WO2005110400A1 - リパーゼ阻害剤、コレステロールエステラーゼ阻害剤、中性脂肪吸収抑制剤、コレステロール吸収抑制剤及びコレステロールエステル吸収抑制剤 - Google Patents

リパーゼ阻害剤、コレステロールエステラーゼ阻害剤、中性脂肪吸収抑制剤、コレステロール吸収抑制剤及びコレステロールエステル吸収抑制剤 Download PDF

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glabridine
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lipase
methylglabridine
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Toshio Hayami
Hideyuki Kishida
Naoki Arai
Shinichi Yokota
Kazuya Hamada
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Kaneka Corporation
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Definitions

  • Lipase inhibitor cholesterol esterase inhibitor, neutral fat absorption inhibitor, cholesterol absorption inhibitor and cholesterol ester absorption inhibitor
  • the present invention relates to a lipase inhibitor, a cholesterol esterase inhibitor, a neutral fat absorption inhibitor, a cholesterol absorption inhibitor and a cholesterol ester absorption inhibitor, an obesity preventing agent, an obesity treating agent, and their effects.
  • the present invention relates to a composition applicable to foods, medicines, pet foods, feeds, and the like, and a method for producing them.
  • Obesity is said to be a cause of lifestyle-related diseases, that is, visceral fat obesity, type 2 diabetes, hyperlipidemia, hypertension and the like. These are also known as multiple 'risk' factor syndromes, which eventually cause vascular diseases such as arteriosclerosis. Consumers, on the other hand, are more interested in dieting, but on the other hand, there are more opportunities to eat fats and cholesterol and meat, etc. than before, and it is difficult to abandon such dietary preferences. Is reality.
  • Other substances that suppress the absorption of neutral fats include substances that inhibit lipase secreted by the spleen.
  • Spleen lipase mainly removes triglycerides (triglycerides) in the duodenum.
  • 2-Hydrolyses to monoacylglycerol and fatty acids.
  • the hydrolyzate forms micelles with bile and phospholipids and is absorbed from small intestinal epithelial cells. Therefore, the substance that inhibits spleen lipase can suppress the absorption of neutral fat by a mechanism different from the above-mentioned dietary fiber.
  • Orlistat product name: XENICAL;
  • Hoffinan-La Roche has been used as a medicament for obesity control based on this mechanism.
  • Foods having lipase inhibitory activity include chitin 'chitosan, plant sterols (patent document 1), pectin (patent document 2), soybean protein (non-patent document 1), phosphatidylcholine (non-patent document 2). ), Extracts of various plants, vegetables, teas and the like (Patent Documents 3, 4, 5, and 6) and specific conjugates in the extracts (Patent Document 7).
  • these foods require a large amount of food to exert a definite effect due to insufficient lipase inhibitory activity, and the safety of long-term food consumption is unknown. And other issues.
  • cholesterol causes an increase in the incidence of stroke, heart disease, cancer and the like in proportion to an increase in its blood concentration. It is feared that when the concentration of cholesterol in the blood, especially the LDL (low-density lipoprotein) cholesterol, which is said to be bad, increases, they are oxidized and cause arteriosclerosis. In particular, with the increase in the consumption of meat, eggs, and dairy products by consumers, health foods have been introduced, which are said to suppress the absorption of cholesterol from the diet.
  • LDL low-density lipoprotein
  • components that exhibit a cholesterol absorption inhibitory effect include soy protein, phospholipid-bound soy peptide, plant sterol ester, psyllium seed-derived dietary fiber, low-molecular sodium alginate, chitosan, and the like (Non-patent Documents). 3). These components are said to inhibit cholesterol absorption and promote excretion by binding or conjugating with cholesterol in the intestine. At the same time, the fat-soluble vitamins (vitamin A, D, E, K) and
  • Non-Patent Documents 4 and 5 It has been reported that the above-mentioned lipase may be involved in the above-mentioned cholesterol absorption action.
  • cholesterol esterase (EC 3.1.1.13) secreted in the upper small intestine It has been reported that it is significantly involved in the absorption of cholesterol, and its inhibitor has also been developed (Non-Patent Documents 6 and 7).
  • Kanzo is a plant belonging to the genus Glycyrrhiza, a legume family.It has been used as a herbal medicine and medicine for ulcers and hepatitis for a long time, and has been used as a food additive (for example, a sweetener). Is abundant and safe food. Varieties with V ⁇ deviation also contain a large amount of flavonoids, which are hydrophobic components, in addition to glycyrrhizin (glycyrrhizic acid), which is a hydrophilic component.
  • Patent Document 8 discloses that, among extracts from which kanzoka can also be obtained, kanzo ⁇ hydrophobic extract containing a large amount of kanzo ⁇ flavonoids and having a very small amount of glycyrrhizin content Prevention and / or improvement of multiple 'risk' factor 1 syndrome A useful point is disclosed (Patent Document 8).
  • Patent Document 9 discloses that this licorice hydrophobic extract has PPARy ligand activity, and its active ingredient is a flavonoid (Patent Document 9). Specifically, the document states that the characteristic flavonoids glabrene, glabridine, glabrol, 3, -hydroxy 4'-O methyl glabridine, 4, O methyl glabridine and It discloses that Hispagrabridine B has high PPARy ligand activity.
  • Patent Documents 10 and 11 disclose that in the invention of a lotion or a hair nourishing agent, a predetermined kanzo extract has a lipase inhibitory effect (Patent Documents 10 and 11).
  • Patent Document 12 discloses that a prescribed kanzo extract reduces serum total cholesterol concentration and LDL concentration (Patent Document 12).
  • Patent Document 12 it is unknown in the literature whether or not it has the ability to suppress the absorption of dietary cholesterol and the like.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-246746
  • Patent Document 2 JP 2003-199534
  • Patent Document 3 JP-A-9-143070
  • Patent Document 4 JP-A-8-268882
  • Patent Document 5 JP-A-2002-53484
  • Patent Document 6 JP 2004-2254A
  • Patent Document 7 JP-A-9-40689
  • Patent Document 8 WO02Z47699
  • Patent Document 9 # 112002-226486
  • Patent Document 10 JP-A-2000-226324
  • Patent Document 11 JP-A-09-241131
  • Patent Document 12 JP-A-2002-114695
  • Non-patent document l Agric. Biol. Chem., 38, 97-101 (1974)
  • Non-Patent Document 2 Agric. Biol. Chem., 40, 889-897 (1976)
  • Non-Patent Document 3 FOODS & FOOD INGREDIENTS JOURNAL OF JAPAN, 209 (7), 559-567 (2004)
  • Non-Patent Document 4 Biochem.J., 339, 615-620 (1999)
  • Non-Patent Document 5 J. Biol. Chem., 278 (44), 42899-42905 (2003)
  • Non-Patent Document 6 BMC Pharmacology, (2004), 4, 1-9
  • Non-Patent Document 7 J. Biol. Chem., 227 (27), 24006-24013 (2002)
  • An object of the present invention is to provide a safe and effective lipase inhibitor, cholesterol esterase inhibitor, neutral fat absorption inhibitor, cholesterol absorption inhibitor, and cholesterol ester absorption inhibitor. Further, the present invention provides a prophylactic agent for obesity, a therapeutic agent for obesity, and a composition applicable to foods, pharmaceuticals, pet foods, feeds, or the like having these effects, and methods for producing them.
  • the present inventors have conducted extensive studies on a variety of compounds, and as a result, have found that glibridin, glabrene, dalabrol, 3, -hydroxy-4,1O-methylglabridine have a lipase inhibitory action and a cholesterol esterase inhibitory action. I'm out. Since these four components below grablidine are present in the plant material of the genus Kanzo, for the purpose of the present invention, the plant material of the genus Kanzo may be used as it is or extracted from it. Analogous compounds can have a similar effect. [0014] The inventor of the present invention orally ingested a composition containing the Kanzo extract to a mouse (or rat) bred on a high fat diet, and obtained the following surprising results:
  • fat As a result of analysis of fat excreted in the feces of the mouse, the amount of cholesterol and cholesterol ester in addition to neutral fats and fatty acids (all of which are hereinafter collectively referred to as “fat”) 1S Actually increased compared to empowered mice and rats that did not take Kanzo extract.
  • the present invention provides a lipase inhibitor, a cholesterol esterase inhibitor, a neutral fat, a cholesterol and cholesterol ester absorption inhibitor, an obesity preventing agent, an obesity treating agent, and their effects.
  • a lipase inhibitor a cholesterol esterase inhibitor
  • a neutral fat a cholesterol and cholesterol ester absorption inhibitor
  • an obesity preventing agent an obesity treating agent
  • the present invention also provides a preparation containing the above composition, for example, a preparation for oral ingestion.
  • the present invention provides (1) glabrene, glabridine, glabrol, 3′-hydroxy-4,
  • the present invention is also a composition for eating and drinking, a pharmaceutical composition, a composition for feed, and a composition for pet food containing the above-mentioned agent.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of inhibitory activity on lipase derived from human and pig spleen.
  • FIG. 2 is a graph showing the measurement results of the amount of fat excreted in feces and the like.
  • FIG. 3 is a graph showing measurement results of changes in blood triglyceride concentration after administration of lipid emulsion.
  • the lipase inhibitor, cholesterol esterase inhibitor, neutral fat absorption inhibitor, cholesterol absorption inhibitor and cholesterol ester absorption inhibitor, obesity preventive agent, obesity treating agent of the present invention, and compositions having the effects thereof are provided by: Glycyrrhiza plant materials such as Glycyrrhiza glabra, G. uralensis, and G. inflata can be obtained.
  • Glycyrrhiza plant materials such as Glycyrrhiza glabra, G. uralensis, and G. inflata can be obtained.
  • Examples of plants called Kanzou include, but are not limited to, Glycyrrhiza glabra, G. uralensis, G. inflata, and hybrids with these or others.
  • the Licorice plant material may preferably be G. glabra.
  • An extract from a plant of the genus Licorice may be suitably used for the purpose of the present invention.
  • the plant material or extract may be at least one compound selected from the group consisting of glabrene, glabridine, glabrol, 3'-hydroxy 4 'O methyl glabridine, 4' O methyl glabridine, hispagrabridine B, and a salt thereof, It contains an ester or glycoside and has an activity of inhibiting a lipase such as a spleen-derived lipase, an activity of inhibiting a cholesterol esterase, an obesity suppressing effect, a fat absorption suppressing effect, and the like.
  • these Ganzo species plant materials or extracts thereof can be used as a lipase inhibitor, a cholesterol esterase inhibitor, a neutral fat absorption inhibitor, a cholesterol absorption inhibitor, a cholesterol ester absorption inhibitor, an obesity prevention agent, or an obesity prevention agent. It can be used as a therapeutic agent or the like (hereinafter referred to as “lipase inhibitor or the like” as appropriate). These agents are used as food additives. Cholesterol esters are generally abundant in meat and dairy products, and oleic acid and other fatty acids are ester-linked to the OH group at position 3 in the cholesterol molecule.
  • Or hyspaglabridin B is a flavonoid classified as isoflavan and is a compound represented by the following general formula (1).
  • Glabrene used in the present invention is a flavonoid classified as isoflav-3-ene, and is a compound represented by the following general formula (2).
