KR102174613B1 - 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 유효성분으로 포함하여 포도당 저하, 칼륨 채널 폐쇄 및 개방을 통한 인슐린 분비 증가, 췌장 β세포의 손상 감소, p13K-p85 서브유닛 억제, 결함이 있는 인슐린 신호전달 개선, 간 글루코키나아제 증가 또는 손상된 글루코스 항상성을 개선시켜 당뇨병의 예방 또는 치료에 효능을 나타낼 수 있다.

Description

밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Preventing or Treating Diabetes Comprising Beeswax-Coated Bee Venom Beads As Active Ingredient}
본 발명은 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 유효성분으로 포함하여 포도당 저하, 칼륨 채널 폐쇄 및 개방을 통한 인슐린 분비 증가, 췌장 β세포의 손상 감소, p13K-p85 서브유닛 억제, 결함이 있는 인슐린 신호전달 개선, 간 글루코키나아제 증가 또는 손상된 글루코스 항상성을 개선시켜 당뇨병의 예방 또는 치료에 효능을 나타내는 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
당뇨병(diabetes)은 인슐린의 분비 결함 또는 인슐린 작용의 결함에서 기인한 만성 고혈당증(hyperglycemia)의 특징을 나타내는 다중적 병인의 대사장애를 말하며, 혈중의 포도당이 비정상적으로 높은 상태가 장기간 지속될 경우 만성적인 대사장애와 이에 따른 만성적 혈관손상으로 다양한 합병증이 발생한다.
당뇨병은 대표적인 성인성 대사질환으로 세계인구의 약 5%가 앓고 있으며, 그로 인한 인명적, 경제적 손실은 실로 막대하다. 당뇨병 환자의 대부분은 경구용 치료제를 복용하고 있으나, 현재까지 안전한 치료제가 개발되어 있지 않은 실정이다. 인슐린 저항성(insulin resistance)이 가장 중요한 기전적 원인으로 알려져 있지만, 정확한 기전은 아직 확실하지 않으며, 다만 유전적인 소인과 환경의 복합적인 원인이 작용하는 것으로 밝혀져 있다.
당뇨병은 전 세계적으로 3번째로 심각한 질병으로 2010년까지 약 2억5천만 명의 당뇨병환자가 예상되며, 국내의 경우에도 계속적인 증가가 예견되고 있다. 국내 사망원인 중 7번째로 높으며, 전체 당뇨병환자의 90% 이상을 차지하고 있는 인슐린 비의존성 당뇨병(Non-insulin dependent diabetes, NIDDM)은 주로 40대 이후에 발병되어 성인형 당뇨병이라 불리며 인슐린을 충분히 생성시키지 못하거나 적절히 이용하지 못함으로써 야기되는 대사장애이다(DeFronzo RA et al., Diabetes Care, 15:318, 1992). NIDDM의 발병 원인은 명확히 밝혀져 있지는 않지만, 서양화된 식생활 및 생활방식 등의 환경적 요인과 비만 및 운동 부족과 같은 유전적인 요인이 모두 작용하는 것으로 생각된다. NIDDM은 보통 식이 요법 및 운동 요법으로 먼저 치료를 시도하고, 이 방법에 의한 치료 효과가 충분치 않은 경우, 일반적으로 약물들이 이용되는데 많은 경우 인슐린이 사용된다. 인슐린은 식사요법과 경구 혈당강하제로 혈당이 조절되지 않는 환자에게 필요하다. 그러나 인슐린은 단백질이므로 소화관에서는 가수 분해되어 비활성화되므로 구강으로는 섭취할 수 없고 정맥이나 피하 내에 주사하여야 한다는 제한점이 있다.
