KR20210063041A - 곤드레추출물과 새싹보리추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선 기능성 복합식품 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
곤드레추출물과 새싹보리추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선 기능성 복합식품 조성물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 출원은 곤드레 에탄올추출물과 새싹보리 에탄올추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방, 치료 또는 개선용 복합조성물 및 그 제조방법을 개시하고 이는 (a) 건조된 천연물 원료를 각각 분쇄하여 건조원료분말을 얻는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 얻은 건조원료분말에 친수성 유기용매를 가하여 교반하면서 열수추출방법으로 추출한 후 각 추출액을 여과하고 농축하는 단계; (c) 상기 단계 (b)에서 얻은 각 천연물의 농축물을 동결건조하고 분쇄하여 분말화하는 단계; (d) 상기 단계 (c)에서 얻어진 각 천연물의 건조분말을 배합하여 복합조성물을 얻는 단계; (f) 상기 단계 (b)단계에서 얻은 농축물을 일정비율로 혼합한 뒤 건조한 후 분쇄하여 복합 건조 조성물을 제조하는 단계로 이루어지며, 상기 본 발명의 제조방법에 따라 플라보노이드를 포함하는 폴리페놀을 다량함유하고 있는 곤드레 에탄올추출물과 새싹보리 에탄올추출물을 복합적으로 사용함으로써 각 천연물의 단일소재보다 비만에 대한 예방, 치료 또는 개선에 시너지 효과가 발현된 신규한 식품소재의 개발이 가능한 각별한 장점이 있는 매우 유용한 발명이다.
Description
본 발명은 비만 예방 및 개선 기능성 식품 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 곤드레 에탄올추출물과 새싹보리 에탄올추출물을 제조하고 이들 곤드레추출물과 새싹보리추출물의 일정비율을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 및 개선 기능성 복합식품 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
과체중 또는 비만은 건강에 위협을 가하는 정도 이상의 체지방이 축적된 상태를 뜻하며, 보통 체질량지수(BMI; Body Mass Index)를 이용하여 간편하게 판단할 수 있으나 과도한 체지방의 축적이 건강에 미치는 인자는 매우 다양할 뿐만 아니라 각각의 인자가 생명체 개체마다 매우 상이하게 작용하기 때문에 정확한 진단을 위해서는 전문기관을 통한 자세한 검사가 필요하다.
과체중이나 비만은 당뇨병, 심혈관계질환, 암 등 다양한 만성질환에 영향을 미쳐 화자 개인의 삶의 질에 큰 영향을 미치는데, 최근에는 비만과 정신적인 건강과의 상관관계에 관련되어서도 연구가 보고된 바가 있다. 사회적으로 비만환자의 증가가 문제되기 시작한 것은 선진국을 중심으로 비만환자 비율이 증가하면서 관련된 만성질환의 환자 증가와 의료비용의 증가 및 경제적 사회구성원의 생산성절감으로 인한 국가의 경제력 약화 등으로 인해 관심받기 시작하였으나, 현재는 개발도상국에서도 환자의 빈도가 급속도로 증가하고 있어 비만에 대한 사회적 관심이 날로 광대해 지고 있다. 세계보건기구(World Health Organization; WHO)는 1975년에 3%였던 성인의 비만비율이 2016년을 기준으로 약 39%로 증가하였다고 보고하였으며,전세계적으로 매년 약 2천8백만명의 인구가 과체중 또는 비만과 관련된 질환으로 인해 사망하고 있다고 보고하였다.
체지방의 축적은 에너지 및 생리학적 조절의 불균형으로 인해 초래하게 된다. 즉, 섭취되는 칼로리의 양이 소비되는 칼로리의 양보다 많아지게 되면 과도한 여분의 칼로리는 지방의 형태로 체내에 축적되게 되는데, 이에 가장 크게 영향을 미치는 것은 무엇보다 식습관과 운동습관 등을 포함하는 생활습관이다. 내분비계적으로 이에 영향을 미치는 요인은 크게 렙틴(leptin)과 인슐린(insulin)의 영향을 들 수 있다. 체지방세포에서 분비되는 호르몬의 일종인 렙틴은 에너지균형과 체지방축적에 직접적으로 영향을 미치는 대표적인 호르몬이다. 렙틴의 분비가 부족하게 되면 식욕이 증가하여 섭취하는 에너지의 양이 많아지는 것이 일반적이다. 하지만 렙팀저항증(leptin resistance)이 증가하게 되면 정상적인 렙틴의 분비에도 불구하고 에너지불균형이 초래되는데, 이러한 증상은 비만환자에서 빈번하게 발견된다. 인슐린은 흡수된 탄수화물이 저분자의 당으로 분해되어 장으로 흡수가 되면 이를 에너지 저장조직인 지방조직으로 운반하여 에너지의 축적을 돕는다. 하지만 렙틴이나 인슐린 등의 내분비계가 지방의 축적에 미치는 영향은 식습관 등의 생활습관이 미치는 영향에 비하면 매우 미비한 정도이다. 따라서 비만을 예방하기 위해서는 칼로리의 섭취를 고려한 식단의 관리와 꾸준한 운동이 가장 효율적이다.
체지방이 과도하게 축적되어 합병증상이 우려되는 고도비만 환자의 경우 외과적인 수술이나 약물의 투여로 전문가의 관리하에 신속한 관리가 필요하다. 외과적인 수술은 지방조직을 일부 제거하거나 소화기관을 일부 절제하여 영양소와 칼로리의 섭취를 줄이는 방법을 의미하며, 약물은 지방이나 탄수화물의 흡수를 저해하거나 식욕을 억제하는 약물을 처방하여 꾸준히 섭취하면서 운동을 병행함으로써 섭취 칼로리를 줄이고 소비 칼로리를 증가시켜 체중과 체지방을 줄여나가는 방법을 의미한다.
하지만 외과적인 수술은 부작용이 치명적인 경우가 있어 특별한 경우를 제외하고는 시행을 적극 권장하지는 않으며, 약물의 경우도 국내외로 사용이 허가된 약물은 12주 이하고 섭취권고가 되는 단기섭취약물 뿐만 아니라 장기로 투여가 허가된 약물에서도 다양한 부작용에 대한 내용이 보고되고 있다.
