KR20160122868A - 콜레스테롤 개선 활성이 우수한 흑삼 추출물을 함유하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 부작용이 적을 뿐 아니라 콜레스테롤 개선 활성을 증진시킬 수 있도록 제조 및 추출된 콜레스테롤 개선 활성이 우수한 흑삼 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 흑삼의 알콜 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

콜레스테롤 개선 활성이 우수한 흑삼 추출물을 함유하는 조성물{Composition Comprising Black Ginseng Extract with Improving Activity of Cholestrol}

본 발명은 부작용이 적을 뿐 아니라 콜레스테롤 개선 활성을 증진시킬 수 있도록 제조 및 추출된 콜레스테롤 개선 활성이 우수한 흑삼 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

예로부터 불로·장생·익기·경신의 명약으로 일컬어지고 있는 인삼(Panax ginseng C.A.Meyer)은 각종 질병의 예방과 치료에 탁월한 효과를 나타낼 뿐만 아니라 전혀 병이 없는 사람들에게도 힘과 활력을 주는 강장제로서 광범위한 약효를 나타낸다. 또한 장기간 사용하여도 전혀 부작용이 없다고 알려져 있어 한약 중에서도 최고의 약재로 꼽힌다.

밭에서 캔 그 상태로서의 인삼인 수삼은 70% 내외의 수분을 함유하고 있으므로 저장 또는 유통 과정에서 손상되기 쉽기 때문에 가공에 의해 저장성을 향상시킨다. 인삼은 가공방법에 따라 건삼, 백삼, 홍삼, 흑삼 등으로 나눌 수 있다. 수삼을 껍질을 제거하지 않고 그대로 건조한 것을 건삼이라 하며, 수삼의 껍질을 제거한 후 건조한 삼을 백삼이라 한다. 수삼을 증기로 쪄서 건조시키는 증숙 및 건조 단계를 거쳐 얻는 것을 홍삼이라 한다. 흑삼은 홍삼의 특유한 형태로 한번의 증숙과 건조과정을 거쳐 제조되는 일반 홍삼과 달리 통상적으로 아홉번 찌고 말리는 구증구포 방법으로 제조된다. 2012년 1월 개정된 인삼산업법 시행규칙은 흑삼을 홍삼과 구분하여, "흑삼은 수삼을 증기나 그 밖의 방법으로 쪄서 익혀 말린 것으로서 담흑갈색 또는 흑다갈색을 띠는 것으로, 제조기준에 의하면 증숙과 건조 과정이 3회 이상 반복된 것을 지칭"한다고 정의한다. 증숙 및 건조에 의해 흑삼은 저장성이 향상될 뿐 아니라, 가열 및 가수분해 과정을 거치면서 유효성분에도 화학적 변화가 수반되어 수삼에는 존재하지 않는 흑삼 특유의 사포닌이 형성되어 고유한 약리효과를 갖게 된다.

콜레스테롤은 세포 원형질막의 구성성분, 부신과 생식선에서의 스테로이드 호르몬의 원료, 담즙의 원료 및 혈중 지단백의 구성성분으로 필수적이다. 이 중 저밀도 콜레스테롤(LDL)은 지단백질 중 산화감수성이 가장 크고, 산화된 LDL은 세포에 독성을 주어 동맥경화를 전개 및 진행시키는 원인이 된다. 반면 고밀도 콜레스테롤(HDL)은 혈관에 축적된 콜레스테롤을 간으로 운반하는 역할을 하는 일명 '좋은 콜레스테롤'로, 높은 HDL 콜레스테롤 수치는 심장마비나 뇌졸중의 위험을 감소시킨다. 중성지방은 지질의 한 종류로 콜레스테롤과 다르며, 높은 중성지방 수치는 심장마비나 뇌졸중의 위험을 증가시킨다. 이러한 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 중성지방이 증가하거나 HDL 콜레스테롤이 감소하는 증상의 질환을 고지혈증(hyperlipidemia), 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia) 등으로 지칭한다. 이상지질혈증은 상기 질환들을 포괄하는 개념의 질환명이다. 이상지질혈증의 치료에는 스타틴(statin), 피브레이트(fibrate), 니코틴산(nicotinic acid), 에제티미브(Ezetimibe), 오메가-3 지방산(Omega-3 fatty acid) 등의 약물을 단독 복용 혹은 병용 복용한다. 그러나 상기 약물은 간독성이나 근육병증, 혈당상승, 소화장애와 같은 부작용이 있어, 부작용을 동반하지 않으면서 인체에 반드시 필요한 콜레스테롤은 유지하면서, 고지혈증을 유발할 수 있는 콜레스테롤 또는 중성지방의 농도를 감소시키는 기능을 갖는 물질의 개발이 필요하다.