경구 혈당 강하제는 세포의 인슐린 수용체의 감도를 향상시키고 췌장을 자극하여 인슐린의 분비를 촉진시키므로 NIDDM환자의 혈당을 조절하는 데에 사용된다. 그러나 NIDDM의 치료를 위한 경구 치료법은 저혈당증, 구역질, 구토, 설사, 발진 등을 일으킬 수 있으며 특히 치명적인 젖산 산증과 같은 심각한 부작용을 야기할 수 있다. 이 외에도 경구 혈당 강하제는 장기간 사용 시 심혈관계 장해나 위 장관 및 간의 장해를 유발시키므로 장시간의 사용은 권장되지 않는다. 이와 같은 결점 및 부작용으로 인하여 현재의 치료제 중 만족스러운 효능을 나타내고 동시에 안전성이 높아 부작용 측면에서도 안심할 수 있어 모든 당뇨병 환자에게 적용될 수 있는 약물이 거의 없기 때문에 당뇨병 특히 NIDDM을 치료하기 위한 보다 효율적인 약물의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, 인슐린 의존성 진성 당뇨병(Insulin dependent diabetes, DM)은 인슐린 분비 및 인슐린 작용의 부족함으로 인해 글루코오스와 지질 대사가 변화하는 것이 특징이다(Aldahmash BA et al., Saudi J Biol Sci 2016; 23: 311-317; Greenbaum CJ., Diabetes Metab Res Rev 2002; 18(3): 192-200). 고혈당을 조절하기 위한 기존의 효과적인 약물 치료법은 바람직하지 않은 부작용을 일으켜서 보다 유망한 대체 약물을 찾게 되었다(Liu Y et al., Food Chem Toxicol 2013; 62: 285-291).
신약 분자의 개발은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되기 때문에 혁신적인 제제화를 통해 기존 약물의 효능 및 안전성을 개선하고 향상시키는 방법도, 질병을 효율적으로 대처하는데 도움이 될 수 있다[Tiwari G et al., Int J Pharm Investig. 2012; 2 (1): 2-11. doi: 10.4103/2230-973X.96920]. 봉독(Bee Venom, BV)과 같이 꿀벌에 의해 생산되는 제품은 최근, 중약(Traditional Chinese Medicine, TCM)에서 광범위하게 사용되기 때문에 주목을 받고 있으며, 면역계의 자극, 항 염증 및 항암 효과 등과 같은 BV의 여러 약리학적 특성이 널리 보도되었다[Zhao M et al., Journal of Traditional Chinese Medical Sciences 2016; 3 (4): 256-262]. 최근의 연구에서는 BV 정맥주사 또는 침 치료를 통한 항 당뇨병 성질을 추가로 밝혀냈다[Mousavi SM et al., J Arthropod Borne Dis 2012; 6 (2): 136-143; Prakash S, Bhargava HR., World Appl Sci J 2012; 32(3): 343-348; Khulan TS et al., J Diabetes Metab 2015; 6: 507. Doi: 10.4172/2155- 6156.1000507].
BV의 치료적 성질은 분명히 입증되었지만, 복강 또는 침 투여가 심한 자극을 유발하기 때문에 안전성 측면이 중요한 제한적인 고려 사항이다. 또한 봉독치료에 관한 면역반응의 범위는 수일에 걸쳐 해결되는 피부반응에서부터 과민반응(anaphylaxis)과 같이 생명을 위협하는 반응까지 해당된다[Turner PV et al., J Am Assoc Lab Anim Sci 2011; 50(5): 600-613; Park JH et al., PLOS ONE, 2015; 1-26. DOI:10.1371/journal.pone.0126971]. 경구 투여가 최상이지만, 순수한 BV는 단백질이기 때문에 경구 투여될 수 없다. 이 문제를 극복하기 위해 Xing 등은 펩타이드와 단백질 약물을 순환계로 효과적으로 전달하기 위한 연구를 진행하여 대장(大腸) 특이적인 약물 전달 시스템을 제안하였다(Xinga L et al., Journal of Controlled Release 2003; 93: 293-300).
