KR101356398B1 - 대두가공 부산물을 유효성분으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

대두가공 부산물을 유효성분으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상기 대두가공 부산물을 유효성분으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유효성분으로 대두의 순물, 대두의 침지수 또는 이들의 혼합물을 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 본 발명에 따른 조성물은 천연 식품의 추출물을 사용하여 인체에 무해하며, 체내 지방의 축적을 감소시킬 수 있는 효과가 탁월할 뿐 아니라 지방산 산화의 촉진을 억제함으로써 고지방 섭취에 의해 발생되는 비만을 예방 및 치료에 부작용 없이 효과적으로 사용할 수 있으며, 또한 비만에 기인한 대사성 및 심혈관, 뇌혈관 질환, 암과 같은 다양한 질병의 예방에 크게 기여할 수 있는 장점이 있다.

Description

대두가공 부산물을 유효성분으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물{Composition containing soybean by product for anti-obesity}
본 발명은 상기 대두가공 부산물을 유효성분으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유효성분으로 대두의 순물, 대두의 침지수 또는 이들의 혼합물을 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
현대사회는 생활수준의 향상으로 인한 식생활의 서구화와 더불어 식생활 패턴의 변화로 인해 식물성 식품의 섭취량은 점차 감소하는 반면 포화지방산이나 콜레스테롤을 많이 함유하고 있는 동물성 식품의 섭취량이 증가함에 따라 비만이 심각한 사회적 문제로 대두되고 있다(Kim et al., 1993).
비만(Obesity)은 에너지 섭취와 소비의 불균형으로 인하여 체지방이 과도하게 축적되어 생기는 일종의 대사성 질환으로(Song et al., 2009), 유전적, 환경적 및 사회적 구조 변화 등과 같은 다양한 원인들이 관여하는 복합적 증후군으로(Grundy, 1998; Albu et al., 1997), 과도한 에너지 섭취로 체내 대사 활동으로 소비되고 남은 영양분이 지방 조직에 중성지방으로 축적되어 발생되며 이러한 지방조직이 필요량 이상으로 과도하게 축적되면 정상적인 생리적 및 생화학적 기능에 영향을 미친다(Huh, 1990). 또한 비만의 정확한 기전을 알려져 있지 않으나 비만도가 높을수록 심혈관 장애 질환 등의 위험도가 높아지는 것으로 알려져 있다. 비만은 그 자체가 갖는 문제점 뿐 아니라, 심혈관계 질환이나 당뇨, 호흡기 질환, 골관절염 같은 질병을 유발할 수 있기 때문에 전 세계적으로 비만에 많은 관심이 모아지고 있다(Antipatis and Gil, 2001).
비만은 에너지의 과다 섭취, 운동 부족뿐 아니라 내분비적 요인, 약물 원인, 유전적 요인 등이 복합적으로 작용하므로 비만을 개선하기 위한 방법으로는 식사, 운동, 행동 요법이나 약물 치료 등이 쓰이고 있다. 약물 요법으로는 비만을 일으키는 작용기전에 따라서 식욕 억제효과를 나타내는 리덕틸과 지방의 소화흡수 억제효과를 나타내는 제니칼 등과 같은 약물이 임상에서 사용되고 있다(Kim, 2004). 하지만 이러한 약물은 기름변이나 복부 팽만감, 어지러움, 구갈, 변비, 혈압상승 등과 같은 부작용을 유발할 수 있는 것이 알려지면서(Reddy and Chow, 1998), 보다 안전하고 효력이 강한 천연 기능성 물질의 개발이 요구되고 있어 천연 생리활성물질에 관한 많은 연구가 필요한 실정이다.
국내의 경우, 다수의 천연물질이 비만 예방에 효과가 있는 건강식품으로 시판되고 있으나 이들 대부분은 과학적인 검증을 거치지 않은 것이 많으며 오히려 건강식품 남용의 원인이 되기도 하여 사회적인 문제가 되고 있다.
한편, 대두 순물, 대두 침지수는 두부 제조 공정 시에 발생되는 부산물로서 현재 순물과 침지수는 두부의 제조과정에서 폐기되고 있다. 일부 대두 순물과 대두 침지수에 대한 항산화 활성(Kim and Lee, 2007)과 기능성 특성(Kim et al., 2006) 및 침지저장액에 따른 두부의 물성 변화(Jang et al., 1995)에 관한 연구가 이루어져 있으나 대두가공 부산물인 순물과 침지수의 생리활성 효능에 관한 연구는 매우 미비한 실정이다.
따라서, 식품으로 식이 가능한 천연자원들을 객관적인 검증하여 비만의 치료 및 예방효과를 갖는 천연물질을 개발하고자하는 노력이 시급히 요구된다.
이에, 본 발명자들은 비만의 치료 및 예방효과를 갖는 천연물질의 개발에 지속적인 연구를 진행하던 중 대두가공 부산물인 대두 순물과 대두 침지수가 고지방 식이에 의한 마우스의 지질대사 개선과 항비만에 대한 우수한 천연 생리활성 효능을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인체에 무해하며 고지방 식이에 의한 체내 지방 축적의 감소시킬 수 있는 천연식품 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 비만의 예방 및 치료효과를 갖는 대두가공 부산물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 대두가공 부산물을 유효성분으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것으로, 보다 상세하게는 대두가공 부산물을 유효성분으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 건강보조 식품을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 조성물은 대두가공 부산물을 함유하는 것을 특징으로 하며, 보다 상세하게는 고지방 식이에 의한 비만을 예방하고 치료하는 용도인 대두가공 부산물 및 이를 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 대두가공 부산물은 대두 침지수(soybean soaking water), 두부 순물(soybean curd whey) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서, 용어 “예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (b) 질환 또는 질병의 경감; 및 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다.