인삼의 성분 중 사포닌 성분은 혈중 콜레스테롤의 지질대사와 관련된 효소활성을 촉진하고, 콜레스테롤의 전환을 촉진함으로써 동맥경화의 중요한 위험인자인 고지혈증을 개선하는 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 고려인삼을 성인남녀에게 투여한 임상실험 결과 역시 HDL 콜레스테롤의 증가, 동맥경화지수(atherogenic index)의 개선 및 베타-지단백(β-lipoprotein)의 저하 등 동맥경화의 예방에 유효한 효과가 있음을 보고하였다. 이에 더하여 공개특허 제10-2014-0041419호에서는 흑삼이 수삼에 비하여 총콜레스테롤 및 중성지방의 저하와, HDL 콜레스테롤 및 동맥경화지수의 저하에 더 효과적임을 보고하였다.

한편 흑삼은 세척한 수삼을 증삼기 내에 넣고 수증기를 사용하여 94~100℃ 정도로 증삼하고 건조하는 것을 최소 3회 이상 반복하여 제조한다. 이러한 증삼과정에서 수삼 내부 온도의 상승에 의한 수삼의 부피 팽창과 전분 팽윤력으로 인하여 동체균열이 40% 정도로 발생하게 된다. 동체균열은 단순히 형태의 불량으로 인한 상품가치의 하락 뿐 아니라 엑스의 유출을 야기하므로 유효성분의 손실로도 이어질 수 있음은 자명하다. 또한 흑삼은 증삼과정에서 유효성분의 변화가 일어나는 것으로, 증삼 및 추출 조건에 따라 콜레스테롤 개선 효능에도 영향이 있을 수 있으므로, 증삼 또는 추출 조건의 변화에 따라 조성물의 효능에 차이가 있을 수 있다.

공개특허 제10-2014-0041419호

본 발명은 콜레스테롤 개선 효과가 우수한 흑삼 추출물을 함유하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 흑삼의 알콜 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 흑삼의 알콜 추출물은 고콜레스테롤 혈중모델에서 식이효율을 감소시키고, 혈중콜레스테롤 수준을 감소시켰다. 특히 HDL-콜레스테롤은 오히려 증가한 것에 반해 LDL-콜레스테롤로 중성지방을 선택적으로 감소시켜 동맥경화지수를 크게 낮추는 효과가 있었다. 흑삼의 알콜 추출물은 물 추출물에 비해 식이효율의 저하나 동맥경화지수 감소 효과가 현저하였으며, 대조군에 대해 GPT 값을 유의적으로 낮추는 효과가 있었다. 장기 무게 측정에 있어서도, 흑삼의 알콜 추출물만이 간과 신장의 무게를 대조군에 비해 유의적으로 감소시켰다. 콜레스테롤 관련 유전자인 ACAT2, HMG CoAR, SREBP2 mRNA의 발현량에도 영향을 미치어 흑삼의 알콜 추출물은 간에서 콜레스테롤의 합성을 억제하는 기전으로 콜레스테롤 개선 효과를 나타내는 것으로 사료된다.

사전 실험에 의하면 상기 알콜수용액은 30%~70%(v/v)의 알콜을 함유하는 것이 바람직하였다. 알콜의 함량이 너무 낮거나, 높은 경우에는 흑삼의 물 추출물에 비해 고콜레스테롤혈증에 대한 효과의 현저성이 관측되지 않았다.

상기 흑삼의 제조 시에는 55~70℃ 습열에서 45분~300분간 예열한 후 증삼하는 것이 바람직하다. 증삼 전 습열로 55~70℃에서 예열하는 것에 의해 증삼과정에서의 동체의 균열을 감소시키고, 엑스의 유출로 인한 손실 역시 감소시킬 수 있었다. 예열 온도가 너무 낮으면 예열의 효과가 없으며, 70℃이상인 경우에는 예열 온도가 너무 높아 예열과정에서도 동체 균열이 일어날 수 있다. 또한 예열 시간이 45분 미만인 경우 예열의 효과가 충분하지 않았고, 예열 시간이 300분을 초과한다고 하여도 예열로 인한 효과가 더 증가하지는 않았다.