이에, 본 발명자들은 당뇨병 치료를 위한 부작용이 적고 안정성이 확보된 물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 당뇨병 유도 쥐에게 경구 투여하는 경우 포도당 저하, 칼륨 채널 폐쇄 및 개방을 통한 인슐린 분비 증가, 췌장 β-세포의 손상 감소, p13K-p85 서브유닛 억제, 결함이 있는 인슐린 신호전달 개선, 간 글루코키나아제 증가 또는 손상된 글루코스 항상성을 개선시켜 당뇨병 치료 및 예방에 매우 효과적인 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 밀랍으로 코팅된 봉독 비드(Bee wax coated bee venom beads, BWCBVA)를 유효성분으로 포함하는 안정성이 확보된 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 유효성분으로 포함하는 안정성이 확보된 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 정제된 봉독으로부터 수용성 분획 분말을 수득하는 단계; (b) 봉독의 수용성 분획 분말을 용매에 용해시키고 알긴산 용액 및 정제된 밀랍을 첨가한 다음, 교반하면서 염화칼슘 수용액을 점적하여 구형의 겔을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 구형의 겔을 건조하여 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 제조하는 단계를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 밀랍으로 코팅된 봉독을 유효성분으로 포함하는 조성물은 포도당 저하, 칼륨 채널 폐쇄 및 개방을 통한 인슐린 분비 증가, 췌장 β세포의 손상 감소, p13K-p85 서브유닛 억제, 결함이 있는 인슐린 신호전달 개선, 간 글루코키나아제 증가 또는 손상된 글루코스 항상성을 개선시키는 효과를 가지고 있어, 당뇨병 및 이로 인한 각종 합병증의 예방 또는 치료에 효능을 나타낼 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 BWCBVA의 형태학적 분석 결과를 도시한 사진이다((A) BWC의 표면 형태; (B) BWCBVA의 표면 형태; (C) BWC에 대한 내부 구조의 표면 형태; (D) BWCBVA에 대한 내부 구조의 표면 형태).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 BWCBVA 중의 BV HPLC 분석 결과를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 BWCBVA 중의 BW에 대한 GC 분석 결과를 도시한 도면이다.
도 4는 정상 및 STZ 유도 당뇨병 쥐에서 PI3K-p85 서브유닛과 글루코키나아제의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한 도면이다.
도 5는 BWCBVA와 glimepiride 처리된 정상 및 STZ 유발 당뇨병 쥐의 췌장 절편의 조직학적 분석. (A) 정상 군; (B) BWCBVA 0.50 mg/kg으로 처리한 정상 쥐; (C) 당뇨병 군; (D) BWCBVA 0.125 mg/kg으로 처리된 당뇨병 쥐; (E) BWCBVA 0.25 mg/kg으로 처리된 당뇨병 쥐; (F) BWCBVA 0.50 mg/kg으로 처리한 당뇨병 쥐; (G) 글리메피리드 10 mg/kg으로 처리한 당뇨병 쥐.
도 6은 BWCBVA가 정상 및 고지방식이(60% fat-유도 당뇨병 쥐(HFD)의 공복 혈당치에 미치는 영향을 12주간 관찰한 도면이다.
도 7은 밀랍 코팅된 독(BWCBVA)이 정상 및 당뇨병쥐(HFD)의 체중에 미치는 영향을 12주 동안 도시한 도면이다.
도 8은 밀랍 코팅된 독(BWCBVA)이 정상 및 당뇨병유발 마우스(HFD)에 12주 동안 미치는 영향을 도시한 도면이다.
도 9는 밀랍 코팅된 독(BWCBVA)이 정상 및 당뇨병유발 마우스(HFD)의 체중에 미치는 영향(12 주간 고지방식이 투여 마우스)을 도시한 도면이다.