  • Glabrol used in the present invention is a flavonoid classified as flavanone, and is a compound represented by the following general formula (3).
  • One of these compounds may be used alone, or two or more of them may be used in combination.
  • esters such as fatty acid esters of the above compounds may also be suitably used.
  • the ester may be any ester suitable for food and drink, for medicine, for quasi-drugs, for cosmetics, for beauty, for feed, for pet food, and the like (hereinafter appropriately referred to as “for food and drink, etc.”). It can be formed with an organic acid or an inorganic acid.
  • Examples of the acid used include hydrochloric acid, sulfuric acid, methanesulfonic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, acetic acid, benzoic acid, oxalic acid, citric acid, tartaric acid, carbonic acid, or phosphoric acid, oleic acid, palmitic acid Long chain fatty acids such as stearic acid, linoleic acid and linolenic acid, and short chain or medium chain fatty acids having about 10 carbon atoms such as acetic acid and butyric acid can be used.
  • salts of the above compounds may also be suitably used.
  • salts of the compound which are acceptable for eating and drinking are alkali metal salts such as sodium and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium or magnesium salts; and Organic ligands, for example, salts formed with quaternary ammonium salts.
  • a glycoside thereof bound to a sugar moiety via one or more hydroxyl groups of the above compound may also be suitably used.
  • the sugar moiety of the glycoside can be any sugar.
  • the sugar moiety is not limited but may include monosaccharides, disaccharides, trisaccharides, oligosaccharides and polysaccharides.
  • the above compounds may exist as enantiomers. If the compounds have at least two or more asymmetric centers, they may exist as diastereoisomers. Such isomers and mixtures in any proportions thereof are included within the scope of the present invention.
  • the above compounds may be optionally substituted.
  • the method for producing these compounds is not particularly limited, and plant materials of the genus Kanzo, such as Glycyrrhiza glabra, G. uralensis, and G. inflata, preferably G. glabra Extracting the plant material by contacting it with a solvent, preferably a hydrophobic or amphiphilic, more preferably an amphiphilic organic or inorganic solvent, by methods well known to those skilled in the art (eg immersion or mixing). including.
  • a solvent preferably a hydrophobic or amphiphilic, more preferably an amphiphilic organic or inorganic solvent
  • Examples of the solvent include, but are not limited to, water, fats and oils such as medium-chain fatty acid triglycerides, dimethylformamide, acetone, dimethyl sulfoxide, N-methyl-2-pyrrolidone, and alcoholic solvents, for example.
  • an ethereal solvent such as tetrahydrofuran or 1,4 dioxane (0.5 to 15% by volume, preferably 2% by volume) or an ester solvent such as ethyl acetate or hydrocarbon Solvents, for example, one or more solvents selected from the group consisting of octane, hexane, toluene or xylene, liquefied carbon dioxide, and oils and fats can be used.
  • the extraction temperature may generally be about 20-100 ° C, usually about 1-80 ° C, preferably about 20-60 ° C.
  • the extraction time may usually be about 0.1 hours to 1 month, preferably about 0.5 hours to 7 days.
  • the extract obtained by the above method or the like may be used as a crude extract, but it may be further purified or purified by column treatment, deodorization treatment, decolorization treatment, or the like. Is also good.
  • the plant material of the genus Kanzo may be used as it is as a lipase inhibitor.
  • the materials are various parts of the plant, such as whole plants, flowers, leaves, roots (rhizomes) Etc. can be used.
  • the material can be milled, if necessary, by drying, cutting, ball milling, sonication, homogenizing, or the like.
  • any other compounds derived from plants or other natural sources, chemically synthesized, or biosynthesized by cultured cells or the like can be used as the lipase inhibitor of the present invention.
  • the compound may be used in a purified form, but may be used in a crude form as long as it does not contain impurities that are unsuitable for foods and drinks.
  • the Kanzo extract of the present invention is concentrated by removing the solvent by a method known to those skilled in the art such as spontaneous evaporation, evaporation under reduced pressure, and heat concentration, and then is combined with the concentrated extract (for example, a solid substance, a powder preparation). can do. Concentrates are generally suitable for large intakes because of the concentrated active ingredients.
  • the Kanzo extract of the present invention can be obtained by the following methods: glabrene, glabridine, grub mouth, 3'-hydroxy-4'O methyl glabridine, 4 'O methyl glabridine on the basis of solid content as measured by liquid chromatography, for example, HPLC.
  • composition of the present invention contains a carrier acceptable for eating and drinking.
  • carriers can be any inert, organic or inorganic material suitable for, for example, oral, enteral, transdermal, subcutaneous, or parenteral administration, including but not limited to water, gelatin, gum arabic, ratatose And microcrystalline cellulose, starch, sodium starch glycolate, calcium hydrogen phosphate, magnesium stearate, talc, colloidal silicon dioxide, and the like.
  • Such compositions may also contain other pharmacologically active agents, and customary additives such as stabilizers, wetting agents, emulsifiers, flavoring agents, buffers, and the like.
  • compositions of the present invention when relative to the total composition, the sum or Kanzou extracted from about 0.001 9 as was 9.999 wt 0/0 of the compound, 0.01 Power et al. 99.99 weight 0 / 0, also includes ⁇ or 0.1 power et 99.9 wt 0/0.
  • the edible carrier can be any food or food additive known to those skilled in the art.
  • Food additive Is preferably any food additive acceptable under the Food Sanitation Law.
  • a lipase sample and a substrate thereof such as tridalicelide or a substance similar thereto, which can be a substrate for lipase (for example, 4-methylpumbelliferone oligomer) Acid ester) in a buffer (eg, Mcllvain buffer) suitable for the enzyme reaction with the sample to be tested for a certain period of time.
  • a buffer eg, Mcllvain buffer
  • the degraded product after the reaction is analyzed by a colorimetric method, a fluorescent method, an enzymatic method, liquid or gas chromatography. It can be determined by titration using a titration method.
  • a cholesterol esterase preparation and a compound that can be a substrate thereof for example, a fatty acid ester of cholesterol or an analog thereof (for example, cholesteryl pyrenyl phosphate) are used.
  • a buffer solution suitable for an enzyme reaction for example, a phosphate buffer solution containing bile salts
  • the decomposed product after the reaction is subjected to a colorimetric method, a fluorescent method, an enzymatic method, It can be determined by liquid or gas chromatography, titration, or the like.
  • Non-Patent Document 7 since the enzyme cholesterol esterase acts on a considerably wide range of substrates, in addition to cholesterol esters, p-Nitrophenyl butyrate as described in (Non-Patent Document 7), triacylglycerol, phospholipids, It is also possible to measure an analog or the like as a substrate.
  • the sample may be given in the drinking water, or may be forcibly administered orally using a sonde or the like. Also genetic An experimental system in which a typical obesity model animal is bred on a normal diet is conceivable, and human tests by volunteers are also possible.
  • kanzo plant material for example, kanzo powder or extract
  • dextrin powder or starch for example, kanzo powder or extract
  • tableting may be performed by adding tablets, binders, coating agents and the like. It is also possible to add an emulsifier and water to Kanzo plant material or the like to make it a water-soluble agent.
  • emulsifier examples include higher alcohols, higher fatty acids, glycerin fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, calcium stearoyl lactate, propylene glycol fatty acid esters, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and polyglycerin fatty acid esters.
  • Activators include higher alcohols, higher fatty acids, glycerin fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, calcium stearoyl lactate, propylene glycol fatty acid esters, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, and polyglycerin fatty acid esters.
  • a product form of an oil / fat composition obtained by mixing the lipase inhibitor or the like of the present invention and an oil / fat may be used.
  • the method of dissolving gravelene, glabridine, glabrol, 3'-hydroxy-4'O methyl glabridine, 4'-O-methyl glabridine, hispagrabridine B, or kanzo ⁇ extract in fats and oils is not particularly limited. It can be performed by operations such as stirring or mixing. When an extract containing the compound or a crude product of the compound is used, since impurities other than the compound are contained, the compound is dissolved in a fat or oil by an operation such as stirring or mixing, and then filtered or filtered.
  • the extract may be dissolved in an organic solvent such as ethanol in advance, mixed with the oil and fat, and then the organic solvent can be distilled off.
  • An oil or fat such as a medium-chain fatty acid triglyceride and the above composition may be prepared, and the adjusted product may be formulated as a capsule preparation.
  • the composition of the present invention may be in the form of a soft capsule preparation in which the composition is enclosed.
  • a soft capsule formulation can be manufactured, for example, as follows. For example, a punching method using a rotary type fully automatic soft capsule molding machine, a flat plate method in which the contents are placed between two sheets of gelatin and pressed with a mold to double-sided force, or a double nozzle
  • a soft capsule preparation can be manufactured by filling the above composition into a capsule film by using a dropping method (such as a seamless capsule) using, molding and drying.
  • Raw materials for the soft capsule include, for example, gelatin, glycerin, and peptide for the film. Also preferably, for example, honey mackerel can be used for thickening the contents.
  • Examples of the shape of the soft force capsule include various shapes such as a football (oval) type, an oblong type, a tube type, a spherical shape, a fish type, and a self-cut type.
  • the size of the soft capsule can be appropriately selected according to the purpose.
  • the capsule diameter can be about 6 mm to 9 mm
  • the capsule shell thickness can be about 0.4 mm to 1.2 mm
  • the mass can be about 0.2 lg to 0.25 g.
  • the soft capsule preparation of the present invention can be easily taken by V, shift of elderly people, adults, children and infants in addition to the above-mentioned lipase inhibitory effect and Z or cholesterol or its ester absorption inhibitory effect. ! / There are also advantages. Since the soft capsule preparation of the present invention is produced by using a natural material with sufficient eating experience, such as kanzo or kanzo extract, it is expected that the possibility of causing side effects is low. The soft capsule preparation of the present invention is convenient to carry and easy to take in large or small quantities.
  • the powder or extract of liquorice may be mixed with flour or the like to make a dry powder such as for bakery or tempura flour, or the powder or extract of liquorice may be dissolved in edible oil to reduce fat absorption. It may be used as edible fat.
  • the powder or extract of Kanzo can be emulsified with an emulsifier and used as a beverage, or the emulsion can be mixed with various processing ingredients to produce confectionery such as chewing gum, chocolate, candy, jelly, biscuit, crackers, etc.
  • Ice cream, frozen desserts such as ice desserts, udon, Chinese food, sobaghetti, instant foods, etc., kneaded products such as scallops, bamboo rings, halves, seasonings such as dressings, mayonnaise, sauces, hams, soups, various types It can also be used for retort food, various frozen foods, pet food, livestock feed, and the like.
  • composition of the present invention examples include agents (eg, anti-inflammatory agents) having the effect of preventing skin troubles caused by bacteria infecting the skin decomposing sebum on the skin surface, or those agents.
  • the effective amount for lipase inhibition, cholesterol esterase inhibition, neutral fat absorption suppression, cholesterol absorption suppression, cholesterol ester absorption suppression, obesity prevention or obesity treatment is as follows: grabrene, glabridine, glabrol, 3 ′ —Hydroxoxy 4 ′ O-methyl glabridine, 4 ′ O-methyl glabridine, and Hispagra brudine B force
  • the composition of the present invention comprises the extract of the present invention and Z or glabrene, glabridine, glabrol, 3, -hydroxy 4'-O methyl glabridine, 4'-O methyl glabridine and hispagrabridine B power.