이에 더하여 흑삼의 제조 시 증삼 공정은 75~85℃에서 수행되는 것이 바람직하였다. 증삼 온도가 75℃보다 낮으면 갈색화 촉진이 미흡하며, 온도가 85℃보다 높으면 신맛과 떫은 맛이 생겼다. 더구나 증삼 온도가 높아질수록 동체 균열이 심하고, 가용성 엑스의 용출현상이 심하여 수율이 크게 감소하였다. 75~85℃에서 증삼하여 제조한 흑삼과 통상의 흑삼 제조 공정인 약98℃에서 증삼하여 제조한 흑삼을 사용하여 고콜레스테롤 식이를 급이한 마우스에 병용시킨 결과, 두 군 대조군에 비해 모두 AI 지수가 낮아졌으나, 두 군간 유의적인 효과의 차이는 없었다(데이터 미기재). 따라서 수율과 품질을 고려하면 본 발명의 흑삼은 75~85℃에서 증삼하여 제조하는 것이 바람직하다.

흑삼 제조공정에서의 동체 균열을 더욱 방지하여 유효성분인 엑스의 유출을 더욱 줄이기 위해서, 본 발명의 흑삼은 수삼의 동체를 내열성 재질로 감아서 밴딩한 상태에서 1차 증삼하는 것이 더욱 바람직하다. 하기 실시예에서는 식품용 랩으로 감은 후 끈으로 묶어주었으나, 이에 한정되는 것은 아니며 동체의 급격한 팽창을 억제할 수 있도록 랩핑 또는 밴딩할 수 있는 것이라면 어떤 형태라도 적용이 가능하다.

상기 약학 조성물은 약제학적 분야에 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 본 발명에서 상기 '약제학적으로 유효한 양'이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 유효 용량 수준은 환자의 질병 종류, 중증도, 연령, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 간독성이나 신독성에 대한 시험결과 독성을 나타내지 않았으며 상기 요소를 모두 고려하여 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있을 것이다.

또한, 본 발명은 흑삼의 알콜수용액 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 개선용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.

이상과 같이 본 발명의 흑삼 추출물을 함유하는 조성물에 의하면 콜레스테롤 개선 효과가 우수하여 고콜레스테롤혈증의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 흑삼의 제조과정에서 엑스의 유출을 최소화하여 고콜레스테롤혈증에 대한 효과가 더욱 현저하여 고콜레스테롤혈증의 예방 및 치료, 개선에 효율적으로 이용될 수 있다.

도 1은 증삼온도에 따른 흑삼의 제조예 사진.
도 2는 증삼 시 랩핑 및 밴딩에 의한 동체 균열 억제효과를 보여주는 사진.
도 3은 고콜레스테롤혈증 병태모델에서 실험군 별 장기 무게의 차이를 보여주는 그래프.
도 4는 고콜레스테롤혈증 병태모델의 실험군에서 간조직에서 발현되는 ACAT2 mRNA 유전자 발현을 나타내는 그래프.
도 5는 고콜레스테롤혈증 병태모델에서 실험군의 HMG-CoAR mRNA 유전자 발현을 나타내는 그래프.
도 6은 고콜레스테롤혈증 병태모델에서 실험군의 간조직에서의 SREBP2 mRNA 유전자 발현을 나타내는 그래프.
도 7은 고콜레스테롤혈증 병태모델에서 각 실험군의 간조직을 H&E 염색한 이미지.
도 8은 고콜레스테롤혈증 병태모델에서 각 실험군의 간조직을 오일-레드 O 염색한 이미지.
도 9는 고콜레스테롤혈증 병태모델에서 각 실험군의 복부지방조직을 오일-레드 O 염색한 이미지

이하 첨부된 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다. 또한 청구범위의 구성요소에 도면부호가 병기되어 있는 경우, 이는 설명 위한 예시적인 것일 뿐 도면부호가 구성요소를 한정하려는 의도가 아님도 명백할 것이다.

실시예

실시예 1 : 흑삼의 제조

1) 수삼의 전처리에 의한 흑삼의 균열 억제효과 평가

사전실험에 의하면 흑삼 제조의 1차 증숙과정에서 심각한 균열현상이 있었다. 이에 흑삼 제조 과정에서 동체 균열로 인한 상품가치 저하와 엑스의 유출을 방지하기 위하여 수삼의 전처리에 의한 균열 억제효과를 평가하였다.

