간 후 WST-8 [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3- (4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt]의 formazan 변환으로 통해 평가하였다. 이를 위해, RAW 264.7 세포를 DMEM 배지 1 mL 당 5Х105개로 96-웰 플레이트에 100 μL씩 분주하여 24시간 동안 배양하여 세포들이 부착되도록 하였다. 다음으로, 1ug/mL의 LPS가 첨가된 180 μL와 다양한 농도의 유근피 추출물 또는 단일 화합물을 처리했다. 24시간 배양 후, MTT를 최종 농도가 0.5 mg/mL가 되게 첨가한 후, 4시간 동안 배양하여 보라색으로 생성된 formazan을 dimethylsulfoxide (DMSO) 100 μL 첨가하여 용해시킨 후, 마이크로플레이트 판독기(Thermo, Varioskan Flash, UK)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 LPS를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 백분율(%)로 나타내었다.
그 결과, 모든 조건의 추출물에서 20ug/mL에서까지의 독성은 나타내지 않았다 (도 14). 또한, 상기 9종의 단일 화합물의 경우 0~100uM에서 모두 독성이 거의 발견되지 않았다 (도 15).
상기 결과를 토대로, 유근피 추출물 및 이로부터 분리된 단일 화합물이 식품소재로써의 충분한 안정성이 보장됨을 확인하였다.
실시예 6: 유근피 추출물로부터 분리된 단일 화합물의 항염증 효능 평가
상기 실시예 2에서 분리 동정한 유근피 추출물 유래 단일 화합물의 항염증 효능을 평가하기 위해, NO(Nitric oxide) 어세이를 수행하였다.
구체적으로, NO 생성 저해작용은 iNtRON사의 nitric oxide plus detection kit로 측정하였다. 즉, Griess 시약 (1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethylendiaminein 25% phosphoric acid)은 NO를 산화시켜 NO2로 변화시키며 생성된 NO2는 540 nm에서 흡광도를 측정하며, NaNO2를 이용하여 검량선을 구하였다. 먼저, RAW 264.7 세포를 DMEM 배지 1 mL 당 5Х105개로 96-웰 플레이트에 100 μL씩 분주하여 24시간 동안 배양하여 세포들이 부착되도록 하였다. 다음으로, 1ug/mL의 LPS가 첨가된 180 μL와 다양한 농도의 유근피 유래 단일 화합물 20 μL를 첨가하여 24시간 배양 후, 배양액에 생성되어 있는 NO의 양을 Griess 시약을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 상기 9종의 유근피 유래 단일물질에서 NO생성 억제능을 확인하였으며, 100uM에서는 80%이상의 억제능을 확인하였다 (도 16).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation Pyeongchang R&BD Support Center <120> A health functional food composition for preventing and improving bone associated diseases containing an ulmus extracts or an effective single compound isolated therefrom <130> PN143204KR <150> KR 10-2021-0185379 <151> 2021-12-22 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc1_F <400> 1 gggtcagtgt gaccgaagat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc1_R <400> 2 ggaagtcaga agtgggtgga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTSK_F <400> 3 ggccaactca agaagaaaac 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTSK_R <400> 4 gtgcttgctt cccttctgg 19 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSCAR_F <400> 5 ctgctggtaa cggatcagct c 21 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OSCAR_R <400> 6 ccaaggagcc agaacctt 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DC-STAMP_F <400> 7 ccaaggagtc gtccatgatt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DC-STAMP_R <400> 8 ggctgctttg atcgtttctc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_F <400> 9 aactttggca ttgtggaagg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_R <400> 10 acacattggg ggtaggaaca 20

Claims (14)