  • a mixture of at least one or more selected from the group or a salt or ester thereof with an oil or fat may be used.
  • Fat based on the composition excluding the Kanzou extract, about 5 to 100 wt%, preferably about 20 to 100 wt%, more preferably about 30 to 100 weight 0/0, more preferably about 40 to 100 weight 0 / 0, more preferably rather about 50 to 100 weight 0/0, more preferably more preferably from about 60 to 100 weight% to about 70 and 100 wt%, more preferably from about 80 forces and 100 wt%, most preferably Can be included at about 90-100% by weight.
  • the fat or oil used in the present invention is a glycerin fatty acid ester containing a medium-chain fatty acid triglyceride, and is preferably about 50% by weight or more, more preferably about 60% by weight or more, most preferably a medium-chain fatty acid triglyceride. Contains about 70% by weight or more.
  • the medium-chain fatty acid triglyceride herein is a fatty acid having about 6 to 12 carbon atoms as a constituent fatty acid, and the constituent ratio of the fatty acid is not particularly limited, but the constituent ratio of the fatty acid having about 8 to 10 carbon atoms is preferable. Is about 50% by weight or more, more preferably about 60% by weight, and most preferably about 70% by weight.
  • a medium-chain fatty acid triglyceride having a specific gravity of about 0.94 to 0.96 at 20 ° C and a viscosity of about 23 to 28 cP (centipoise) at 20 ° C is more preferable.
  • any of medium-chain fatty acid triglycerides, such as those derived from nature and those prepared by transesterification, can be used.
  • the fat or oil used in the present invention is a glycerin fatty acid ester containing a partial glyceride, and preferably contains the partial glyceride in an amount of about 50% by weight or more, more preferably about 60% by weight or more, and most preferably about 5% by weight or more. Contains 70% by weight or more.
  • the partial glyceride is diglyceride (1,2-diacylglycerol, 1,3-diacylglycerol) or monoglyceride (1-monoacylglycerol, 2-monoacylglycerol). Although a good mixture of both may be used, diglyceride is also preferable from the viewpoint of workability.
  • any of natural glycerides and those prepared by transesterification can be used.
  • the present invention provides, as an active ingredient, at least one or more compounds selected from the group consisting of glabrene, glabridine, glabrol, 3′-hydroxy 4 ′ O-methyl glabridine, 4 ′ O-methyl glabridine and hispagrabridine B, and esters and salts thereof.
  • glabrene glabrene
  • glabridine glabrol
  • 3′-hydroxy 4 ′ O-methyl glabridine 4 ′ O-methyl glabridine and hispagrabridine B
  • esters and salts thereof esters and salts thereof.
  • Lipase inhibitor, cholesterol esterase inhibitor, neutral fat absorption inhibitor, cholesterol absorption inhibitor, cholesterol ester absorption inhibitor, obesity prevention agent, obesity treatment agent, etc. I will provide a.
  • the lipase inhibitor and the like may be used as a food additive.
  • Kanzo which is the origin of the composition of the present invention and the lipase inhibitor, has been used as a food additive. Therefore, the above-mentioned composition and lipase inhibitor of the present invention are also effective for use in large quantities for eating and drinking.
  • the present invention provides a Glycyrrhiza plant, which is selected from the group consisting of glabren, glabridine, glabrol, 3′-hydroxy-4 ′ O-methyl glabridine, 4 ′ O-methyl glabridine and hispagrabridine B by contacting with a solvent. Extracting at least one compound, or its ester, its salt, or its glycoside And a method for producing the composition or agent of the present invention. If necessary, the above compounds, salts, esters, or glycosides thereof may be mutually converted.
  • the method may be applied to a method for preventing obesity or a method for treating obesity by including a step of ingesting the agent or composition of the present invention into animals including mammals.
  • animals generally include, but are not limited to, those who need or need to prevent or treat obesity.
  • treatment of obesity means that at least weight gain is suppressed, or weight loss is required, if necessary.
  • obesity means that the BMI (body mass index) is 30 or more.
  • obesity is also included in the case of obesity with the above-mentioned BMI value and the obesity reserve army leading to it, and the so-called visceral obesity.
  • MCT oil solution was dissolved in methanol for HPLC and analyzed by HPLC under the following conditions.As a result, gramblene, glabridine, Roll, 4'-O-methyl glabridine contained 6.6mg, 30.8mg, 12.6mg, 9.7mg respectively.
  • the soft capsule preparation of the present invention for example, the above-mentioned MCT oil solution was pressed into a gelatin film by using a rotary soft capsule manufacturing apparatus, whereby a soft capsule having a content of 360 mg could be obtained. .
  • J'sphere ODS-H80, 4.6 ⁇ 250 mm ( ⁇ MC) was used at a column temperature of 40 ° C.
  • the mobile phase ratio of acetonitrile in a 20 mM phosphoric acid aqueous solution was kept constant at 35% from the start of analysis to 20 min, and was increased at a constant ratio so that it became 70% after 20 min and 75 min, and 80% from 75 min to 80 min.
  • the flow rate was set at lmlZmin.
  • the injection amount was 201 and the detection wavelength was 254 nm.
  • the retention time of each compound was 40.
  • the method for measuring the inhibitory activity against lipase derived from pig and human spleen is as follows.
  • Mcllvaine buffer prepared to pH 7.4 by adding 0.1M aqueous solution of citric acid to 0.1M disodium hydrogen phosphate 22.51, each of the above-mentioned target substances dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) 2.51, Lipase (derived from human or porcine spleen; Sigma) dissolved in Mcllvaine buffer 50 1.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Lipase derived from human or porcine spleen; Sigma
  • Mcllvaine buffer 50 1 Methoxymethylsulfoxide
  • Oleic acid ester (4 MUO) of 4-methylpumbelliferone prepared in ImM with buffer 50 1 were mixed and kept at 37 ° C for 20 minutes.
  • the human enzyme was added at luZml, and the pig enzyme at 119 uZml. Stop the reaction by adding 50 1 of 1N hydrochloric acid.
  • reaction value 4-methylpumbelliferone
  • Inhibitory activity (%) ⁇ 1— (reaction value of sample additive Z reaction value of control) ⁇ X 100
  • a gravlavidine preparation (a glabridine preparation and an epipicatechin gallate preparation), which are the main flavonoids present in the ethanol extract of G. darabra and the ethanol extract of G. darabra, were used. It was confirmed that both of these products clearly inhibited lipase activity derived from pig and human spleen.
  • the amount of Kanzo extract is expressed as a solid content.
  • the amount of glabridine in Kanzo extract is about 10% by weight based on solids.
  • XENICAL XENICAL
  • Roche XENICAL
  • flavonoids other than glabridine such as glabrol, glabrene, and 4 'O-methyl dalabridene, also showed strong lipase inhibitory activity.
  • the four flavonoids present in these G. glabra extracts have previously been reported to exhibit lipase inhibitory activity: oleanolic acid (Sigma'Aldrich), epicatechin gallate (Wako Pure Chemical), and It showed stronger lipase inhibitory activity than curcumin (Sigma).
  • MCT medium chain fatty acid triglyceride (Actor M2; RIKEN Vitamin Co., Ltd.)) (3 parts by weight of Kanzo ethanol extract, 7 parts by weight of medium chain fatty acid triglyceride) Cholesterol derived from the spleen from the spleen of each of the purified sample (“LFO”), the major flavonoids in the ethanol extract of Canzo de grapula, glabridine, grub mouth, gravure, and 4'-O-methyl glabridine The inhibitory activity on esterase was examined.
  • LFO purified sample
  • the method for measuring the inhibitory activity on cholesterol esterase derived from the spleen is as follows. 100 mM NaCl added to lOOmM phosphate buffer (pH 7.0) was used as the reaction buffer. As a substrate, a solution prepared by dissolving lmg of Cholesteryl (pyren-l-yl) hexanoate (ChPH; Sigma) and 10mg of egg yolk lecithin in 1ml of ethanol (EtOH) was prepared (Chemistry and Physics of Lipids, 36, 335). -341, 1985).
  • G. glabra's ethanol extract a sample obtained by dissolving it in medium-chain fatty acids (LFO), and a major flavonoid present in the ethanol extract of G. darabra Gravlidine, glabrol, glabrene, and 4'O-methyl glabridine were also confirmed to have strong cholesterol esterase inhibitory activity.
  • LFO medium-chain fatty acids
  • C57BL / 6J mice females were obtained from Clea Japan, 8 weeks of age and bred on a high fat diet shown in Table 3 for 8 weeks to prepare an obesity model. Food and water were available ad libitum during breeding.
  • the animals were divided into 4 groups of 10 animals each, except for individuals having particularly large body weights.
  • the MCT oil solution of the ethanol extract of G. darabra obtained in Example 2 was further diluted with MCT to obtain an MCT oil solution of a ethanol extract containing 1.2% glabridin (hereinafter also referred to as FOJ).
  • FOJ a ethanol extract containing 1.2% glabridin
  • the MCT solution was mixed with the high-fat diet shown in Table 3 to prepare a test feed shown in Table 4.
  • the glabridin content in the MCT lysate (LFO) of Kanzo extract was adjusted to 1.2%.
  • Obesity model mice divided into four groups were allowed to freely ingest and reared for about 8 weeks, and then weighed. Table 5 shows the change in body weight for each group. The significance test was performed by Dunnet's multiple comparison method of population means.
  • Example 5 The body weight suppression effect shown in Example 5 was collected during the experiment to confirm that the fat absorption suppression effect by lipase inhibition and the cholesterol absorption suppression effect by Z or cholesterol esterase inhibition were involved.
  • the amounts of neutral fat (triglyceride), fatty acids, cholesterol, and cholesterol esters remaining in feces were compared. The comparison results are shown in Table 6 below.
  • the amount of triglyceride in feces was determined by adding about 0.5 g of feces to 4 ml of sodium sulfate solution (6.25%). Suspended, extracted twice with 6 ml of hexane (3 volumes) and Z2-propanol (2 volumes), concentrated with an evaporator (40 ° C), and subjected to gas chromatography (column: equity-1 (supelco; inner diameter) 0.25 mm, film thickness 0.25 ⁇ m, length 2 m); the temperature was raised from 120 ° C to 340 ° C at 10 ° C / min).
  • trioleicide As standard substances used for quantitative calculation, trioleicide (TG) is used for triolein (Sigma), cholesterol (CH) is used for cholesterol (Sigma), and cholesterol ester (CE) is used for cholesterol palmitate and cholesterol stearate. Rate (Sigma) was determined as a standard. The amount of free fatty acids (FA) excreted in feces was also measured using oleic acid (Wako Pure Chemical) as a standard. Gravlidine content in the MCT oil solution (LFO) of Kanzo extract was adjusted to 1.2%.
  • Example 7 Comparison of triglyceride content in feces and the like SD rats (6-week-old male) were mixed with the high-fat diet shown in Table 3 and the MCT oil solution (LFO) of the ethanol extract of G. darabra shown in Table 7 below. ; Charles River) for 10 days.
  • MCT oil solution (LFO) of Kanzo extract is obtained by dissolving Kanzo extract in MCT so that the amount of glabridine in Kanzo extract is 1%.