금산인삼시장에서 4년근 수삼을 10월 초순에 구입하여 세척하였다. 세척된 수삼을 60℃에서 24시간 건조하거나, 항온항습기에서 0, 30, 45, 90, 180 또는 300분간 60℃ 습열로 예열 처리하였다. 이후 전처리된 수삼을 98℃에서 7시간 증삼하고 60℃에서 건조하는 것을 9회 반복하였다. 최종 건조는 60℃에서 24시간 건조하여 흑삼을 제조하였다. 1차 증숙 후 균열 억제효과를 평가한 결과, 60℃에서 건조하여 피부백삼을 제조하여 증숙한 경우에는 균열 현상이 나타나지 않았다. 60℃로 습열처리한 경우에는 일부 균열이 관측되었으나 전처리를 하지 않은 경우에 비해 그 빈도가 현저히 감소하였다. 습열처리 시간은 45분 이상인 경우에는 전처리 시간이 증가하여도 균열에 미치는 영향은 유사하였다.

흑삼을 피부백삼으로 제조한 경우에는 균열은 없었으나 갈색화반응이 미약하였고, 백삼 고유의 흑냄새와 백삼 맛이 남아있어 흑삼 제조에는 적합하지 않았다. 반면 60℃ 습열을 이용하여 예열처리한 흑삼은 갈색도 촉진이 양호하였으며 최종 제조된 흑삼의 쓰고 텁텁한 맛을 다소 감소시킬 수 있었다.

2) 증삼 온도에 따른 흑삼의 제조

60℃ 습열로 예열처리한 수삼을 사용하여 증삼 온도에 따라 흑삼을 제조하고 그 품질을 비교하였다. 먼저 세척된 수삼을 60℃ 습열로 45분간 예열하고, 각각 60, 70, 80, 90 또는 98℃에서 7시간 증삼하고 60℃에서 건조하는 것을 9회 반복하였다. 최종 건조는 60℃에서 24시간 건조하여 흑삼을 제조하였다. 도 1은 각 온도에서 제조한 흑삼의 사진이다. 도 1에서 확인할 수 있듯이, 70℃ 이하에서 제조한 흑삼은 갈색도 촉진이 다소 미흡하였으나, 80℃ 이상에서는 갈색도 정도가 양호하였다.

하기 표 1은 1차 증삼 후 건조하여 제조한 홍삼무게를 대조군으로 한 증삼 온도에 따른 흑삼의 무게 수율과 10배(v/w)의 50% EtOH로 추출한 엑스의 수율을 나타낸다.

먼저 1차 증삼에 의해 제조한 홍삼 대조구의 수삼 대비 수율은 28.47%로, 98℃에서 제조한 흑삼은 10.78%가 감소하여 수삼으로부터의 최종 수율은 25.4%를 나타내었다. 수율감소는 증삼온도가 감소할수록 완화되어 80℃에서 제조한 흑삼은 홍삼 대조구 대비 3.22%가 감소하여 제조수율이 27.54%였다.

증삼 온도가 증가할수록 증삼과정 중 가용성 엑스의 용출현상이 심하여 98℃ 흑삼 제조구는 엑스의 수율이 26.1%에 불과하였으나, 80℃ 흑삼 제조구는 31.1%로 약 20%정도 수율이 향상되었다. pH미터(orion-2 star pH meter, seoul, korea)를 사용하여 pH를 측정한 결과 80℃ 흑삼 제조구는 4.96인 것에 비해 98℃ 흑삼 제조구는 4.25로 고온제조 흑삼의 신맛과 떫은 맛의 주된 요인이 됨을 알 수 있다.

3) 랩핑 및 밴딩에 의한 흑삼의 균열 억제효과 평가

랩핑 및 밴딩이 증삼 과정에서의 균열을 추가로 방지할 수 있는 지 확인하였다. 세척된 수삼을 식품용 랩과 끈을 사용하여 랩핑 및 밴딩한 후 60℃에서 45분간 습열로 예열처리하고, 98℃에서 7시간 증삼하였다. 비교를 위하여 세척된 수삼을 함께 98℃에서 7시간 증삼한 후 균열의 정도를 비교하였다. 도 2는 증숙된 삼의 사진으로 밴딩처리하지 않은 경우에는 균열의 정도가 빈번하였으나 (붉은 원으로 표시), 랩핑 및 밴딩된 경우에는 균열이 빈도가 급감한 것을 확인할 수 있다(푸른 원으로 표시).