도 10은 정상 및 streptozotocin 유도 당뇨병 쥐에서 12 주 치료 후 혈청 내 꿀벌밀랍코팅 된 독(BWCBVA)이 간 표지 효소 (SGOT, SGPT) 및 신장 표지 (BUN)에 미치는 영향
도 11은 꿀벌 (독) 및 꿀벌 밀랍 코팅 된 독(BWCBVA)이 정상 및 실험 당뇨병 쥐(HFD)의 포도당 및 혈청 지질 수준에 미치는 영향을 도시한 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 봉독의 수용성 분획 분말을 용매에 용해시키고 알긴산 용액, 정제된 밀랍 및 염화칼슘 수용액을 이용하여 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 수득하고, 이를 유효성분으로 포함하는 조성물이 포도당 저하, 칼륨 채널 폐쇄 및 개방을 통한 인슐린 분비 증가, 췌장 β-세포의 손상 감소, p13K-p85 서브유닛 억제, 결함이 있는 인슐린 신호전달 개선, 간 글루코키나아제 증가 또는 손상된 글루코스 항상성을 개선시키는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명은 일 관점에서 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서 (a) 정제된 봉독으로부터 수용성 분획 분말을 수득하는 단계; (b) 봉독의 수용성 분획 분말을 용매에 용해시키고 알긴산 용액 및 정제된 밀랍을 첨가한 다음, 교반하면서 염화칼슘 수용액을 점적하여 구형의 겔을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 구형의 겔을 건조하여 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 제조하는 단계를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 또 다른 관점에서 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 밀랍으로 코팅된 봉독 비드는 멜리틴(melittin), 포스포리파제(phospholipase), 테트라코사놀(tetracosanol), 옥타코사놀(octacosanol) 또는 트리아콘타놀(triacontanol)을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 봉독 100중량부에 대하여 500~1800중량부의 밀랍을 포함할 수 있다. 또한, 바람직하게는 봉독 100중량부에 대하여 800~1200중량부의 밀랍, 더욱 바람직하게는 900~1100중량부의 밀랍을 포함할 수 있으며, 500중량부 미만일 경우에는 건조 후 완전한 입자형성이 어려운 문제점이 있으며, 1800중량부를 초과할 경우에는 입자형성전 유화액 형성단계에서 균질화되지 않는 등의 문제점이 있다.
본 발명에 있어서, 포도당 저하, 칼륨 채널 폐쇄 및 개방을 통한 인슐린 분비 증가, 췌장 β세포의 손상 감소, p13K-p85 서브유닛 억제, 결함이 있는 인슐린 신호전달 개선, 간 글루코키나아제 증가 및 손상된 글루코스 항상성 개선으로 구성된 군에서 선택되는 작용이 발생할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 항당뇨병 화합물을 더 포함할 수 있는데, 상기 항당뇨병 화합물은 나테글리니드, 레파글리니드, 글리타존류, 설포닐 우레아계, 메트포르민, 글리메프라이드, 티아졸리딘디온계, 비구아나이드계, 알파-글루코시데이스 억제제인 아카보스, 메글리티나이드계의 프란딘으로 구성된 군에서 1종 이상 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물의 제조방법에 있어서, 상기 봉독의 수용성 분획 분말 100중량부를 기준으로 용매 10,000중량부, 1~3중량% 농도의 알긴산나트륨 용액 10,000중량부, 밀랍 500~1800중량부 및 4~8중량% 농도의 염화칼슘 수용액 40,000중량부를 첨가할 수 있다. 상기 용매는 증류수일 수 있다.
알긴산나트륨 용액이 1중량%미만일 경우에는 입자형성이 어려운 문제점이 있으며 3중량%를 초과할 경우에는 입자형성 전 유화액 형성단계에서 균질화 되지 않는 문제점이 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 대장에 기반을 둔 약물전달 시스템을 약간 변형시켜 경구투여 가능한 장(腸) 기반 봉독 조성물(bee wax coated bee venom, BWCBVA)을 제조할 수 있다. 밀랍(BW, 비왁스라고도 함, bee wax)도 식용 조성물 캡슐의 완벽한 코팅물질이라는 특성이 알려져 있으며, 약리학적으로 중요한 2차 대사산물을 함유하고 있다(Munro IC et al., Safety evaluation of specific food additives (other than food flavoring agent). 또한 El-Sabbagh 등은 약물과 밀랍 혼합물의 제조는 더 오랜 기간에 걸쳐 약물을 방출하는 지속형 메커니즘을 갖는 기능을 수행할 수 있다고 보고된 바 있다. 밀랍과 카나우바 왁스를 비교하면 두 왁스가 모두 12시간 이후로 50%의 약물 방출에 필요한 시간을 증가시키지만, 밀랍은 소화효소를 보호하는 데에 상당한 영향을 나타낸다는 것을 확인하였다(EL-Sabbagh HM et al., Alex J Pharmaceu Sci 1988; 2(1):80- 83).