  • FIG. 2 is a graph showing the measurement results of the amount of fat and the like in rat feces. As shown in Figure 2, the amount of fatty acids, tridalicelide, cholesterol, and cholesterol esters in the feces of rats that received G. glabra extract orally increased compared to the control, i.e., the fat was in the feces. Excretion was confirmed. In addition, * mark in Fig. 2 is significant at 5% risk, and ** signifies 1% significance.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of measurement of triglyceride in blood after 1, 2, 4, and 6 hours of oral ingestion using Triglyceride Test Co., Ltd. 0.3 ml of blood was collected from the jugular vein. Six animals were measured per group, and the significance test was performed by multiple comparison of population means using DUNNET. As shown in FIG. 3, it was confirmed that the oral administration of the G. glabra extract significantly reduced the blood tridaliceride concentration.

Abstract

　本発明は、これまで医薬品や漢方薬、甘味料などの食品添加物や健康食品として経口摂取あるいは充分な食経験があるカンゾウ又はカンゾウ抽出物またはそれに含まれるグラブリジン、グラブロール、グラブレン、および４’－Ｏ－メチルグラブリジンにヒト及び豚の膵臓由来リパーゼ、およびコレステロールエステラーゼを阻害する作用等があることを見出した。またそれを含む餌を与えることにより、実験動物の肥満を抑制し、また中性脂肪やコレステロールを糞中に多く排泄させ、体内への吸収を抑制していることを証明した。これにより、これまで多く用いられてきた食物繊維配合組成物とは全く別のリパーゼ阻害および／またはコレステロールエステラーゼ阻害に基づく中性脂肪及びコレステロール吸収抑制性組成物及び肥満抑性組成物の供給を可能にした。                                                                                     

Description

明 細 書
リパーゼ阻害剤、コレステロールエステラーゼ阻害剤、中性脂肪吸収抑制 剤、コレステロール吸収抑制剤及びコレステロールエステル吸収抑制剤
技術分野
[0001] 本発明は、リパーゼ阻害剤、コレステロールエステラーゼ阻害剤、中性脂肪吸収抑 制剤、コレステロール吸収抑制剤及びコレステロールエステル吸収抑制剤、肥満予 防剤、肥満処置剤、並びに、それらの作用を有する食品、医薬品、ペットフード又は 飼料等に応用可能な組成物、並びにそれらの製法方法に関する。
関連出願の相互参照
[0002] 日本国特許出願 2004— 143210号（2004年 5月 13日出願）および日本国特許 出願 2004— 271567 (2004年 9月 17日出願）の明細書、請求の範囲、図面および 要約を含む全開示内容は、これら全開示内容を参照することによって本出願に合体 される。
背景技術
[0003] 肥満は、生活習慣病すなわち、内臓脂肪型肥満、 2型糖尿病、高脂血症、高血圧 症などの原因と言われる。これらは、やがて動脈硬化症などの血管病を引き起こすマ ルチプル 'リスク'ファクター症候群とも言われている。一方、消費者においては、ダイ エツトに対する関心は高 、反面、脂肪分ゃコレステロールの多 、肉類等を食する機 会は以前より増加しており、そのような食事への嗜好は捨てがたいのが現実である。
[0004] 中性脂肪分の多い食事をすると必然的に多量の中性脂肪が体内に吸収されて肥 満の原因になってしまうため、中性脂肪の吸収を抑える効果を謳った健康食品も登 場してきている。現在、これらの中性脂肪吸収抑制効果を示す成分の本体は、海草 由来や穀物由来の食物繊維であることが多い。それらの食物繊維を含む健康食品 は、繊維質の中に脂肪を包み込むことにより小腸上皮からの吸収率を低下させ、糞と 共に対外へ排泄される割合を増やすと!、う原理に基づ!、て 、る。
[0005] その他、中性脂肪の吸収を抑制するものとして、脾臓力 分泌されるリパーゼを阻 害する物質がある。脾臓リパーゼは、主に十二指腸内で中性脂肪 (トリグリセライド)を 2—モノァシルグリセロールと脂肪酸に加水分解する。その加水分解物は胆汁やリン 脂質とミセルを形成し、小腸上皮細胞から吸収される。したがって、この脾臓リパーゼ を阻害する物質は、上述の食物繊維とは違ったメカニズムで中性脂肪の吸収を抑制 することが可能である。実際に欧米ではオルリスタツト (製品名：XENICAL;
Hoffinan-La Roche社）がこのメカニズムに基づく肥満抑制用医薬として使用されてい る。
[0006] また、リパーゼ阻害活性のある食品として、キチン'キトサンや植物ステロール類 (特 許文献 1)、ぺクチン (特許文献 2)、大豆蛋白（非特許文献 1)、ホスファチジルコリン（ 非特許文献 2)などの他、様々な植物や野菜、茶などの抽出物 (特許文献 3、 4、 5、 6 )や抽出物中の特定ィ匕合物 (特許文献 7)などが報告されている。しかし、それらの食 品は、リパーゼ阻害活性が不十分であるために明確な効果を発揮するには多量の摂 取が必要であり、また、食品として長く摂取したときの安全性が未知であるなどの課題 を有している。
[0007] 一方、コレステロールは、その血中濃度の上昇と比例して脳卒中、心臓病、癌など の罹患率の増加をもたらす。血中のコレステロール、特に悪玉といわれる LDL ( low-density lipoprotein)コレステロールの濃度が高くなると、それらが酸化されて動 脈硬化を引き起こすと恐れられている。特に消費者による肉や卵、乳製品の摂取量 が増加して 、ることと相俟って、食餌からのコレステロール吸収を抑える効果を謳った 健康食品も登場してきて 、る。健康食品分野でコレステロール吸収抑制効果を示す 成分としては、大豆たんぱく質、りん脂質結合大豆ペプチド、植物ステロールエステ ル、サイリウム種子由来食物繊維、低分子アルギン酸ナトリウム、キトサンなどが知ら れている（非特許文献 3)。これらの成分は、腸内でコレステロールと結合もしくは抱合 することでコレステロールの吸収阻害及び排泄促進作用を発現するとされるが、同時 に脂溶性ビタミン (ビタミン A、 D、 E、 K)や |8カロチンなどの吸収も抑制される可能性 がある点で問題となり得る。
[0008] なお、上記のようなコレステロール吸収作用にも上述したリパーゼが関与している可 能性を示す報告がなされている (非特許文献 4、 5)。その他、リパーゼと同様に脾臓 力 小腸上部に分泌されるコレステロールエステラーゼ（EC 3.1.1.13)が、小腸からの コレステロールの吸収に大きく関与するという報告がなされており、その阻害剤の開 発も行われて ヽる（非特許文献 6、 7)。
[0009] 最近、カンゾゥ力 得られる所定の抽出物力 マルチプル'リスク'ファクター症候群 の予防及び Z又は改善に有用であることが見出されている。カンゾゥはマメ科カンゾ ゥ属 (Glycyrrhiza属)の植物であり、古くから漢方薬や医薬として潰瘍、肝炎などに対 し服用されてきおり、また食品添加物 (例えば甘味料)として使用されてきた食経験が 豊富かつ安全な食材でもある。 Vヽずれの品種にも親水性成分であるグリチルリチン（ グリチルリチン酸)のほか、疎水性成分のフラボノイドも多く含まれている。特許文献 8 は、カンゾゥカも得られる抽出物のうち、カンゾゥフラボノイドを多く含み、かつ、グリチ ルリチン含量が極微量であるカンゾゥ疎水性抽出物力 マルチプル'リスク'ファクタ 一症候群の予防及び Z又は改善に有用である点を開示して 、る（特許文献 8)。
[0010] さらに、特許文献 9は、このカンゾゥ疎水性抽出物が PPAR yリガンド活性を有し、 その活性成分はフラボノイドであることを開示している（特許文献 9)。具体的には、同 文献では、 G.グラブラ由来の抽出物に含有される特徴的なフラボノイドであるグラブ レン、グラブリジン、グラブロール、 3，ーヒドロキシ 4'—O メチルグラブリジン、 4， O メチルグラブリジン及びヒスパグラブリジン Bが高い PPAR yリガンド活性を有 している点を開示している。
[0011] 一方、特許文献 10、 11は、化粧水や養毛剤の発明において、所定のカンゾゥ抽出 物がリパーゼ阻害効果を有する点を開示している (特許文献 10、 11)。また、特許文 献 12は、所定のカンゾゥ抽出物が血清総コレステロール濃度および LDL濃度を低 下させる点を開示している（特許文献 12)。ただし、同文献においては、食事由来の コレステロール等の吸収抑制作用がある力否かは不明である。
特許文献 1：特開 2003 - 246746
特許文献 2 :特開 2003— 199534
特許文献 3：特開平 9— 143070
特許文献 4：特開平 8— 268882
特許文献 5：特開 2002— 53484
特許文献 6：特開 2004 - 2254 特許文献 7：特開平 9—40689
特許文献 8 :WO02Z47699
特許文献 9： #112002- 226486
特許文献 10：特開 2000— 226324
特許文献 11：特開平 09— 241131
特許文献 12：特開 2002— 114695
非特許文献 l :Agric. Biol. Chem., 38, 97-101 (1974)
非特許文献 2 :Agric. Biol. Chem., 40, 889-897 (1976)
非特許文献 3 : FOODS & FOOD INGREDIENTS JOURNAL OF JAPAN, 209(7), 559-567 (2004)
非特許文献 4: Biochem. J., 339, 615-620 (1999)
非特許文献 5 : J. Biol. Chem., 278(44), 42899-42905 (2003)
非特許文献 6 : BMC Pharmacology, (2004) ,4, 1-9
非特許文献 7 : J. Biol. Chem., 227(27), 24006-24013 (2002)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 本発明の課題は、安全かつ効果的なリパーゼ阻害剤、コレステロールエステラーゼ 阻害剤、中性脂肪吸収抑制剤、コレステロール吸収抑制剤及びコレステロールエス テル吸収抑制剤の提供である。また、これらを含有する肥満予防剤、肥満処置剤、 並びに、それらの作用を有する食品、医薬品、ペットフード又は飼料等に応用可能な 組成物、並びにそれらの製法方法の提供である。