가장 오랫동안 사용되고 있는 장기간 사용 허가 약물인 Orlistat은 위장관계에서의 지질분해효소인 lipase의 길항제로써 섭취된 지방의 분해화 흡수를 저해하는 약물이다. 대표적인 부작용으로는 소화불량, 기름변, 변실금, 대변 횟수의 증가 등을 들 수 있다. 또한 필수미량영양소인 지용성 비타민의 흡수를 저해하기 때문에 비타민 결핍증상도 나타날 수 있다. Loracaserine은 포만감과 섭식행동을 조절하는 세로토닌 수용체에 선택성이 있어 식욕을 억제하는 약물로써 사용되는 약물이다. 알려진 부작용으로는 유의적인 수준은 아니지만 심장판막증의 위험성을 높였는데, 전신격 약물인 renfluramine에 비해 안전하다고 조사되었다. 일반적으로 교감신경에 작용하는 약물들에서 나타나는 부작용 증상들(어지럼증, 구토증상, 메스꺼움, 변비, 피로감 등)이 일부 발견된다. 1일 1회 피하에 투여하는 liraglutide는 포만감을 유도하고 대사량을 증가시키는 기전으로 체중을 감량시키는데 국내에서는 아직 비만치료제로써는 사용이 금지되어 있으며, 당뇨병증상 개선을 위해 사용되고 있다. 대표적인 부작용으로 구토증상이 있으며, 심한 정도는 아니지만 심박수의 증가와 우울감 등의 부작용도 일부 보고된 바가 있다. Contrave는 naltrexone과 bupropion의 병용요법으로 식욕을 억제하는 비만치료제이다. 가장 흔한 부작용은 구역질이며 그 외에 변비, 어지럼증, 떨림, 복통, 이명 등의 부작용이 일부 나타나기도 한다.
이처럼 의료적인 차원에서 시행되는 외과 수술 및 비만치료제의 부작용으로 인해 체지방을 안전하고 효율적으로 감소시킬 수 있는 천연물 유래의 성분 연구 및 소재의 개발이 활발하게 이루어지고 있으며, 최근에는 일명 다이어트유산균인 Lactobacillus gasseri BNR17이 한국식품의약품안전처(식약처)로부터 체지방감소에 도움을 줄 수 있는 소재로 인증을 받았으며, 시서스추출물, 가르시니아캄보지아추출물, 녹차카테킨, 보이차추출물 등이 있다. 하지만 이들 천연물 유래의 비만예방 소재들도 정도가 미비하긴 하지만 부작용이 다소 보고되고 있으며, BNR17 유산균의 경우 유산균제제를 과다하게 섭취할 경우 나타날 수 있는 흔한 부작용인 복통, 설사, 구역감 등이다. 시서스의 경우 두통, 복부팽만감, 입술건조, 설사, 불면증 등의 부작용이 보고되고 있으며, 가르시니아캄보지아추출물은 설사와 복통, 메스꺼움 등의 위장질환이 흔하며, 어린이나 임산부 등에게 섭취를 지양하라고 권고한다. 이처럼 현재 시중에 유통되고 있는 건강기능성식품 소재들도 결국은 안전성으로부터 자유로울 수 없으며, 특히 그 효능이 미비한 점으로 인해 꾸준하게 소비가 이루어지지 않는 다는 단점이 있다.
따라서 현재 건강기능성식품 시장에서는 안전성과 뛰어난 효능이 보장된 신규소재의 개발이 절실히 요구되고 있으며, 이를 위해서는 천연물을 이용한 다양한 소재와 추출법개발에 대한 스크리닝 작업과 연구 및 제폼의 개발과 사업화가 필요하다. 특히 먹거리가 풍족해지고 초고령화시대와 제2의 베이비붐세대가 갱년기에 접어드는 시점이 맞물린 시점을 앞두고 있기에 비만과 관련된 성인병이나 생활습관병에 대해서 관심이 점점 증가할 것으로 보인다. 이러한 사회구성원의 생활과 인식변화로 인해 멀지 않은 미래에 개인 맞춤형 식품·의약품 시장이 열릴 것으로 판단되며, 이러한 소비자의 욕구를 충족시킬 수 있는 다양한 소재와 제품의 개발 및 사회적 해결 방안 등이 요구될 것으로 생각된다.
곤드레(Cirsium setidens)는 고려엉겅퀴라고도 불리우며, 쌍떡잎식물의 국화과 여러해살이풀로 대한민국의 특산종으로 전국의 산과 들에서 널리 분포하여있다. 다른 엉겅퀴는 약용과 식용으로 모두 이용되는 반면 곤드레는 식용으로만 사용되며, 주로 어린잎을 나물을 해먹거나 쌀과 함께 밥을 하여서 곤드레밥이라고 하여 먹는다. 자연상태의 곤드레에 함유되어 있는 생리활성물질은 펙토리나린(pectolinarin)이다. 곤드레유래의 펙토리나린의 알려진 유효성으로는 항비만, 항산화, 항염 등이 알려져 있으며, 펙토리나린을 생물전환 등을 통해 비배당체 형태인 펙토리나리제닌(pectolinarigenin)으로 전환이 가능한데, 항염, 항알레르기, 간보호작용 등의 유효성이 보고된 바가 있다. 곤드레의 추출물을 활용한 기술로는 항바이러스성 조성물, 노화 및 면역기능 개선용 식품 조성물, 혈당강하용 조성물, 뇌신경세포 보호용 빵의 제조기술, 고지혈증 개선용 조성물, 항비만용 조성물 등의 특허가 공개 또는 등록되어 있다.
대한민국 공개특허 제10-2015-0036881 (특허문헌 8 참조)에서는 곤드레원료를 증자-건조-열수추출-초음파추출-동결건조 등의 공정을 거쳐 추출물을 활용한 지방분화 및 축적 억제용 조성물을 in vitro와 in vivo체제하에서 입증하여 제시하고 있다. 하지만 곤드레에 함유된 대표적 유효성분인 펙토리나린 또는 펙토리나리제닌 성분의 함량은 명시하고 있지 않았다.
대한민국 등록특허 제10-1766911-0000호 (특허문헌 1 참조)에서는 곤드레의 생물전환을 통한 pectolinarigenin의 함량을 증대시켜 지방세포분화 저해용 곤드레발효물을 제조하는 방법을 제시한 바가 있다. 해당 특허에서는 펙토리나린의 비배당체인 페토리나리제닌의 함량을 효율적으로 증대시키는 법을 제시하였으며, 해당 방법으로 제시된 곤드레발효물의 체지방축적억제를 세포실험을 통해 입증하였으나, 동물실험 단계 이상에서의 시험 결과는 제시하지 않고 있다.