본 발명은 유효성분으로, 대두가공 부산물을 함유하는, 비만 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 대두가공 부산물은 대두 침지수(soybean soaking water), 두부 순물(soybean curd whey) 또는 이들의 혼합물인 것으로, 보다 바람직하게는 대두 침지수를 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 두부 순물(soybean curd whey)은 보다 상세하게는 두부 제조 시 발생하는 액상의 순물을 10,000 내지 14,000 rpm으로 원심분리한 후, 여과지를 이용하여 고형분을 제거하여 수득된 상층액, 상기 상층액의 농축물, 또는 상기 농축물을 동결 건조하여 제조한 건조물을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 대두 침지수(soybean soaking water)는 대두를 상온의 물에 침지하여 수득되는 것으로, 보다 상세하게는 대두를 열수가열 없이, 10 내지 30℃의 온도의 물에 3 내지 24시간 침지한 후 수득되는 여과물, 상기 여과물의 농축물, 또는 상기 농축물을 동결 건조하여 제조한 건조물을 포함한다.
본 발명의 조성물은 상기 대두 침지수(soybean soaking water), 두부 순물(soybean curd whey) 또는 이들의 혼합물인 유효성분을 전체 조성물 중 0.001 내지 30 중량%로 포함하여 제조될 수 있다.
상기 유효성분은 간과 부고환 조직의 지방 변성 및 지방축적 억제; 체내 콜레스테롤의 축적 억제; 중성지방의 축적 억제, 전지방세포의 지방세포로의 분화, 지방세포의 증식; 지방생성의 억제; 아세틸-코에이 카르복실라제(ACC, acetyl-CoA carboxylase)의 활성 억제; 및 AMP 유도 활성화 단백질 키나아제(AMPK, AMP-activated protein kinase)의 활성 증가;로부터 선택되는 1종 이상의 작용을 통하여 비만에 대한 근본적인 원인을 제어하는 것을 특징으로 한다.
보다 상세하게는 상기 유효성분은 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체 감마(PPARγ, peroxisome proliferator activated receptor)의 활성을 저해함으로써 항비만 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 건강 보조 식품으로 개발될 수 있다. 상기 건강보조 식품은 드링크제, 캬라멜, 쵸콜릿, 다이어트바 제형, 및 과자류로부터 선택되는 1종 이상인 것으로, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 스탄니오칼신 2 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 식품은 비만의 개선 또는 예방, 및 인지 기능의 개선에 매우 유용하다.
본 발명에 따른 조성물은 천연 식품의 추출물을 사용하여 인체에 무해하며, 체내 지방의 축적을 감소시킬 수 있는 효과가 탁월할 뿐 아니라 지방산 산화의 촉진을 억제함으로써 고지방 섭취에 의해 발생되는 비만을 예방 및 치료에 부작용 없이 효과적으로 사용할 수 있으며, 비만에 기인한 대사성 및 심혈관, 뇌혈관 질환, 암과 같은 다양한 질병의 예방에 크게 기여할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 대두가공 부산물 섭취 식이군에 대한 간세포의 조직학적 변화를 확인한 결과이고,
(A: 정상 식이군, B: 고지방 식이군, C: 대두 순물 식이군, D: 대두 침지수 식이군)
도 2는 본 발명에 따른 대두가공 부산물 섭취 식이군에 대한 지방세포의 조직학적 변화를 확인한 결과이며,
(A: 정상 식이군, B: 고지방 식이군, C: 대두 순물 식이군, D: 대두 침지수 식이군)
도 3은 본 발명에 따른 대두가공 부산물 섭취 식이군에 대한 아세틸-코에이 카르복실라제(acetyl-CoA carboxylase)의 인산화를 확인한 결과이고,
(ND: 정상 식이군, HFD: 고지방 식이군, H-SCW: 대두 순물 식이군, H-SSW: 대두 침지수 식이군)
도 4는 본 발명에 따른 대두가공 부산물 섭취 식이군에 대한 마우스 복부 지방조직의 분포를 확인한 결과이며,
(A: 정상 식이군, B: 고지방 식이군, C: 대두 순물 식이군, D: 대두 침지수 식이군)
도 5는 본 발명의 대두가공 부산물 처리 농도에 따른 전지방세포의 세포 생존율을 확인한 것이고,
도 6은 본 발명의 대두가공 부산물 처리 농도에 따른 지방세포 내 지방함량을 확인한 것이며,
도 7은 지방세포의 분화 전(A) 및 분화 후(B)의 모습을 현미경을 통해 확인한 결과이고,
도 8은 본 발명의 대두가공 부산물 처리 농도에 따른 전지방세포의 분화능을 확인한 결과이며,
도 9는 본 발명의 대두가공 부산물 처리 농도에 따른 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체 감마(PPARγ)의 발현을 확인한 결과이고,
도 10은 본 발명의 대두가공 부산물 처리 농도에 따른 지방대사 관계 유전자들의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과이며,
도 11은 본 발명의 대두가공 부산물 처리 농도에 따른 지방대사 관계 유전자들의 발현을 ImageQuant program을 이용해 정량화한 결과이고,
(A: APOE, B: adipsin, C: Fabp4, D: Scd1)
도 12는 본 발명의 대두가공 부산물 처리 농도에 따른 아디포카인(adipokine) 관계 유전자들의 발현을 확인한 결과이다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
[제조예]
(1) 두부 순물(soybean curd whey)
실험에 사용한 순물 시료는 두부 제조 시 발생하는 액상의 순물을 12,000 rpm으로 원심분리한 후, 여과지(whatman No.1)를 이용하여 고형분을 제거하여 상층액을 수득하고, 수득된 상층액을 농축, 동결 건조하여 건조시료를 사용하였다. 한편, 액상시료는 두부 제조 시 발생하는 액상의 순물을 그대로 시료로 하였다.
