KR102210500B1 - 감초 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 감초 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 감초 열수 추출물의 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 감초 추출물의 분획물은 근아세포를 증식시키고 근육세포로의 분화를 촉진시키는 데에 우수한 효과를 가지므로, 상기 조성물을 이용하여 다양한 근육질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명에 따른 감초 추출물의 분획물은 근아세포를 증식시키고 근육세포로의 분화를 촉진시키는 데에 우수한 효과를 가지므로, 상기 조성물을 이용하여 다양한 근육질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
Description
본 발명은 감초 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 감초 열수 추출물의 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
근육(muscle)은 인체를 구성하는 중요한 요소로, 중배엽의 줄기세포에서 발현되는 조직이다. 근육은 우리 몸의 40% 정도를 담당하며, 뼈와 힘줄에 지지해서 위치하고 근섬유 다발들로 이루어져 서로 움직이고 세포의 크기를 변하도록 하여 수축을 유발한다. 근육은 골격근육, 심장근육, 내장근육으로 구분되는데, 각각의 위치에서 힘을 만들어내고 움직임을 유발하며, 뼈, 관절, 내장 등의 신체기관을 보호하는 역할도 한다. 또한, 근육은 재생 능력을 가지고 있어, 근육이 손상을 받게 되면 위성세포와 그 주변 환경에 의해서 변성된 후 다시 원래의 수축 이완 능력을 가진 근육으로 재생될 수 있다.
근육질환은 선천적인 유전이나 환경적인 원인에 의해서 발생되며, 최근 고령화 사회 및 수명 연장의 흐름에 따라 근 감소와 관련된 질환이 증가하고 있다. 사람의 근육은 40세 이후부터 매년 1% 이상씩 감소하고, 80세가 되면 최대 근육량의 50% 수준이 감소됨으로써, 노년의 근육 감소는 전반적인 신체기능을 떨어뜨리는 가장 중요한 원인으로 인식되고 있다. 이러한 근육질환은 과거에 비해 전 세계적으로 증가 추세에 있다.
하지만, 근육질환은 그 원인이 다른 질환에 비해 다양하기 때문에 정확한 진단이 쉽지 않고, 그 종류에 따라 증상 및 질환의 강도도 다양하며, 희귀 질환의 형태로 정확한 메커니즘이 밝혀지지 못한 경우가 많다. 근육질환은 그 증상이 급격하게 진행되고, 근육질환 환자들은 상기 질환이 진행됨에 따라 혼자서는 일상적인 생활이 어려울 정도로 고통 받고 있으나, 근본적인 관련 질환에 대한 치료제들은 거의 없는 실정이다.
본 발명의 목적은 근육질환 치료에 우수한 효과를 가진 천연물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감초 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 감초 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 감초 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근아세포의 근육세포로의 분화 촉진용 시약 조성물, 사람을 제외한 동물에 감초 추출물의 분획물을 처리하는 단계를 포함하는 근아세포의 근육세포로의 분화 촉진 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 감초 추출물의 분획물은 근아세포를 증식시키고 근관을 형성시키며, 근육세포로의 분화를 촉진하는 데에 우수한 효과를 가진다. 이에 본 발명에 따른 감초 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물로 다양한 근육질환을 효과적으로 예방, 개선, 또는 치료할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 천연물을 이용함으로써 부작용이 적고, 안전한 장점을 가진다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 감초 추출물 또는 이의 분획물 제조방법을 개략적으로 도식화한 것이다.
도 2는 감초 열수 추출물 처리에 따른 근아세포(C2C12)의 증식 및 분화 관찰 결과로, a는 감초 열수 추출물의 농도에 따른 세포 증식을 MTT 법으로 확인한 이미지 및 그래프이고, b는 상기 세포 표면에 스크래치(scratch)를 가한 후 감초 열수 추출물의 처리에 따른 변화를 나타낸 이미지이며, c는 근아세포의 근육세포로의 분화 여부를 확인할 수 있는 융해 지수(fusion index), 실시간 PCR(real-time PCR), 웨스턴 블롯 및 면역 염색법 결과이다.
도 3은 감초 열수 추출물 섭취에 따른 마우스의 근육을 분석한 결과로, a는 마우스의 체중 및 근육 감소율을 나타낸 표이고, b는 웨스턴 블롯 결과이며, c는 웨스턴 블롯을 통해 나온 밴드의 강도를 특정하여 수치화한 그래프이고, d는 면역 염색법을 통한 단백질 발현 변화를 나타낸 이미지이다.
도 4는 감초 추출물의 분획물 처리에 따른 근아세포 증식 여부 결과로, a는 근아세포의 MTT 분석 이미지 및 그래프이고, b는 상기 세포 표면에 스크래치를 가한 후 상기 분획물 처리에 따른 변화를 나타낸 이미지이다.
도 5는 감초 추출물의 분획물 처리에 따른 근아세포의 분화 관찰 결과로, a는 근관 형성 이미지 및 융해 지수를 나타낸 그래프이고, b 및 c는 상기 분획물 처리에 따른 근육 분화/근육 위축 유전자 및 단백질의 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 에틸 아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 최종 단일 물질들의 화학구조를 나타낸다.
도 7은 최종 단일 물질들의 처리에 따른 근아세포 증식 및 분화 관찰 결과로, a는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 최종 물질 10종의 처리에 따른 세포 증식 변화를 나타낸 그래프, b는 근관 형성 이미지 및 융해 지수를 나타낸 그래프이며, c는 구매한 최종 물질 3종의 처리에 따른 세포 증식 변화를 나타낸 그래프, d는 근관 형성 이미지 및 융해 지수를 나타낸 그래프이다.
도 8은 구매한 최종 물질 중 리퀴리티게닌(Liquiritigenin)을 마우스에 섭취시킨 후 근육의 변화를 분석한 결과로, a는 체중, 근육 무게 및 근육 감소율을 나타낸 그래프이고, b는 H&E 염색 결과를 나타내며, c는 근육의 직경(㎛)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 감초 열수 추출물 처리에 따른 근아세포(C2C12)의 증식 및 분화 관찰 결과로, a는 감초 열수 추출물의 농도에 따른 세포 증식을 MTT 법으로 확인한 이미지 및 그래프이고, b는 상기 세포 표면에 스크래치(scratch)를 가한 후 감초 열수 추출물의 처리에 따른 변화를 나타낸 이미지이며, c는 근아세포의 근육세포로의 분화 여부를 확인할 수 있는 융해 지수(fusion index), 실시간 PCR(real-time PCR), 웨스턴 블롯 및 면역 염색법 결과이다.
도 3은 감초 열수 추출물 섭취에 따른 마우스의 근육을 분석한 결과로, a는 마우스의 체중 및 근육 감소율을 나타낸 표이고, b는 웨스턴 블롯 결과이며, c는 웨스턴 블롯을 통해 나온 밴드의 강도를 특정하여 수치화한 그래프이고, d는 면역 염색법을 통한 단백질 발현 변화를 나타낸 이미지이다.
도 4는 감초 추출물의 분획물 처리에 따른 근아세포 증식 여부 결과로, a는 근아세포의 MTT 분석 이미지 및 그래프이고, b는 상기 세포 표면에 스크래치를 가한 후 상기 분획물 처리에 따른 변화를 나타낸 이미지이다.