실시예 2 : 흑삼 추출물의 콜레스테롤 개선 효과 검정

1) 시료의 제조

금산인삼시장에서 4년근 수삼을 10월 초순에 구입하여 세척한 다음 식품용 랩과 끈을 사용하여 랩핑 및 밴딩하였다. 60℃에서 45분간 습열로 예열처리하고, 80℃에서 7시간 증삼하였다. 이후 랩핑과 밴딩을 풀고 2시간 건조와 80℃ 7시간 증삼을 8회 반복하고, 24시간 건조하여 저온 흑삼을 제조하였다.

제조된 흑삼 시료를 컷터를 이용하여 약 1~1.5cm 크기로 절단한 다음 50%(v/v) 에탄올 10배량(v/w)을 가하고 환류냉각관을 연결하여 80℃ 수조에서 8시간 추출하였다. 추출액을 별도로 보관하고 7배의 50%(v/v) 에탄올을 가하여 8시간씩 2회 더 추출하였다. 추출액을 합하여 여과포 및 여지(midium fast: chm F1001, CHMLAB GROUP in EEC)로 여과하고 여액을 60℃ 수조에서 감압농축하여 알콜엑스(BG_EtOH, 수분: 35.55%)을 제조하였다.

물엑스(BG_H2O)는 50% 에탄올 대신 증류수를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법에 의해 제조하였으며 수분 함량은 34.45%였다.

2) 실험동물의 준비

7주령의 수컷 SD 흰쥐를 대한바이오링크(대한민국)로부터 분양받아 사용하였다. 분양 받은 실험동물은 표준식이(조단백질 22.1%이상, 조지방 8.0%이하, 조섬유 5.0%이하, 조회분 8.0%이하, 칼슘 0.6%이상, 인 0.4%이상, 삼양사 Co. Korea)와 물을 자유롭게 공급하면서 1주일 간 실험실 환경에 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 1주일 순화시킨 건강상태가 양호한 8주령의 SD 흰쥐에 표준식이에 콜레스테롤 1.5%, 비타민D2 1.25 million IU/kg, cholic acid 0.5%를 첨가한 고콜레스테롤 식이를 37일간 공급하였다. 한편 8주령부터 표준식이를 계속 공급한 군을 정상군으로 하였다. 고콜레스테롤 식이를 1주일 공급 후 7시간 절식 후 꼬리 정맥에서 채혈한 결과 혈중 콜레스테롤 농도가 200㎎/mL 이상이 되어 고콜레스테롤혈증이 유발되었음을 확인하고, 5마리씩 4개의 군으로 나누어 하기 조제 및 식이를 공급하며 30일간 추가로 사육하였다. 대조군은 별도의 조제를 공급하지 않고 고콜레스테롤 식이만을 공급하였다. BG_H2O군은 고콜레스테롤 식이를 공급하면서 1)에서 제조한 흑삼 물엑스를 매일 200mg/kg의 용량으로 매일 2회씩 경구투여하였다. BG_H2O군은 고콜레스텔롤 식이를 공급하면서 1)에서 제조한 흑삼 알콜엑스를 매일 200mg/kg의 용량으로 매일 2회씩 경구투여하였다. 양성대조군은 고콜레스테롤 식이를 공급하면서 고지혈증 치료제인 로바스타틴을 매일 20mg/kg의 용량으로 매일 2회씩 경구 투여하였다. 동물 사육실의 환경은 항온(24±2℃), 항습(50±5%) 및 12시간 간격의 광주기(light on 07:00~19:00)로 명암으로 조절되는 SPF 환경을 유지하였다. 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였다.

3) 체중 및 식이효율 측정

사육 전 및 사육이 끝난 사료섭취량 및 실험동물의 체중을 측정하여 (최종 체중-처음 체증)을 계산하여 체중 변화를 평가하고, 체중증가량(g)/사료섭취량(g) × 100의 공식에 의해 식이효율(FER, %)을 계산하여 하기 표 2에 나타내었다.

식이효율은 고콜레스테롤혈증을 나타내는 하나의 척도로, 식이효율의 수치가 적을수록 체중 조절효과가 있다고 할 수 있다. 대조군은 정상군에 비해 식이효율이 다소 증가하였으며, 로바스타틴 투여군, BG_H2O군 및 BG_EtOH군은 대조군에 비해 식이효율이 감소된 추이를 나타내었으나 통계적인 유의성은 없었다.