(2) 대두 침지수(soybean soaking water)
대두를 열수가열 없이, 15℃의 물에 8 시간 침지한 후, 여과, 농축, 동결 건조하여 사용하였다.
[ 실험예 1]
본 실험에서 사용한 3주령 수컷 마우스(C57BL/6)는 (주)샘타코에서 구입하여, 사육실에서 일정한 조건(온도 21.4±0.05℃, 습도 61±1%, 명암은 12시간 주기)에서 사육하였다. 식이는 물(증류수)과 사료[(주)중앙실험동물에서 구입한 Dyets사 사료(AIN-93G Purified Rodent Diet)]를 충분히 섭취하게 하면서 1주일 동안 순치하였다.
순치 후 실험동물은 각 실험군에 따라 각각 고지방 사료를 섭취시켜(40% Beef Tallow+AIN-76A Diet) 약 7주간 비만 유도 및 각 시료가 비만 유도에 영향을 조사하였다. 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 모든 실험식이는 사육 기간 동안 냉장 보관 하여 실험에 사용하였다.
실험군은 총 4개 그룹으로 정상 식이군(Normal diet (fat: 11.7%), ND), 고지방 식이군[High fat diet(fat : 40%), HFD], 10% 대두 순물 식이군[high fat(fat: 40%)+상기 제조예에서 제조한 10% 대두 순물, H-SCW], 10% 대두 침지수 식이군[high fat(fat: 40%)+상기 제조예에서 제조한 10% 대두 침지 후, H-SSW]으로 나누어 약 7주간 하기 표 1과 같이 각기 다른 조성의 사료를 섭이시켰다. 또한 실험기간 동안 체중 변화를 관찰하기 위해서 매일 일정시간에 체중을 측정하고, 사료와 식수의 변화량을 체크하였다.
본 실험예에서 모든 동물실험 과정은 NIH(National Institutes of Health)의 실험동물관리 규정(Principle of Laboratory Animal Care)과 안동대학교의 실험동물 관리와 사용 지침의 규정에 따라 수행하였다.
Figure 112011021083976-pat00001
실험 최종일에 실험동물을 약 12시간 절식시킨 후 에테르(ether)로 마취시킨 후, 경동맥에서 혈액을 채취하였다. 혈액은 serum용 튜브에 받아 1600 x g 에서 15분간 원심분리 후 혈청을 얻고, 분석 전까지 -80℃에서 냉동 보관하였다. 혈액 채취 후 실험동물을 개복한 부고환 지방 조직과 간조직을 적출하고 생리식염수에 세척한 후 여과지로 물기를 닦아내었다. 전자저울로 생조직의 중량을 측정하고 분석하기 전까지 -80℃에서 냉동 보관하였다.
(1) 간과 부고환 지방조직에서 지방 조직량과 조직학적 변화
대두 순물과 대두 침지수가 고지방 식이에 의한 마우스의 비만에 미치는 영향을 알아보기 위하여 간과 부고환 지방 조직의 중량을 측정하여 비교해보았다.
지방조직의 중량를 측정하기 위하여 개복 직후 간조직 및 부고환 지방 조직을 적출한 뒤 인산완충용액으로 세척한 다음 여과지로 수분을 제거하고 중량을 측정하여 하기 표 2에 나타내었다.
Figure 112011021083976-pat00002
상기 표 2에서도 확인할 수 있듯이, 각 실험군 당 간조직의 중량은 고지방 식이군이 정상 식이군에 비하여 83.2% 높게 나타났다. 반면 대두 순물 식이군과 대두 침지수 식이군은 고지방 식이군에 비해 각각 24.8%, 68.3%의 감소되었다. 또한 부고환 지방의 중량을 조사한 결과 고지방 식이군이 정상 식이군에 비해 210% 높게 나타났으며, 대두 순물 식이군과 대두 침지수 식이군은 고지방 식이군에 비해 각각 24.3%, 76.9%로 감소하였다.
또한, 지방조직의 지방세포 크기를 확인하기 위하여 중량 측정이 끝난 지방 조직을 4% 포름알데히드 용액으로 고정하였다. 고정 후 수세와 탈수 과정을 거친 다음 파라핀(paraffin) 용액을 처리하여 파라핀 블록(paraffin block)을 만든 후 4 내지 6 ㎛의 두께로 절편화 하였다. 절편화된 조직은 헤마톡 실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)에 이중염색한 후, 광학현미경(Olympus BX50, Japan)하에서 관찰하고, 사진 촬영은 Olympus DP-71을 사용해 각 실험군들의 지방조직을 관찰하였다(Heo etal.,2009;Choietal.,2006).