도 5는 감초 추출물의 분획물 처리에 따른 근아세포의 분화 관찰 결과로, a는 근관 형성 이미지 및 융해 지수를 나타낸 그래프이고, b 및 c는 상기 분획물 처리에 따른 근육 분화/근육 위축 유전자 및 단백질의 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 에틸 아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 최종 단일 물질들의 화학구조를 나타낸다.
도 7은 최종 단일 물질들의 처리에 따른 근아세포 증식 및 분화 관찰 결과로, a는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 최종 물질 10종의 처리에 따른 세포 증식 변화를 나타낸 그래프, b는 근관 형성 이미지 및 융해 지수를 나타낸 그래프이며, c는 구매한 최종 물질 3종의 처리에 따른 세포 증식 변화를 나타낸 그래프, d는 근관 형성 이미지 및 융해 지수를 나타낸 그래프이다.
도 8은 구매한 최종 물질 중 리퀴리티게닌(Liquiritigenin)을 마우스에 섭취시킨 후 근육의 변화를 분석한 결과로, a는 체중, 근육 무게 및 근육 감소율을 나타낸 그래프이고, b는 H&E 염색 결과를 나타내며, c는 근육의 직경(㎛)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 감초 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer)는 쌍떡잎식물 장미목 콩과에 속하는 약용 식물로, 자연에서 채취 또는 재배하여 수득한 것일 수 있고, 상업적으로 판매되는 것을 구입한 것일 수 있다.
상기 감초는 뿌리 또는 뿌리줄기를 그대로 사용하거나, 또는 주피를 제거하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 감초의 건조 뿌리를 사용할 수 있다.
본 명세서에서, "추출물"이란, 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고 천연물의 성분을 뽑아냄으로써 얻어진 물질을 의미하는 것으로, 천연물의 성분을 뽑아내어 얻어진 물질을 추출 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질을 모두 포함할 수 있다.
상기 감초 추출물은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출될 수 있고, 예를 들어, 열수 추출, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등이 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 감초 추출물은 물, C1 내지 C4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출된 것일 수 있고, 바람직하게는 상기 감초를 감초 중량 대비 15 내지 25배, 보다 바람직하게는 20배의 증류수에 넣어, 110 내지 120℃, 보다 바람직하게는 115℃에서, 2 내지 4시간, 보다 바람직하게는 3시간 가열하여 추출한 열수 추출물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 감초 추출물의 분획물은 상기 감초 추출물, 바람직하게는 상기 감초의 열수 추출물을 디클로로메탄(dichloromethane), 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 및 n-부탄올(n-buthanol)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 용매로 분획한 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 에틸 아세테이트로 분획한, 감초 열수 추출물의 에틸 아세테이트 분획물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 감초의 열수 추출물을 증류수에 현탁시킨 후, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, n-부탄올을 차례로 분배시키고, 각각의 용액을 증발시켜 디클로로메탄 분획물, 에틸 아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물을 수득하였다.
본 발명에 있어서, 상기 감초 추출물의 분획물은 근아세포를 증식시키고 근관을 형성시키며, 근아세포의 근육세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 또한, 상기 감초 추출물의 분획물은 근육 단백질 분해와 근육 위축을 억제시킬 수 있다.
상기 감초 추출물의 분획물은 근육 분화 또는 근육 재생 관련 인자인 MYOG, MYOD, MYL2 및 Pax7로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현을 증가시킬 수 있고, 근육 단백질 분해 또는 근육 위축 관련 인자인 MSTN, MuRF1, Atrogin 1 및 니트로티로신(Nitrotyrosine)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다.
MYOD는 근육 특이 유전자의 발현을 개시하게 하고 근육위성세포(muscle satellite cells)가 근아세포(myoblast)로 분화하는 것을 유도한다. MYOD의 활성에 의한 미오게닌(myogenin, MYOG) 발현의 유도는 근아세포의 결합(fusion)에 가장 중요한 요소로, 근관세포(myotube)의 형성에 관여하며, 이와 같은 과정을 통해 형성된 근섬유는 다발을 이루어 최종적으로 근육을 형성하게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 근육질환은 근 기능 저하, 근육 소모 또는 근육 퇴화 등으로 인한 근육질환으로, 예를 들어, 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육감소증(sarcopenia), 근육병증(myopathy), 근무력증(myasthenia) 및 근육 손상(muscular injury)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "예방"이란, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물의 투여에 의해 근육질환, 또는 이의 적어도 하나 이상의 증상의 발생을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 재발을 예방하거나 방지하기 위해 상기 질병에 차도가 있는 대상의 치료를 포함한다.
본 명세서에서, "치료"란, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 근육질환, 또는 이의 적어도 하나 이상의 증상을 완화, 감소, 또는 소멸시키는 등 그 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서, "약학 조성물"이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물로, 본 발명의 목적상 근육질환, 또는 이의 적어도 하나 이상의 증상을 예방하거나 또는 치료하기 위해 투여되는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 감초 추출물의 분획물의 활성 및 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 보다 상세하게는 통상의 방법에 따라 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 비경구형 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 겔제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 치료 효능의 증진을 위해 칼슘이나 비타민 등을 더 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.
상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 근육질환이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여할 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 근육질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물 치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명은 감초 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 감초 추출물의 분획물은 감초 열수 추출물을 에틸 아세테이트로 분획한 것일 수 있다.
상기 감초 추출물의 분획물은 근아세포를 증식시키고 근관을 형성시키며, 근아세포의 근육세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 또한, 상기 감초 추출물의 분획물은 근육 단백질 분해와 근육 위축을 억제하므로, 근육질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물로 활용할 수 있다.
이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.
본 명세서에서, "개선"이란, 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물의 섭취에 의해 근육질환, 또는 이의 적어도 하나 이상의 증상을 완화, 감소, 또는 소멸시키는 등 그 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서, "건강기능식품"이란, 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 포함하며, 영양 공급 외에도 본 발명의 목적상 근육질환의 예방, 생체 방어, 면역, 회복 등의 생체 조절 기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료 효과가 높은 식품을 의미한다.
본 발명에 따른 건강기능식품은 근육질환의 예방 또는 개선 목적으로, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가될 수 있다.
상기 건강기능식품은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 음료 및 각종 드링크, 과실 및 그의 가공식품(과일통조림, 잼 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(햄, 베이컨 등), 빵류 및 면류, 쿠키 및 스낵류, 유제품(버터, 치즈 등) 등이 가능하며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함할 수 있다. 또한, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 식품학적으로 허용 가능한 식품 첨가제(식품 첨가물) 및 적절한 기타 보조 성분을 더 포함하여 제조될 수 있다. 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정할 수 있다. 상기 '식품첨가물공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
상기 기타 보조 성분은 예를 들어, 향미제, 천연 탄수화물, 감미제, 비타민, 전해질, 착색제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있으며, 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품에 함유된 상기 감초 추출물의 분획물의 유효 용량은 근육질환 예방 또는 개선 등 그 사용 목적에 따라 적절하게 조절될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 식품을 원료로 하여 일반 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 근육질환 예방 또는 개선을 위한 보조제로 섭취될 수 있다.