4) 혈액 지질생화학적 분석

사육이 끝난 실험동물은 희생 전 3시간 동안 절식시킨 후 에틸 에테르로 마취하여 심장 천좌법으로 채혈한 후 30분 이내에 3,000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청은 -70℃에서 보관하며 혈액생화학적 검사를 실시하였다.

BD Vacutainer (REF,367955, UK)로 분리한 혈청에서 간 기능의 지표인 GOT와 GPT, 신장 기능의 지표인 Creatinine, 혈청 및 간의 지질함량의 지표인 총콜레스테롤, HDL (High-density lipoprotein), 중성지방(triglyceride)의 함량을 생화학자동 분석기(Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan)를 이용하여 측정한 다음 하기 수식에 의해 LDL-콜레스테롤 및 동맥경화지수(Atherogenic index, AI)를 산출하였다. 하기 표 3은 측정 결과를 정리한 결과이다.

LDL-콜레스테롤 = 총콜레스테롤 - (HDL-콜레스테롤 + 중성지방/5)

동맥경화지수 (AI) = (총콜레스테롤 - HDL-콜레스테롤)/HDL-콜레스테롤

정상군에 비해 고콜레스테롤 식이를 제공한 대조군에서는 총 콜레스테롤 수준이 크게 중가하였으며, 로바스타틴 투여군은 대조군에 비해 혈청 내 총 콜레스테롤 수준이 감소하기는 하였으나, 통계적 유의성은 나타나지 않았다. 이에 비해 BG_H20군과 BG_EtOH군에서는 대조군에 비해 각각 33.9%와 30.4%로 유의적으로 감소하였다.

로바스타틴, BG_H20군 및 BG_EtOH군은 모두 대조군에 비해 LDL-콜레스테롤의 감소를 나타내었으며, 이로 인해 동맥경화지수가 각각 9.6%, 27.7%, 34.9%로 감소하였다. 특히 BG_EtOH군은 콜레스테롤 개선효과가 현저하여 HDL-콜레스테롤은 다소 증가하고, LDL-콜레스테롤 및 중성지방은 크게 감소하여 AI 지수 감소가 가장 현저하였다. 간독성을 나타내는 GPT 지수에 있어서도 다른 군보다 감소효과가 뚜렷하였다. 신독성을 나타내는 크레아티닌 지수는 큰 차이가 없어, 신독성을 유발하지 않음을 확인할 수 있었다.

5) 장기 및 지방무게 측정

4)에서 혈액을 채취한 즉시 각 실험동물 장기조직을 적출하여 칭량하였다. 도 3은 칭량결과를 보여주는 그래프로, 고콜레스테롤혈증 대조군의 간무게(22.058±0.493)는 정상대조군의 간무게(11.750g±0.484)에 비하여 두 배 가까이 증가하였다. 로바스타틴 투여군(22.066±0.782)은 대조군과 차이가 없었으며, BG_H2O군(20.396±1.443)은 감소하기는 하였으나 유의적인 차이는 없었다. BG_EtOH군(19.246±0.358)은 통계적으로 유의하게 감소하였다(p<0.001). 신장무게 역시 대조군은 정상군에 비해 5.7% 정도 증가하였으며, 로바스타틴과 BG_H2O 투여군은 대조군에 비해 다소 감소하였으나 유의적인 차이는 없었고 BG_EtOH군만이 유의적인 차이를 나타내었다. 반면 비장무게는 모든 실험군에서 유의적인 차이가 없었다.

6) 간조직에서의 콜레스테롤 관련 유전자 발현 분석

5)에서 칭량이 완료된 간 조직으로부터 RNAzol^B(Tel-Test) 용액을 사용하여 RNA를 추출하였다. 구체적으로, 간 조직에 RNAzol^B 500 ㎕를 넣고 homogenizer로 조직을 분쇄한 후, 클로로폼(CHCl₃) 50 ㎕를 첨가하고 다시 15초간 혼합하였다. 이를 얼음에 15분간 방치한 후 13,000 rpm에서 원심 분리하여 약 200 ㎕의 상층액을 회수하였다. 상층액에 이소프로판올 200 ㎕를 혼합하여 천천히 흔들고 얼음에서 15분간 방치하였다. 이를 다시 13,000 rpm에서 원심 분리한 후 80% EtOH로 수세하고 3분간 진공건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 DEPC(diethyl pyrocarbonate)를 처리한 20 ㎕의 증류수에 녹여 75 ℃에서 불활성화 시킨 후 first strand cDNA합성에 사용하였다.

