JP6336943B2

JP6336943B2 - 肝脂肪症用のカレビンａ

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Publication number: JP6336943B2
Application number: JP2015096854A
Authority: JP
Inventors: ナガブシャナムカリアナム; マジードアンジュ; マジードムハンメド
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-05-09
Filing date: 2015-05-11
Publication date: 2018-06-06
Anticipated expiration: 2035-05-11
Also published as: JP2015214542A

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年５月９月に出願された同時係属中の米国特許出願１４２７４０９６の一部継続特許出願であり、したがって２０１２年１月１０日に出願された１３／３４７０７１の一部継続特許出願であり２０１５年１月１３日に米国特許第８９３３１２１号として認可されており、したがって２０１１年１月１０日に出願された仮出願６１４３１１４７の非仮出願である。

本発明は一般に、肥満管理のための薬物に関する。より詳細には本発明は、充分分化した脂肪細胞において脂肪分解を引き起こすその能力の点での、カレビンＡの抗肥満能力に関する。哺乳動物において高脂肪誘導型肝脂肪症を低減するカレビンＡの能力も開示する。

肥満は先進国における最も優勢な栄養障害であり、発展途上国において増大している問題である。肥満は世界規模の流行病および体重過多として記載され、肥満状態の個体（２５以上のＢＭＩ）は、様々な身体の慢性疾患、ならびにうつ病、摂食障害および自尊心の低下などの心理的問題に関するリスクが高い。肥満は、心臓血管疾患、糖尿病、骨関節炎、閉塞性睡眠時無呼吸および癌のような様々な疾患と関係がある。ＷＨＯは、肥満が、世界中の予防可能な死の上位１０個の原因のうちの１つであると考えている。
肥満では、脂肪生成のプロセスを介した新たな脂肪細胞（脂肪細胞）の生成および／または細胞ごとの増加した量の細胞質トリグリセリドの沈着のため、脂肪組織塊が増大する。内部で生成した脂肪液滴が１つの大きな塊に合体すると、脂肪細胞が発生する。最終的に、皮膚真皮下での脂肪生成の増強および脂肪細胞の塊の蓄積のために、セルライトが生じる。
脂肪生成の研究は、ヒトにおけるこのプロセスの操作が、肥満および糖尿病の負担の軽減をもたらし得るという希望と共に進んでいる。分子レベルでは、レプチン、アディポネクチン、ＴＮＦ−αなどの幾つかのマーカーが、肥満の治療において標的化されている。
この障害を治療するための薬剤は利用可能であるが、肥満およびその関連する社会経済的結果の管理を手助けするための安全で自然な手法が、絶えず必要とされ探索されている。
カレビンＡは、β−アミロイド外傷から神経細胞を保護すること（Park SY et al,J Nat Prod.2002 September;65(9):1227-31）、薬剤耐性ヒト胃癌細胞においてアポトーシスを誘導し、ＭＡＰＫファミリーの活性を制御することが知られている（Li Y et al,Eur J Pharmacol.2008 Sep4;591(1-3):252-8）。Zeng Y et al.(Chem Pharm Bull (Tokyo)2007 June;55(6):940-3)は、２つの新たなカレビン誘導体、４’’−（４’’’−ヒドロキシフェニル−３’’’−メトキシ）−２’’−オキソ−３’’−ブテニル−３−（４’−ヒドロキシフェニル）−プロペノエート、および４’’−（４’’’−ヒドロキシフェニル）−２’’−オキソ−３’’−ブテニル−３−（４’−ヒドロキシフェニル−３’−メトキシ）−プロペノエートを論じている。
本発明は、脂肪細胞（脂肪細胞）の末期分化中の脂肪蓄積を予防するカレビンＡの能力、および肥満管理におけるその利用を開示する。本発明は、肥満と関係がある生化学的マーカーを有利に制御する、カレビンＡの能力を解明する。カレビンＡの顕著な生体制御性は、炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１β）によって引き起こされる、レプチン生成の抑制、アディポネクチン発現の増加、ならびに局所的（脂肪細胞）および全身的炎症の抑制を含む。

Park SY et al,J Nat Prod.2002 September;65(9):1227-31 Li Y et al,Eur J Pharmacol.2008 Sep4;591(1-3):252-8 Zeng Y et al.Chem Pharm Bull (Tokyo)2007 June;55(6):940-3

したがって、本発明の主な目的はカレビンＡの抗肥満能力を開示することである。本発明の別の目的は、充分分化した脂肪細胞において脂肪分解を誘導するカレビンＡの能力を開示することである。本発明のさらなる別の目的は、哺乳動物において高脂肪誘導型肝脂肪症を低減するカレビンＡの能力をさらに開示することである。
本発明は前述の目的を満たし、さらなる関連利点を提供する。

本発明は、脂肪生成の抑制におけるカレビンＡの能力、および肥満管理におけるその利用を開示する。本発明は、哺乳動物における肥満と関係がある生化学的マーカーを有利に制御する、カレビンＡの能力を解明する。カレビンＡの顕著な生体制御性は、炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１β）によって引き起こされる、レプチン生成の抑制、アディポネクチン発現の増加、ならびに局所的（脂肪細胞）および全身的炎症の抑制を含む。本発明の一部として、完全に分化した脂肪細胞において脂肪分解を刺激するカレビンＡの能力も開示する。さらに本発明は、哺乳動物において高脂肪誘導型肝脂肪症を低減するカレビンＡの能力も開示する。
本発明の他の特徴および利点は、例えば本発明の原理を例示する添付の図面と共に、以下のより詳細な記載から明らかとなる。
出願した本特許または出願は、カラーで作製した少なくとも一枚の図面を含有する。カラー図面を添付した本特許または本出願、公開のコピーは、リクエストおよび必要な料金の支払いにより特許事務所によって与えられる。