새싹보리(barley sprout, barley grass)는 보리종자의 싹을 틔워 일정기간 키워낸 약 15cm내외의 보리순을 의미하며, 현재 국내에서는 이것의 잎과 줄기 또는 전체를 건조 분말화한 형태의 제품이 주로 유통 판매 되고 있다. 새싹식물은 생명의 탄생과 성장에 필요한 생리활성 물질이 다량 함유할 수 있을 것이라는 소비자나 연구자의 관심이 많아지면서 최근에 많은 연구가 이루어지고 관련된 제품이 급속도로 증가하고 있는 추세이다. 가까운 일본에서는 그 효능에 대해 수년전부터 많은 관심을 받아 아오지루(靑汁)라는 이름으로 음료, 분말, 차 등의 형태로 유통이 활발하게 이루어지고 있다. 새싹보리에는 다양한 무기질과 미량영양소를 포함하고 있는데, 특히 주목받는 유효성분은 사포나린(saponarin), 루토나린(lutonarin) 및 폴리코사놀(policosanols)을 들 수 있다. 이들 성분과 관련되어 새싹보리에 대한 만성질환(비만, 당뇨, 고지혈등 등)에 대한 효능과 간보호효과, 피부건강증진효과, 혈압조절기능, 위장관계기능 개선, 항암, 항염, 심혈관계질환 예방, 항산화, 혈압조절작용 등에 대한 효능이 보고된 바가 있다. 새싹보리의 추출물을 활용한 기술로는 골성장촉진용 조성물, 혈행개선용 식품 조성물, 항산화 또는 항염증용 조성물, 갱년기 장애의 예방 또는 치료용 조성물, 미백 및 주름개선용 화장료 조성물, 고혈압 치료용 약학조성물, 혈중 알코올 농도 감소 또는 간기능 개선용 조성물, 지질대사 질환 예방 또는 치료용 조성물 등이 있다.
대한민국 특허 제10-1645464호 (특허문헌 21 참조)에서는 새싹보리를 열수 또는 유기용매를 활용하여 얻은 추출물, 또는 이를 분리정제한 특정 분획을 활용한 지방세포 분화용 조성물을 제시하고 있는데, 실시예에서 제시하고 있는 분획물을 얻는 과정이 고순도의 에탄올을 활용하거나 컬럼 등의 정제방법을 이용하는 등 상업적으로 활용이 난해한 점이 있어 이를 개선하면서 효율적으로 사포나린이나 루토나린 등의 유효성분을 추출하는 방법의 확립이 필요한 실정이다. 또 해당 특허에서는 in vitro 체제하의 자료만으로 효능을 입증하였기에 진전된 실험을 통한 확실한 효능의 입증 자료가 필요하다.
국내 특허 10-1766911호에는 곤드레를 표고버섯균사를 이용하여 발효시킨 곤드레 발효물의 비만 예방 및 치료용 조성물이 그리고 국내 특허공개 10-2015-0036881호에는 곤드레 증자 건조물의 초음파를 이용한 85~95℃에서의 열수추출물의 항비만용 조성물이 개시되어 있을 뿐이다.
또 국내 특허공개 10-2018-0003073호와 특허 10-1645464호에는 새싹보리의 에탄올추출물의 비만 효과를 개시하고 있다.
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본 출원의 목적은 상기 언급한 천연물인 곤드레와 새싹보리의 유효성분이 상업적으로 활용이 가능한 추출조건 범위 내에서 가장 효율적으로 추출되는 조건을 설정하고 그렇게 제조된 각각의 추출물을 최적 배합비로 혼합한 복합 조성물(complex)을 제조하여 각 천연물의 단일소재 대비 체지방감소 효능을 개선하는데 있다.
본 출원의 다른 목적은 저농도의 알코올범위 즉, 0~30% 내에서 유효성분을 가장 효율적으로 추출한 방법에 따라 각각의 추출물을 추출하고 고형분함량을 기준으로 각각의 추출물을 배합-농축-건조하여 각 천연물의 단일소재 대비 뛰어난 체지방감소 효능을 나타내는 복합조성물 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 출원의 상기 목적은 곤드레추출물과 새싹보리추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방, 치료 또는 개선용 복합조성물의 제조방법은 (a)건조된 각 천연물 원료를 분쇄하여 건조원료분말을 얻는 단계; (b)상기 단계 (a)에서 얻은 건조원료분말에 친수성 유기용매를 가하여 교반하면서 수추출방식으로 추출한 후 추출액을 여과하고 농축하는 단계; (c)상기 단계 (b)에서 얻은 천연물의 농축물의 고형분함량을 기준으로 일정 비율 가장 바람직하기는 3:1(w/w)로 혼합하는 단계; (d) 상기 단계 (c)에서 얻어진 농축물의 각 혼합물(mixture)을 동결건조한 후 분쇄하여 복합조성물(complex)을 제조하는 단계로 이루어진다.
상기 건조된 천연물 원료는 곤드레 및 새싹보리를 건조시킨 것으로, 본 발명에 사용되는 건곤드레와 새싹보리건조분말에는 플라보노이드 및 이의 배당체, 페놀류, 환원당, 다당, 유기산, 엽록소가 함유되어 있고, 곤드레추출물에 함유되어 있는 플라보노이드에는 펙토리나린(pectolinarin)이 특히 다량 함유되어 있으며, 새싹보리추출물에는 사포나린(saponarin)과 루토나린(lutonarin)이 많이 함유되어 있는 것이 특징이다.
상기 단계 (b)에서 친수성 유기용매는 물 또는 알코올이거나 그 혼합물이고, 수추출방식은 온도 40~60℃에서 30분~180분 동안 1~3회 추출하되, 1회 추출시 사용되는 정제수의 양은 원료 중량대비(w/w) 5~30배로 하는 것이 공정의 안전성 및 원료에 함유되어 있는 유효성분인 플라보노이드류의 안정성 등을 고려할 때 가장 경제적이고 추출공정이 비교적 단순하여 바람직하였다. 유기용매를 사용할 경우 비교적 극성이 높은 에탄올이 가장 바람직하였으며, 정제수와 혼합하여 주로 30% (w/w)의 에탄올을 사용하되, 다만 추출장치의 안전성 등을 고려하여 다른 범위의 농도에서 추출하여도 무방하다. 이때 상온에서 30분~180분 동안 1~3회 추출하되, 1회 추출시 사용되는 용매의 양은 원료 중량대비(w/w) 5~30배로 하는 것이 공정의 안전성 및 원료에 함유되어 있는 유효성분인 플라보노이드류의 안정성 등을 고려할 때 가장 경제적이고 추출공정도 비교적 단순하여 바람직하였다.