한편, 알지네이트는 세포 매트릭스와 효소 그리고 약물과 식품 보조제를 결합하는 천연의 폴리산(poly acid) 물질이다(Perka C et al., J Biomed Mater Res 2000; 49: 305-311; Lanza RP et al., Transplantation 1995; 59: 1485-1487; Zimmerberg J et al., Science 1980; 210: 906-908). 일정한 모양과 크기를 갖는 구형 겔을 얻기 위해 염화칼슘 수용액에 점적하여 얻어지는 구(球)형 겔을 제조하고, 이를 "알긴산 비드(alginate bead)"로 규정하였다. 알지네이트 비드의 무독성, 높은 생체 이용률 및 재붕해 능력은 약물제제 분야에서 큰 장점으로 간주된다. 알긴산 나트륨은 산에 민감한 약물을 위액으로부터 보호하는 완벽한 선택이다. 많은 연구에서 알긴산 비드는 약물제어 방출 제제로 사용될 수 있음을 확인하고 이 특성을 바탕으로 한 결과를 입증하였다.
본 발명은 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ)-유도 수컷 흰쥐(Wister rat)에서의 항당뇨병에 대해 경구 투여 가능한 BWCBVA 약제로 제조하였다.
본 발명에서 경구 투여된 BWCBVA는 경구 투여된 BW 및 복강 투여된 BV와 비교하여 유의적인 포도당 저하 효과를 나타낸다. 결과적으로 당뇨병 쥐에서 칼륨채널 폐쇄 및 칼슘채널 개방을 통한 인슐린 분비증가로 인슐린 수치가 증가됨으로써
Figure 112018092068648-pat00001
세포의 손상을 줄여주는 것으로 예상된다.
BWCBVA에 의해 향상된 인슐린 분비는 지배적 신호경로 유전자인 PI3K-p85 서브유닛을 억제하여 결함이 있는 인슐린 신호전달을 개선시키며 간 글루코키나아제를 증가시켜 손상된 글루코스 항상성을 정상으로 돌아가게 한다. 또한, BWCBVA에 함유되어 있는 멜리틴 및 PLA2는 당뇨병 쥐의 β세포 손상을 감소시킨다. BWCBVA의 GC 분석 결과는 변화된 콜레스테롤 대사를 조절하고 항 당뇨 활성의 원인물질이 될 수 있는 테트라코사놀(tetracosanol), 옥타코사놀(octacosanol) 및 트리아콘타놀(triacontanol)이 있음을 보여준다. 게다가, BWCBVA의 경구 투여는 당뇨 쥐에서 간 바이오 표지들을 개선시킨다. 또한, 정상 쥐에서 SGOT 및 SGPT의 레벨의 상승은 관찰되지 않는 것으로 보아 투여용량 범위에서 BWCBVA의 독성은 없는 것으로 추정된다.
상기 결과로부터 경구용 장(腸)특이적 약물인 BWCBVA가 당뇨병을 치료하기 위한 효과적인 방법으로 고려될 수 있다.
본 발명에 있어서, 당뇨병은 제1형 당뇨, 제2형 당뇨, 젊은이에게 발생하는 성인형 당뇨병, 지진성 자가면역성 당뇨병, 췌장 당뇨병 등의 모든 종류의 당뇨병을 포함하는 것이며, 당뇨합병증은 상기한 예들 외에도 사구체 경화증, 발기불능, 당뇨성 신경병증, 월경전 증후군, 혈관 재협착, 궤양성 대장염, 관상동맥심질환, 고혈압, 협심증, 심근경색, 뇌졸중, 피부 및 결합조직질환, 대사성 산증, 손상된 내당력에 의한 증상 등이 포함된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 필수 성분으로 하되, 이를 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
나아가 본 발명의 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 당뇨병 또는 그 합병증의 치료물질과 혼합하여 제공될 수도 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 당뇨병의 예방 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 공지의 항당뇨병 화합물을 추가적으로 포함할 수 있다.
이러한 항당뇨병 화합물로는 나테글리니드, 레파글리니드, 글리타존류, 설포닐 우레아계, 메트포르민, 글리메프라이드, 티아졸리딘디온계, 비구아나이드계, 알파-글루코시데이스 억제제인 아카보스, 메글리티나이드계의 프란딘 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 약학적 조성물의 투여 경로는 경구 투여가 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만 캡슐, 정제 및 수성 현탁액 및 용액을 포함하여 경구적으로 허용되는 어떠한 용량으로도 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 흔히 사용되는 담체로는 락토즈 및 옥수수 전분이 포함된다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐형으로 경구 투여하는 경우 유용한 희석제로는 락토즈 및 건조된 옥수수 전분이 포함된다. 수성 현탁액이 경구 투여될 때 활성 성분은 유화제 및 현탁화제와 배합된다. 필요한 경우, 감미제 및/또는 풍미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 상기한 밀랍으로 코팅된 봉독 비드는 치료학적 유효량 또는 예방학적 유효량으로 함유된다.