オイルレッド−Ｏ染色法によって試験した、０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でカレビンＡによって影響を受けた脂肪生成抑制率のグラフ表示である。０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でカレビンＡによって影響を受けたヒト脂肪細胞におけるレプチン生成の抑制率のグラフ表示である。Ｐ値^*：＜０．０１；^**：＜０．００１。０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でカレビンＡによって影響を受けたヒト脂肪細胞におけるアディポネクチン発現の増加率のグラフ表示である。Ｐ値^*：＜０．０１。０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でカレビンＡによって影響を受けたヒト脂肪細胞におけるＴＮＦ−α発現の抑制率のグラフ表示である（Ｐ値^*：＜０．０１；^**：＜０．００１）。０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でカレビンＡによって影響を受けたヒト脂肪細胞におけるＩＬ−６発現の抑制率のグラフ表示である（Ｐ値^*：＜０．０１）。処置したスイス系アルビノマウス由来の血清におけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの発現に対する、多用量のカレビンＡの影響のグラフ表示である。動物の数＝グループ当たり６匹。Ｐ値：^*＜０．０１；^**＜０．００１スチューデントの「ｔ」検定。処置したスイス系アルビノマウス由来の血清におけるＩＬ−６の発現に対する、多用量のカレビンＡの影響のグラフ表示である。動物の数＝グループ当たり６匹。Ｐ値：^*＜０．０１；^**＜０．００１スチューデントの「ｔ」検定。カレビンＡが、３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の分化および脂肪生成を抑制することを示す図である。図９（Ａ）−（Ｂ）は、それぞれ、実験群Ｃ５７ＢＬ／６マウスの体重に対する食餌補充の影響の写真およびグラフ表示である。高脂肪食（ＨＦＤ）供給Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける相対脂肪組織重量に対するカレビンＡ補充の影響を示す図である。高脂肪食（ＨＦＤ）供給Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける相対脂肪組織重量に対するカレビンＡ補充の影響を示す図である。高脂肪食（ＨＦＤ）供給Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける相対脂肪組織重量に対するカレビンＡ補充の影響を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血清におけるレプチン発現に対するカレビンＡ補充の影響を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血清におけるアディポネクチン発現に対するカレビンＡ補充の影響を示す図である。Ｈ＆Ｅ組織切片、およびＨＦＤマウス群において脂肪細胞の大きさを元に戻すカレビンＡ（０．２５％と１％）のその能力のグラフ表示を示す図である。

本発明は、脂肪細胞（脂肪細胞）の末期分化中の脂肪蓄積を予防するカレビンＡの能力、および肥満管理におけるその利用を開示する。本発明は、肥満と関係がある生化学的マーカーを有利に制御する、カレビンＡの能力を解明する。カレビンＡの顕著な生体制御性は、炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−１（ＩＬ−１β）によって引き起こされる、レプチン生成の抑制、アディポネクチン発現の増加、ならびに局所的（脂肪細胞）および全身的炎症の抑制を含む。

最も好ましい実施形態では、本発明は、脂肪生成を抑制する方法であって、脂肪細胞を有効量のカレビンＡと接触させるステップを含む方法に関する。言い換えると、本発明は、哺乳動物脂肪細胞の末期分化中の脂肪蓄積を予防する方法に関する（図１および８）。
別の好ましい実施形態では、本発明は、脂肪細胞におけるレプチン発現を抑制する方法であって、脂肪細胞を有効量のカレビンＡと接触させるステップを含む方法に関する（図２）。
別の好ましい実施形態では、本発明は、脂肪細胞におけるアディポネクチンの発現を増加させる方法であって、脂肪細胞を有効量のカレビンＡと接触させるステップを含む方法に関する（図３）。
別の好ましい実施形態では、本発明は、脂肪細胞における炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−αの発現を抑制する方法であって、脂肪細胞を有効量のカレビンＡと接触させるステップを含む方法に関する（図４）。
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、脂肪細胞における炎症誘発性サイトカインインターロイキン−６の発現を抑制する方法であって、脂肪細胞を有効量のカレビンＡと接触させるステップを含む方法に関する（図５）。

特定の実施形態では、本明細書で前に言及した脂肪細胞はヒト脂肪細胞である。
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物における炎症誘発性サイトカインの肥満誘導性全身的発現を低減する方法であって、それを必要とする対象に有効量のカレビンＡを投与するステップを含む方法に関する。特定の実施形態では、本明細書のこの段落中で言及する炎症誘発性サイトカインは、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）を含む［図６および７］。

さらに他の最も好ましい実施形態では、本発明は、以下に関する。
１．体脂肪の過剰な蓄積のリスクがある哺乳動物における肥満管理の方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充して脂肪生成抑制の効果をもたらすステップを含む方法。
２．体脂肪の過剰な蓄積のリスクがある哺乳動物における肥満管理でのカレビンＡの使用であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充して脂肪生成抑制の効果をもたらすステップを含む使用。
３．体脂肪の過剰な蓄積のリスクがある哺乳動物において脂肪生成を抑制する方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充するステップを含む方法。
４．肥満哺乳動物の体重を減少させる方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口投与するステップを含む方法。
５．肥満哺乳動物の体重を減少させるための方法におけるカレビンＡの使用であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口投与するステップを含む使用。
６．肥満哺乳動物における全身アディポネクチン発現を増加させる方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充するステップを含む方法。
７．肥満哺乳動物におけるＩＩ型糖尿病の予防、その発症の遅延および／またはその進行の鈍化を助長するための方法であって、前記哺乳動物に治療有効量のカレビンＡを経口投与して全身アディポネクチン発現レベルの増加をもたらすステップを含む方法。
８．哺乳動物における肥満症を治療（処置）するための方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充して、脂肪生成の抑制、体重の減少、および全身アディポネクチン発現の増加の効果をもたらすステップを含む方法。
９．哺乳動物において除脂肪体重を増進するための方法であって、前記哺乳動物に有効量のカレビンＡを経口食餌補充して、除脂肪体重と脂肪組織の間の比率を除脂肪体重寄りに移すことによって除脂肪体重の増加の効果をもたらすステップを含む方法。
さらに別の好ましい実施形態では、対象は哺乳動物である。
さらに別の好ましい実施形態では、対象はヒトである。
抗肥満分子としてのカレビンＡの潜在的治療価値は、本明細書において以下で解明する具体例によって理解することができる。

（例Ｉ）
カレビンＡの急性経口毒性
表Ｉは、カレビンＡの急性経口毒性に関して試験したパラメータを列挙する。
結果：
最大２週間の観察において経口で最大２０００ｍｇ／ｋｇまで、マウスにおいて死亡は観察されなかった。

（例ＩＩ）
脂肪生成培養物のオイルレッド−Ｏ染色ならびにＥＬＩＳＡによるレプチン、アディポネクチン、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の評価
脂肪細胞の末期分化は、巨大細胞質小胞中の多量の脂質の蓄積を伴う。細胞培養における脂肪細胞分化を測定するための一般的なアッセイは、色素オイルレッド−Ｏ（ＯＲＯ）を用いたアッセイである。ＯＲＯは、脂肪細胞分化（脂肪生成）の信頼できる指標である、脂質可溶性の鮮やかな赤色の色素である。