본 발명은 감초 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근아세포 증식용 시약 조성물을 제공한다.
본 발명은 감초 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근아세포의 근육세포로의 분화 촉진용 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 사람을 제외한 동물에 감초 추출물의 분획물을 처리하는 단계를 포함하는 근아세포 증식 방법을 제공한다.
본 발명은 사람을 제외한 동물에 감초 추출물의 분획물을 처리하는 단계를 포함하는 근아세포의 근육세포로의 분화 촉진 방법을 제공한다.
이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 감초 추출물 및 분획물 제조
1. 재료 준비
감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer)의 건조 뿌리는 광명 약초점에서 말린 허브로 구입했다. 모든 식물에 대한 표본은 한국 한의학 연구소의 KM 응용 센터 약초 은행에 보관되어 있다.
2. 감초 열수 추출물의 제조
감초 열수 추출물을 제조하기 위해 건조 감초 조각(50.0g)을 1,000mL 증류수에 넣어 115℃에서 3시간 가열하여 추출하였다. 추출 후 표준시험체(standard testing sieves, 150㎛)를 이용하여 여과하고 동결건조 하였다. 동결건조 추출물 가루는 3차 증류수에 녹인 후 4℃에 24시간 동안 방치하였다. 24시간 후 5000g에서 5분간 원심분리 후 상등액을 새로운 튜브에 옮긴 후 -20℃에 보관하였다.
3. 감초 열수 추출물의 분획물 제조
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 감초 추출물 또는 이의 분획물 제조방법을 개략적으로 도식화한 것이다.
도 1과 같이, 상기 실시예 1의 2번 단계에서 제조된 감초 열수 추출물(10.0g)을 증류수에 현탁시킨 후, 디클로로메탄(dichloromethane, DCM, CH2Cl2), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate, EtOAc 또는 EA), n-부탄올(N-Butanol, BuOH)로 분배시켰다. 이어서, 각각의 용액을 45℃에서 감압 하에 증발시켜 디클로로메탄(99.6mg), 에틸 아세테이트(333.0mg), n-부탄올(1037.0mg) 분획물을 각각 수득 하였다.
4. 최종 물질 추출 및 분리
4-1. 추출 및 분리 방법
1H 및 13C NMR 스펙트럼은 내부 표준으로서 테트라메틸실레인(tetramethylsilane; TMS)이 사용된 600MHz에서 BRUKER AVANCE III HD 600을 사용하여 기록되었다. 중압 액체 크로마토그래피(Medium-pressure liquid chromatography; MPLC)는 SNAP KP-SIL 및 SNAP Ultra C18 카트리지가 있는 Isolera One(Biotage, Uppsala, Sweden)을 사용하여 수행되었다. 칼럼 크로마토그래피(Column chromatography)는 실리카겔(Kieselgel 60, 70-230 및 230-400 메쉬(mesh), Merck, Darmstadt, Germany), YMC C18 수지 및 얇은 층 크로마토그래피(thin-layer chromatography; TLC)를 사용하여 실리카겔 60 F254 및 RP-18 F254S 플레이트(0.25 mm, Merck, Darmstadt, Germany)로 세척한 뒤, UV 광(254 및 365 nm)으로 시각화하고 10% 황산(H2SO4)으로 염색하였다.
4-2. 최종 물질 추출 및 확인
도 1과 같은 순서로, 먼저 감초(Glycyrrhiza uralensis, 4.2kg)의 건조 뿌리를 100% 메탄올(MeOH)로 3회 환류 추출하였다(각각 15L). 메탄올 추출물(957.0g)을 증류수에 현탁시킨 후, 디클로로메탄(DCM)으로 분배시켰다. 이의 물 분획으로부터 디클로로메탄 용액을 제거한 후, 에틸 아세테이트(EtOAc)로 분배시킨 다음, 에틸 아세테이트 용액을 45℃에서 감압 하에 증발시켜 에틸 아세테이트 분획물(137.0g)을 수득하였다.
상기 에틸 아세테이트 분획물을 헥산-에틸아세테이트-메탄올(hexane-EtOAc-MeOH, 5.5:1:0.1, 3:1:0.1, v/v), 클로로포름-아세톤-메탄올(CHCl3-Acetone-MeOH, 3:1:0.1, v/v), 클로로포름-메탄올-물(CHCl3-MeOH-H2O, 5:1:0.1, 3:1:0.1, v/v)과 함께 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography) 진행을 통해 5개의 분획(Fr. E1-E5)과 반 결정질 고체(Semi-crystalline solid, Fr. EC)를 확보하였다.
분획물 E2(4.9g)는 SNAP Ultra C18 카트리지를 사용하여 MPLC에 의해 메탄올-물(MeOH-Water, 34-75% MeOH, v/v)의 기울기로 분리하여 화합물 1(23.9mg)을 포함한 16 분획(Fr. E2A-E2P)을 확보하였다.
- 화합물 1 (4-하이드록시벤조산, 4-hydroxybenzoic acid ) : 흰색 분말(White powder), C7H6O3; 1H NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 7.67 (2H, d, J = 7.2 Hz, H-2, 6), 6.61 (2H, d, J = 7.2 Hz, H-3, 5). 13C NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 170.1 (C=O), 163.3 (C-4), 132.9 (C-2, 6), 122.7 (C-1), 116.0 (C-3, 5).
분획물 E2C(243.5mg)는 헥산-에틸아세테이트-메탄올(hexane-EtOAc-MeOH, 3:1:0.1, v/v) 용제가 있는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 분리하여 화합물 2(108.5mg)를 확보하였다.
- 화합물 2 (리퀴리티게닌, Liquiritigenin ): 무색 바늘 결정체(Colorless needle crystals), C15H12O4; 1H NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 7.68 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5), 7.28 (2H, d, J = 7.6 Hz, H-2´, 6´), 6.77 (2H, d, J = 7.8 Hz, H-3´, 5´), 6.45 (1H, d, J = 6.5 Hz, H-6), 6.31 (1H, s, H-8), 5.32 (1H, d, J = 12.6 Hz, H-2), 3.00 (1H, t, J = 15.0 Hz, H-3a), 2.64 (1H, d, J = 16.8 Hz, H-3b). 13C NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 192.1 (C=O), 165.3 (C-7), 164.1 (C-9), 157.5 (C-4´), 129.9 (C-1´), 128.4 (C-5), 127.6 (C-2´, 6´), 114.9 (C-3´, 5´), 113.5 (C-10), 110.3 (C-6), 102.4 (C-8), 79.6 (C-2), 43.5 (C-3).
분획물 E2D(420.3mg)는 SNAP KP-SIL 카트리지를 사용하여 MPLC에 의해 헥산-에틸아세테이트-메탄올(hexane-EtOAc-MeOH, 17-25% EtOAc-MeOH, 1:0.1, v/v)의 기울기로 격리하여 화합물 3(51.7mg)과 화합물 4(15.4 mg)로 확보되었다.