역전사 반응은 위에서 추출한 총 RNA 3 ㎍을 DNase I (10U/㎕) 2U/tube를 37℃ heating block에서 30분간 반응한 후 75℃에서 10분 동안 변성시키고, 2.5 ㎕ 10 mM dNTPs mix, 1 ㎕ random sequence hexanucleotides (25 pmole/ 25 ㎕), RNA inhibitor로서 1 ㎕ RNase inhibitor (20 U/㎕), 1 ㎕ 100 mM DTT, 4.5 ㎕ 5×RT buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂)를 가한 후, 1 ㎕의 M-MLV RT (200 U/㎕)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하였다. 20 ㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에서 5초간 원심침강하여 37℃ heating block에서 45분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성하였다. first-strand cDNA를 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 유전자 발현을 위한 rt PCR에 사용하였다.

rt PCR은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행하였으며, rt PCR에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 4와 같다.

유전자 발현은 TaqMan probe (FAM dye-labeled, ABi, USA)를, internal standard는 Mouse GAPDH probe set (Applied Biosystems, 4352339E); Endogenous Control(VIC

/ MGB Probe, Probe limited)를 사용였으며, 프라이머의 최종 농도가 200 nM가 되도록 반응시켰다. rt PCR은 pre-denaturation을 50℃에서 2 분, 94 ℃에서 10분 하였으며, 95℃에서 0.15 min, 45℃에서 1분을 40cycle 수행하였다. 실험군과 대조군은 internal standard로 G3PDH를 사용하여 target group의 Quantitative PCR

y = x(1+e)n

x = starting quantity

y = yield

n = number of cycles

e = efficiency

로 계산하여 RQ (relative quantitative)을 측정하였다.

도 4 ~ 도 6은 각각 ACTA 2(acyl coenzyme A : cholesterol acyl transferase 2), HMG-CoAR (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase) 및 SREBP2 (sterol regulatory element binding protein number 2) 유전자의 발현을 분석한 결과이다.

ACAT2는 간으로부터 콜레스테롤을 방출시키는데 관여하는 4개의 효소 중의 하나로, 콜레스테롤이 동맥을 순환하도록 함으로써 치명적인 플라크를 형성하는 요인이 된다. 유전적으로 ACAT2를 생성하지 못하도록 조작된 마우스는 정상적으로 ACAT2 효소를 생성하는 마우스보다 동맥경화 정도가 85%나 적게 나타났다고 보고된 바 있다. 도 4는 고콜레스테롤혈증 병태모델의 실험군에서 간조직에서 발현되는 ACAT2 mRNA 유전자 발현을 나타내는 그래프로, 대조군 중 한 개체의 ACAT2 mRNA 유전자 발현의 RQ값을 1로 했을 때 실험군의 상대정향 값을 분석하였다. 고콜레스테롤혈증 대조군의 간조직에서 ACAT2 mRNA 유전자 발현은 정상군 0.456 (RQ)에 비하여 약 2.95배 이상 증가하였다. 로바스타틴(p<0.05)과 BG_EtOTH(p<0.01) 투여군은 대조군에 비해 RQ값이 통계적으로 유의하게 감소하였으며, BG_EtOH군은 정상군과 유사한 값을 나타내었다. BG_H2O군은 대조군에 비해서는 RQ값이 감소하였으나 통계적으로 유의하지는 않았다.

HMG-CoAR은 콜레스테롤 생합성에서 율속 단계인 메발론산으로의 HMG-CoA 전환을 자극하는 환원 효소로 HMG-CoAR의 유전자 발현이 감소하면 총 콜레스테롤이 감소한다고 설명할 수 있다. 도 5는 고콜레스테롤혈증 병태모델에서 실험군의 HMG-CoAR mRNA 유전자 발현을 나타내는 그래프로, 대조군 중 한 개체의 RQ값을 1로 했을 때 실험군의 상대정향 값을 분석하였다. 대조군의 간조직에서 HMG-CoAR mRNA 유전자 발현은 정상군 0.496 (RQ)에 비하여 약 2.29배 이상 증가를 나타내었다. 로바스타틴, BG_H2O 및 BG_EtOH 군 모두는 대조군에 비해 RQ값이 통계적으로 유의하게 감소하였다(p<0.05). 특히 BG_H2O 및 BG_EtOH 군은 모두 정상군과 유사한 RQ값을 나타내었다.