原理：
オイルレッドＯ（ソルベントレッド２７、スーダンレッド５Ｂ、Ｃ．Ｉ．２６１２５、およびＣ２６Ｈ２４Ｎ４Ｏ）は、凍結切片上の中性トリグリセリドおよび脂質ならびにパラフィン切片上の幾つかのリポタンパク質の染色に使用する、リソクローム（脂溶性色素）ジアゾ色素である。それは５１８（３５９）ｎｍで最も吸収される赤色粉末の外見を有する。オイルレッドＯは、スーダン染色に使用する色素の１つである。同様の色素には、スーダンＩＩＩ、スーダンＩＶ、およびスーダンブラックＢがある。アルコール固定は脂質を除去するので、染色は新たなサンプルで実施しなければならない。それは一層深い赤色をもたらし、したがって染色状態が一層容易に見られるので、オイルレッドＯは大抵スーダンＩＩＩおよびスーダンＩＶの代用となる。
オイルレッドＯは油溶性色素である。油溶性色素は、組織／細胞中の脂質物質において、通常のヒドロアルコール（ｈｙｄｒｏａｌｃｏｈｏｌｉｃ）色素溶媒より高い色素可溶性を示す。したがって、それは細胞を十分に染色する。

方法：
３Ｔ３−Ｌ１細胞、約６０×１０⁴個の細胞を４８〜７２時間接種して７０〜８０％の融合を得た。４８時間後、新たに調製した２００μｌのＡＩＭ（脂肪生成誘導培地）を加える。７２時間後、異なる濃度の試験化合物を含む２００μｌのＡＰＭ（脂肪生成進行培地）をウエルに加える。細胞は５％ＣＯ２および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）中で４８時間インキュベートする。ＥＬＩＳＡによるレプチン、アディポネクチン、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの評価用に、上清を回収し保存する。細胞は１００μｌの１０％ホルマリンを加えることによって固定し、ＯＲＯ染色を行う。ＯＤはマイクロプレートリーダーで４９２ｎｍにおいて読み取る。Ｇｒａｐｈｐａｄｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、結果はＩＣ₅₀値として表す。
脂肪生成の抑制率は以下のように計算する。
抑制率＝Ｃ−Ｔ／Ｔ^*１００
上式でＣは分化／未分化細胞におけるオイルレッドＯの吸光度であり、
Ｔはサンプル処置分化／未分化細胞におけるオイルレッドＯの吸光度である。レプチン、アディポネクチン、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの評価は、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓからのユーザーズマニュアルに従って行う。

参考文献
1. Wu Z, Xie Y, Morrison R F, Bucher NLR, Farmer SR 1998. PPAR γ induces the Insulin-dependent Glucose Transporter GLUT4 in the absence of C/EBP_□ during the conversion of 3T3 fibroblasts into adipocytes. J Clin Invest. 101:22-32.

2. A pre-adipose 3T3 cell variant highly sensitive to adipogenic factors & to human growth hormone. L A Salazar-Olivo, F Castro-Munozledo & W Kuri-Harcuch. Department of Cell Biology, Centro de Investigation y de Estudios Avanzados del I.P.N., Mexico D.F., Mexico. Journal of Cell Science, 1995.Vol 108, Issue 5 2101-2107.

3. A Nuclear Receptor Atlas: 3T3-L1 Adipogenesis. Mingui Fu, Tingwan Sun, Angie L. Bookout, Micheal Downes, Ruth T. Yu, Ronald M. Evans and David J. Mangelsdorf. Molecular Endocrinology, 2005. 19 (10): 2437-2450.

4. “ Expression of a Constitutively Active Akt Ser/Thr Kinase in 3T3-L1 Adipocytes Stimulates Glucose Uptake and Glucose Transporter 4 Translocation, Aimee D Kohn et al, J. Biol. Chem. 1996, 271:31372-31378.

結果：
図１は、オイルレッド−Ｏ染色法によって試験した、０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でカレビンＡによって影響を受けた、それぞれ３２．４３％、３８．５９％および３５．８％の脂肪生成抑制率を示す。

図２は、０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でのカレビンＡによる、ヒト脂肪細胞におけるレプチン生成の抑制率を示す（それぞれ３４．９２％、４１．０４％および３９．４８％）。ヒト脂肪細胞においてレプチン生成を抑制する際のカレビンＡの影響、および肥満管理とのその関係の重要性は、以下の事実に由来する（Notes on Pathophysiology of the Endocrine System、Colorado State University）。

レプチンは、脂肪細胞中で主に発現されるタンパク質ホルモンである。レプチンは、体重、代謝および生殖機能の調節において重要な役割を有する。このタンパク質は肥満（ｏｂ）遺伝子によってコードされ、約１６ｋＤａの質量である。正常濃度において、レプチンの生物学的機能は、空腹、食欲、体温調節およびエネルギー代謝を制御する脳の視床下部中枢に対するその影響に主に帰属する。したがって、非肥満個体中のレプチンは、２つの重要なメカニズム（ｉ）摂食挙動を制御するニューロペプチドＹの抑制による可能性が最も高い、空腹および食物消費の低下、および（ｉｉ）体温の上昇、酸素の消費によるエネルギー消耗の増大、および脂肪組織塊の消失によって、体重減少をもたらす可能性がある。しかしながら、肥満または誘導型肥満の実験モデルの場合のレプチンの過剰な分泌は、視床下部中枢の機能の混乱をもたらし、肥満の対象は飽満状態に到達せず、栄養過剰状態に向かう傾向がある。したがって、肥満において過剰発現レベルのレプチンの有効な低減をもたらすことが不可避となり、図２中に示すように、カレビンＡはこの分野において有望である。

図３は、０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でのカレビンＡによる、ヒト脂肪細胞におけるアディポネクチン発現の増加率を示す（それぞれ２７．１２％、３４．０６％および３２．８％）。アディポネクチンは、ほぼ独占的に脂肪細胞によって産生されるサイトカインであり、やせた健常な個体によって非常に高レベルで発現される。他方で肥満個体は低レベルのこのアディポカインを発現し、冠動脈性心疾患（ＣＡＤ）、糖尿病および高血圧になりやすい。