- 화합물 3 ((R)-(-)-베스티톨, (R)-(-)-Vestitol ): 무색 결정체(Colorless crystals), C16H16O4; 1H NMR (600 MHz, Acetone-d6) δ 7.05 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-6´), 6.89 (1H, d, J = 7.1 Hz, H-5), 6.50 (1H, s, H-3´), 6.42 (1H, d, J = 6.1 Hz, H-5´), 6.36 (1H, d, J = 5.7 Hz, H-6), 6.28 (1H, s, H-8), 4.23 (1H, d, J = 6.7 Hz, H-2), 3.98 (1H, t, J = 9.5 Hz, H-2), 3.72 (3H, s, -OCH3), 3.47 (1H, m, H-3), 2.99 (1H, m, H-4), 2.82 (1H, d, J = 14.8 Hz, H-4). 13C NMR (600 MHz, Acetone-d6) δ 160.3 (C-4´), 157.4 (C-7), 156.6 (C-2´), 156.1 (C-9), 131.0 (C-5), 128.7 (C-6´), 120.9 (C-1´), 114.3 (C-10), 108.7 (C-6), 105.6 (C-5´), 103.6 (C-8), 102.4 (C-3´), 70.4 (C-2), 55.3 (-OCH3), 32.6 (C-3), 31.0 (C-4).
- 화합물 4 (이소리퀴리티게닌, Isoliquiritigenin ): 황색 결정체(Yellow crystals), C15H12O4; 1H NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 7.90 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-6´), 7.73 (1H, d, J = 15.2 Hz, H-β), 7.56 (3H, s, H-2, 6, α), 6.79 (2H, d, J = 8.3 Hz, H-3, 5), 6.36 (1H, dd, J = 8.6, 1.6 Hz, H-5´), 6.24 (1H, s, H-3´). 13C NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 193.5 (C=O), 167.5 (C-4´), 166.3 (C-2´), 161.5 (C-4), 145.6 (C-β), 133.3 (C-6´), 131.8 (C-2, 6), 127.8 (C-1), 118.2 (C-α), 116.9 (C-3, 5), 114.7 (C-1´), 109.1 (C-5´), 103.8 (C- 3´).
분획물 E2F(95.1mg)는 SNAP KP-SIL 카트리지를 사용하여 MPLC에 의한 헥산-에틸아세테이트-메탄올(hexane-EtOAc-MeOH, 11-22% EtOAc-MeOH, 1:0.1, v/v)의 기울기로 분리하여 화합물 5(11.2mg)로 확보되였다.
- 화합물 5 (메디카르핀, Medicarpin ): 흰색 비결정 분말(White amorphous powder), C16H14O4; 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.39 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1), 7.13 (1H, d, J = 7.1 Hz, H-7), 6.55 (1H, d, J = 6.0 Hz, H-2), 6.45 (2H, s, H-8, -10), 6.42 (1H, s, H-4), 5.50 (1H, d, J = 5.8 Hz, H-11a), 4.24 (1H, d, J = 5.4 Hz, H-6eq), 3.77 (3H, s, -OCH3), 3.62 (1H, br t, J = 10.4 Hz, H-6ax), 3.54 (1H, d, J = 4.3 Hz, H-6a). 13C NMR (600 MHz, CDCl3) δ 161.2 (C-9), 160.7 (C-10a), 157.1 (C-3), 156.8 (C-4a), 132.3 (C-1), 124.9 (C-7), 119.2 (C-6b), 112.8 (C-11b), 109.9 (C-2), 106.5 (C-8), 103.8 (C-4), 97.0 (C-10), 78.6 (C-11a), 66.6 (C-6), 55.6 (-OCH3), 39.6 (C-6a).
분획물 E3(41.6g)는 SNAP Ultra C18 카트리지를 사용하여 MPLC에 의해 메탄올-물(MeOH-Water, 33-80% MeOH, v/v)의 기울기로 분리되어 15개 분획(Fr. E3A-E3O)으로 확보되었다. 분획물 E3E(140.0mg)는 SNAP KP-SIL 카트리지를 사용하여 MPLC에 의해 헥산-에틸아세테이트-메탄올(hexane-EtOAc-MeOH, 28-36% EtOAc-MeOH, 1:0.1, v/v)의 기울기로 격리하여 화합물 6(35.2mg)으로 확보되었다.
- 화합물 6 (테트라하이드록시 메톡시칼콘, Tetrahydroxy methoxychalcone ): 황색 침상(Yellow needles), C16H14O6; 1H NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 7.89 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-β), 7.55 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-α), 7.48 (1H, d, J = 6.7 Hz, H-2´), 7.45 (1H, s, H-6´), 7.14 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 6.82 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-5´), 6.59 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-5), 3.78 (3H, s, -OCH3). 13C NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 191.4 (C=O), 152.1 (C-4´), 150.7 (C-4), 149.9 (C-2), 146.5 (C-3´), 140.9 (C-3), 139.6 (C-β), 131.8 (C-1´), 123.4 (C-6´), 121.4 (C-1), 120.5 (C-α), 120.3 (C-6), 116.3 (C-2´), 115.9 (C-5´), 112.7 (C-5), 61.7 (-OCH3).
분획물 E3F(410.0mg)는 SNAP KP-SIL 카트리지를 사용하여 MPLC에 의해 헥산-에틸아세테이트-메탄올(hexane-EtOAc-MeOH, 20-34% EtOAc-MeOH, 1:0.1, v/v)의 기울기로 격리하여 5개 분획(Fr. E3FA-E3FE)으로 확보되었다. 분획물 E3FB(17.5mg)는 TLC(실리카 겔 60 F254, hexane-EtOAc-MeOH, 1:1:0.2, v/v)로 분리하여 화합물 7(5.6mg)로 확보되었다.
- 화합물 7 (리코칼콘 B, Licochalcone B ): 황색 침상(Yellow needles), C16H14O5; 1H NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 7.97 - 7.91 (3H, m, H-2´, 6´, β), 7.61 (1H, d, J = 15.7 Hz, H-α), 7.19 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 6.85 (2H, d, J = 6.9 Hz, H-3´, 5´), 6.61 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-5), 3.81 (3H, s, -OCH3). 13C NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 191.3 (C=O), 163.9 (C-4´), 151.0 (C-4), 149.9 (C-2), 141.0 (C-β), 139.7 (C-3), 132.2 (C-2´, 6´), 131.1 (C-1´), 121.3 (C-1), 120.4 (C-α), 120.3 (C-6), 116.4 (C-3´, 5´), 112.7 (C-5), 61.7 (-OCH3).
분획물 E5(20.4g)는 SNAP Ultra C18 카트리지를 사용하여 MPLC에 의해 메탄올-물(MeOH-Water, 20-44% MeOH, v/v)의 기울기로 격리되어 9개의 분획(Fr. E5A-E5I)으로 확보되었다. 분획물 E5B-D는 SNAP KP-SIL 카트리지를 사용하여 MPLC에 의한 클로로포름-메탄올-물(CHCl3-MeOH-H2O, 12-20% MeOH-H2O, 1:0.1, v/v)의 구배와 결합하여 5개의 분획(Fr. E5BA-E5BE)으로 확보되었다. 분획물 E5BA는 반결정질 고체를 획득한 후 메탄올에서 재분배하여 화합물 8(969.0mg)로 확보되었다.