그 결과, 고지방 식이군은 과량의 지방과 콜레스테롤이 정상적으로 체외 배출되지 못하여 간 내의 지방 축적이 유도됨으로서 간이 비대해진 것으로 보이며, 체지방 축적을 대표하는 부고환 지방 조직의 중량을 조사한 결과 고지방 식이로 인해 증가하는 경향을 보였으나 순물과 침지수의 식이로 인하여 지방 축적이 감소되는 것으로 나타났다. 이는 고지방 식이군은 과량의 지방과 콜레스테롤이 정상적으로 체외 배출되지 못하여 간 내의 지방 축적이 유도됨으로서 간과 부고환 지방 조직이 비대해졌으나 대두 순물과 대두 침지수는 고지방 식이로 인한 간 내 지방과 부고환 지방의 축적을 감소시키는 데 효과가 있는 것을 확인한 결과이기도 하다.
특히, 대두 침지수는 고지방 식이로 인한 간과 부고환 지방 조직의 지방 축적을 현저하게 억제시킨 것으로 보아, 고지방 식이에 의한 복부비만억제와 대사성 질환을 예방하는 데에는 순물보다는 침지수가 더 효과적인 생리활성 물질임을 확인할 수 있었다.
(2) 간과 부고환 지방조직에서의 병리조직학적 변화
간은 포도당을 글리코겐으로 합성하여 저장하는 역할을 하는 소화기관으로 동화작용에 의해 생성된 글리코겐은 혈당을 조절하는 용도로 쓰이지만, 지나치게 많아진 경우 지방의 형태로 전환되어 저장되기 때문에 간의 중량 증가 및 조직적 변화를 유발하게 된다(Friedman et al., 1991). 또한 비만은 지방 조직 중량의 증가와 혈중 지방함유량의 증가를 특징으로 하기 때문에 부고환의 지방에 대한 조사는 체중 변화와 비만을 조사하는 데 중요한 지표로서 고지방 식이로 인한 비만 유도 시 부고환 지방의 중량과 크기는 모두 증가하게 된다(Fujioka, 2002).
이러한 측면에서 순물과 침지수가 고지방 식이에 의한 마우스의 간과 부고환 지방의 조직학적 변화에 미치는 영향을 조사하여 본 결과 도 1에서도 확인할 수 있듯이, 정상 식이군의 간 조직은 세포 핵이 대체로 둥글고 중앙에 위치하였으며 간세포 사이의 쿠퍼세포가 전체적으로 고르게 퍼져있는 것을 확인할 수 있었다. 반면 고지방 식이로 비만을 유도한 마우스의 경우 핵 주위에 심한 지방 변성과 공포 현상이 나타났으며 이로 인해 세포질안의 핵이 주변으로 밀려 있었고 정상군에서 관찰되던 쿠퍼세포는 현저히 감소되었다.
이에 반해 대두 순물 식이군은 정상 식이군에 비해 세포 내 지방 축적으로 인하여 간세포가 비대화되어 있었으나 고지방 식이군과 같은 간세포 체적의 지방공포 현상은 뚜렷하지 않았고, 대두 침지수 식이군의 경우 간 조직은 일부의 지방공포만이 확인될 뿐 대다수의 간세포와 쿠퍼세포가 정상 간세포와 유사한 것으로 나타나 고지방 식이군과 같은 심각한 간 조직의 이상현상은 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
또한 대두 순물과 대두 침지수가 흰색지방인 부고환지방의 형태조직학적 변화에 미치는 영향을 살펴본 결과 도 2에서도 확인할 수 있듯이, 정상 식이군에 비해 고지방 식이군은 지방의 축적으로 인하여 지방 세포의 크기가 매우 커진 것을 확인할 수 있었다.
반면 대두 순물 식이군과 대두 침지수 식이군은 고지방 식이군에 비하여 지방세포가 작아져 있었는데, 특히 대두 침지수 식이군의 경우 지방세포의 수는 정상 식이군에 비해 다소 많았으나 세포의 크기는 정상 지방세포와 거의 유사한 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과는 최근 연구에서 Moon 등(2003)은 한약재로 구성된 천연 소재 조성물이 부고환 지방 조직량의 감소와 지방세포 크기를 감소시켜 항비만에 효과가 있다고 한 바 있으며, Yuan 등(2009)은 간과 부고환 지방의 축적을 감소시키는 효과가 있다고 보고된 바와 같이, 상기 실시예의 대두 순물 및 대두의 침지수가 고지방 식이로 인한 간과 부고환 조직의 지방 변성을 억제하는 데에 효과적임을 확인한 결과이며, 나아가 항비만 효과가 있음을 확인한 결과이기도 하다.
(3) 혈액 성분의 생화학분석
비만에서는 지방 대사와 당대사의 비정상적 흐름으로 인한 다양한 이상지혈증이 흔히 동반되고, 기존의 연구에 따르면 비만을 식이로 유도한 동물의 경우 중성지방과 콜레스테롤, 그리고 혈당 수치 증가에 대한 결과가 보고된 바 있다(Lee et al., 2006).