또한 상기 단계 (d)에서 곤드레와 새싹보리의 추출농축물의 배합 비율은 고형분함량 기준으로 1:9(w/w) 내지 9:1(w/w)의 비율로 혼합한 복합조성물에서 항비만 효과가 우수하게 나타났다.
본 발명에 있어서 상기 단계 (b)의 추출액은 원료를 물과 알코올의 혼합용매를 이용하여 추출하여 얻어진 추출물을 의미한다. 추출방법은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 바람직하게는 추출 대상인 곤드레 및 새싹보리에 상기 추출 용매를 침지시키는 단계를 통하여 냉침, 환류, 가온, 초음파, 고압분산 등에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 상기 추출물은 이후 감압여과, 감압농축, 건조 등을 수행하여 용매를 제거하여 사용할 수 있다. 건조 방법은 동결건조, 분무건조 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 단계 (d)의 복합조성물은 곤드레 에탄올추출물과 새싹보리 에탄올추출물을 임의의 양으로 배합한 조성물을 의미하는 것이다. 바람직하게는 1:9(w/w) 내지 9:1(w/w)의 배합비 범위에서 되는 것이 좋다.
상기한 본 발명의 복합조성물 제조방법은 각각의 원료 추출물을 농축한 후 고형분 함량을 기준으로 중량부로 계산하여 혼합한 후 건조하고 분쇄하는 방법, 각각의 추출물을 따로 건조하고 분쇄하여 분말화한 후 혼합하는 방법을 모두 사용할 수 있었으며, 가장 바람직하게는 농축된 추출물을 고형분함량 대비 2~3:1(w/w) 비율로 조절하여 균일하게 혼합한 후 건조시켜 분쇄기(blender)를 활용하여 분쇄하고 균질화하는 방법이 효율적이었다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 복합조성물을 함유하는 비만을 예방, 치료 또는 개선할 수 있는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 비만 예방, 치료 또는 개선용 식품 조성물은 그 유효성분인 복합조성물을 지방세포의 분화를 억제하거나 중성지질축적을 억제하는 효능이 나타날 수 있는 임의의 양으로 포함할 수 있다.
상기 식품이라 함은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 각종 식품류, 음료수, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 각종 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 및 비타민 복합제 등이 될 수 있으며, 그 외에도 통상적인 의미에서의 건강식품, 기능성식품 등을 포함한다.
상기 식품으로 제조시 본 발명의 숙취 해소용 복합조성물에 정제수, 감미료, 산미료, 증점제, 향료, 색소 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 예컨대 감미료는 설탕, 과당, 올리고당, 포도당, 아스파탐, 솔비톨, 자일리톨, 스테비오사이드 중 어느 하나 이상을 사용할 수 있으며, 산미료는 구연산, 비타민C, 비타민B6, 사과산 중 어느 하나 이상을 사용할 수 있다. 또한 증점제는 펙틴, 덱스트린, 검류 중 어느 하나 이상을 사용할 수 있으며, 향료로서는 딸기농축과즙, 사과농축과즙 등의 각종 과일농축 과즙을 하나 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따라 지방세포의 분화 또는 지방의 축적을 억제하는 방향으로 각각 관여하는 곤드레 에탄올추출물과 새싹보리 에탄올추출물을 복합적으로 사용함으로써 단일소재 대비 시너지효과를 발현하는 비만 예방, 치료 또는 개선용 복합조성물의 신규한 식품소재를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 곤드레 및 새싹보리의 각 에탄올 추출복합물의 제조공정도,
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 곤드레 에탄올추출물(CS), 새싹보리 에탄올추출물(BS) 및 이들 각 추출물의 복합조성물(CS+BS)을 3T3-L1세포에 처리하여 확인한 세포생존율 그래프,
도 3는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 곤드레 에탄올추출물(CS), 새싹보리 에탄올추출물(BS) 및 이들 각 추출물의 복합조성물(CS+BS)을 3T3-L1세포에 처리하여 확인한 지방세포분화(지방축적) 그래프,
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 곤드레 에탄올추출물(CS), 새싹보리 에탄올추출물(BS) 및 이들 각 추출물의 복합조성물(CS+BS)을 분화가 유도된 3T3-L1세포에 처리하여 확인한 중성지질 함량 그래프,
도 5는 고지방식이 비만모델쥐에게 새싹보리 에탄올추출물(BS), 곤드레 에탄올추출물(CS), 및 이들 각 추출물의 복합조성물(BS+CS)과 양성대조물질(가르시니아캄보지아추출물)을 처리하여 8주간 사육하며 측정한 체중변화를 나타낸 그래프와 희생전에 측정한 최종 체중을 나타낸 그래프,
도 6은 고지방식이 비만모델쥐에게 새싹보리 에탄올추출물(BS), 곤드레 에탄올추출물(CS), 및 이들 각 추출물의 복합조성물(BS+CS)과 양성대조물질(가르시니아캄보지아추출물)을 처리하여 8주간 사육한 후에 측정한 체중증가량 및 식이효율을 나타낸 그래프,
도 7은 고지방식이 비만모델쥐에게 새싹보리 에탄올추출물(BS), 곤드레 에탄올추출물(CS), 및 이들 각 추출물의 복합조성물(BS+CS)과 양성대조물질(가르시니아캄보지아추출물)을 처리하여 8주간 사육한 뒤 희생시킨 장기(간, 지방조직)의 무게를 나타낸 그래프,
도 8은 고지방식이 비만모델쥐에게 새싹보리 에탄올추출물(BS), 곤드레 에탄올추출물(CS), 및 이들 각 추출물의 복합조성물(BS+CS)과 양성대조물질(가르시니아캄보지아추출물)을 처리하여 8주간 사육한 뒤 채취한 혈액으로부터 측정한 혈당(glucose), 중성지질(triglyceride), 총콜레스테롤(total cholesterol), 저밀도지단백콜레스테롤(LDL-cholesterol), 고밀도지단백콜레스테롤(HDL-cholesterol)과 인슐린(insulin), 렙틴(leptin), 아디포넥틴(adiponectin)의 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 9는 본 발명 일실시예에 따라 제조된 복합조성물의 유효성분함량을 측정하기 위해 HPLC분석한 결과물 중 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 곤드레 에탄올추출물(CS), 새싹보리 에탄올추출물(BS) 및 이들 각 추출물의 복합조성물(CS+BS)을 3T3-L1세포에 처리하여 확인한 세포생존율 그래프,