参考文献
1. Tamar. R. Aprahamian and Flora Sam, “Adiponectin in Cardiovascular Inflammation and Obesity, Int J. Inflam. 2011; 2011: 376909;
2. Hotta K, Funahashi T, Arita Y, et al. Plasma concentrations of a novel, adipose-specific protein, adiponectin, in type 2 diabetic patients. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 2000; 20(6):1595-1599;
3. Iwashima Y, Katsuya T, Ishikawa K, et al. Hypoadiponectinemia is an independent risk factor for hypertension. Hypertension. 2004; 43(6):1318-1323;
4. Kumada M, Kihara S, Sumitsuji S, et al. Association of hypoadiponectinemia with coronary artery disease in men. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 2003; 23(1):85-89 and
5. Lindsay R S, Funahashi T, Hanson R L, et al. Adiponectin and development of type 2 diabetes in the Pima Indian population. The Lancet. 2002; 360(9326):57-58.

カレビンＡはヒト脂肪細胞においてアディポネクチンのレベルを効率よく高めることが示され（図３）、したがって肥満管理の分野において有望である。
図４および５は、０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌの濃度でのカレビンＡによる、ＴＮＦ−α（それぞれ３６．０３％、４０．８１％および４５．４７％）ならびにＩＬ−６（それぞれ２１．３１％、３２．３７％および３１．７％）の抑制率を示す。Bastard JP et al,“Recent Advances in the relationship between obesity, inflammation and insulin resistance”,Eur Cytokine Netw.2006 March;17(1):4-12は、肥満が白色脂肪組織（ＷＡＴ）の低度の炎症と関係があることを例証する。この筆者は、肥満において、ＷＡＴは、ＷＡＴに影響を与えるだけでなく身体の他の全身器官にも影響を与える、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のような炎症誘発性分子の高い発現によって特徴付けられることも言及する。図４および５は、カレビンＡは脂肪細胞中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６発現を低減する際に有効であり、肥満において局所的および全身的炎症の影響を制御するのに有用な作用物質であり得ることを実証する。

（例ＩＩＩ）
カレビンＡによる全身的炎症の制御
本発明者らは、ネズミ好中球系において細胞内ＴＮＦおよび細胞外ＩＬ−１βを抑制するカレビンＡの能力を支持する、さらなる証拠も提示する（表ＩＩ、表ＩＩＩ）。好中球はヒストプラーク（ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）勾配法によって単離し、リポ多糖（ＬＰＳ）での刺激後ｉｎｖｉｔｒｏでＴＮＦ−αを産生するそれらの能力に関して試験する。細胞は暗所でフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗マウスＴＮＦ−αと共にインキュベートし、滅菌ＰＢＳで洗浄した後、サンプルはＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に再懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤＬＳＲ；ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）において直接得た。蛍光誘導はゲートの好中球集団（１０，０００事象）のＰＥ（ＦＬ１）パラメータで設定した。ロリプラムを１００μｇ／ｍｌで、この試験におけるＴＮＦ−αの標準抑制剤として使用した。蛍光補正、データ解析、およびデータ表示は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏソフトウェア（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して実施した。
参考文献
1. Clara, B., R. C. Arancha, G. M. Andre's, P. Atanasio, A. Julia, and O. Alberto. 2003. A new method for detecting TNF-α-secreting cells using direct immunofluorescence surface membrane stainings. J. Immuno. Methods 264:77-87.
2. Khurshid A. Bhat, Bhahwal A. Shah, Kuldeep K. Gupta, Anjali Pandey, Sarang Bani, Subhash C. Taneja. Semi-synthetic analogs of pinitol as potential inhibitors of TNF-α cytokine expression in human neutrophils. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19 2009, 1939-1943.

本発明者らは、処置したマウス（ｉｎ−ｖｉｖｏモデル）由来の血清における細胞外ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β［図６］およびＩＬ−６［図７］の発現を低減する、カレビンＡの能力に関する試験データも提示する。６〜８週齢のスイス系アルビノ雄マウスを、１２時間／１２時間の明暗サイクル下において２２±２℃に維持した。Brieva A,Guerrero A,Alonso-Lebrero J L and Pivel JP.2001によって記載された方法に従い、マウスには６日間段階的用量（ｗ／ｖ）での試験薬剤の経口治療（処置）、次に１ｍｇ／ｋｇのＬＰＳの静脈内注射を施した。イムノフェロン、天然源の糖複合体は、ＬＰＳ誘導型ＴＮＦ−α産生および炎症応答を抑制する。International Immunopharmacology 1,1979-1987。それぞれのグループ中６匹のマウスを使用し、実験は三連で実施した。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６の産生は、ＬＰＳ注射後９０分で、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）により処置したマウス由来の血清において評価した。標準薬剤として３０ｍｇ／ｋｇでロリプラムを使用した。
図６および７は、カレビンＡはＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６を低減する際に有効であることを実証し、したがってこの化合物が、肥満において局所的および全身的炎症の影響を制御するのに有用な作用物質であることを示す。

（例ＩＶ）
カレビンＡによる脂肪生成の抑制
細胞培養および脂肪細胞分化

アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入したマウス３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を、加湿５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃において、２ｍＭグルタミン（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１００００単位のペニシリン／ｍＬおよび１０ｍｇストレプトマイシン／ｍＬ）および１０％コウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。簡単に言うと、細胞は２４ウエル（２×１０⁴／ｍＬ）または１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭを含む１０ｃｍ皿に接種して、完全に融合させた。（第０日として定義した）融合後２日で、１．７μＭのインスリン、０．５ｍＭの３−イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）および１２．７μＭのデキサメタゾン（ＤＥＸ）を含有する分化用培地（ＭＤＩ）中、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で２日間細胞をインキュベートした。次いでこの培地を、１０％ＦＢＳおよびインスリン（１．７μＭ）を含有しカレビンＡ有りまたは無しのＤＭＥＭに交換し、これは２日毎に交換した。培養培地におけるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の最終濃度は０．０５％未満であった。オイルレッド−Ｏ染色用に、細胞を８日後（第１０日）に採取した。