- 화합물 8 (리퀴리틴, Liquiritin ): 흰색 분말(White powder), C21H22O9; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.65 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-5), 7.44 (2H, s, H-2´, 6´), 7.06 (2H, s, H-3´, 5´), 6.51 (1H, s, H-6), 6.35 (1H, s, H-8), 4.88 (1H, s, H-1´), 3.68 (1H, s, H-6´), 3.10 - 3.50 (6H, m, H-2´, 3´, 4´, 5´, 6´, 3), 2.67 (1H, d, J = 15.2 Hz, H-3). 13C NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 190.4 (C=O), 165.1 (C-7), 163.5 (C-9), 157.9 (C-4´), 132.8 (C-1´), 128.8 (C-5), 128.4 (C-2´, 6´), 116.6 (C-3´, 5´), 114.0 (C-10), 111.0 (C-6), 103.0 (C-8), 100.7 (C-1´), 79.1 (C-2), 77.5 (C-5´), 77.0 (C-3´), 73.6 (C-2´), 70.1 (C-4´), 61.1 (C-6´), 43.6 (C-3).
분획물 E5BB-C는 클로로포름-메탄올-물(CHCl3-MeOH-H2O, 7:1:0.05, 6:1:0.05 및 MeOH, v/v) 용매와 함께 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 결합 및 분리하여 6개의 분획(Fr. E5BBA-E5BBF)으로 확보되었다. 분획물 E5BBD(220.0mg)는 SNAP KP-SIL 카트리지를 사용하여 MPLC에 의해 에틸아세테이트-메탄올-물(EtOAc-MeOH-H2O, 4-10% MeOH-H2O, 1:0.1, v/v)의 기울기로 격리하여 화합물 9(113.5mg)로 확보되었다.
- 화합물 9 (리퀴리틴 아피오시드, Liquiritin apioside ): 황색 분말(Yellow powder), C26H30O13; 1H NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 7.71 (1H, d, J = 8.3 Hz, H-5), 7.41 (2H, d, J = 6.9 Hz, H-2´, 6´), 7.09 (2H, s, H-3´, 5´), 6.48 (1H, d, J = 6.4 Hz, H-6), 6.34 (1H, s, H-8), 5.44 (1H, br s, H-1´), 5.40 (1H, s, H-2), 4.98 (1H, d, J = 7.0 Hz, H-1´), 3.01 (1H, t, J = 14.5 Hz, H-3), 2.70 (1H, t, J = 16.8 Hz, H-3). 13C NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 193.2 (C=O), 166.8 (C-7), 165.4 (C-9), 159.1 (C-4´), 134.3 (C-1´), 129.8 (C-5), 128.8 (C-2´, 6´), 117.5 (C-3´, 5´), 115.0 (C-10), 111.8 (C-6), 110.7 (C-1´), 103.8 (C-8), 100.7 (C-1´), 80.7 (C-3´), 80.7 (C-2), 78.6 (C-2´), 78.5 (C-3´), 78.0 (C-2´), 78.0 (C-5´), 75.4 (C-4´), 71.3 (C-4´), 66.0 (C-5´), 62.4 (C-6´), 44.9 (C-3).
분획물 EC(3.0g)는 SNAP KP-SIL 카트리지를 사용하여 MPLC에 의해 클로로포름-메탄올-물(CHCl3-MeOH-H2O, 12-16% MeOH-H2O, 1:0.1, 100% Acetone, v/v)의 기울기로 분리하여 1개 분획으로 확보된 후, 메탄올에서 재분산하여 화합물 10(22.2mg)으로 확보되었다.
- 화합물 10 (오노닌, Ononin ): 흰색 분말(White powder), C22H22O9; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.43 (1H, s, H-2), 8.05 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5), 7.53 (2H, d, J = 7.5 Hz, H-2´, 6´), 7.24 (1H, s, H-8), 7.15 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-6), 6.99 (2H, d, J = 7.6 Hz, H-3´, 5´), 5.12 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1´), 3.78 (3H, s, -OCH3), 3.73 (1H, m, C-6´), 3.19 - 3.48 (5H, m, H-2´, 3´, 4´, 5´, 6´). 13C NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 175.1 (C-4), 161.9 (C-7), 159.4 (C-4´), 157.5 (C-9), 154.1 (C-2), 130.5 (C-2´, 6´), 127.4 (C-5), 124.4 (C-1´), 123.8 (C-3), 118.9 (C-10), 116.0 (C-6), 114.0 (C-3´, 5´), 103.8 (C-8), 100.4 (C-1´), 77.6 (C-5´), 76.9 (C-3´), 735. (C-2´), 70.7 (C-4´), 61.0 (C-6´), 55.6 (-OCH3).
<실험예 1> 감초 추출물, 이의 분획물 처리에 따른 근아세포 증식, 분화 및 근육 재생 효과 확인
1. 실험방법
1-1. C2C12 세포 배양 및 감초 열수 추출물, 이의 분획물 또는 최종 물질 처리에 따른 증식 관찰
마우스 근아세포주인 C2C12 세포는 10% 소태아혈청(Fetal bovine serum; FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/streptomycin; P/S)이 포함된 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM)에서 배양하였다.
감초의 열수 추출물, 이의 분획물 또는 최종 물질의 효과를 검증하기 위해, C2C12 세포(2×103 cells/ml)를 12 웰(well) 세포 배양 접시에 넣고 24시간 동안 부착시킨 후, 열수 추출물(0, 50, 100, 200㎍/ml), 이의 분획물(25㎍/ml) 또는 최종 물질(0.5ng/ml)을 1일 동안 처리하고 세포의 증식을 확인하였다. 배지는 2일에 한번씩 교체하였으며 세포는 37℃에서 배양하였다.
1-2. 스크래치(Scratch) 실험
C2C12 세포가 100% 성장하였을 때 세포 표면에 스크래치(scratch)를 가하고 열수 추출물(50㎍/ml) 또는 이의 분획물(25㎍/ml)을 처리하여 1일 동안 배양한 후 세포의 회복 정도를 관찰하였다.
1-3. 근아세포의 증식 검증(MTT 법)
세포의 증식을 검증하기 위해 세포의 배양 배지를 제거하고 DMEM으로 세포를 세척한 후, 인산완충생리식염수(phosphate bufffered saline; PBS)에 용해된 MTT 시약(0.5mg/ml) 500㎕를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. 반응액을 제거하고 1000㎕의 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)를 각 웰에 첨가하였다. 보라색의 포르마잔 결정(formazan crystals)을 DMSO에 완전히 용해시키고 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
1-4. 감초 열수 추출물, 이의 분획물 및 최종 물질 처리에 따른 분화 관찰
분화처리 유도를 위해 세포가 약 70% 이상 성장하였을 때 2% FBS와 1% P/S를 추가한 DMEM(분화배지)으로 교체하고 열수 추출물(100㎍/ml), 분획물(25㎍/ml) 또는 최종 물질(0.25ng/ml)을 처리한 후, 2일 또는 4일 동안 배양하였다. 배지는 2일에 한번씩 교체하였으며 세포는 37℃에서 배양하였다.