또한 혈장의 GOT와 GPT 효소의 활성도 변화는 간세포의 변성과 괴사가 진행되어 아미노기 전이효소(transaminase)가 혈중 유리되어 높아짐에 따라서 간 조직 손상의 지표가 된다.
본 실험에서는 채혈한 혈액은 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 혈장을 분석에 사용하였다. 분리된 혈장은 아미노산 전이효소(GOT, GPT), 총콜레스테롤(total cholesterol), 고밀도 지질단백질(high density lipoprotein), 저밀도 지질단백질(low density lipoprotein), 총 지질(total lipid) 및 중성지방(triglyceride) 함량의 조사를 위해 혈액분석기(Hitachi 7600)에서 분석하였다.
Figure 112011021083976-pat00003
그 결과 상기 표 3에서도 확인할 수 있듯이, 혈청 중 GOT 활성은 정상 식이군과 각 실험군을 비교하였을 때에 고지방 식이군은 27.8%, 대두 순물 식이군은 57.1%, 대두 침지수 식이군은 20.6% 정도 증가율을 보였으며, GPT 활성은 정상 식이군에 비해 고지방 식이군과 대두 순물 식이군이 모두 증가하였으나 대두 침지수 식이군의 경우 정상 식이군과 유사한 수치를 나타내었다.
이와 더불어 혈청 중 총 콜레스테롤 수치는 정상 식이군에 비하여 고지방 식이군이 93.6%, 대두 순물 식이군이 71.2%, 대두 침지수 식이군이 13.2%로 나타났고, 특히 중성지방 함량은 고지방 식이군이 정상 식이군에 비해 252.7% 증가하여 매우 큰 폭의 수치변화를 보였으며, 대두 순물 식이군이 247.9%, 대두 침지수 식이군이 82.8%로 나타나 대두 침지수 식이군이 고지방 식이로 인한 체내 콜레스테롤과 중성 지방의 증가율을 감소시키는데 효과적으로 작용하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 HDL-콜레스테롤 수치는 정상 식이군에 비해 고지방 식이군이 가장 높게 나타났으며, LDL-콜레스테롤 수치는 대두 침지수 식이군이 고지방 식이군과 대두 순물 식이군에 비하여 가장 낮은 감소폭을 보였다.
혈중 지질 함량의 감소는 관상심혈관계 질환 위험을 감소시킨다는 여러 연구 결과(Park et al., 2005; Wat et al., 2009; Davignon and Cohn, 1996)에 근거하여 상기 실시예의 두부 부산물 중 대두 침지수는 대두 순물에 비해 비만에 의해 유발되는 심혈관계의 위험성을 줄여주는 데 효과적임을 확인한 결과이기도 하다.
(4) 비만 표적 단백질의 인산화비
본 실험에서는 비만의 표적 단백질인 AMPK와 ACC의 활성을 알아보고자 간조직에서 p-AMPK와 p-ACC의 발현을 조사하였다.
간 조직에서 phospho-AMPK와 phospho-ACC는 웨스턴 블럿(western blot)으로 확인하였다. 간 조직을 lysis buffer(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.25% sucrose, 0.4 mg/ml digonin and 1.5 mM PMSF)를 이용하여 균질화 시켰으며, 단백질 정량은 Bio-Rad assay reagent(Bio-Rad, USA)를 이용하여 측정하였다. 간에서 추출한 단백질 40 μg을 전기영동한 후 1차 antibody(p-AMPK-alpha, p-Acetyl-CoA)(Cell signaling Technology, Beverly, USA)를 처리하였고, 2차 antibody(anti-rabbit IgG-HRP)(Santa cruz biotechnology, Santa Cruz, USA)를 처리하여 AMPK와 ACC의 인산화비를 확인하였다.
도 3에서도 확인할 수 있듯이 정상 식이군의 p-ACC의 발현에 대해 상대적인 실험군의 인산화비를 조사한 결과, 고지방 식이군의 p-ACC는 23.0%로 나타난 데 반해 대두 순물 식이군은 83.6%, 대두 침지수 식이군은 164.2%로 조사되었다.
상기의 결과로부터 대두 순물과 대두 침지수는 고지방 식이에 비해 ACC의 인산화에 효과적으로 작용하는 것을 확인할 수 있었으며 특히, 대두 침지수의 경우 ACC의 인산화비가 매우 높기 때문에 metabolic sensor에 해당하는 단백질의 활성화와 지방산 산화 촉진을 억제함으로써 항비만 효과가 매우 높은 것을 확인할 수 있었다.
(5) 복부의 지방조직 분포
12주령의 수컷 C57BL/6 마우스의 복부 지방 부피를 측정하기 위해 생체 내 미세단층촬영 시스템(In-vivo Micro-CT, Skyscan 1076, SKYSCAN N.V., Belgium)을 이용하여 등뼈(lumbar vertebrae) 2번부터 5번(L2~L5)까지 촬영하였다. 촬영 시 마우스의 마취를 위해 케타민(Ketamine, Huons, 1.5 ml/kg)과 자일라진(Xylazine, Bayer, 0.5 ml/kg)을 사용하였다. 복부 지방 영상의 획득을 위하여 생체 내 미세단층촬영 시스템의 복셀 크기를 35 , 필터는 알루미늄 1.0 mm, 노출시간은 790 ms, 전압은 100 kV, 전류는 100 , 회전각은 1.2 °(deg)로 설정하였다.