  1. 유근피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 파골세포 과발현 또는 과분화로 인한 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 유근피 추출물 또는 이의 분획물은 왕느릅나무(Ulmus macrocarpa)로부터 유래된 것이며,
    상기 파골세포 과발현 또는 과분화로 인한 골 관련 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골결손, 골위축(bone atrophy), 골괴사, 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 섬유성 골염, 페이젯병(Paget's disease), 칼슘 조절 이상의 대사성 골질환, 암세포의 골전이나 인공관절의 피로잔해(wear debris)에 의해 초래되는 뼈의 용해, 암(cancer)에 의한 골재흡수 질병, 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 골절(fracture), 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis), 골형성 부전증(osteogenesis imperfecta), 구루병, 내분비 질환 또는 약물에 의한 이차성 골소실, 치주염(periodontitis)에 의한 치조골 결손 및 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 약학 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 뷰탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 및 디클로로메탄로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출한 것인, 약학 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 감압고온 추출, 열탕 추출, 환류 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 상온 추출, 초음파 추출, 증기 추출 및 분획 추출로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 추출한 것인, 약학 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물 또는 이의 분획물은 하기 화학식 1 내지 9로 표현되는 화합물들로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 또는 이의 용매화물을 포함하는 것인, 약학 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112022059377931-pat00016

    [화학식 2]
    Figure 112022059377931-pat00017

    [화학식 3]
    Figure 112022059377931-pat00018

    [화학식 4]
    Figure 112022059377931-pat00019

    [화학식 5]
    Figure 112022059377931-pat00020

    [화학식 6]
    Figure 112022059377931-pat00021

    [화학식 7]
    Figure 112022059377931-pat00022

    [화학식 8]
    Figure 112022059377931-pat00023

    [화학식 9]
    Figure 112022059377931-pat00024
    .
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물 또는 이의 분획물은 파골세포 분화 억제 활성을 갖는 것인, 약학 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물 또는 이의 분획물은 항염증 활성을 갖는 것인, 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 유근피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 파골세포 과발현 또는 과분화로 인한 골 관련 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
    상기 유근피 추출물 또는 이의 분획물은 왕느릅나무(Ulmus macrocarpa)로부터 유래된 것이며,
    상기 파골세포 과발현 또는 과분화로 인한 골 관련 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골결손, 골위축(bone atrophy), 골괴사, 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 섬유성 골염, 페이젯병(Paget's disease), 칼슘 조절 이상의 대사성 골질환, 암세포의 골전이나 인공관절의 피로잔해(wear debris)에 의해 초래되는 뼈의 용해, 암(cancer)에 의한 골재흡수 질병, 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 골절(fracture), 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis), 골형성 부전증(osteogenesis imperfecta), 구루병, 내분비 질환 또는 약물에 의한 이차성 골소실, 치주염(periodontitis)에 의한 치조골 결손 및 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 식품 조성물.
  9. 유근피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 파골세포 과발현 또는 과분화로 인한 골 관련 질환 예방 또는 개선용 사료 조성물로서,
    상기 유근피 추출물 또는 이의 분획물은 왕느릅나무(Ulmus macrocarpa)로부터 유래된 것이며,
    상기 파골세포 과발현 또는 과분화로 인한 골 관련 질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골결손, 골위축(bone atrophy), 골괴사, 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 섬유성 골염, 페이젯병(Paget's disease), 칼슘 조절 이상의 대사성 골질환, 암세포의 골전이나 인공관절의 피로잔해(wear debris)에 의해 초래되는 뼈의 용해, 암(cancer)에 의한 골재흡수 질병, 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 골절(fracture), 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis), 골형성 부전증(osteogenesis imperfecta), 구루병, 내분비 질환 또는 약물에 의한 이차성 골소실, 치주염(periodontitis)에 의한 치조골 결손 및 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 사료 조성물.
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KR102334305B1 (ko) 2018-12-24 2021-12-03 건국대학교 글로컬산학협력단 블루베리 추출물을 함유하는 골질환 예방 또는 치료용 조성물

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Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2009,19(16), 4684-4687 *
Journal of Acupuncture Research, 2005, 22(3), 13-22* *

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