1-5. 김자염색(Giemsa stain) 및 융해 지수(fusion index)
세포의 배지를 제거하고 PBS로 세포를 세척하였다. 세척 후 1:1 부피 비율의 메탄올(Methanol):PBS 시약을 처리한 후 2분 동안 고정하였다. 추가적으로 2:1 부피 비율의 메탄올:PBS 시약을 첨가한 후 2분 동안 추가로 고정하였다. 2분 후 0.04% 김자(Giemsa) 시약을 첨가한 후 30분 동안 방치하고 30분 후 PBS로 세척한 뒤 세포의 모습을 현미경으로 관찰하고 세포의 사진을 3장씩 찍었다(300×). 찍은 사진에서 근관세포 내에서 융해(fusion)된 핵의 수를 세고, 총 세포의 핵 수를 센 후 융해된 핵 수를 총 세포의 핵 수로 나누어 % 값을 산출하였다.
1-6. RNA 추출 및 cDNA 합성
트리졸(TRIzol™) 시약 1ml을 첨가한 후 초고주파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 분쇄하였다. 분쇄한 샘플을 원심분리 한 후(12,000rpm, 10분, 4℃) 상층액을 새 튜브에 옮기고 클로로포름 200㎕를 넣고 실온에 10분 동안 방치하였다. 그런 후 원심분리하여(12,000rpm, 10분, 4℃) 투명색의 상층액을 수득하였다.
다음으로 이소프로판올(isopropanol) 500㎕를 넣고 10분 동안 방치하고 원심분리하여 RNA 펠렛을 얻었다. RNA 펠렛에 70% 에탄올(에탄올 + 디에틸피로카르본산 (diethylpyrocarbonate; DEPC)이 처리된 증류수)을 첨가하여 세척한 후, 완벽하게 제거하고 건조시켰다. 건조된 투명색의 RNA에 DEPC가 처리된 증류수를 넣고 -80℃에 보관하였다. 전체 RNA 양은 나노드롭(Nanodrop)으로 측정하였으며, 1.2% 아가로즈 젤 (Agarose gel)에서 18s, 28s 밴드를 확인하였다. cDNA는 2㎍의 전체 RNA(total RNA)와 랜덤 헥사머(random hexamer) 프라이머, 역전사효소(Reverse Transcriptase)와 함께 합성하였다(25℃: 10분, 37℃: 120분, 85℃: 5분).
1-7. 유전자 발현 확인
유전자 발현 확인을 위해 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하였다. 실시간 유전자 발현 관찰을 위해 사이버 그린(SYBR green)의 형광물질을 포함한 Power SYBR Green PCR Master Mix를 이용하여 유전자 발현을 분석하였다(7500 real-time PCR system). PCR 프라이머는 NCBI GenBank에서 확보된 염기서열(nucleotide sequence)에 따라 Primer 3 software (http://frodo.wi.mit.edu)로 디자인하였다.
PCR은 95℃에서 10분, 다시 95℃에서 33초, 유전자 프라이머 온도(tm)에 따라 33초, 72℃에서 33초 동안 40회 반응을 진행하였다. 실시간 PCR 분석을 통해 나온 c(t) 값의 분석을 통해 유전자 발현 값을 분석하였다 (fold change 2-△△Ct formula). 처리하지 않은 세포의 유전자의 발현 값을 1로 두고 처리한 세포의 유전자 발현 값을 계산하였다. 유전자 c(t) 값 분석 시 평준화(normalization)는 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 이용하였다.
상기 PCR 프라이머의 서열은 표 1과 같다.
| Gene | Product size(bp) |
Tm (℃) |
Sequence (F) | Sequence (R) |
| GAPDH | 155 | 59 | 5'-tgctggtgctgagtatgtcg-3' (서열번호 1) |
5'-caagcagttggtggtacagg-3' (서열번호 2) |
| MYOD | 213 | 59 | 5'-aggagcacgcacacttctct-3' (서열번호 3) |
5'-tctcgaaggcctcattcact-3' (서열번호 4) |
| MYOG | 185 | 59 | 5'-tccagtacattgagcgccta-3' (서열번호 5) |
5'-caaatgatctcctgggttgg-3' (서열번호 6) |
| MYL2 | 177 | 59 | 5'-aaagaggctccaggtccaat-3' (서열번호 7) |
5'-cctctctgcttgtgtggtca-3' (서열번호 8) |
| Atrogin1 | 160 | 59 | 5'-ttcagcagcctgaactacga-3' (서열번호 9) |
5'-tgaaagcttcccccaaagta-3' (서열번호 10) |
| MuRf1 | 206 | 59 | 5'-tgaggtgcctacttgctcct-3' (서열번호 11) |
5'-tcacctggtggctattctcc-3' (서열번호 12) |
| MSTN | 163 | 59 | 5'-acgctaccacggaaacaatc-3' (서열번호 13) |
5'-ggagtcttgacgggtctgag-3' (서열번호 14) |
1-8. 세포 조직 면역염색법(Immunocytochemistry)
배양한 C2C12 세포의 배지를 제거하고 PBS로 1번 세척하였다. 세척한 세포에 4% 포름알데히드(formaldehyde, Sigma)를 처리하여 15분간 세포를 고정한 후, PBS를 이용하여 세포를 세척하고 0.2% 트립톤(tipton) X-100(Sigma)을 넣은 후 5분간 방치하였다. 다시 PBS를 이용하여 세척하고 인헨서 용액(enhancer sol.)을 넣고 30분간 방치한 후 1차 항체(MYOD, MYOG, Myosin light chain 2(MYL2), Atrogin 1, MuRF1, Nitrothyrosine, MSTN, 1:50)를 넣고 4℃에서 14시간 동안 반응시켰다. 항체를 제거하고 PBS로 10분 동안 3번 세척한 후, 2차 항체(Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit or mouse SFX kit)와 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 항체를 제거하고 PBS로 10분 동안 세척한 후 DAP I(4′,6-diamidino-2-phenylindol)로 핵을 염색하고 형광현미경을 이용하여 단백질의 발현을 관찰하였다.
1-9. 웨스턴 블롯(Western blot)
배양한 C2C12 세포의 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. 세척한 세포에 RIPA 버퍼(Radioimmunoprecipitation assay buffer, Thermo)와 단백질 분해효소 억제제(Thermo)를 넣은 후 세포를 용해하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질 중 40㎍을 8 내지 10%의 아크릴아마이드 겔(Acrylamide gel)에서 전기영동한 후 PVDF 멤브레인(Polyvinylidene fluoride membrane, Milipore)에 옮겼다. 이를 3% 탈지유(skim milk)나 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA)으로 1시간 동안 실온에서 블로킹(blocking)하였다. 그런 후, 1% 탈지유 또는 BSA에 희석한 1차 항체(MYOD: 1:500, MYOG: 1:400, MYL2: 1:1000, ß-actin: 1:1000, MuRF1: 1:500, Atrogin 1: 1:500, Nitrotyrosine: 1:10000, MSTN: 1:500, GAPDH: 1:1000)를 첨가하고 16시간 이상 4℃에서 반응시켰다. 16시간 후 TBST(Tween 20이 포함된 Tris-Buffered Saline)로 3번 세척하고, HRP(horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 TBST로 3번 세척하고 Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate를 넣어준 후 현상하였다.