상기 생체 내 미세단층촬영 시스템 촬영을 이용하여 획득한 영상으로부터 Mimics 13.0(materialise N.V., Belgium) 프로그램을 이용하여, 수컷 C57BL/6 마우스 복부 내부의 각 조직들에 해당되는 그레이 값(gray value)을 구하였다. 경계치 기법(threshold method)을 이용하여 측정된 각 조직들의 그레이 값을 기준으로 영상 내에서 등뼈(lumbar vertebral), 체지방 조직(lean tissue), 지방(adipose tissue), 피부(skin)로 각 영역을 구분하였고, 추출한 복부 지방 조직을 3차원 구조로 재구성하고 이로부터 부피를 측정하였다. 측정된 각 개체의 체중량과 복부 전체 지방 부피 및 복부 피하 지방 부피, 복부 내장 지방 부피를 하기 표4에 나타냈다.
Figure 112011021083976-pat00004
상기 표 4 및 도 4에서도 확인할 수 있듯이 마우스의 복부 지방 조직 분포를 생체 내 미세단층 촬영 시스템을 통해 확인해본 결과, 정상 식이군에 비해 고지방 식이군은 상당량의 피하지방과 내장지방이 복부에 높은 면적을 차지하는 것으로 확인되었다. 그러나 10% 대두 순물 식이군은 고지방 식이군보다 더 복부지방이 많이 분포하였으며 10% 대두 침지수 식이군의 경우 대두 순물 섭이군과 고지방 섭이군에 비해 약 1.7 내지 2.7배로 감소됨을 확인할 수 있었다.
또한 각 실험군에 따른 체중량과 복부지방을 비교하여 보았을 때 체중량은 고지방 식이군이 40.5±0.5 g으로 가장 높게 나타났으나 내장지방과 피하지방의 부피는 대두 순물 식이군의 총 복부지방의 부피가 4205.7±511.2 ㎣으로 가장 높은 수치를 나타내었다. 반면 대두 침지수 식이군은 고지방 식이군과 대두 순물 식이군에 비하여 복부지방의 부피가 큰 폭으로 감소된 것으로 나타났으며 특히, 피하지방의 부피는 502.0±48.5 ㎣로, 정상 식이군의 431.8±129.7 ㎣과 유사한 수치를 보였다.
상기의 결과로부터 대두 순물 식이군에 비해 대두 침지수 식이군은 고지방 식이로 인한 복부 지방의 축적을 억제하는 데 효과적인 것임을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 2]
(1) 대두가공 부산물 처리농도에 따른 전지방세포의 세포생존율
실험에 사용한 3T3-L1 pre-adipocyte cell(전지방세포)은 American Type Culture Collection(ATCC) 로부터 구입하여 사용하였으며, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco Inc., USA) 배지에 10% fetal bovine serum과 1% antibiotics-antimycotic을 첨가하여 5% CO2가 존재하는 37℃ 세포 배양기에서 2~3일에 한 번씩 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
대두부산물 처리에 의한 농도 의존적 세포생존율은 MTT assay로 측정하였다. 배양된 3T3-L1 전지방세포를 96 well plate에 5×103 cells/well 가 되도록 분주하고, 24시간 배양 후 상등액을 제거하고 배지와 함께 대두부산물 추출시료를 10 ppm, 25 ppm, 100 ppm 농도로 처리하였다.
상기 대두부산물을 농도 별로 처리하고 24시간을 배양한 후 MTT 시약(5 mg/ml)을 well 당 10 ㎕첨가하고 3시간 동안 추가 배양하였다. 그 후 상등액을 제거하고 DMSO 150 ㎕를 각 well에 분주하여 30분 교반한 뒤 microplate reader(Infinite200, Tecan Trading AG, Switzerland)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해서 환원된 양을 나타내며, 각 well에 생존한 세포수와 비례한다.
세포 생존도(%) = (시료처리군의 흡광도/ 대조군의 흡광도) × 100
그 결과 도 5에서도 확인할 수 있듯이 대두 침지수는 고농도인 100 ppm농도 처리시에 95% 이상의 세포 생존율을 보이는 것을 확인할 수 있었으며, 대두 순물 처리시에는 10 ppm에서 95.21%, 25 ppm에서 92.12%, 100 ppm에서 88.65%의 세포 생존율(P<0.05)을 보여 고농도의 대두가공 부산물을 처리시에 세포 생존율이 일부 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
(2)지방 분화 억제 효능에 미치는 영향
3T3-L1 adipocyte cell(지방세포)의 분화 억제 효능에 미치는 영향을 분석하기 위하여 배양된 세포에 분화유도물질과 함께 대두 침지수 및 대두 순물을 각각 10 ppm, 25 ppm, 100 ppm의 농도로 처리하였다. 분화유도과정이 끝난 후 세포를 Oil Red O 염색하여 현미경으로 관찰한 후 지방함량을 정량하였다. 분화유도물질을 처리하지 않은 세포와 분화유도물질을 처리한 세포를 대조군으로 하였다.