課題を解決するための手段
[0013] 本発明者らは、多種の化合物を鋭意検討した結果、グリブリジン、グラブレン、ダラ ブロール、 3，ーヒドロキシー 4，一 O—メチルグラブリジンがリパーゼ阻害作用および 及びコレステロールエステラーゼ阻害作用を有することを見 、だした。これらグラブリ ジン以下 4成分は、カンゾゥ属植物材料中に存在するから、本発明の目的のために、 カンゾゥ属植物材料そのまま、またはそこから抽出して使用することができる。類似化 合物は同様の作用を有しうる。 [0014] 本発明者は、そのカンゾゥ抽出物を含む組成物を高脂肪食で飼育しているマウス (またはラット）に経口摂取たところ、以下のような驚くべき結果が得られた：
(a)体重増加が実際に抑制される、
(b)そのマウスの糞中に排泄された脂肪の分析の結果、中性脂肪、脂肪酸のほか、 コレステロール、コレステロールエステル量（これらすベてを以後、適宜「脂肪」という 言葉で総称する） 1S カンゾゥ抽出物を摂取させな力つたマウスおよびラットと比較し て実際に増加している、
(c)高脂肪食と共にカンゾゥ抽出物を経口摂取させたラットの数時間後の血中トリグ リセライド濃度が、対照と比較して顕著に減少する。
[0015] 上記内容を含む検討の結果、本発明は、リパーゼ阻害剤、コレステロールエステ ラーゼ阻害剤、中性脂肪、コレステロール及びコレステロールエステル吸収抑制剤、 肥満予防剤、肥満処置剤、並びに、それらの作用を有する食品、医薬品、ペットフー ド又は飼料等に応用可能な組成物、並びにそれらの製法方法等を提供する。また、 本発明は、上記組成物を含む製剤、例えば経口摂取用製剤を提供する。
[0016] 即ち、本発明は、（1)グラブレン、グラブリジン、グラブロール、 3'—ヒドロキシー4，
O メチルグラブリジン、 4' O メチルグラブリジン及びヒスパグラブリジン Bから なる群より選ばれる 1種以上の化合物、もしくはその塩、そのエステル、またはその配 糖体を有効成分とするリパーゼ阻害剤、コレステロールエステラーゼ阻害剤、中性脂 肪吸収抑制剤、コレステロール吸収抑制剤、コレステロールエステル吸収抑制剤、肥 満予防剤、並びに、肥満処置剤である。
[0017] また、本発明は、上記の剤を含む飲食用組成物、医薬組成物、飼料用組成物、並 びに、ペットフード用組成物でもある。
発明の効果
[0018] 本発明のリパーゼ阻害剤、コレステロールエステラーゼ阻害剤、コレステロール吸 収抑制剤等を使用することにより、中性脂肪および Zまたはコレステロール等の吸収 を抑制し、例えばヒトゃヒト以外の動物 (ヒトを除く哺乳動物を含む)の肥満抑制、生活 習慣病の予防等に効果がある。
図面の簡単な説明 [0019] [図 1]ヒト及びブタの脾臓由来リパーゼに対する阻害活性の結果を示すグラフである。
[図 2]糞中に排泄された脂肪量等の測定結果を示すグラフである。
[図 3]脂質ェマルジヨン投与後の血中トリグリセライド濃度の推移の測定結果を示すグ ラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 1.カンゾゥ属植物材料
本発明のリパーゼ阻害剤、コレステロールエステラーゼ阻害剤、中性脂肪吸収抑 制剤、コレステロール吸収抑制剤及びコレステロールエステル吸収抑制剤、肥満予 防剤、肥満処置剤、並びにそれらの作用を有する組成物は、ダリキルリーザ ·グラブラ (Glycyrrhiza glabra)、 G.ゥラレンシス（G. uralensis)、 G.インフラータ（G. inflata)な どのカンゾゥ属（Glycyrrhiza)植物材料力 得られ得る。カンゾゥと呼ばれる植物体と しては、限定されないが、ダリキルリーザ'グラブラ（Glycyrrhiza glabra)、 G.ゥラレン シス（G. uralensis)、 G.インフラータ（G. inflata)およびこれらまたはその他との交配 種などが挙げられる。カンゾゥ属植物材料は好ましくは G.グラブラであり得る。カンゾ ゥ属植物からの抽出物を本発明の目的のために好適に使用しうる。
[0021] 該植物材料または抽出物は、グラブレン、グラブリジン、グラブロール、 3 '—ヒドロキ シー 4' O メチルグラブリジン、 4' O メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジン B のうちの 1種類以上の化合物またはその塩、エステルもしくは配糖体を含有し、脾臓 由来リパーゼなどのリパーゼを阻害する活性、コレステロールエステラーゼを阻害す る活性、肥満抑制作用、または脂肪吸収抑制作用等を有する。本発明にしたがって 、これらのガンゾゥ属植物材料またはその抽出物を、リパーゼ阻害剤、コレステロール エステラーゼ阻害剤、中性脂肪吸収抑制剤、コレステロール吸収抑制剤、コレステロ ールエステル吸収抑制剤、肥満予防剤、または肥満処置剤等 (以下、適宜「リパーゼ 阻害剤等」と記載する）として使用できる。それらの剤は、さらに、食品添加物等として 利用しる。コレステロールエステルは、一般的に、肉類や乳製品に多く含まれ、コレス テロール分子中の 3位の OH基にォレイン酸その他の脂肪酸がエステル結合したも のである。
[0022] 2.化合物 本発明で使用されるグラブリジン（glabridin)、 3 '—ヒドロキシ 4'—O—メチルダラ ブリジン（3'- hydroxy卜 4'- 0- methylglabridin)、 4， 一O—メチルグラブリジン（ 4'-0-methylglabridin)、またはヒスパグラブリジン B (hyspaglabridin B)はイソフラバン (isoflavan)に分類されるフラボノイドであり、下記一般式（1)にて表される化合物であ る。
[0023] [化 1]
Figure imgf000008_0001
[0024] グラブリジンは R1 =H、 R2 = OH、 3 'ーヒドロキシー 4' O メチルグラブリジンは Rl = OH、 R2 = OCH 、 4， 一 O—メチルグラブリジンは R1 =H、 R2 = OCH、ヒス
3 3 パグラブリジン Bは R1〜R2が— CH = CH— C (CH ) —O で六員環を構成する。
3 2
[0025] 本発明で使用されるグラブレン（glabrene)は、イソフラブ一 3 ェン（isoflav-3-ene) に分類されるフラボノイドであり、下記一般式（2)で表される化合物である。
[0026] [化 2]
Figure imgf000008_0002
本発明で使用されるグラブロール（glabrol)は、フラバノン (flavanone)に分類される フラボノイドであり、下記一般式（3)で表される化合物である。 [0028] [化 3]
Figure imgf000009_0001
[0029] これらの化合物の 1種を、または 2種以上混合して使用しうる。
[0030] 本発明では、上記化合物の脂肪酸エステルなどのエステルも好適に使用しうる。該 エステルは、例えば飲食用、医薬用、医薬部外品用、化粧品用、美容用、飼料用ま たはペットフード用等 (以下、適宜「飲食用等」と記載する）に好適な任意の有機酸ま たは無機酸とで形成することができる。使用する酸としては、例えば塩酸、硫酸、メタ ンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、シユウ酸、クェン酸 、酒石酸、炭酸、またはリン酸の他、ォレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール 酸、リノレン酸などの長鎖脂肪酸、および酢酸、酪酸などの短鎖または炭素数 10前 後の中鎖脂肪酸が使用できる。
[0031] 本発明では、上記化合物の塩も好適に使用しうる。例えば、上記化合物が酸性部 分を有する場合、飲食用等に許容される上記化合物の塩は、アルカリ金属塩、例え ばナトリウム、カリウム塩;アルカリ土類金属塩、例えばカルシウムまたはマグネシウム 塩;および好適な有機配位子、例えば第四級アンモ-ゥム塩とで形成される塩を含 む。
[0032] 本発明では、上記化合物の 1または 2以上の水酸基を介して糖部分に結合された その配糖体も好適に使用しうる。該配糖体の糖部分は、任意の糖であり得る。該糖部 分は限定されないが、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖類および多糖類を含みうる [0033] 上記化合物は、少なくとも 1つの不斉中心を有する場合、それらはェナンチォマー として存在し得る。上記化合物が少なくとも 2以上の不斉中心を有する場合、それら は、ジァステレオ異性体として存在し得る。そのような異性体およびその任意の割合 の混合物は、本発明の範囲内に包含される。上記化合物は必要により置換されてい てもよい。
[0034] 3.化合物の製造方法
これら化合物を製造する方法は、特に限定されず、ダリキルリーザ'グラブラ（ Glycyrrhiza glabra)、 G.ゥラレンシス（G. uralensis)、 G.インフラータ（G. inflata)など のカンゾゥ属植物材料、好ましくは G.グラブラ植物材料を、溶媒、好ましくは疎水性 または両親媒性、より好ましくは両親媒性の有機または無機溶媒と接触させることに よって、当業者に周知の方法 (例えば浸漬、または混合）により抽出することを含む。
[0035] 溶媒としては、以下に限定されないが、水、中鎖脂肪酸トリグリセリドなどの油脂、ジ メチルフオルムアミド、アセトン、ジメチルスルフォキシド、 N—メチルー 2—ピロリドンま たはアルコール性溶媒、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたは ter t ブタノール、またはエーテル溶媒、例えば、テトラヒドロフランまたは 1, 4 ジォキ サン (0. 5から 15容量％、好ましくは 2容量％)またはエステル溶媒、例えば、酢酸ェ チルまたは炭化水素溶媒、例えば、オクタン、へキサン、トルエンまたはキシレン、液 化炭酸ガスまたは油脂力 なる群より選ばれる 1種または 2種以上の溶媒を使用する ことができる。
[0036] 簡便には、油脂、メタノール、エタノール、酢酸ェチル、アセトン、へキサン、液ィ匕炭 酸ガス等力 なる群より選ばれる 1または 2種以上の溶媒を使用する。抽出温度は、 一般に約 20〜100°C、普通約 1〜80°C、好ましくは約 20〜60°Cが好適であり得 る。抽出時間は普通約 0. 1時間〜 1ヶ月、好ましくは約 0. 5時間〜 7日間が好適であ り得る。
[0037] リパーゼ阻害剤等として、上記の方法等による抽出物を粗抽出物のまま使用しても よいが、さらにカラム処理、脱臭処理、脱色処理などにより粗精製又は精製したもの を使用してもよい。もちろん、カンゾゥ属植物材料をそのままリパーゼ阻害剤等として 使用することもできる。該材料は、植物体の各種部分例えば全草、花、葉、根 (根茎） などを使用できる。該材料を、必要に応じて乾燥、裁断、ボールミル、超音波処理、 ホモジナイザーなどによって粉碎しうる。