オイルレッド−Ｏ染色
分化の末期に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、６０分間１０％ホルマリンで固定し、室温において１時間０．５％オイルレッドＯイソプロパノール中で染色する。過剰なオイルレッドＯ色素は蒸留水で２回洗浄し、次いで乾燥させた。細胞内の染色された脂質滴は光学顕微鏡により目で見て確認し、倍率１００倍でデジタルカメラを用いて撮影した。脂質蓄積を定量化するため、染色された脂質滴はイソプロパノール中に溶かし、５２０ｎｍで吸光度を測定した。

図８は、カレビンＡが、３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の分化および脂肪生成を抑制することを示す。オイルレッドＯで染色した３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の分化および写真撮影（上部および中部）。３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞はＭＤＩ（ＩＢＭＸ、ＤＥＸ、およびインスリンを含むＤＭＥＭ）で２日間インキュベートし、インスリンを含有しそれぞれカレビンＡ（０、５、１０、１５、２０、２５および３０μＭ）有りまたは無しのＤＭＥＭに次いで８日間交換した。脂質含有物は２−プロパノールによりオイルレッドＯ染色細胞から抽出し、５２０ｎｍで分光光度計分析によって定量化した。

動物実験−試験Ｉ

５週齢のオスＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＢｉｏＬＡＳＣＯ実験動物センター（ＴａｉｗａｎＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）から購入し、制御雰囲気（５０％相対湿度で２５±１℃）において１２時間光期／１２時間暗期サイクルで収容した。馴化後１週間で、以下のように１２週間、通常食（ＮＤ、１５％が脂肪としてのエネルギー）、高脂肪食（ＨＦＤ；４０％が脂肪としてのエネルギー）、およびそれぞれ０．２５％または１％カレビンＡ（食餌１ｋｇ当たり２．５ｇまたは１０ｇのカレビンＡ）を補充したＨＦＤの、各々８匹の動物の４グループに動物をランダムに分けた（表Ｖ）。実験食はＰｕｒｉｎａ５００１食（ＬａｂＤｉｅｔ、ＰＭＩＮｕｔｒｉｔｉｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）から改変し、その組成は表ＩＶ中に列挙する。動物には、常時食餌と水を自由に与えた。食餌用カップには毎日新たな食餌を補給した。動物の食餌摂取は毎日モニタリングし、体重は毎週記録した。この試験で使用した全ての動物実験用プロトコールは、ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＫａｏｈｓｉｕｎｇＭａｒｉｎｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＩＡＣＵＣ、ＮＫＭＵ）によって承認された。試験の最後に、全ての動物を一晩断食させ、ＣＯ₂窒息によって屠殺した。血液サンプルを、生化学的分析用に心臓から回収した。肝臓、脾臓、腎臓および脂肪パッド（性腺周囲、腹膜後方および腸間膜脂肪）をすぐに除去し、重量測定し（表ＶＩ）写真撮影した。図９（Ａ）は、第１２週最後の各グループの代表的な写真を示す。体重は毎週モニタリングし、各グループの平均体重は平均±ＳＥとして表した。統計解析はスチューデントのｔ検定により行った。（＊）Ｐ＜０．０１、ＮＤグループと比較；（＃）Ｐ＜０．０１、ＨＦＤグループと比較。ＮＤは通常食でありＨＦＤは高脂肪食である（図９（Ｂ））。

図１０（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、性腺周囲脂肪、腹膜後方および腸間膜脂肪の写真、ならびに相対性腺周囲脂肪、腹膜後方および腸間膜脂肪重量の割合のグラフ表示も示す図である。

ａ．材料および方法で記載したようにマウスには１２週間食餌を与え、体重は週２回モニタリングした。各グループの平均体重は平均±ＳＥとして表し（グループ当たりｎ＝８）、統計解析はスチューデントのｔ検定により行った。ＮＤは通常食でありＨＦＤは高脂肪食である。＊、Ｐ＜０．０１、および＊＊＊、Ｐ＜０．０００１、ＮＤグループと比較。＃、Ｐ＜０．０１、および＃＃Ｐ＜０．００１、ＨＦＤグループと比較。

ａ．カレビンＡ（０．２５％および１％）補充有りまたは無しのＨＦＤを１２週間マウスに与えた。各グループのマウスを第１２週の最後に屠殺し、肝臓、脾臓、および腎臓を摘出し、写真撮影し、重量測定し記録した。データは平均±ＳＥとして表した（グループ当たりｎ＝８）。相対臓器重量は体重の割合として表す（肝臓重量／体重×１００）。ＮＤは通常食でありＨＦＤは高脂肪食である。

動物実験−試験２−肥満哺乳動物モデルにおける体重減少の実証
試験システムの詳細

試験性能
Ａ．管理
ａ．条件：標準的な実験室条件、適切で新鮮な空気供給（１時間当たり空気変化１２〜１５）による空気調節、室温２２±３℃、相対湿度３０〜７０％、１２時間光期および１２時間暗期サイクルの下に動物を収容した。温度と相対湿度は１日１回記録する。
ｂ．収容：
ステンレススチール製シッパーチューブを備える水筒中にペレット食と飲料水を保持するための容器を有する、標準的なポリプロピレン製ケージ（サイズ：Ｌ２９０×Ｂ１４０×Ｈ１４０ｍｍ）およびステンレススチール製上部メッシュグリル中に個々の動物を収容した。滅菌済みの籾殻を床物質として与える。
ｃ．馴化：動物は５日間で実験室条件に馴化させ、毎日臨床兆候に関して観察した。

ｄ．食餌：馴化の間中ＰｒａｎａｖＡｇｒｏＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓＬｉｍｉｔｅｄ，Ｓａｎｇｌｉ，Ｍａｈａｒａｓｔｒａにより製造されたＡＭＲＵＴＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＦｅｅｄを自由に動物に与えた。ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔＩｎｃ，ＵＳＡにより製造されＩｎｄｕｓＭａｒｋｅｔｉｎｇ，Ｈｙｄｅｒａｂａｄ，ＡｎｄｈｒａＰｒａｄｅｓｈ，ＩＮＤＩＡから得た、ＯｐｅｎＳｏｕｒｃｅＤｉｅｔＤ１２４５０Ｂ食（１０ｋｃａｌ％の脂肪含む）およびＯｐｅｎＳｏｕｒｃｅＤｉｅｔＤ１２４９２高脂肪食（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）を、肥満の誘導および主要試験に使用した。
ｅ．水：滅菌済み飲料水を、馴化および肥満誘導期の間中自由に与えた。逆浸透膜装置に通した深井戸水を、ステンレススチール製シッパーチューブを備えるプラスチック製水筒中に与えた。