1-10. 조직면역염색법(Immunohistochemistry)
파라핀이 함유된 근육조직에 각각 자일렌(xylene)과 에탄올로 디파라핀화 (deparaffinization) 및 수분을 공급하였으며, 내생성 과산화효소 활동(endogenous peroxidase activity)을 중지시키기 위해 0.3% H2OH/메탄올에서 조직을 담구었다. 그 다음, 형태학 관찰을 위해 헤마톡실린/에오신(hematoxylin/eosin)으로 염색하거나, 1%의 정상 염소 혈청(Normal goat serum)으로 비특이적 항체와의 반응을 차단하기 위해 조직과 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 1차 항체(1:50)와 16시간 이상 4℃로 반응시켰다. 16시간 후 PBS에 3번 세척하고 HRP(horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체(1:100)를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 홀스레디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이티드 스트렙트아비딘(Horse radish peroxidase-conjugated streptavidin)을 첨가하여 단백질의 발현을 검출한 후 현미경을 통해 관찰하였다.
1-11. 감초 열수 추출물 식이에 따른 근육재생효과 관찰
감초의 열수 추출물 또는 최종 물질인 리퀴리티게닌(liquiritigenin) 처리에 따른 근육재생효과를 관찰하기 위해 마우스에 감초 열수 추출물 또는 리퀴리티게닌 섭취 및 카디오톡신(Cardiotoxin; CTX)을 근육에 주입/비주입을 한 후 근육의 형태 및 재생을 관찰하였다. C57BL/6 마우스에 감초 열수 추출물(100mg/kg) 또는 리퀴리티게닌(15mg/kg)을 섭취시킨 1일 후 100mM의 카디오톡신을 비복근(gastrocnemius) 근육에 주입하였다. 카디오톡신 주입 후 매일 감초 열수 추출물 또는 리퀴리티게닌을 섭취시켰으며, 카디오톡신 미주입 또는 주입 7일 후 근육조직을 샘플링하였다. 카디오톡신을 미주입 또는 주입 7일 후 확보한 근육에서 직경(㎛)을 이미지 제이(image J) 프로그램을 이용하여 측정하였다.
2. 실험결과
2-1. 감초 열수 추출물 처리에 따른 근아세포의 증식 및 분화 확인
감초 열수 추출물 처리에 따른 근아세포의 증식을 확인하기 위해 C2C12 세포에 상기 열수 추출물 0, 50, 100, 200㎍/ml을 1일 동안 처리한 후 세포의 증식을 MTT 법으로 분석하였다.
도 2는 감초 열수 추출물 처리에 따른 근아세포(C2C12)의 증식 및 분화 관찰의 결과로, 여기에서 근아세포의 증식 정도는 아무것도 처리하지 않은 세포의 값을 100으로 두고 감초 열수 추출물을 처리한 세포의 상댓값을 계산하였고, 분화 및 유전자 발현 정도는 아무것도 처리하지 않은 세포의 값을 1로 두고 감초 열수 추출물을 처리한 세포의 상댓값을 계산하여 나타내었다. 이는 하기 실험에서도 동일하게 적용된다.
도 2를 참조하면, a 에서 감초 열수 추출물 50 및 100㎍/ml를 세포에 처리하였을 때, 상기 추출물을 처리하지 않은 세포에 비해 약 20% 정도 세포가 증식되었음을 확인할 수 있었다. 또한, b 이미지를 통해 C2C12 세포에 스크래치(scratch)를 가한 후 감초 열수 추출물 50㎍/ml을 1일 동안 처리하였을 때, 상기 추출물을 처리하지 않은 세포보다 상기 추출물을 처리한 세포의 회복 정도가 더 높은 것으로 나타났다.
도 2의 c를 참조하면, 감초 열수 추출물 처리에 따른 C2C12 세포의 분화를 확인하기 위해 세포에 2% FBS 분화 배지를 처리하고 감초 열수 추출물(100㎍/ml)을 같이 처리하여 4일 동안 배양한 결과, 상기 추출물을 처리한 세포에서 근관 형성이 관찰되고, 근육세포로 분화할 때 높게 발현되는 MYOD, MYOG, MYL2 등의 유전자 또는 단백질의 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 단백질 분해 및 근육 위축과 관련된 Atrogin 1, MuRF1 유전자 또는 단백질의 발현이 감소하는 것으로 나타났다.
2-2. 감초 열수 추출물 처리에 따른 근육재생효과 확인
감초 열수 추출물 처리에 따른 근육재생효과를 확인하기 위해 마우스에 감초 열수 추출물을 섭취시킨 후 카디오톡신을 마우스 근육에 주입하여 손상된 근육의 재생 정도를 분석하였다. 또한, 손상이 없는 근육에서도 상기 추출물의 효과를 검증하기 위해 감초 열수 추출물을 먹인 후 관련 단백질의 발현을 관찰하였다.
도 3은 감초 열수 추출물 섭취에 따른 마우슨 근육을 분석한 결과로, 이를 참조하면, a의 표에서 감초 열수 추출물을 섭취한 마우스와 섭취하지 않은 마우스 간 체중의 변화는 거의 없었으나, 섭취하지 않은 마우스에 비해 상기 추출물을 섭취한 마우스의 근육 감소율이 적은 것으로 나타났다.
도 3의 b, c 및 d를 참조하면, 감초열수추출물/카디오톡신을 주입한 마우스의 근육에서 근육재생 시 높게 발현되는 단백질인 Pax7, MYOD, MYOG 및 MYL2 단백질의 발현이 카디오톡신만 주입한 마우스에 비해 증가하였으며, 근육 분화 억제, 단백질 분해 및 근육위축과 관련된 MSTN, MuRF1, Atrogin 1 및 Nitrotyrosine 단백질의 발현이 감초열수추출물/카디오톡신을 주입한 마우스의 근육에서 카디오톡신만 주입한 마우스에 비해 감소하는 것으로 나타났다. 하지만 근육 손상을 주지 않은 마우스의 근육에서는 감초 열수 추출물 섭취에 따른 단백질의 발현 차이를 관찰할 수 없었다.
2-3. 감초 추출물의 분획물 처리에 따른 근아세포의 증식 확인
감초 추출물의 분획물 처리에 따른 근아세포의 증식을 확인하기 위해 C2C12 세포에 분획 5종(25㎍/ml)을 1일 동안 처리한 후, 세포의 증식을 MTT 법으로 분석하였다.
도 4는 감초 추출물의 분획물 처리에 따른 근아세포 증식 여부 결과를 나타낸 것으로, 이를 참조하면, 감초 열수 추출물(EX, 10%)을 처리한 세포 뿐만 아니라, 감초의 에틸 아세테이트 분획물(EtOAc, 12%) 또는 n-부탄올 분획물(BuOH, 12%)을 처리한 세포에서도 상기 추출물 또는 상기 분획물을 처리하지 않은 세포에 비해 세포의 증식이 증가하는 것으로 나타났다. 하지만 디클로로메탄(DCM) 분획물을 처리한 세포에서는 처리하지 않은 세포에 비해 세포의 증식이 감소한 것으로 나타났다(27%).
또한, 세포에 스크래치를 가하고 상기 분획물을 처리하여 1일 동안 배양한 결과, 에틸 아세테이트 분획물을 처리한 세포에서 처리하지 않은 세포에 비해 세포의 스크래치를 가한 부위의 회복력이 높은 것으로 나타났다.