[0038] 勿論、その他植物等の天然由来、化学合成あるいは培養細胞などにより生合成し た化合物のいずれも、本発明のリパーゼ阻害剤等として使用することができる。また、 該化合物は、精製したものを使用することができるが、飲食品等として不適当な不純 物を含有しない限り粗精製したものを使用することもできる。
[0039] 4.カンゾゥ抽出物
本発明のカンゾゥ抽出物は、自然蒸発、減圧蒸発、加熱濃縮等の当業者に周知の 方法により溶媒を除去することによって濃縮した後、濃縮された抽出物 (例えば固形 物、粉末調整品）とすることができる。濃縮物は、有効成分が濃縮されているため、一 般に多量摂取に適している。本発明のカンゾゥ抽出物は、液体クロマトグラフィー、例 えば HPLCで測定した場合にその固形分基準で、グラブレン、グラブリジン、グラブ口 ール、 3'—ヒドロキシー 4' O メチルグラブリジン、 4' O メチルグラブリジン及 びヒスパグラブリジン B力もなる群より選ばれる少なくとも 1種以上の化合物またはその 塩、エステルもしくは配糖体を、遊離化合物の 1種または 2種以上の総量として約 1重 量％以上、好ましくは約 5重量％以上、より好ましくは約 10重量％以上、もっとも好ま しくは約 15重量％以上含有してもよ 、（上限は約 99%重量以下)。
[0040] 5.組成物
本発明の組成物は、飲食用等に許容される担体を含む。それらの担体は、例えば 経口、経腸、経皮、皮下、または非経腸投与のため好適な任意の不活性、有機また は無機材料であり得、限定されないが水、ゼラチン、アラビアガム、ラタトース、微結晶 性セルロース、スターチ、ナトリウムスターチグリコレート、燐酸水素カルシウム、ステア リン酸マグネシウム、タルク、コロイド性ニ酸ィ匕ケィ素、などであることができる。そのよ うな組成物はまた、他の薬理学的活性な剤、および慣行の添加物、例えば安定剤、 湿潤剤、乳化剤、香味剤、緩衝剤、などを含みうる。本発明の組成物は、組成物全体 を基準とした場合に、上記化合物の総和またはカンゾゥ抽出物として約 0. 001から 9 9. 999重量0 /0、 0. 01力ら 99. 99重量0 /0、また ίま 0. 1力ら 99. 9重量0 /0含む。飲食 用担体は、当業者に周知の任意の食品または食品添加物であり得る。食品添加物 は食品衛生法上許容される任意の食品添加物が好ましい。
[0041] 6.リパーゼ阻害活性
本発明において、リパーゼ阻害活性を有することを確認するには、例えば、リパー ゼ標品とその基質であるトリダリセライドまたはその類似物質でリパーゼの基質となり 得る化合物（例えば 4—メチルゥンベリフエロンのォレイン酸エステル）を、被検サンプ ルと共に酵素反応に好適な緩衝液 (例えば Mcllvain buffer)中で一定時間反応させ、 反応後の分解物を比色法や蛍光法、酵素法、液体又はガスクロマトグラフィー、滴定 法等で定量することで可能である。
[0042] 7.コレステロールエステラーゼ阻害活性
本発明にお 、て、コレステロールエステラーゼ阻害活性を有することを確認するに は、例えば、コレステロールエステラーゼ標品とその基質となりうる化合物例えばコレ ステロールの脂肪酸エステルやその類似物質 (例えばコレステリルピレニルフォスフ エート)を、被検サンプルと共に酵素反応に好適な緩衝液 (例えば胆汁酸塩を含んだ リン酸緩衝液）中で一定時間反応させ、反応後の分解物を比色法や蛍光法、酵素法 、液体又はガスクロマトグラフィー、滴定法等で定量することで可能である。またコレス テロールエステラーゼという酵素はかなり幅広い基質に作用することから、コレステロ ールエステル以外にも（非特許文献 7)に記載されているような p-Nitrophenyl butyrateでも、またトリァシルグリセロールやリン脂質やそれらの類縁体などを基質とし て測定することも可能である。
[0043] 8.脂肪吸収抑制、コレステロール吸収抑制等
脂肪吸収抑制効果の確認は、例えば、高脂肪食で動物 (マウス、ラットなど)を飼育 し、その餌中に被検サンプルを混入させて一定期間飼育した後の体重や体脂肪量 を測定する方法、および Zまたは糞中に残存する脂質量を測定する方法で可能であ る。糞の他に血液や臓器中の脂質量の蓄積を測定することでも確認しうる。コレステ ロール吸収抑制効果またはコレステロールエステル吸収抑制効果の確認は、脂肪吸 収抑制効果の確認と同様の方法において、コレステロール量またはコレステロールェ ステル量を測定する方法によって確認しうる。サンプルの与え方は飲料水中に混入さ せても良いし、またゾンデなどを用いて強制的に経口投与しても構わない。また遺伝 的肥満モデル動物を普通食で飼育した実験系も考えられるし、ボランティアによるヒト での試験も可能である。
[0044] 9.製品形態例
本発明の組成物を応用した最終的な製品形態として、例えば、カンゾゥ植物材料（ 例えばカンゾゥの粉末または抽出物)をデキストリン粉末や澱粉等と混ぜて粉末体や 散剤、顆粒形態にしたり、滑沢剤、結合剤、コーティング剤等を添加して打錠し、錠 剤形態にしても良い。カンゾゥ植物材料等に対して乳化剤と水とを加えて水溶性剤 にすることも可能である。乳化剤としては、例えば高級アルコール類、高級脂肪酸類 、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ステ ァロイル乳酸カルシウム、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン ソルビタン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステルなどの界面活性剤が挙げ られる。
[0045] 本発明のリパーゼ阻害剤等と油脂とを混合した油脂組成物の製品形態としてもよい 。グラブレン、グラブリジン、グラブロール、 3'—ヒドロキシー 4' O メチルグラブリジ ン、 4'— O—メチルグラブリジン、ヒスパグラブリジン B、またはカンゾゥ抽出物を油脂 に溶解する方法は、特に限定されず、通常の撹拌又は混合などの操作により実施で きる。該化合物を含む抽出物、あるいは該化合物の粗精製品を用いる場合、該化合 物以外の不純物が含まれているため、撹拌又は混合などの操作により該化合物を油 脂に溶解した後に、濾過又は遠心分離などの操作により油脂に不溶な不純物を除 去することが望ましい。該化合物の精製品を用いる場合、容易に均一な溶液を得るこ とができる。また、該化合物を含む抽出物、あるいは該化合物の粗精製品を用いる場 合、予めエタノールなどの有機溶媒に溶解し、その溶液と油脂を混合した後に、有機 溶媒を留去することもできる。
[0046] 中鎖脂肪酸トリグリセリドのような油脂と上記組成物とを調製し、調整した物をカプセ ル製剤として製剤化してもよい。本発明の組成物を内封する、ソフトカプセル製剤の 製品形態としてもよい。ソフトカプセル製剤は、例えば以下のように製造し得る。例え ばロータリー式全自動ソフトカプセル成型機を用いた打ち抜き法、二枚のゼラチンシ ート間に内容物を入れ金型で両面力 圧縮して打ち抜く平板法、または二重ノズル を用いた滴下法 (シームレスカプセル等)等を用いて、上記組成物をカプセル皮膜に 充填し、成型および乾燥することにより、ソフトカプセル製剤を製造できる。
[0047] 前記ソフトカプセルの原料としては、皮膜用には例えばゼラチン、グリセリン、ぺクチ ンを含む。また好ましくは内容物の増粘用に例えば蜜蝌が使用できる。前記ソフト力 プセルの形状は、各種の形状、例えばフットボール (oval)型、長楕円型、チューブ型 、球形、フィッシュ型、セルフカット型、等が挙げられる。また、前記ソフトカプセルの 大きさは、 目的に応じて適宜選定することができる。例えば、カプセル直径は約 6mm 〜9mm、カプセル外皮の厚みは約 0. 4mm〜l . 2mm、質量約 0. lg〜0. 25gで あり得る。
[0048] 本発明のソフトカプセル製剤は、上述のリパーゼ阻害効果、および Zまたはコレス テロールまたはそのエステル吸収阻害効果の他、老人、成人、子供および乳幼児の V、ずれによっても容易に摂取可能であると!/、う利点もある。本発明のソフトカプセル 製剤は、食経験が十分な天然素材であるカンゾゥまたはカンゾゥ抽出物等力 製造 されるから、副作用が生ずる可能性が低いことが予想される。本発明のソフトカプセ ル製剤は、携帯に便利であり、および多量または少量でも摂取することが容易である
[0049] その他、カンゾゥの粉末または抽出物を小麦粉等と混ぜてベーカリー用やテンプラ 粉等といった乾燥粉末体としても良いし、また、カンゾゥの粉末または抽出物を食用 油に溶解させて脂肪吸収低減食用油脂としても良い。また、カンゾゥの粉末または抽 出物を乳化剤と共にェマルジヨン化し、飲料としても良いし，そのェマルジヨンを様々 な加工用食材と混合してチューインガム、チョコレート、キャンディー、ゼリー、ビスケッ ト、クラッカーなどの菓子類、アイスクリーム、氷菓などの冷菓類、うどん、中華麵、ス バゲティー、即席麵などの麵類、蒲鋅、竹輪、半片などの練り製品、ドレッシング、マ ヨネーズ、ソースなどの調味料、ハム、スープ、各種レトルト食品、各種冷凍食品、ぺ ットフードや家畜飼料などへも利用することができる。
[0050] 本発明の組成物を応用したその他の例として、皮膚に感染する菌が皮膚表面の皮 脂を分解することによって生ずる皮膚トラブルを防ぐ効能を有する剤 (例えば抗炎症 剤）、またはそれらのいずれかを含む化粧品 (例えば保湿剤、美白剤、紫外線防止剤 、化粧水、または化粧クリーム)または養毛剤としての応用も可能である。
[0051] 9.化合物等の有効量
本発明において、リパーゼ阻害、コレステロールエステラーゼ阻害、中性脂肪吸収 抑制、コレステロール吸収抑制、コレステロールエステル吸収抑制、肥満予防、また は肥満処置のために有効な量は、グラブレン、グラブリジン、グラブロール、 3'—ヒド 口キシー 4' O メチルグラブリジン、 4' O メチルグラブリジンおよびヒスパグラ ブリジン B力 なる群より選択される 1種または 2種以上の遊離ィ匕合物の総量として、 成人一曰一人当たり約 0. 00001〜600mgZkg体重、好まし <は約 0. 0001〜60 mgZkg体重、より好ましくは約 0. 001〜6mgZkg体重、もっとも好ましくは約 0. 01 〜0. 6mgZkg体重であり得る。もっとも、それらの有効な量は、対象動物の年齢、体 重、健康、性別、摂取の様式および時間、排出の割合、上記組成物の組み合わせ、 および対象の状態の程度などに依存して異なり得るが、当業者周知の方法により実 験的または経験的に決定することができる。
[0052] 好ましくは、本発明の組成物は、本発明の抽出物及び Zまたはグラブレン、グラブリ ジン、グラブロール、 3，ーヒドロキシ 4'—O メチルグラブリジン、 4'—O メチル グラブリジン及びヒスパグラブリジン B力もなる群より選ばれる少なくとも 1種以上また はその塩もしくはエステルを、油脂と混合したものであってもよい。油脂は、カンゾゥ 抽出物をのぞく組成物基準で、約 5から 100重量％、好ましくは約 20から 100重量％ 、より好ましくは約 30から 100重量0 /0、より好ましくは約 40から 100重量0 /0、より好まし くは約 50から 100重量0 /0、より好ましくは約 60から 100重量％より好ましくは約 70か ら 100重量％、より好ましくは約 80力ら 100重量％、もっとも好ましくは約 90から 100 重量％含まれることができる。