그 결과 도 6에서도 확인할 수 있듯이, 분화유도물질을 처리한 세포와 비교하여 대두 순물 추출물을 처리한 군은 10 ppm에서 94.42%, 25 ppm에서 87.09%, 100 ppm에서 79.14%로 나타나 처리 농도가 증가함에 따라 지방세포 내 지방함량이 유의성 있게 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, Oil Red O 염색 후 현미경 관찰 시에도 도 8에서 확인할 수 있듯이, 대두 순물 및 대두 침지수의 농도가 증가함에 따라 염색된 지방함량이 감소함을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터 대두 순물의 경우 처리농도가 증가할수록 지방세포 분화 억제 효능이 나타남을 확인하였으며, 대두 침지수의 경우는 10 ppm의 저농도 처리시에도 85.54%의 지방세포 분화 억제 효능이 나타남을 확인할 수 있었고, 이는 대두가공 부산물은 전지방세포가 지방세포로 분화하여 지방세포를 형성하는 것을 억제하는 효과가 있음을 확인한 결과이기도 하다.
[ 실험예 3]
(1) 분화유도 최종 전사 인자 PPAR γ의 발현에 미치는 영향
3T3-L1 adipocyte cell(지방세포)의 분화유도에 연관된 유전자의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 분화 유도 되어진 대조군과 각각 10 ppm, 25 ppm 및 100 ppm의 대두 순물 및 대두 침지수를 처리한 후 분화유도 되어진 실험군을 비교하였다.
전지방세포는 적당한 분화 자극과 지방세포형성 유도 조절자의 발현에 의해 최종 전사인자인 PPARγ의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체 감마(PPARγ, peroxisome proliferator activated receptor)는 nuclear hormone receptor superfamily에 속하며, PPAR family member로는 PPARα, PPARγ, PPARζ가 알려져 있다. 이들 PPAR 전사인자들은 Retinoid X receptor α와 heterodimer를 이루어 표적 유전자의 PPRE(peroxisome proliferator response element)를 인지하고, 지방 형성에 관련된 지방세포분화 관련 유전자의 발현을 조절한다. 따라서 이를 확인하기 위하여 분화 유도 및 대두부산물의 처리에 따른 지방세포형성의 최종 전사인자인 PPARγ의 발현을 확인하였다.
우선, TRIzol (Gibco Inc., USA)을 이용하여 total RNA를 추출한 후 Total RNA Clean up kit(Ambion, USA) 를 사용하여 정제하였다. 정제된 RNA를 template로 SuperScript™ kit(Invitrogen, USA)를 이용하여 single stranded cDNA를 제조하였다. 지방세포분화와 관련된 유전자들을 특이적으로 증폭하기 위해 하기 표 5에 기재된 프라이머를 제작하였으며, 각 유전자의 발현 정도를 GAPDH 유전자의 발현과 비교하여 확인하였다. 유전자의 발현정도는 전기영동 후 ImageQuant 5.2 (GE Healthcare, USA) 프로그램을 이용하여 분석하였다.
Figure 112011021083976-pat00005
도 9에서도 확인할 수 있듯이 대두 순물 및 대두 침지수를 처리한 처리구에 대한 PPARγ mRNA발현 양상을 확인할 결과, 지방세포의 분화가 유도된 대조군과 비교하여 대두 순물 및 대두 침지수를 처리한 처리구에서는 PPARγ의 mRNA발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
대두 침지수 처리시 모든 처리 농도에서 50% 미만의 발현 감소를 보였으나 일부 농도 비의존적인 현상이 확인되었다. 또한 대두 순물의 경우 처리 농도가 증가함에 따라 PPARγ의 발현이 농도 의존적으로 감소하여 Oil Red O 염색을 통한 세포관찰 결과와 일치하는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터 대두 순물 및 대두 침지수의 지방 세포 분화 억제는 PPARγ 의 발현의 억제를 통하여 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 지방대사에 대한 대두가공 부산물의 효과
지방세포의 분화 유도 과정이 진행되면 전사 조절 인자인 PPARγ의 조절에 의해 지방대사 관련 유전자의 발현이 증가한다. PPARγ의 발현이 증가하면 체내 당의 흡수가 증가되고 지방세포의 분화를 유발하게 되는 것으로 알려져 있다. 또 지방세포의 분화 과정에서 지방 대사에 관여하는 apolipoprotein E(APOE), fatty acid binding protein 4(Fabp 4), adipsin 및 stearoyl-coenzyme A desaturase 1 (Scd 1)은 PPARγ 등의 전사조절인자에 의해 조절되는 것으로 알려져 있어, 본 실험에서는 대두 순물 및 대두 침지수의 지방세포 분화 억제를 확인하기 위하여 이들 유전자의 발현 정도를 분석하였다.
그 결과, 도 10 및 도 11에서도 확인할 수 있듯이 APOE의 경우 대조군과 비교하여 대두 순물과 대두 침지수 처리시에는 30 내지 40% 미만으로 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. Scd1유전자의 발현은 분화 유도시 미분화에 비해 발현이 증가하나, 대두 순물과 대두 침지수를 처리한 후 대조군과 비교하여 처리농도에 따라 각각 50 내지 85%의 유전자 발현정도를 확인할 수 있었다.