Ｂ．グループ分け
体重無作為化および階層化法により、馴化の最終日に動物のグループ分けを行った。使用した動物の体重変動が各グループの平均体重の±２０％を超えないように、動物のグループ分けを行った。

Ｃ．試験設計
動物は５グループ、すなわちそれぞれ１０匹の動物（５匹のオスと５匹のメス）からなるグループ１、２、３、４および５に分けた。グループ毎の動物のグループに関する詳細、用量および数／性別は表ＶＩＩ中に表す。

Ｄ．動物処置
ａ．用量体積：動物当たりの用量体積＝試験期間中全ての動物に関して体重１ｋｇ当たり１０ｍｌ
ｂ．肥満誘導：肥満の誘導中および主要試験中、Ｇ１対照グループの動物には１０ｋｃａｌ％の脂肪を含有する通常対照食Ｄ１２４５０Ｂを与え、Ｇ２〜Ｇ５グループの動物には６０ｋｃａｌ％の脂肪を含有する高脂肪食Ｄ１２４９２を与えた。

ｃ．主要試験：主要試験は肥満の誘導後に開始した。３用量のカレビンＡを、第２９日から毎日連続して２８日の間動物に投与した。食餌の供給は、肥満の誘導において実施したのと同様の形式で主要試験中続けた。Ｇ１対照およびＧ２高脂肪食対照グループの動物には０．５％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）を投与し、一方他のグループの動物には試験期間の第２９日から第５６日まで試験品を与えた。投与の用量体積は、個々の動物のその週の体重に従い維持した。試験の全体期間は６１日であった（馴化期５日＋肥満の誘導２８日＋主要試験２８日）。

統計解析：この試験から得た生データにコンピュータによる統計処理を施した。（添付表の形式での）コンピュータによるデータのプリントアウトは元の生データで確認した。確認後、体重に関するデータ、体重、血液学的および臨床化学的パラメータ、臓器重量に関するデータは、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍバージョン５．０１、Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用して、一元配置ＡＮＯＶＡ（分散分析）およびダンネットの事後検定に施した。全ての解析および比較は９５％の信頼レベルで評価し（Ｐ＜０．０５）、以下で言及する報告中、Ｇ１とＧ３、Ｇ４、Ｇ５およびＧ６を比較した場合の上付き文字^aによる表示によって、およびＧ２とＧ３、Ｇ４、Ｇ５およびＧ６を比較した場合の上付き文字^bによる表示によって示した。＊：適用する場合統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）。
データは、以下の比較によって一元配置−ＡＮＯＶＡ統計解析に施した：
以下に表すように、Ｇ１グループ｛（１０ｋｃａｌ％の脂肪含む）対照グループ｝と、Ｇ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ４グループ｛カレビンＡ１０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝およびＧ５グループ｛カレビンＡ２０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝の比較：

以下に表すように、Ｇ２−（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食対照と、Ｇ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ４グループ｛カレビンＡ１０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝およびＧ５グループ｛カレビンＡ２０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝の比較：

結果
体重：個々の動物の体重は第１日における受け入れ日、およびその後試験期間中週１回（±１日）記録した。
オスおよびメスの動物の毎週の体重の概要は、それぞれ表ＶＩＩＩ（ａ）／ＶＩＩＩ（ｂ）およびＩＸ（ａ）／ＩＸ（ｂ）中に表す。

オスの動物では、Ｇ１グループ｛（１０ｋｃａｌ％の脂肪含む）対照グループ｝と比較して、第１５日にＧ５グループ｛カレビンＡ２０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な増大があった。これらの変化は、食餌の脂肪含量の差と関係があると考えた。
オスの動物では、Ｇ１グループ｛（１０ｋｃａｌ％の脂肪含む）対照グループ｝と比較して、第２２日および第２９日にＧ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ４グループ｛カレビンＡ１０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ５グループ｛カレビンＡ２０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な増大があった。これらの変化は、食餌の脂肪含量の差に原因があると考えた。

オスの動物では、Ｇ１グループ｛（１０ｋｃａｌ％の脂肪含む）対照グループ｝と比較して、第３６日にＧ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な増大があった。これらの変化は、食餌の脂肪含量の差に原因があると考えた。
オスの動物では、Ｇ２グループ｛６０ｋｃａｌ％の脂肪含む｝高脂肪食対照｝と比較して、第３６日にＧ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ４グループ｛カレビンＡ１０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な減少があった。これらの変化は、試験品カレビンＡの投与の影響と関係があると考えた。

オスの動物では、Ｇ２グループ｛６０ｋｃａｌ％の脂肪含む｝高脂肪食対照｝と比較して、第４３日、第５０日および第５６日にＧ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ４グループ｛カレビンＡ１０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ５グループ｛カレビンＡ２０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な減少があった。これらの変化は、試験品カレビンＡの投与に原因があると考えた。

メスの動物では、Ｇ１グループ｛（１０ｋｃａｌ％の脂肪含む）対照グループ｝と比較して、第１５日および第２２日にＧ５グループ｛カレビンＡ２０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な増大があった。これらの変化は、食餌の脂肪含量の差に原因があると考えた。
メスの動物では、Ｇ１グループ｛（１０ｋｃａｌ％の脂肪含む）対照グループ｝と比較して、第２９日および第３６日にＧ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ４グループ｛カレビンＡ１０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ５グループ｛カレビンＡ２０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な増大があった。これらの変化は、食餌の脂肪含量の差に原因があると考えた。

メスの動物では、Ｇ１グループ｛（１０ｋｃａｌ％の脂肪含む）対照グループ｝と比較して、第４３日にＧ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ４グループ｛カレビンＡ１０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な増大があった。これらの変化は、食餌の脂肪含量の差に原因があると考えた。
メスの動物では、Ｇ２グループ｛６０ｋｃａｌ％の脂肪含む｝高脂肪食対照｝と比較して、第４３日、第５０日および第５６日にＧ３グループ｛カレビンＡ５ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ４グループ｛カレビンＡ１０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝、Ｇ５グループ｛カレビンＡ２０ｍｇ／ｋｇ＋（６０ｋｃａｌ％の脂肪含む）高脂肪食｝において週当たりの体重平均値の統計学的に有意な減少があった。これらの変化は、試験品カレビンＡの投与に原因があると考えた。