[0053] 本発明で使用される油脂は、中鎖脂肪酸トリグリセリドを含むグリセリン脂肪酸エス テルであって、好ましくは中鎖脂肪酸トリグリセリドを約 50重量％以上、より好ましくは 約 60重量％以上、もっとも好ましくは約 70重量％以上含むものである。ここでの中鎖 脂肪酸トリグリセリドは、炭素原子数約 6〜 12の脂肪酸を構成脂肪酸とし、その脂肪 酸の構成比率は特に限定されないが、炭素原子数約 8〜10の脂肪酸の構成比率は 、好ましくは約 50重量％以上、より好ましくは約 60重量％、もっとも好ましくは約 70重 量％以上である。とりわけ、 20°Cでの比重が約 0. 94-0. 96、 20°Cでの粘度が約 2 3〜28cP (センチポアズ)の中鎖脂肪酸トリグリセリドがさらに好ましい。また、中鎖脂 肪酸トリグリセリドは、天然由来のものやエステル交換などにより調製したものなど、い ずれも使用することができる。
[0054] また、本発明で使用される油脂は、部分グリセリドを含むグリセリン脂肪酸エステル であって、好ましくは部分グリセリドを約 50重量％以上、より好ましくは約 60重量％以 上、もっとも好ましくは約 70重量％以上含むものである。ここでの部分グリセリドとは、 ジグリセリド（1, 2 ジァシルグリセロール、 1, 3 ジァシルグリセロール）又はモノグリ セリド（1ーモノアシルグリセロール、 2—モノアシルグリセロール）であり、いずれを用 いても良いし、両者が混合されたものを用いても良いが、加工性の観点力もジグリセリ ドが好ましい。また、部分グリセリドは、天然由来のものやエステル交換などにより調 製したものなど、いずれも使用することができる。
[0055] 10.リパーゼ阻害剤等
本発明は、有効成分としてグラブレン、グラブリジン、グラブロール、 3'—ヒドロキシ 4' O メチルグラブリジン、 4' O メチルグラブリジン及びヒスパグラブリジン B 力もなる群より選ばれる少なくとも 1種以上の化合物、そのエステル、塩、または配糖 体を含有することを特徴とするリパーゼ阻害剤、コレステロールエステラーゼ阻害剤、 中性脂肪吸収抑制剤、コレステロール吸収抑制剤、コレステロールエステル吸収抑 制剤、肥満予防剤、または肥満処置剤等を提供する。
[0056] 前記リパーゼ阻害剤等は、食品添加物として利用してもよい。本発明の組成物およ びリパーゼ阻害剤等の由来となってカンゾゥは、食品添加物として使用されてきた実 績がある。したがって、本発明の上記組成物およびリパーゼ阻害剤等は、飲食等用と して大量に摂取する用途にも有効である。
[0057] 11.製造方法等
本発明は、カンゾゥ属（Glycyrrhiza)植物を溶媒と接触させることによって、グラブレ ン、グラブリジン、グラブロール、 3'ーヒドロキシー 4' O メチルグラブリジン、 4' O—メチルグラブリジン及びヒスパグラブリジン B力もなる群より選ばれる少なくとも 1種 以上の化合物、もしくは、そのエステル、その塩、またはその配糖体を抽出する工程 を含む、本発明の組成物または剤の製造方法を提供する。必要により、上記化合物 、その塩、エステル、もしくは配糖体は相互に変換してもよい。
[0058] 本発明の剤または組成物を哺乳動物を含む動物一般に摂取させる工程を含めるこ とにより、肥満予防方法または肥満処置方法に応用してもよい。そのような動物一般 は、肥満予防または肥満処置の必要のある場合に限らず、必要のない場合も含む。 本明細書において、肥満の処置は、少なくとも体重の増加が抑制されること、または 必要により体重が減少することを意味する。一般に、肥満とは、 BMI (体格指数、 body mass index)が 30以上の場合を意味する。ここで、 BMIは、計算式 BMI =体重 [m]/ (身長 [kg])2で求めることができる。本明細書においては、前記 BMI値を有する肥 満及びそれに至らな 、肥満予備軍、また 、わゆる内臓肥満の場合も肥満に含むもの とする。
実施例
[0059] 以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限 定されるものではない。
[0060] (実施例 1) G.ダラブラのエタノール抽出物の調整
G.グラブラ（アフガニスタン産）の根茎 1. 5Kgを 7. 5Lのエタノールで 45°C、 2時 間抽出する操作を 2回行った。抽出液を 40°C保温下でエバポレーターで減圧濃縮し て 670mlの濃縮液を得た。そのうち 600mlに活性炭 9. 7gを加え、 3時間攪拌後、濾 紙で濾過した盧液をエバポレーターで濃縮乾固して、 32. 4gの活性炭処理抽出物（ グラブラ.エタノール抽出物）を得た。残りの 70mlの濃縮液は活性炭処理せずにその まま濃縮し、 3. 7gの抽出物を得た。
[0061] (実施例 2)グラブラ ·エタノール抽出物 MCTオイル溶解物の調製
実施例 1の活性炭処理後のグラブラ 'エタノール抽出物 30. Ogと中鎖脂肪酸トリダリ セリド（MCT)であるアクター M— 2 (理研ビタミン (株）：脂肪酸組成は C8： C10 = 99 ： 1) 58gとを混合して約 1時間撹拌した後、吸引ろ過により不溶分を分離することによ つて、 G.グラブラ抽出物固形分として 30%含有する MCTオイル溶解物 81. 5g得た 。得られた MCTオイル溶解物を HPLC用メタノールに溶解し、下記の条件にて HPL C分析を行った結果、 MCTオイル溶解物 lgあたりにグラブレン、グラブリジン、グラブ ロール、 4'—O—メチルグラブリジン力それぞれ 6. 6mg、 30. 8mg、 12. 6mg、 9. 7 mg含まれていた。
[0062] なお、本発明のソフトカプセル製剤の実施例として、例えば上記 MCTオイル溶解 物をロータリー式ソフトカプセル製造装置を用いてゼラチン皮膜に圧入することで、 内容量 360mgのソフトカプセル剤を得ることができた。
[0063] (HPLC分析条件）
分析カラムは、 J ' sphere ODS— H80, 4. 6 X 250mm ( (株）ヮイエムシィ）をカラ ム温度 40°Cにて使用した。移動相は、 20mM リン酸水溶液に対してァセトニトリル の比率を分析開始から 20minまで 35%で一定とし、 20min以降 75min後に 70%と なるように一定の比率で上昇させ、 75minから 80minまで 80%で一定とするグラジ ェント条件で、流速 lmlZminとした。注入量は 20 1とし、検出波長は 254nmとし た。各化合物の保持時間は、グラブレンが 40. Omin、グラブリジンが 50. 2min、ダラ ブロールが 58. 3min、4'—0 メチルグラブリジンが 66. 8minであった。定量は、 各化合物のピーク面積を標準品のピーク面積力 得た検量線と比較するとによって 行った。
[0064] (実施例 3)リパーゼ阻害活性の確認
上記グラブラ 'エタノール抽出物のほか、これまでリパーゼ阻害活性を示すことが報 告されている（特開平 10— 265328、特開 2002— 53484、特開 2004— 137190) ォレアノール酸 (シグマ ·アルドリッチ）やェピカテキンガレート（和光純薬）、およびグ ラブリジン標準品について、豚及びヒト脾臓由来リパーゼに対する阻害活性を測定し た。
[0065] 豚及びヒト脾臓由来リパーゼに対する阻害活性の測定方法は、以下の通りである。
Mcllvaine緩衝液（0. 1M リン酸水素 2ナトリウムに 0. 1M クェン酸水溶液を加えて pH7. 4に調製） 22. 5 1、ジメチルスルホキシド（DMSO)に溶解した上記各対象物 2. 5 1、 Mcllvaine緩衝液に溶解したリパーゼ (ヒトまたは豚の脾臓由来; Sigma社)溶 液 50 1、同緩衝液で 0. ImMに調製した 4—メチルゥンベリフエロンのォレイン酸ェ ステル（4 MUO) 25 1を混合し、 37°Cで 20分保温した。ヒト由来酵素は luZml、 豚由来酵素は 119uZmlの濃度で添加した。 1Nの塩酸を 50 1添加して反応を止 め、 IN—クェン酸ナトリウム水溶液 100 1加えて pHを 4. 3付近に調製して蛍光 (励 起波長 320nm、蛍光波長 450nm)を測定した。コントロール（DMSOのみ）及び上 記各サンプル中のリパーゼで切断されて生じた 4ーメチルゥンベリフエロン量（以下「 反応値」と略す）は、リパーゼ存在下の蛍光強度からリパーゼ非存在下の蛍光強度を 差し引いて求めた。阻害活性は計算式：
阻害活性（％) = { 1—（サンプル添加物の反応値 Zコントロールの反応値） } X 100
C 十异し/^。
[0066] 図 1に示すように、 G.ダラブラのエタノール抽出物、及び G.ダラブラのエタノール 抽出物中に存在する主なフラボノイドである 2つのグラブリジン標品（グラブリジン標 品およびェピカテキンガレート標品）の 2者共、豚及びヒト脾臓由来リパーゼ活性を明 らかに阻害することが確認された。なお、図 1中、カンゾゥ抽出物の量は固形分として 表す。カンゾゥ抽出物中のグラブリジン量は固形分基準で約 10重量％である。
[0067] 図 1に示す結果に加えて、さらに各種対象物についてのリパーゼ阻害活性を測定 した。表 1は、各種対象物についての、ブタ脖臓リパーゼに対する IC50値 g/ml )を示す。表右欄は、対象物の分子量に基づレ、て計算したモル濃度（ μ Μ)を示す。 使用したリパーゼ酵素は、豚由来で 310uZmlで添加した。 LFO (カンゾゥ抽出物の MCTオイル溶解物）は、カンゾゥダラブラのエタノール抽出物を、グラブリジン濃度 1 %となるように MCTに溶解することによって調整した。オルリスタツト（商品名
XENICAL;ロシュ社）は、比較対照として用いた医薬品である。
[0068] [表 1] パーゼ 測定結果 [IC50値（ g/ml) ]
Figure imgf000019_0001
[0069] 表 1に示すように、上記グラブラ 'エタノール抽出物および LFOの他、 G.グラブラ中 のグラブリジン以外のフラボノイドであるグラブロール、グラブレン、 4' O—メチルダ ラブリジンも強いリパーゼ阻害活性を示した。これら G.グラブラ抽出物中に存在する 4つのフラボノイドは、これまでリパーゼ阻害活性を示すことが報告されて ヽるォレアノ ール酸 (シグマ'アルドリッチ）、ェピカテキンガレート（和光純薬）、およびクルクミン（ シグマ)などよりも強!、リパーゼ阻害活性を示した。
[0070] (実施例 4)コレステロールエステラーゼ阻害活性の確認
グラブラ ·エタノール抽出物、そのグラブラ ·エタノール抽出物を MCT (中鎖脂肪酸 トリグリセリド (アクター M2；理研ビタミン株式会社) )に溶解 (カンゾゥエタノール抽出 物 3重量部、中鎖脂肪酸トリグリセリド 7重量部）させたサンプル（「LFO」）、カンゾゥグ ラプラのエタノール抽出物中に存在する主なフラボノイドであるグラブリジン、グラブ口 ール、グラブレン、 4'—O メチルグラブリジン標品のそれぞれについて、ゥシ脾臓 由来コレステロールエステラーゼに対する阻害活性を検討した。