간세포의 콜레스테롤 함량이 감소할 때 세포질에 비활성 형태로 상주하는 SREBPs는 단백 분해 효소로 인해 쪼개지고 전사 인자로 활성화되어 세포핵으로 옮긴 뒤, 유전자에 직접적으로 결합되거나 HMGCR과 LDLR 등의 콜레스테롤 생합성에 간접적으로 관여하여 상기 유전자들의 발현이나 전사를 조절하게 된다. 도 6은 고콜레스테롤혈증 병태모델에서 실험군의 간조직에서의 SREBP2 mRNA 유전자 발현을 나타내는 그래프로, 대조군 중 한 개체의 RQ값을 1로 했을 때 실험군의 상대정향 값을 분석하였다. 대조군의 간조직에서 SREBP2 mRNA 유전자 발현은 정상군 0.727 (RQ)에 비하여 약 1.88배 이상 증가를 나타내었다. 로바스타틴, BG_H2O 및 BG_EtOH 군 모두는 대조군에 비해 RQ 값이 감소하였으나, 로바스타틴 군만이 통계적인 유의성을 나타내었다(p<0.05). BG_H2O 및 BG_EtOH 군은 대조군에 대한 RQ 값의 감소가 유의성을 나타내지는 않아쓰나, 평균값은 정상군과 유사하였다.

7) 병리조직분석

5)에서 적출한 간과 복부지방조직을 절취하여 10% neutral buffered formalin에 24시간 동안 고정 시킨 다음 graded alcohol로 탈수시키고 파라핀으로 포매하여 block을 제작하였다. 상기 block으로부터 microtome을 사용하여 4 ㎛ 두께의 조직절편을 제작하고 hematoxylin & eosin (H&E) 염색 또는 오일-레드 O 염색을 시행한 뒤 xylene clearing을 거쳐 permount로 처리한 후 광학현미경위에서 조직 또는 장기별 특이 병변의 유무를 관찰하였다. 도 7과 8은 각 실험군의 간조직을 H&E 염색, 오일-레드 O 염색한 이미지를, 도 9는 복부지방조직을 오일-레드 O 염색한 이미지를 나타낸다.

도 7과 8의 대조군에서 보듯이 지방간이 유발된 간조직에서는 마이크로 지방구가 간세포질에 축적되어 거대소포성(macrovesicular) 지방증으로 진행되어 조직상에 큰 지방구들이 나타나며, 또한 헤마톡실린-에오신(H-E)과 oil red O 염색으로 염색 시 지방의 축척으로 회색지방축적세포들이 넓게 분포하는 지방간이 나타났다. 로바스타틴군은 대조군에 비해 회색지방축적세포들과 거대소포성 지방증이 감소하였으며, BG_H2O 및 BG_EtOH는 로바스타틴 군보다도 그 효과가 더욱 현저하였다.

도 9는 고콜레스테롤혈증 병태모델에서 시험물질에 따른 복부지방조직 검사 (H&E 염색) 결과이다. 고콜레스테롤식이 고콜레스테롤혈증 흰쥐모델에서 시험물질에 따른 지방 조직 형태에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 고콜레스테롤식이 섭취로 인해 고콜레스테롤혈증이 유발되면 지방세포의 크기가 현저히 증가하게 된다. 도 9에서 대조군은 정상군에 비하여 지방세포 크기가 증가한 반면, 로바스타틴, BG_H2O 또는 BG_EoTH 투여군에서는 대조군에 비해 지방세포 크기의 감소를 나타내었다.

<110> DBIO <120> Composition Comprising Black Ginseng Extract with Improving Activity of Cholestrol <130> P0415-277 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gcaaagcctc gtgacatcct 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gccattggct gtctgagtca a 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctatactgcc aggagtggta cgc 23 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agctcccaaa atgtcggct 19 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 acatccgtct ccagtccaaa a 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcaaagcctc gtgacatcct 20

Claims (6)

1. 흑삼의 알콜수용액 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 알콜은 30~70%(v/v)의 알콜을 함유하는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 흑삼의 제조 시 55~70℃ 습열에서 45분~300분간 예열한 후 증삼하는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
   
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 흑삼의 제조 시 증삼 공정은 75~85℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 흑삼의 제조 시 동체의 균열을 억제하기 위하여 수삼의 동체를 내열성 재질로 감아서 밴딩한 상태에서 1차 증삼하는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
6. 흑삼의 알콜 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 개선용 식품 조성물.

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