したがって、高脂肪食誘導型肥満状態のオスおよびメスＣ５７動物の体重減少において、体重１ｋｇ当たり５、１０および２０ｍｇの試験濃度で、カレビンＡは影響を有したと結論付けることができた。
さらに、試験期間の終了後（第５７日）、ガスチャンバー内で過剰なＣＯ₂に曝すことにより動物を無痛屠殺し、臓器重量を記録した。全動物由来の脳、胸腺、肝臓、副腎、腎臓（対）、脾臓、心臓および卵巣／精巣（対）から必要に応じて任意の接着組織を摘出し、乾燥を避けるため可能な限り速やかに湿潤状態で重量を測った。一般に、オスとメスの間で臓器重量の統計学的に有意な差はなかったが、例えばオスグループの肝臓において、臓器特異的重量改善が観察可能であった（表Ｘ参照）。この結果は肝臓に関する表ＶＩにおける改善を確証する。Behnke,A.R.1953.Lean body mass.A.M.A.Arch.Int.Med.91,585は除脂肪体重増進の指標として肝臓を示すことができ、H.F.Kraybill et al,J ANIMSCI1954,13:548-555は、他の内臓臓器も同様に除脂肪体重増進の指標となり得ることを示す。毒性を示さない臓器重量の持続的増大の観点での統計学的有意性は、長期の試験期間にわたり大きなサンプルサイズ（より多数の試験動物）で得ることができる可能性が非常に高い。表ＶＩおよび表Ｘの結果は、脂肪生成を抑制し体重を減少するだけでなく除脂肪体重も増進する、カレビンＡの能力の予備的指標として解釈することができる。

さらに、試験期間の終了時に、レプチンおよびアディポネクチンの全身発現を推定するため、エチレンジアミド四酢酸カリウム（Ｋ２−ＥＤＴＡ）抗凝血薬を含有するチューブ内に全動物から血液サンプルを回収した。血液サンプルは、微細なキャピラリーチューブの助力で適度なエーテル麻酔の下、眼窩後部神経穿刺法から無痛回収した。抗凝血薬を含まないチューブ内に回収した血液サンプルは１０分間３０００ｒｐｍで遠心分離して、レプチンおよびアディポネクチンを推定するためＥＬＩＳＡ技法に施す血清を得た。肥満症におけるバイオマーカーとしてのレプチンおよびアディポネクチン発現の出現は段落００２３および００２４で十分論じている。カレビンＡは肥満哺乳動物の血清におけるレプチン発現の抑制に対してわずかな影響を示し（図１１）、肥満哺乳動物の血清レベルにおけるアディポネクチン発現を増加する際に有意な影響を示した（図１２）。低い全身アディポネクチンレベルは、ＩＩ型糖尿病のような病状の進行における予測因子として挙げられている（Chamukuttan Snehalatha et al,「Plasma Adiponectin Is an Independent Predictor of Type 2 Diabetes in Asian Indians」,Diabetes Care December 2003 vol.26 no.12 3226-3229）。肥満症の哺乳動物モデルにおける全身アディポネクチンレベルを有意に増加するカレビンＡの能力は、前記哺乳動物におけるＩＩ型糖尿病の発症の予防を助長する、その能力を示す。

カレビンＡおよび脂肪分解と脂肪細胞の大きさに対するその影響
段落［００３１］と［００３２］中に略述した手順ステップ中に記載したようにカレビンＡで事前に処置しなかった完全に分化した脂肪細胞（第８日）を、５〜３０μＭの濃度でカレビンＡを用いて処置した。脂肪分解は脂質のグリセロールへの分解と関係があり、グリセロールは細胞培養培地に放出されそこで検出された。５〜２０μＭの濃度でのカレビンＡは、培地へのグリセロールの放出をもたらさなかったことを観察した。３０μＭの濃度でカレビンＡを使用して脂肪細胞を処置したとき、グリセロールを検出した。したがって、別の最も好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物の脂肪細胞において脂肪分解を誘導する方法であって、様々な濃度のカレビンＡで哺乳動物の脂肪細胞を処置して前記脂肪細胞中で用量依存的脂肪分解の効果をもたらすステップを含む方法に関する。本明細書の前の段落００３６と００３７を参照すると、１２週間の間のＨＦＤを用いた処置によるオスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける肥満の誘導、および精巣上体脂肪（脂肪細胞）または全身脂肪結合組織中の組織切片の評価によって、脂肪細胞の大きさの顕著な膨張が示された。精巣上体脂肪塊を切開し、少なくとも２４時間１０％緩衝ホルマリン中に固定し、次いで一連のエタノール溶液で脱水し、パラフィン包埋用に処理した。厚さ５〜６μｍの切片を切断し、脱パラフィン処理し、再水和状態にし、ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、顕微鏡写真機により評価を施した。脂肪細胞の大きさは、切片あたり１０のランダムな視野で２００倍の倍率において、接眼マイクロメーターを備えるＮｉｋｏｎ光学顕微鏡（日本）を使用して決定した。０．２５％と１％の濃度でカレビンＡを用いてＨＦＤマウスを処置すると、脂肪細胞の大きさの顕著な縮小を観察し、脂肪細胞は正常な形態を示した（図１３）。したがって、さらに別の最も好ましい実施形態において、本発明は、肥満哺乳動物の脂肪組織中の脂肪細胞の大きさを元に戻す方法であって、（ａ）高脂肪食レジメンが原因で膨張した哺乳動物の脂肪細胞と（ｂ）カレビンＡを、前記哺乳動物への有効濃度のカレビンＡの経口投与を介して接触させて、脂肪組織中の正常な脂肪細胞の大きさに戻す効果を得るステップを含む方法に関する。

カレビンＡおよび高脂肪食を与えたマウスにおいて誘導された肝脂肪症に対するその影響（図１４）
図１４は、（ｉ）肉眼による形態観察においてＨＦＤ群の肝臓中で明らかな炎症、および（ｉｉ）組織（Ｈ＆Ｅ）切片におけるバルーン状変質を伴う炎症とトリグリセリド蓄積、ならびに肝臓中の炎症、バルーン状変質およびトリグリセリド含有量を低減するカレビンＡ（０．２５％と１％）の能力を示す。同じ結果をグラフでも表示する。
１２週間の間のＨＦＤを与えたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ＧＯＴおよびＧＴＰの血清中レベルに関して評価した。結果は、ＮＤ群と比較したとき、血清中ＧＯＴおよびＧＴＰの増大を示した（表ＸＩ）。