그러나 특정 환자에 대한 특정 유효량은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 규정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 변할 수 있음은 이해될 것이다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
바람직한 양태로서, 구강내 투여를 위한 의약 조성물은 고체상의 부형제와 함께 활성 성분을 혼합함으로써 제조할 수 있으며 정제 또는 당의정 형태로 제조하기 위해 과립형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제로는 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소비톨과 같은 슈가 형태 또는 옥수수, 밀가루, 쌀, 감자 또는 다른 식물로부터 전분, 메틸 셀룰로스, 하이드로시프로필메틸-셀룰로스 또는 나트륨 카복시메틸세룰로스와 같은 셀룰로스, 아라빅 검, 타가칸쓰 검을 포함하는 검류와 같은 카보하이드레이트 또는 젤라틴, 콜라겐과 같은 단백질 필러를 사용할 수 있다. 필요한 경우에는, 교차결합된 폴리비닐피롤리돈, 아가 및 알긴산 또는 나트륨 알긴산과 같은 각각의 염 형태의 붕해제 또는 용해제를 첨가할 수 있다.
한편 본 발명에 따른 밀랍으로 코팅된 봉독 비드는 당뇨병의 예방 또는 개선을 위한 식품의 형태로도 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 건강 기능 식품은 식품 조성물로서, 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 건강 기능 식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용한 제1형 당뇨 모델로는 다양한 실험용 당뇨병 모델 중에서 가장 신뢰할 만한 STZ (Streptozotocine)-유도 당뇨병 모델을 선택하여 사용하였다. STZ의 복강 내 투여는 DNA 스트랜드(strand)를 파괴함으로써 내성 인슐린 분비를 감소시키고 췌장 β세포의 인슐린 분비능력을 손상시켜 고혈당증을 초래한다(Akbarzadeh A et al., Ind J of Clin Biochem 2007; 22 (2): 60-64; Junejo JA et al., Biomed and Pharmacother 2017; 95: 84-94).
본 발명에서 BWCBVA를 21일 동안 경구 투여한 경우에 공복 혈당이 크게 낮아졌고 그 다음으로 낮아진 것은 BWC 투여군이다. BV와 같은 자극 물질의 복강 내 투여는 자극을 유발해서 장폐색 및 유착성 복막염으로 이어질 수 있다[Turner PV et al., J Am Assoc Lab Anim Sci 2011; 50(5): 600-613; Ewan PW. Allergy to insect stings: a review. J R Soc Med 1985; 78(3): 234-239]. 이로 인해 BV의 복강투여를 일주일에 두 번으로 최소화하였고 항당뇨 활성은 약해졌지만, 당뇨 대조군과 비교했을 때 BWC보다 더 낮았다. Mousavi 등은 4 주간 매일 복강 내 주사시 BV의 항당뇨 성질을 보고한 바 있다[Mousavi SM et al., J Arthropod Borne Dis 2012; 6 (2): 136-143].
BV는 경구 투여 시 위와 소장의 소화 효소에 의해 변성될 수 있는 단백질이기 때문에 밀랍으로 코팅된 BV(BWCBVA) 약물전달 시스템을 통해 구강 투여함으로써 이 문제를 극복하였다. BWCBVA의 BVA는 제제의 내부 코어에 놓여 졌고 밀랍(외부 제1층을 형성), 알지네이트 및 염화칼슘(제2층으로 작용함)에 의해 보호된다. BWCBVA의 경구 투여는 위장에 들어갔을 때 위액으로부터 보호되며 BW층은 장(腸)내 미생물에 의해 지속적으로 가수 분해되어 흡수된다. 그런 다음 BWCBVA의 나머지 부분은 장에 들어가서 알긴산 및 염화칼슘에 의해 생성된 두 번째 층이 효과적으로 흡수되어 BWCBVA의 BVA 부분의 방출을 촉진, 공복 혈당을 현저히 감소시킨다. 따라서 BW와 BVA의 시너지 효과는 BV와 BW의 각각을 복강내 주입 및 경구투여한 경우와 비교하여 BWCBVA의 잠재적인 항당뇨 효과를 나타낼 수 있다.