도 3는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 곤드레 에탄올추출물(CS), 새싹보리 에탄올추출물(BS) 및 이들 각 추출물의 복합조성물(CS+BS)을 3T3-L1세포에 처리하여 확인한 지방세포분화(지방축적) 그래프,
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 곤드레 에탄올추출물(CS), 새싹보리 에탄올추출물(BS) 및 이들 각 추출물의 복합조성물(CS+BS)을 분화가 유도된 3T3-L1세포에 처리하여 확인한 중성지질 함량 그래프,
도 5는 고지방식이 비만모델쥐에게 새싹보리 에탄올추출물(BS), 곤드레 에탄올추출물(CS), 및 이들 각 추출물의 복합조성물(BS+CS)과 양성대조물질(가르시니아캄보지아추출물)을 처리하여 8주간 사육하며 측정한 체중변화를 나타낸 그래프와 희생전에 측정한 최종 체중을 나타낸 그래프,
도 6은 고지방식이 비만모델쥐에게 새싹보리 에탄올추출물(BS), 곤드레 에탄올추출물(CS), 및 이들 각 추출물의 복합조성물(BS+CS)과 양성대조물질(가르시니아캄보지아추출물)을 처리하여 8주간 사육한 후에 측정한 체중증가량 및 식이효율을 나타낸 그래프,
도 7은 고지방식이 비만모델쥐에게 새싹보리 에탄올추출물(BS), 곤드레 에탄올추출물(CS), 및 이들 각 추출물의 복합조성물(BS+CS)과 양성대조물질(가르시니아캄보지아추출물)을 처리하여 8주간 사육한 뒤 희생시킨 장기(간, 지방조직)의 무게를 나타낸 그래프,
도 8은 고지방식이 비만모델쥐에게 새싹보리 에탄올추출물(BS), 곤드레 에탄올추출물(CS), 및 이들 각 추출물의 복합조성물(BS+CS)과 양성대조물질(가르시니아캄보지아추출물)을 처리하여 8주간 사육한 뒤 채취한 혈액으로부터 측정한 혈당(glucose), 중성지질(triglyceride), 총콜레스테롤(total cholesterol), 저밀도지단백콜레스테롤(LDL-cholesterol), 고밀도지단백콜레스테롤(HDL-cholesterol)과 인슐린(insulin), 렙틴(leptin), 아디포넥틴(adiponectin)의 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 9는 본 발명 일실시예에 따라 제조된 복합조성물의 유효성분함량을 측정하기 위해 HPLC분석한 결과물 중 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
이하, 첨부 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다.
실시예1. 천연물 추출물의 제조 및 이들의 복합조성물의 제조
본 발명에서 일실시예로서 제조된 곤드레와 새싹보리의 복합조성물(complex) 제조공정은 도1에 나타낸 것과 같으며, 그 상세한 방법은 하기와 같다.
여기서 100℃의 열수추출방식과 15~25℃ 증온수 추출방식은 비만관련 유효성분함량에 있어 현저한 저하로 인하여 폐기하고 두가지 천연식품 소재의 추출은 에탄올 추출방법으로 설계하였다.
1-1.곤드레 농축추출물의 제조
상기 곤드레는 곤드레 생산 농가(강원도 정선)를 통해 건조물을 구매하였다. 구매한 건곤드레는 분쇄기(blender)를 이용하여 분쇄하여 분말형태의 곤드레원료로 제조한 후 추출기에 넣고 곤드레 건조분말원료 중량대비(w/w) 30배의 가장 바람직하기는 30% 주정에탄올을 가한 다음 상온에서 60분간 추출하여 추출물을 얻었다. 추출물을 종이여과하여 얻어진 여액을 약 30brix까지 농축하여 곤드레 에탄올농축액을 수득하였다(도 1).
1-2.새싹보리 추출물의 제조
상기 새싹보리는 보리싹 생산 농가(경상북도 울진)을 통하여 건조분말을 구매하였다. 구매한 원료를 추출기에 넣고 가장 바람직하게는 30%의 에탄올(v/v)을 새싹보리 원료 중량대비(w/w) 30배 가하고, 상온에서 120분간 추출하여 추출물을 얻었다. 이 추출물을 종이여과하여 얻어진 여액을 진공 농축하여 새싹보리 에탄올추출농축액을 수득하였다(도 1).
1-3. 복합조성물의 제조
상기에서 제조된 곤드레농축액과 새싹보리농축액을 고형분함량 대비 바람직하기는 2~4:1(w/w), 더욱 바람직하게는 3:1(w/w)의 비율로 혼합하여 동결건조하였다.
실시예2. 비만 예방, 치료 및 개선효과 를 확인하기 위한
in vitro
세포실험
2-1. 세포 배양
생쥐에서 유래한 지방전구세포인 3T3-L1 세포는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였다. 3T3-L1 세포는 DMEM배지 (Welgene)에 10% bovine calf serum(BCF), 100units/mL penicillin과 100 ug/mL streptomycin을 첨가한 세포 배양액(complete DMEM 배양액)을 사용하여 37℃ 습윤한 CO2 배양기 (5% CO2/95% air)에서 배양하였다. 세포가 배양접시의 80% 정도 찼을 때, phosphate buffer saline(PBS, pH 7.4)으로 세포 단층을 씻어낸 후 trypsin-2.65 mM EDTA를 첨가하여 세포를 떼어내어 계대 배양하였고, 배지는 2일마다 교환하였다.
2-2. 세포 생존율(cell viability) 측정
3T3-L1 세포를 3 x 104 cells/well이 되도록 24-well plate에 분주하고 24시간 세포를 배양하였다. 세포를 24시간 배양한 후 각각의 시험물질을 다양한 농도 (0, 50, 100, 200, 300, 400 ug/mL)로 함유한 세포 배양액으로 교환하여 세포를 72시간 배양하였다. 세포를 72시간 배양한 후 MTT assay (Denizot F and Lang R. J Immunological Method 89: 271-277, 1986)을 실시하여 살아있는 세포수를 측정하였다. MTT assay 방법은 미토콘드리아의 dehydrogenase가 MTT (Amresco)를 환원시켜 푸른색 물질인 formazan을 만드는 원리에 기초한 것으로 본 시험에서는 formazan을 isopropanol에 용해시킨 다음 570 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
도2에 나타낸 것과 같이 양성대조군을 포함한 모든 농도의 시료에서 100%이상의 세포생존율을 나타내 세포독성이 없는 것으로 판단되었다.