[0071] ゥシ脾臓由来コレステロールエステラーゼに対する阻害活性の測定方法は、以下 の通りである。 lOOmM リン酸ノ ッファ（pH7. 0)に 100m NaClを加えたものを反 応液用バッファとした。基質として、 Cholesteryl(pyren-l-yl)hexanoate (ChPH； Sigma) lmgおよび卵黄レシチン 10mgを lmlのエタノール（EtOH)に溶解したものを作製し た（作製法は Chemistry and Physics of Lipids, 36, 335-341, 1985を参照）。上記反応 液用バッファを含む反応液全体に対して、基質を 1Z100量、タウロコール酸 Na( Sigma)を 6mM、 DMSOに溶解した被検物を反応液全体の 1Z35量、およびコレステ ロールエステラーゼ（ゥシ脾臓由来；オリエンタル酵母社製)を 0. 13ユニット/ ml添 加し、 37°Cで反応させた。蛍光光度計 (励起 340nm、蛍光 397nm)で反応産物で ある 6—ピレニルへキサノイツクアシッドの蛍光強度を継時的に測定した。なお、阻害 活性はリパーゼの場合 (実施例 3)と同様の計算方法を用いた。
[0072] [表 2] コレステロールエステラ一ゼ阻害活 ft測定結果 [IC50値 gZn
対家物 gZml U M
Glabrene 10.0 30
Glabridine 44.0 135
Glabrol 5.0 12
4'一 0 - Methylglabridine 19.0 57
Glabraエタノール抽出物 4 ―
LFO 1 8.0 ―
[0073] 表 2に示すように、 G.グラブラ 'エタノール抽出物、それを中鎖脂肪酸に溶解させ たサンプル (LFO)、また G.ダラブラのエタノール抽出物中に存在する主なフラボノ イドであるグラブリジン、グラブロール、グラブレン、 4' O メチルグラブリジンも強い コレステロールエステラーゼ阻害活性を持つことが確認された。
[0074] (実施例 5)体重増加抑制効果の確認
C57BL/6Jマウス (雌)を日本クレア社より 8週齢で入手後、表 3に示す高脂肪食で 8 週間飼育し、肥満モデルを作成した。飼育中、餌と水は自由摂取させた。
[0075] [表 3] 脂 成
Figure imgf000021_0001
[0076] その後体重の特に大きな個体を除き、 10匹づっ 4群に分けた。実施例 2で取得し た G.ダラブラのエタノール抽出物の MCTオイル溶解物をさらに MCTで希釈して、 グラブリジンを 1. 2%含むカンゾゥエタノール抽出物の MCTオイル溶解物（以下 FOJとも表示する）を調製した。その MCT溶解物を表 3の高脂肪食に混ぜて表 4に 示す試験用飼料を作製した。カンゾゥ抽出物の MCT溶解物 (LFO)中のグラブリジ ン含量は 1. 2%に調製されている。
[0077] [表 4] 試験用飼料
Figure imgf000022_0001
[0078] 4群に分けた肥満モデルマウスに自由摂取させて約 8週間程度飼育した後、体重を 測定した。表 5は、各群の体重の変化を示す。有意差検定は Dunnetによる母平均 の多重比較法により行った。
[0079] [表 5]
Figure imgf000022_0002
[0080] 表 5に示すように、カンゾゥ抽出物の MCTオイル溶解物の量に依存して、明らかな 体重増加抑制効果が認められることがわかる。
[0081] (実施例 6)糞中のトリグリセライド量等の比較
実施例 5に示す体重抑制効果について、リパーゼ阻害による脂肪吸収抑制効果お よび Zまたはコレステロールエステラーゼ阻害によるコレステロール吸収抑制効果が 関与して!/、ることを確認するために、実験期間中に採取した糞の中に残存する中性 脂肪（トリグリセライド）、脂肪酸、コレステロール、コレステロールエステル量を比較し た。比較結果は、下の表 6に示す。
[0082] 糞中のトリグリセライド量等は、糞約 0. 5gを 4mlの硫酸ナトリウム溶液 (6. 25%)に 縣濁し、 6mlのへキサン（3容量） Z2—プロパノール（2容量）で 2回抽出し、エバポレ 一ター（40°C)で濃縮し、ガスクロマトグラフィー（カラム： equity- 1 (supelco社；内径 0. 25mm,膜厚 0. 25 μ m、長さ 2m)； 120°Cから 10°C /分で 340°Cまで昇温）で測定 した。定量計算用に使用する標準物質として、トリダリセライド (TG)量にはトリオレイ ン（Sigma)、コレステロール量（CH)にはコレステロール（Sigma)、コレステロールエス テル量（CE)にはコレステロールパルミテート及びコレステロールステアレート（Sigma )を標準として定量した。また糞中に排泄された遊離脂肪酸量 (FA)もォレイン酸 (和 光純薬）を標準として測定した。カンゾゥ抽出物の MCTオイル溶解物（LFO)中のグ ラブリジン含量は 1. 2%に調製した。
[0083] [表 6] 高脂肪食を与えたマウス糞中の Wグリセライド含量（i/ gTGZg糞）、脂肪酸含量 (mgFA
糞）、コレステロール含量（ ju gCHZg糞）、コレステロールエステル含量（ gCE/g 糞）
6
Figure imgf000023_0001
7
Figure imgf000023_0002
[0084] 表 6で明らかなように、カンゾゥ抽出物の MCTオイル溶解物を加えた群の場合、糞 中に排泄された中性脂肪 (TG :トリダリセライド）、脂肪酸、コレステロール、コレステロ ールエステル量のそれぞれは、高脂肪食のみの対照群と比較して用量依存的に明 らかに増加する傾向が確認できた。脂肪等の吸収を抑制し、その脂肪等を糞中によ り多く排泄させる効果は、上記した体重抑制効果 (実施例 4参照）に寄与しているもの と考えられる。
[0085] (実施例 7)糞中のトリグリセライド量等の比較 表 3で示した高脂肪食に、以下の表 7に示す、 G.ダラブラのエタノール抽出物の M CTオイル溶解物（LFO)を混入させた混餌にぉ 、て、 SDラット（6週齢雄；チヤール ズリバー）を 10日間飼育した。表 7中、カンゾゥ抽出物の MCTオイル溶解物（LFO) とは、カンゾゥ抽出物中のグラブリジン量が 1%となるようにカンゾゥ抽出物を MCTに 溶解したものである。
[0086] [表 7] 高脂肪餌に LFOと MCTとを添加した試料の調製
Figure imgf000024_0001
[0087] 10日間の飼育期間中、 3日目、 7日目、 10日目のそれぞれの前日から 24時間、各 頭毎個別に集めた糞を実施例 5と同様に凍結乾燥、抽出し、含まれる脂肪量等を測 定した。 n数はコントロールが 4、その他は 3である。有意差検定は DUNNETの母平 均の多重比較法で行った。
[0088] 図 2は、ラット糞中の脂肪量等の測定結果を示すグラフである。図 2に示すように、 G .グラブラ抽出物を経口で摂取したラットの糞中の脂肪酸、トリダリセライド、コレステロ ール、コレステロールエステル量は、対照と比較して増加している、すなわち脂肪が 糞中に多く排泄されていることが確認された。なお、図 2中の *印は危険率 5%で有 意、 * *印は 1%有意表す。
[0089] (実施例 8)血中のトリダリセライド濃度の測定
ー晚絶食させた Wistarラット（8週齢雄：チャールズリバ一： N=6)に対して、表 7に 示す脂質ェマルジヨンにグラブラ抽出物（グラブリジンが 1。/0となるように MCTに溶解 )含有 MCT (LFO)を 1 %、および 3 %混合したものをゾンデで強制経口摂取した。 具体的には、各ラットに対して、 2mlの脂質ェマルジヨン (コーン油：水 = 1 : 1)を経口 摂取した。脂質ェマルジヨンは、表 8に示す各組成物を 10分間超音波処理すること によって作成した。 [表 8]
血中 TG測定用脂質ェマルジヨン組成
Figure imgf000025_0001
図 3は、経口摂取の 1、 2、 4、 6時間経過後の血中のトリグリセライドを、トリグリセライ ドテストヮコーを用いて測定した結果を示すグラフである。血液は頸静脈より 0. 3ml 採取した。 1群につき 6匹の測定を行い、有意差検定は DUNNETによる母平均の 多重比較法で行った。図 3に示すように、 G.グラブラ抽出物の経口投与によって血 中のトリダリセライド濃度が著明に減少していることが確認された。

Claims

請求の範囲
[1] グラブレン、グラブリジン、グラブロール、 3，ーヒドロキシー 4' O メチルグラブリ ジン、 4' O メチルグラブリジン及びヒスパグラブリジン B力もなる群より選ばれる 1 種以上の化合物、もしくはその塩、そのエステル、またはその配糖体を有効成分とす るリパーゼ阻害剤。
[2] グラブレン、グラブリジン、グラブロール、 3，ーヒドロキシー 4' O メチルグラブリ ジン、 4' O メチルグラブリジン及びヒスパグラブリジン B力もなる群より選ばれる 1 種以上の化合物、もしくはその塩、そのエステル、またはその配糖体を有効成分とす る中性脂肪吸収阻害剤。
[3] グラブレン、グラブリジン、グラブロール、 3'—ヒドロキシ 4'—O メチルグラブリジ ン、 4' O メチルグラブリジン及びヒスパグラブリジン B力もなる群より選ばれる少な くとも 1種以上の化合物、もしくはその塩、そのエステル、またはその配糖体を有効成 分とする、コレステロールエステラーゼ阻害剤。
[4] グラブレン、グラブリジン、グラブロール、 3，一ヒドロキシ一 4'—O—メチルグラブリ ジン、 4' O メチルグラブリジン及びヒスパグラブリジン B力もなる群より選ばれる少 なくとも 1種以上の化合物、もしくはその塩、そのエステル、またはその配糖体を有効 成分とする、コレステロールまたはコレステロールエステルの吸収阻害剤。
[5] グラブレン、グラブリジン、グラブロール、 3，ーヒドロキシー 4' O メチルグラブリ ジン、 4' O メチルグラブリジン及びヒスパグラブリジン B力もなる群より選ばれる 1 種以上の化合物、もしくはその塩、そのエステル、またはその配糖体を有効成分とす る肥満予防剤または肥満処置剤。
[6] 前記 1種以上の化合物、もしくはその塩、そのエステル、またはその配糖体は、カン ゾゥ属 (Glycyrrhiza)植物材料、または当該植物材料の溶媒抽出物カゝら得られる、請 求項 1から 5の!、ずれかの剤。
[7] 該溶媒がエタノールを含む、請求項 6の剤。
[8] 前記カンゾゥ属植物材料がグラブラ (glabra)種である請求項 6の剤。
[9] 前記カンゾゥ属植物がゥラレンシス (uralensis)種である請求項 6の剤。
[10] 請求項 1から 9の 、ずれかの剤と飲食用に許容される担体とを含む、飲食用組成物
[11] 請求項 1から 9のいずれかの剤と医薬用に許容される担体とを含む、医薬組成物。
[12] 請求項 1から 9のいずれかの剤と飼料用またはペットフード用に許容される担体とを 含む、飼料用組成物またはペットフード用組成物。
[13] 請求項 10から 12のいずれかの組成物を含む製剤。
[14] カンゾゥ属 (Glycyrrhiza)植物材料を溶媒と接触させる工程を含む、請求項 1から 9 の！、ずれかの剤の製造方法。
[15] 請求項 1から 9のいずれかの剤、請求項 10から 12のいずれかの組成物、または請 求項 13の製剤のそれぞれの有効量を動物に適用することにより、肥満を予防または 肥満を処置する方法。
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