STZ 유도 당뇨병 쥐는 근육 소모량의 증가와 조직 단백질의 감소로 인해 체중 감소를 보였다[Chatterjee MN,　Shinde R. Text book of medical biochemistry, Jaypee Brothers Medical Publishers,　New Delhi　(2002)]. BWCBVA를 21일 동안 경구투여한 결과에서는 체중의 개선을 관찰할 수 있는데, 이는 글리코겐 생성이 역전되어 근육이 에너지를 소모함으로써 발생되었다 [Balamurugan R et al., Eur J Pharmacol 2011; 667: 410-418; Patel DK et al., Asian Pac J Trop Biomed 2011; 1(4): 316-322]. 고혈당증과 저인슐린 혈증은 진성당뇨(Diabetes Melitos, DM)에서 모니터링 되는 특징적인 매개 변수다. BWCBVA 및 글리메피리드의 경구 투여는 공복 혈당 수준을 현저하게 감소시키고 STZ-유발 당뇨병 쥐에서 혈장 인슐린 수치를 급상승시킴으로써 BWCBVA의 항당뇨 효과가 확인되었다. BWCBVA 치료는 STZ에 의한 β-세포 손상을 억제한다. 또한 BWCBVA의 HPLC 및 GC분석 결과 멜리틴, PLA2 및 테트라코사놀(tetracosanol)이 함유되어 있음이 확인되었다. 멜리틴 및 PLA2는 랑게르한스섬 염증을 감소시켜 β-세포의 회복을 돕고 인슐린 분비를 촉진시키며, 테트라코사놀은 혈당 조절을 향상시킬 잠재력을 가지고 있는 것으로 보고 되어 있다[Mousavi SM et al., J Arthropod Borne Dis 2012; 6 (2): 136-143; Hsu CY et al., J Funct Food 2015; 14: 174-182)].
BWCBVA의 혈당저하효과를 확인하기 위하여 인슐린 분비의 성질을 추가로 분석하였다. K+ 이온 의존성 경로에 의해 당이 베타세포로부터 인슐린 분비를 촉진하는 보고 등을 더 분석하였다(Sato A. et al., Diabetes 1998; 47: 1713-1721; Seghers V et al., J Biol Chem 2000; 275: 9270-9277). 세포수준에서는 ATP 민감성 칼륨이온 통로에 ATP를 공급하는 산화성인산화 촉진이 K+ 이온의 유출을 감소시키고, 이 과정이 궁극적으로 베타세포의 활동전위를 탈분극(depolarize)시켜 인슐린을 함유한 분비 과립의 안팎 저장소 모두로부터 칼슘이온을 증가시켜 세포 외로 배출시키면서 인슐린을 방출하게 한다. 따라서 칼륨과 칼슘이온 통로는 당뇨약물 개발을 위한 강력한 목표로 간주되고 있다(Yang SN et al., Am J Physiol Endocrinol Metab. 2000; 288: E16-28; Stumvoll Yotsuyanagi T et al., Chem Pharm Bull 1987; 35: 1555-1563).
본 발명에서는 인슐린 자극에 대한 BWCBVA의 작용방식을 해석하기 위해 STZ 유도 당뇨 쥐에 대한 니코란딜(nicorandil)과 니페디핀(nifedipine)의 영향을 시험하였다. 그 결과, 니코란딜과 니페디핀 모두 BWCBVA의 항당뇨 성질을 상쇄하는 것으로 나타났다. 더구나 BWCBVA의 BVA 부분은 세포표면을 쉽게 뚫고 들어 갈수 있는 수용성 분자 예를 들면, 멜리틴(melittin)을 포함하고 있어서 원형질막을 탈분극 시켜 K+-ATP 통로를 차단시킨다. 이는 Ca+2의 유입을 증가시켜 전압(voltage) 의존적 칼슘통로를 활성화시키고 인슐린분비가 일어나게 한다(Mariot P et al., Diabetes 1998; 47 (3): 365-373; Kecskemeti V et al., Curr Med Chem 2002; 9 (1): 53-71; Hossen MS et al., J Chem 2017. Article ID 4035626. doi.org/10.1155/2017/4035626). 이와 관련하여 고무나무(Ficus deltoidea)의 수용성 추출물은 인슐린 분비 성질을 가지고 있는 것으로 이미 확인된 바 있다[Gerich J et al., Metabolism 1980; 29 (11): 1164-1175]. 이러한 결과들은 BWCBVA의 인슐린 분비 활성으로 인하여 K+-ATP 통로가 막히고 세포 표면의 Ca+2 통로 신호경로가 개방되는 데에서 기인하는 것임을 시사하고 있다.