반면 Fabp 4의 mRNA 발현은 대조군과 비교하여 대두 순물과 대두 침지수를 처리하였을 때 유전자 발현의 큰 변화가 없음을 확인하였다. 또한 adipsin은 중성지방 아실화(acylation)를 자극하여 complement peptide를 촉진하는 세린 프로테아제(serine protease)로서 배양지방세포에서 주로 확인되며, 분화 유도 과정에서 에너지 저장 신호와 관련하여 발현이 유도되는 것으로 알려져 있다. 대두 순물과 대두 침지수을 처리하였을 때 지방분화세포에서 adipsin의 발현은 전체적으로 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었으며 특히, 대두 순물을 10 ppm 농도 처리 시 그 발현량은 지방세포 분화 대조군에 비해 50% 미만으로 감소하였으며. 대두 침지수를 처리하였을 때 농도 의존적으로 adipsin의 발현이 100 ppm 농도에서 각각 45%, 28% 미만으로 감소하였다.
지방대사 관련 유전자 중 일부 유전자들의 mRNA 발현을 억제하는 상기의 결과는 대두 순물 및 대두 침지수가 지방대사 과정을 조절하여 지방세포의 분화를 조절함을 확인한 결과이기도 하다.
(3) 아디포카인에 대한 대두가공 부산물의 효과
지방세포는 중성지방의 합성, 저장 기능뿐 만 아니라 여러 가지 호르몬, 사이토카인(cytokine) 등의 분비를 통하여 비만과 당뇨 등의 여러 성인성 질환을 유발할 수 있다고 밝혀져 있다. 이러한 지방세포에서 분비되는 아디포카인(adipokines) 으로 레지스틴(resistin, RETN), 아디포넥틴(adiponectin, ADIPOQ) 등이 알려져 있다.
상기 레지스틴(resistin, RETN)은 지방의 세포질에 존재하며 유일하게 지방조직에서만 발현되며, PPARγ 의 synthetic ligand인 thialidinedione(TZD) 에 의해 발현이 감소된다고 알려져 있다. 따라서 이들 아디포카인(adipokines)에 대한 발현정도를 분석하였다.
그 결과, 도 12에서도 확인할 수 있듯이 지방세포 분화 유도 시 발현되는 레지스틴(resistin, RETN)은 대두부산물 처리 시 지방세포 분화 유도 대조군에 비해 발현의 차이 크게 나타나지 않았다.
반면 아디포넥틴(adiponectin, ADIPOQ)은 대두 침지수 및 대두 순물을 처리하였을 때 모든 처리농도 조건에서 mRNA 발현이 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터 대두 침지수 및 대두 순물은 아디포카인(adipokines) 중에서 아디포넥틴(adiponectin, ADIPOQ)의 분비량을 감소시킴으로써 지방세포의 지방생성과 관련된 에너지 대사 조절에 관여하는 것을 확인할 수 있었고, 지방 분화 유도 물질 처리에 의한 전지방세포에서 지방세포로 분화 시 지방세포의 분화 억제 및 지방생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
뿐만 아니라 지방세포의 분화 과정에서 지방대사 및 에너지 대사를 조절하는 adipsin, Fabp4, adiponectin(ADIPOQ) 등의 유전자 발현을 억제하였으며, 이러한 유전자 발현양상은 대두가공 부산물의 처리에 따른 지방세포 분화과정에서 지방함량 정도에 따른 Oil-Red O 염색결과와 일치하여 대두가공 부산물의 처리가 지방합성 단계에서 일부 조절에 관계되고 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 대두가공 부산물이 PPARγ 발현량을 감소시키는 결과에 비추어 보았을 때 대두가공 부산물이 가지는 지방세포 분화유도의 억제는 분화유도 전사인자의 억제를 통하여 주로 나타나며 동시에 지방세포의 지방생성 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
결국, 상기의 결과로부터 대두가공 부산물에 의한 지방세포분화 및 지방생성 억제는 지방분화와 지방 대사 조절 관련 유전자의 발현을 통하여 조절되며, 전임상 실험을 통해 결국, 대두가공 부산물은 비만예방 및 억제제로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (9)

  1. 유효성분으로, 대두가공 부산물을 함유하는 비만 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 대두가공 부산물은 대두 침지수(soybean soaking water), 두부 순물(soybean curd whey) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 대두 침지수는 대두를 10 내지 30℃의 온도의 물에 3 내지 24시간 침지하여 수득되는 것을 특징으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 유효성분은 전체 조성물 중 0.001 내지 30 중량%인 것을 특징으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 유효성분은 간과 부고환 조직의 지방 변성 및 지방축적 억제; 체내 콜레스테롤의 축적 억제; 중성지방의 축적 억제, 전지방세포의 지방세포로의 분화, 지방세포의 증식; 지방생성의 억제; 아세틸-코에이 카르복실라제(ACC, acetyl-CoA carboxylase)의 활성 억제; 및 AMP 유도 활성화 단백질 키나아제(AMPK, AMP-activated protein kinase)의 활성 증가;로부터 선택되는 1종 이상의 작용에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 유효성분은 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체 감마(PPARγ, peroxisome proliferator activated receptor)의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 비만 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 제 1항에 따른 조성물을 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강 보조 식품.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 건강보조 식품은 드링크제, 캬라멜, 쵸콜릿, 다이어트바 제형, 및 과자류로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 비만 예방 또는 개선용 건강 보조 식품.
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