2-3. 세포 분화 유도 및 시험물질 처리
3T3-L1 세포를 1 x 105 cells/w의 농도로 24 well plate에 분주하였다. 세포가 confluence한 상태에 도달한 후, 순차적으로 3종의 분화유도배약액 (DM)으로 세포 배양액을 교환하여 세포를 배양하여 지방세포로 분화를 유도하였다. 즉, 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에 DMI (1 uM dexamethasone, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 5 ug/mL insulin)를 첨가한 분화유도배양액으로 세포배양액을 교환하여 2일 동안 분화를 자극하였다. 2일 후, 10% FBS를 함유한 DMEM배지에 5 ug/mL insulin을 첨가한 새로운 분화유도배양액으로 교환하여 다시 2일 동안 분화를 자극하였다. 총 4일 동안 분화를 자극한 후, 세포를 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 약 4~8일 동안 유지하여 지방세포로의 분화를 유도하였으며, 이 기간에는 세포배양액을 2일마다 교환하였다. 시험물질이 지방세포 분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 분화유도배양액에 3종의 시험물질을 농도별 (0, 100, 200 및 400 ug/mL)로 첨가하여 세포에 처리하였다.
2-4. 지방세포 분화 (지방 축적) 측정 (Oil red-O 염색 및 정량)
3T3-L1 세포의 분화를 유도하며 시험물질을 처리한 후, 세포를 DPBS (Welgene)로 헹군 후 4% paraformaldehyde (PFA, Biosesang)를 넣어 1시간 동안 실온에서 세포를 고정시켰다. 세포를 고정시킨 후, oil Red O (Sigma-Aldrich Co.) 용액을 처리하여 1~2시간 동안 실온에서 염색하였다. 지방세포의 염색 정도를 눈으로 관찰한 후, 세포를 증류수로 헹구고 현미경을 통해 지방세포를 관찰하였다. 지방세포 분화 정도를 정량 분석하기 위해 oil red O 염색 후 isopropanol로 녹여 490nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
도3에서 보듯이 400 μ의 농도에서 양성대조군인 HCA는 약 30.4%의 지방세포분화 억제효과가 나타났으며, 곤드레-새싹보리 에탄올추출물의 복합조성물은 약 27.6%가 억제되었다. 이는 곤드레 에탄올추출물 단일효과인 18.3%와 새싹보리 에탄올추출물 단일소재의 효과인 22.5%보다 높은 억제효율을 나타내었음이 확인 되었으며, 양성대조군인 HCA의 효과에 대비하여 약 90.8%의 효과를 나타내었다.
2-5. 지방세포 내 중성지방 함량 측정
3T3-L1 세포를 3 x 105 cells/well이 되도록 6-well plate에 분주하여 분화 유도 하면서 시험물질을 처리한 후, 세포배양액을 제거하고 세포를 DPBS *Welgene)로 헹궈주었다. 세포에 증류수 300 μ를 넣고 cell scraper를 사용하여 세포를 1.5 mL 에펜튜브에 모은 후 homogenizer로 균질화하였다. 균질화한 세포용액에 Folch{chloroform : methanol = 2:1(v/v)}용매를 900 μ넣고 잘 섞어준 후 37℃에서 30분간 반응 시켰다. 30분 후, 10분간 원심분리 (5,000 rpm)하여 지질이 함유되어 있는 하층액을 새로운 1.5 mL tube에 옮겨 담은 후 고효율 원심농축장치 (GeneVac)를 사용하여 2시간 동안 원심분리하며 chloroform층을 증발 및 건조 시켜 pellet을 얻었다. 이 pellet에 chloroform 20 μ를 넣고 지질을 다시 용해시킨뒤 시험용액으로 이용하였다. 시험용액은 triglyceride assay kit (아산제약)을 이용하여 제조사에서 제시하는 방법에 따라 중성지방을 측정하였다.
곤드레-새싹보리 에탄올추출물의 복합조성물의 처리는 400μ이 농도에서 지방세포에서 중성지질의 축적을 억제하는 것으로 나타내었는데, 양성대조군인 HCA군에서 약 44.5% 중성지질의 축적이 억제되었고 본 발명의 복합조성물은 악31.9% 가량 억제되었다(도4). 이는 복합조성물이 단일소재인 곤드레 에탄올추출물(19.3%)와 새싹보리 에탄올추출물(25.8%)에 비해 높은 비만 예방, 치료 또는 개선효능을 나타내었음을 나타내는 결과이며, 이상의 in vitro 세포실험결과를 종합하였을 때, 곤드레 에탄올추출물과 새싹보리 에탄올추출물 각각의 효능에 비하여 복합물이 비만 예방, 치료 또는 개선효능에 대하여 시너지 효과가 있음을 확인하였다.
2-6. 통계처리
모든 분석 수치는 편균(mean) ± 표준오차 (standard error of the mean, SEM)으로 나타내었다. 대조군과 시험물질 투여군의 차이를 비교하기 위하여 분산분석 (ANOVA)로 분석 후 SAS software version 9.4(SAS institute)에서 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유의성을 검증하였다(p < 0.05).
실시예3. 비만 예방, 치료 및 개선효과 를 확인하기 위한
in vivo
동물실험
3-1. 실험동물 사육환경
실험동물은 특정병원체가 없는 4주령, 수컷 C57BL/6N mouse는 ㈜오리엔트바이오에서 구입하여 사용하였으며, 1주일 간 검역 및 적응과정을 거친 뒤 체중 감소가 없는 건강한 실험동물을 선별하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 환기회수 10~15 회/시간, 조명시간 12시간 (08:00~20:00), 조도 150~300 Lux으로 설정 된 사육환경에서 사육하였으며, 시험 전 기간 동안 실험동물은 실험동물용 고형사료와 음수를 자유롭게 섭취하도록 하였다.