2-4. 감초 추출물의 분획물 처리에 따른 근아세포의 분화 확인
감초 추출물의 분획물 처리에 따른 C2C12 세포의 분화 확인을 위해 세포에 2% FBS 분화 배지를 처리하고 상기 분획물(25㎍/ml) 또한 같이 처리하여 4일 동안 배양하였다.
도 5는 감초 추출물의 분획물 처리에 따른 근아세포의 분화 관찰 결과로, 이를 참조하면, 감초의 에틸 아세테이트(EtOAc) 분획물의 처리에 따라 근관의 형성이 증가하였음을 확인할 수 있었다.
이와 더불어, 근육분화와 관련된 MYOD, MYOG 및 MYL2 유전자와 단백질의 발현이 증가하였으며, 단백질 분해, 근육위축 및 분화억제와 관련된 Atrogin 1, MuRF1 및 MSTN 유전자의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다. 또한, MuRF1 및 MSTN 단백질의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다.
감초의 n-부탄올(BuOH) 분획물을 처리한 경우에도 근관의 형성이 증가하였음을 확인할 수 있었고, 이와 더불어, MYOG 및 MYL2 유전자와 단백질의 발현이 증가하였으며, Atrogin 1 및 MuRF1 유전자의 발현은 감소하였다. 감초 열수 추출물(EX)을 처리한 경우에도 MYL2 유전자의 발현이 증가하였고, Atrogin 1 및 MuRF1 유전자의 발현이 감소하였으며, 물(H2O) 분획물을 처리한 경우에는 MYOG 유전자의 발현이 약간 증가하였으나, 그 외 관련 유전자의 발현은 변화를 보이지 않았다.
2-5. 최종 단일 물질 처리에 따른 세포의 증식 확인
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 에틸 아세테이트(EtOAc) 분획물로부터 분리된 단일 물질의 화학구조를 나타낸다. 상기 분획물에서 여러 단계의 분획을 거쳐 10종의 최종 물질을 분리한 후 구조 분석을 진행하였다.
하기 표 2는 상기 분리된 10종의 최종 물질 및 이의 분석 결과를 나타낸다.
상기 최종 물질 처리에 따른 C2C12 세포의 증식을 관찰하기 위해 최종 물질 0.5ng/ml을 1일 동안 처리하고 세포의 증식을 MTT 법으로 관찰하였다.
도 7은 최종 단일 물질들의 처리에 따른 근아세포 증식 및 분화 관찰 결과로, a를 참조하면, 0.5ng/ml의 리퀴리티게닌 (Liquiritigenin; 10%), 테트라하이드록시 메톡시칼콘 (Tetrahydroxymethoxychalcone; 8%) 또는 리코칼콘 B (Licochalcone B; 11%)의 물질을 처리한 세포에서 상기 물질을 처리하지 않은 세포에 비해 세포의 증식이 증가하는 것으로 나타났다.
도 7의 b를 참조하면, 근관 형성 및 융해 지수가 리퀴리티게닌(13%), 테트라하이드록시 메톡시칼콘(28%) 또는 리코칼콘 B(19%) 처리에 따라 증가하는 것으로 나타났으며, c를 참조하면, 구입한 순수한 리퀴리티게닌(0.25ng/ml, 5%), 테트라하이드록시 메톡시칼콘(0.25ng/ml, 5%) 또는 리코칼콘 B(1ng/ml, 11%)의 물질을 처리한 세포에서 상기 물질을 처리하지 않은 세포에 비해 세포의 증식이 증가하는 것으로 나타났다. 또한, d를 참조하면 근관 형성 및 융해지수가 리퀴리티게닌(20%), 테트라하이드록시 메톡시칼콘(23%) 또는 리코칼콘 B(20%) 처리에 따라 증가하는 것으로 나타났다.
2-6. 리퀴리티게닌(Liquiritigenin) 처리에 따른 근육재생효과 확인
리퀴리티게닌 처리에 따른 근육재생효과를 확인하기 위해 마우스에 리퀴리티게닌을 섭취시킨 후 카디오톡신을 마우스 근육에 주입하여 재생된 근육의 직경을 측정함으로써 손상된 근육의 재생 정도를 관찰하였다.
도 8은 구매한 리퀴리티게닌(Liquiritigenin)을 마우스에 섭취시킨 후 근육의 변화를 분석한 결과로, 이를 참조하면, a에서 리퀴리티게닌을 섭취한 마우스와 섭취하지 않은 마우스 간 체중의 변화 및 근 무게는 거의 변화는 없었으나, 섭취하지 않은 마우스에 비해 상기 물질을 섭취한 마우스의 근육 감소율은 적은 것으로 나타났다.
도 8의 b 및 c를 참조하면, 리퀴리티게닌을 섭취한 마우스의 근육 직경이 섭취하지 않은 마우스에 비해 재생된 근육의 직경(섭취하지 않은 마우스 근육 직경: 78±4㎛, 섭취한 마우스 근육 직경: 91±3㎛)이 더 큰 것으로 확인되었다. 카디오톡신 미주입 마우스의 근육에서도 섭취한 마우스의 근육 직경이 섭취하지 않은 마우스의 근육 직경(섭취하지 않은 마우스 근육 직경: 124±4㎛, 섭취한 마우스 근육 직경: 139±4㎛)에 비해 더 큰 것으로 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University
Korea Institute of Oriental Medicine
DAEGU CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING MUSCULAR DISEASES
COMPRISING FRACTION OF GLYCYRRHIZA URALENSIS FISCHER EXTRACT
<130> ADP-2020-0190
<150> KR 10-2019-0072992
<151> 2019-06-19
<160> 14
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<400> 1
tgctggtgct gagtatgtcg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> GAPDH-r
<400> 2
caagcagttg gtggtacagg 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 4
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<223> MSTN-r
<400> 14
ggagtcttga cgggtctgag 20
Claims (10)
- 감초 열수 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 분획물은 상기 감초 열수 추출물을 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 분획한 것이며,
상기 근육질환은 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육감소증(sarcopenia), 근육병증(myopathy), 근무력증(myasthenia) 및 근육 손상(muscular injury)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 감초 열수 추출물은,
상기 감초를 증류수에 넣어 110 내지 120℃에서 2 내지 4시간 가열하여 추출한 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 분획물은,
근아세포를 증식시키고 근관을 형성시키며, 근육세포로의 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 분획물은,
근육 단백질 분해 또는 근육 위축을 억제시키는 것을 특징으로 하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 분획물은,
근육 분화 관련 인자인 MYOG, MYOD, MYL2 및 Pax7로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현을 증가시키고, 근육 단백질 분해 관련 인자인 MSTN, MuRF1, Atrogin 1 및 니트로티로신(Nitrotyrosine)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 삭제
- 감초 열수 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로서,
상기 분획물은 상기 감초 열수 추출물을 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 분획한 것이며,
상기 근육질환은 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육감소증(sarcopenia), 근육병증(myopathy), 근무력증(myasthenia) 및 근육 손상(muscular injury)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 근육질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물. - 감초 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근아세포의 근육세포로의 분화 촉진용 시약 조성물.
- 사람을 제외한 동물에 감초 추출물의 분획물을 처리하는 단계를 포함하는 근아세포의 근육세포로의 분화 촉진 방법.
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