データは平均±ＳＥとして表した（ｎ＝群当たり８）。異なるラベル（ａ、ｂ、ｃ）での各列内の平均値は、一元配置分散分析およびダンカンの多重範囲検定によって有意に異なる（ｐ＜０．０５）。ＮＤ：通常食、ＨＦＤ：高脂肪食。

ＮＤ群と比較すると、肉眼による形態観察で見られたようにＨＦＤ群の肝臓は顕著に膨張した（ＨＦＤ誘導型肝臓損傷−肝脂肪症）。異なる群中の肝臓の一部分を切開し、少なくとも２４時間１０％緩衝ホルマリン中に固定し、次いで一連のエタノール溶液で脱水し、パラフィン包埋用に処理した。厚さ５〜６μｍの切片を切断し、脱パラフィン処理し、再水和状態にし、ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、顕微鏡写真機により評価を施した。肝臓組織変化はKleiner, D. E., Brunt, E. M., Van, N. M., Behling, C. et al., Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2005, 41, 1313-1321中に略述されたＮＡＦＬＤシステムに従い評価した。肝細胞バルーン化のスコアは、Ｈ＆Ｅ染色切片において倍率２００倍で、視野あたりのバルーン状細胞の数に基づき０〜２で等級付けした（等級付け：０＝バルーン状細胞なし、１＝わずかなバルーン状細胞、２＝顕著なバルーン状細胞）。浸潤免疫細胞の数は、５つの異なる領域において倍率２００倍で計数した。ＨＦＤ群では、有意な変質性炎症、肝細胞バルーン状変質およびトリグリセリド蓄積が見られた。定量分析によって、ＮＤ群と比較して上昇した肝臓トリグリセリドレベルが示された。０．２５％と１％の濃度のカレビンＡの投与によって、用量依存的にＨＦＤ誘導型トリグリセリド、肝細胞バルーン状変質および炎症性浸潤が低減した。したがって、別の最も好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物における高脂肪食（ＨＦＤ）誘導型肝脂肪症を治療（処置）する方法であって、炎症性浸潤、肝細胞バルーン状変質および高トリグリセリドレベルによって示されるＨＦＤ罹患肝細胞とカレビンＡを、前記哺乳動物への有効濃度のカレビンＡの経口投与を介して接触させて、用量依存的に肝脂肪症の低減の効果をもたらすステップを含む方法に関する。あるいは、別の最も好ましい実施形態において、本発明はさらに、哺乳動物における高脂肪食（ＨＦＤ）誘導型肝脂肪症を治療（処置）するためのカレビンＡに関する。

好ましい実施形態を参照しながら本発明を記載してきたが、本発明がそれに限定されないことは当業者によって明らかに理解される。そうではなくて、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲と関連してのみ解釈される。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕哺乳動物の脂肪細胞において脂肪分解を誘導する方法であって、様々な濃度のカレビン−Ａで哺乳動物の脂肪細胞を処置して前記脂肪細胞中で用量依存的脂肪分解の効果をもたらすステップを含む方法。
〔２〕肥満哺乳動物の脂肪組織中の脂肪細胞の大きさを元に戻す方法であって、（ａ）高脂肪食レジメンが原因で膨張した哺乳動物の脂肪細胞と（ｂ）カレビン−Ａを、前記哺乳動物への有効濃度のカレビン−Ａの経口投与を介して接触させて、脂肪組織中の正常な脂肪細胞の大きさに戻す効果を得るステップを含む方法。
〔３〕哺乳動物における高脂肪食（ＨＦＤ）誘導型肝脂肪症を治療する方法であって、炎症性浸潤、肝細胞バルーン状変質および高トリグリセリドレベルによって示されるＨＦＤ罹患肝細胞とカレビン−Ａを、前記哺乳動物への有効濃度のカレビン−Ａの経口投与を介して接触させて、用量依存的に肝脂肪症の低減の効果をもたらすステップを含む方法。

Claims

哺乳動物の脂肪細胞において脂肪分解を誘導するための薬理組成物であって、哺乳動物の脂肪細胞を処置して前記脂肪細胞中で用量依存的脂肪分解の効果をもたらすために有効な濃度のカレビン−Ａを含む、薬理組成物。
肥満哺乳動物の脂肪組織中の脂肪細胞の大きさを元に戻すための経口投与用薬理組成物であって、前記脂肪細胞が、高脂肪食レジメンが原因で膨張した哺乳動物の脂肪細胞であり、前記薬理組成物が、脂肪組織中の正常な脂肪細胞の大きさに戻す効果を得るために有効な濃度のカレビン−Ａを含む、経口投与用薬理組成物。
哺乳動物における高脂肪食（ＨＦＤ）誘導型肝脂肪症を治療するための経口投与用薬理組成物であって、前記高脂肪食（ＨＦＤ）誘導型肝脂肪症が、炎症性浸潤、肝細胞バルーン状変質および高トリグリセリドレベルによって示され、前記薬理組成物が、用量依存的に肝脂肪症の低減の効果をもたらすために有効な濃度のカレビン−Ａを含む、経口投与用薬理組成物。
非ヒト哺乳動物の脂肪細胞において脂肪分解を誘導する方法であって、様々な濃度のカレビン−Ａで非ヒト哺乳動物の脂肪細胞を処置して前記脂肪細胞中で用量依存的脂肪分解の効果をもたらすステップを含む方法。
肥満非ヒト哺乳動物の脂肪組織中の脂肪細胞の大きさを元に戻す方法であって、（ａ）高脂肪食レジメンが原因で膨張した非ヒト哺乳動物の脂肪細胞と（ｂ）カレビン−Ａを、前記非ヒト哺乳動物への有効濃度のカレビン−Ａの経口投与を介して接触させて、脂肪組織中の正常な脂肪細胞の大きさに戻す効果を得るステップを含む方法。
非ヒト哺乳動物における高脂肪食（ＨＦＤ）誘導型肝脂肪症を治療する方法であって、炎症性浸潤、肝細胞バルーン状変質および高トリグリセリドレベルによって示されるＨＦＤ罹患肝細胞とカレビン−Ａとを、前記非ヒト哺乳動物への有効濃度のカレビン−Ａの経口投与を介して接触させて、用量依存的に肝脂肪症の低減の効果をもたらすステップを含む方法。