3-2. 실험물질 투여
1주일 간 적응 기간을 거쳐 선별 된 실험동물은 난괴법에 의거하여, (G1) 정상대조식이군, (G2) 고지방식이군 대조군, (G3) 고지방식이+ 곤드레 에탄올추출물 투여군, (G4) 고지방식이+ 새싹보리 에탄올추출물 투여군, (G5) 고지방식이+ 곤드레와 새싹보리 추출물의 복합조성물 투여군, (G6) 고지방식이+ 양성대조물질(가르시니아 캄보지아추출물, HCA) 투여군으로 분류하였으며, 각 시험군 당 10마리의 실험동물을 사용하였다. 시험 전 기간 동안 정상대조식이군 (G1)과 고지방식이군 (G2, G3, G4, G5, G6)에는 정상대조식이 (D12450B, 10% of kcal from fat, Research Diets Inc)와 고지방식이 (D12452, 60% of kcal from fat, Research Diets Inc)를 각각 공급하였고, 식이와 음수는 자유 섭취하게 하였다. 시험물질은 생리식염수에 녹여 8주 간 일정한 시간에 경구 투여하고 (G3, G4, G5, G6), G1과 G2군은 시험 물질이 함유되지 않은 생리식염수를 다른 시험군과 동일하게 경구 투여를 실시하였다.
3-3. 체중 및 식이섭취량 측정
시험기간 동안 매주 일정한 시간에 실험동물의 체중을 측정하였다. 각 실험동물의 식이섭취량은 2일 간격으로 측정하였고, 시험기간 동안 섭취한 양을 계산하여 일일식이섭취량과 일일에너지섭취량을 산출하였다. 식이효율(Food Efficiency Ratio, FER)은 시험기간 내에 체중 증가량을 동일기간 섭취한 식이의 양으로 나누어 다음과 같이 계산하였다.
시험기간 중에 측정한 동물의 체중 변화는 도5에 표시한 것과 같이 모든 군에서 꾸준히 증가하는 양상을 나타내었으며, 정상대조군(CON)에 비해 고지방식이 비만모델군(HFD)에서 체중의 증가량이 많았다. 시험물질을 처리한 모든 군 (BS, CS, BS+CS, HCA 등)에서 고지방식이군(HFD)에 비해 체중의 증가 양상이 감소하였으며, 특히 BS+CS군은 시험시작 1주차부터 유의적인 차이를 보이기(p<0.05) 시작해서 8주차 시험종료까지 유의성을 나타내었다. 시험종료시의 체중을 시험시작일의 체중에서 제외하여 측정한 총 체중증가량을 확인하면 고지방식이군(HFD)에서 19.4 g이 증가하여 정상대조군의 증가량인 9.1 g과 비교하여 비만유도가 이루어졌음을 알 수 있었으며, 시험물질을 처리한 모든 군에서 비만유도군에 비해 증가량이 유의적으로 감소하였음을 알 수 있었으며, 특히 곤드레-새싹보리 에탄올추출물의 복합조성물을 처리한 군(BS+CS)에서 가장 낮은 체중증가량(13.8 g)을 보였다 (BS: 15.4 g, CS: 15.5 g, HCA: 15.4 g). 이 같은 결과로 고지방식이로 인해 과하게 증가할 수 있는 체중증가현상을 억제해 주는 효과에 대하여 새싹보리 에탄올추출물과 곤드레 에탄올추출물을 단일조성물로 활용하는 것에서 이들을 혼합한 복합조성물이 시너지효과를 나타내는 것이라고 설명될 수 있다.
각 군의 식이효율을 나타낸 도6에서 보듯이 고지방식이군(HFD)로 인해 증가한 식이효율이 시험물질을 처리한 모든 군에서 다소 감소하는 것을 확인하였지만, 이들 간에 유의적인 차이는 없었다.
3-4. 실험동물 채혈
실험동물을 희생 전 16시간 동안 절식시킨 후 tribromoethanol을 tertiary amylalcohol로 희석하여 만든 마취제를 사용하여 마취한 후 안와채혈을 하였다. 혈액은 serum separate tube(Becton Dickinson)에 담아 30분간 실온에 방치하고 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분리하였으며, 분석 전까지 -70℃에 보관하였다.
3-5. 간 및 지방조직 무게 측정
실험동물에서 혈액 채취 후 간, 지방조직(부고환지방무게, 후복강지방무게, 내장지방무게, 서혜부지방무게, 견갑골지방무게 등)을 적출하여 각각의 무게를 측정하였다. 각 조직학적 분석을 위해 각각의 조직 일부를 절단하여 4% paraformaldehyde(Sigma-Aldrich Co.)에 고정하였고, 남은 조직은 향후 추가 분석을 위해 -70℃에 보관하였다.
도7에서 보듯이 간의 무게는 시험물질을 처리한 모든 군에서 고지방식이군에 비하여 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다(p < 0.01). 지방조직의 경우 견갑골지방무게를 제외한 다른 모든 지방조직(부고환지방, 후복강지방, 내장지방, 서혜부지방)에서 고지방식이로 인해 지방조직의 무게가 유의적으로 증가였다(도7). 새싹보리 에탄올추출물을 단일조성물로 처리할 경우 내장지방을 제외하고는 지방조직의 무게를 감소시키는 효과가 나타나지 않았다. 곤드레 에탄올추출물을 단일조성물로 처리할 경우 내장지방과 부고환지방을 일정수준 낮추는 효과가 있었는데, 특히 부고환지방의 무게에서 고지방식이군에 비해 뚜렷한 감소 효과를 확인할 수 있었다(p < 0.01). 곤드레-새싹보리 에탄올추출물의 복합조성물을 처리한 군(BS+CS)에서는 모든 지방조직에서 고지방식이군(HFD)에 비해 감소하는 경향을 나타내었으며, 특히 부고환지방무게에서 유의적인 차이를 나타내었다(p < 0.05).
3-6. 혈액(혈청) 내 포도당, 지질 성분 및 지방대사 관련 호르몬 분석
혈청 내 포도당, 중성지방, 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 수준은 혈액생화학 분석기(KoneLab 20, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 측정하였다. 혈청 내 insulin 함량은 Millipore Corporation에서 구입한 측정 kit을 사용하였으며, leptin 및 adiponectin 함량은 R&D Systems에서 구입한 측정 kit을 사용하여 각각 제조사에서 제시한 방법에 따라 측정하였다.
혈중 포도당수치는 고지방섭취군(HFD)에서 현저하게 증가하였으며, 시험물질 처리군에서 모두 유의적으로 감소하였다. 만성적인 고지방식이섭취는 혈중 중성지질과 총콜레스테롤 및 저밀도지방단백의 함량을 높이고 고밀도지방단백의 함량을 낮추어 심혈관 및 관상심혈관질환의 발병 위험을 높인다. 본 시험에서 고지방식이를 섭취한 군(HFD)에서는 이와 같은 양상이 뚜렷하게 나타났다. 즉, 정상대조군(CON)에 비해 고지방식이군에서 혈중 중성지질, 총콜레스테롤, 저밀도지방단백(LDL)의 함량이 증가하였으며, 고밀도지방단백(HDL)의 함량은 유의적으로 감소하였다. 새싹보리 에탄올추출물 단일조성물을 투여한 군(BS)과 양성대조군인 가르시니아캄보지아추출물 투여군(HCA)은 혈중 중성지질, 혈중총콜레스테롤의 함량이, 곤드레 에탄올추출물 단일조성물투여군(CS)과 곤드레-새싹보리 에탄올추출물의 복합조성물 투여군(BS+CS)은 혈중 중성지질과 총콜레스테롤 함량이 유의적으로 감소하였다. 혈중 HDL-콜레스테롤의 경우 시험물질을 투여한 모든 군에서 유의적으로 증가하였다(도8).
장기간의 고지방섭취는 만성적인 혈당의 상승을 초래하여 인슐린저항성이 유도되며, 체지방이 과다하게 축적되면 혈중에 인슐린농도가 높게 나타나는 고인슐린혈증이 지속된다. 도8에 나타난 바와 같이 고지방식이군(HFD)은 정상대조군(CON)에 비해 혈중인슐린 농도가 증가하였으며, 시험물질을 처리한 모든 군에서 유의적으로 감소하였다. 지방조직에서 생성되어 분비되는 호르몬인 렙틴(leptin)은 음식섭취 및 에너지균형 조절에 작용하는 호르몬으로 비만인 경우에 그 분비량이 증가하는 경향을 나타내는 것으로 알려져 있다. 반면에 지방조직에서 분비되는 에너지대사와 관련된 호르몬인 아데포넥틴(adiponectin)은 비만인 사람에게서 정상인에 비해 낮은 수치를 나타내는 경향을 보인다. 본 실험에서 동물의 혈중 렙틴 및 아디포넥틴 함량을 측정한 결과 렙틴은 고지방식이군에서 유의적으로 증가하여 양성대조군인 HCA군을 제외하고는 시험물질을 처리한 BS, CS 및 BS+CS군에서 모두 고지방식이군(HFD)에 비해 유의적으로 감소하였다. 혈중 아디포넥틴의 농도는 정상대조군(CON)과 고지방식이군(HFD)에서 유의적인 차이를 보이지 않았지만 새싹보리 에탄올추출물 단일처리군(BS), 곤드레 에탄올추출물 단일처리군(CS) 및 양성대조군(HCA)군에서 고지방식이군에 비해 유의적으로 증가하는 양상을 보였다(도8).
실시예4. 유효성분 함량 분석
곤드레의 유효성분인 펙토리나린과 새싹보리의 유효성분인 사포나린 및 루토나린은 HPLC-DAD를 이용하여 분석하였으며, 분석조건은 다음의 표 1과 같다. 시료를 적당량 정확하게 칭량하여 용량플라스크에 덜고, 플라스크의 표시선까지 40% 메탄올을 체운다. 10분간 초음파처리를 한 후 syringe filter (0.45μ를 이용하여 여과한 후에 HPLC 장치에 주입하였다. 표준품은 5 종 이상의 농도로 조제하여 HPLC로 분석하였으며, 각 농도별로 HPLC장치로 분석하아여 산출된 peak의 면적을 직선성으로 연결하여 얻어진 함수식에 대입하여 함량을 산출하였다.
| 항목 | 조건 |
| 주입량 | 20 μL |
| 검출기 파장 | 284 nm |
| 칼럼 온도 | 30℃ |
| 이동상 | A : 0.1% TFA가 함유된 증류수 B : 메탄올(methanol) |
| 유속 | 0.7 mL/분 |
| 시간(분) | A용액(%) | B용액(%) |
| 0 | 90 | 10 |
| 5 | 85 | 15 |
| 10 | 88 | 18 |
| 15 | 80 | 20 |
| 20 | 78 | 22 |
| 25 | 78 | 22 |
| 30 | 75 | 25 |
| 32 | 72 | 28 |
| 35 | 50 | 50 |
| 38 | 50 | 50 |
| 40 | 35 | 65 |
| 43 | 10 | 90 |
| 48 | 10 | 90 |
| 50 | 90 | 10 |
| 55 | 90 | 10 |
상기 실시예에서 제조된 곤드레-새싹보리 에탄올추출물의 복합조성물이 함유한 유효성분 분석 결과는 다음 표3과 같다.
| lutonarin | saponarin | pectolinarin | |
| 함량(mg/g) | 4.97 | 11.87 | 39.67 |
이 같은 결과는 곤드레 및 새싹보리의 통상의 열수추출물 또는 에탄올추출물의 공지된 농축액 동결건조분말의 10~20배 각각 높은 함량(mg/g)을 나타내고 있음이 확인되었다.
Claims (5)
- (a) 건조된 곤드레와 새싹보리의 천연물 원료를 분쇄하여 각 건조원료분말을 얻는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 각 건조원료분말에 에탄올을 가하여 교반하면서 추출하여 추출액을 여과하고 농축하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 각 천연물의 추출농축액을 동결건조하고 분쇄하여 분말화하는 단계;
(d) 상기 단계 (c)에서 얻어진 각 천연물의 건조분말을 배합하여 복합조성물을 얻는 단계 및;
(f) 상기 단계 (b)에서 얻은 농축물을 고형분함량 대비 2~3:1(w/w)로 혼합한 후 동결건조한 후 분쇄하여 복합 건조 조성물을 제조하는 단계로 이루어진 곤드레 에탄올추출물과 새싹보리 에탄올추출물을 함유하는 비만 예방 및 개선 기능성 복합조성물의 제조방법. - 제 1항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 건조된 천연물원료에 30%의 에탄올(v/v)을 원료 중량대비(w/w) 10~15배 가하고, 교반하면서 온도 15~25℃에서 30분~100분 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 곤드레와 새싹보리의 에탄올추출농축액의 배합 비율은 고형분함량 기준으로 1~9 : 1~9(w/w)의 비율로 혼합하여 복합조성물을 조성하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항의 방법으로 제조된 곤드레 에탄올추출물과 새싹보리 에탄올추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 개선 기능성 복합조성물.
- 제 4항의 복합조성물이 포함된 항비만용 식품 조성물.
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