PI3K는 인슐린 신호를 주로 담당하는 결정적인 p85와 p110 서브유닛(subunits)으로 구성되어 있다. 여러 문헌에서 제1형 당뇨에서 PI3K-p85 단백질의 발현은 인슐린 신호의 결함과 관련이 있어, STZ 투여는 PI3K-p85 서브유닛의 발현을 증가시킴으로써 궁극적으로 PI3K 활성을 억제하여 인슐린 신호를 혼란시킨다는 것을 확증하고 있다[Chen Y et al., Mol Neurobiol 2014; 49(1): 547-562. DOI 10.1007/s12035-013-8539-y; Bonini JA et al., Biochem Biophys Res Commun 1995; 212 (3): 933-938; Clark Jr RE et al., J Neurochem 2002; 83: 565-573]. 21일 동안의 BWCBVA와 글리메피리드(glimepiride) 경구투여는 간 PI3K-p85 서브유닛의 발현을 하향 조절함으로써 인슐린 신호결함 및 인슐린 민감도를 경감시켜서 혈장 인슐린을 증가시킨다(Leonardini A et al., PPAR Res 2009; 818945. DOI 10.1155/2009/818945l). Jarvis 등도 p85-결핍 마우스에서 인슐린 민감도가 증가한다고 보고하였다[Jarvis FM et al., J Clin Invest 2002; 109(1): 141-149]. BWCBVA 처리는 간 글루코키나아제[glucokinase, 글루코오스-업테이크(glucose-uptake)를 촉진시키는 간 인슐린 민감도 증가의 지표]의 발현을 증가시켰다. 이는 당 생성을 저하시키고 정상적인 당 지혈(haemostatis)을 유지(혈중 당 농도의 흐름을 막는)하는 것을 도와줄 수 있을 것이다[Bechmann LP et al., Hepatology 2012; 55: 1083-1109; Backer ID et al., Am J Physiol Endocrinol Metab 2016; 311(1): E42-55.doi:10.1152/ajpendo.00034. 2016; Mas A et al., Diabetes 2006; 55: 1546-1553]. 당뇨병에서 인슐린 신호 장애 및 인슐린 감수성 감소는 콜레스테롤 대사를 방해한다[Bandyopadhyay M et al., Planta Med 1993; 59(4): 312-314]. BWCBVA 처리는 혈청 TC와 TG를 감소시켜 항-지질이상(anti-dyslipidemic) 증상을 보이는데, 이것은 인슐린 신호변경에 의한 인슐린 수치 증가로 인한 것일 수 있다. 또한 테트라코사놀(tetracosanol), 옥타코사놀(octacosanol) 및 트리아콘타놀(triacontanol)과 같은 지방족 알코올의 존재는 잠재적으로 콜레스테롤 대사를 조절할 수 있다[Aldakinah AA et al., J Pharm Pharmacol 2017; 69 (7):856-864. doi: 10.1111/jphp.12713; Buchwald R et al., Apidologie 2009; 40: 585-594. DOI: 10.1051/apido/2009035]. 당뇨병으로 괴사된 간 조건으로 인해 혈청 간 표지효소인 SGOT와 SGPT의 증가가 보고 되었다(Nuissiera G et al., 미국등록특허 5,663,156; Ohaeri OC., Biosci Rep 2001; 21(1): 19-24). BWCBVA를 처리하면 혈청 SGOT 및 SGPT 수준이 크게 감소한다. 또한, 이러한 간 마커 효소(liver marker enzymes)들은 비탄수화물 공급원을 혈액내의 당으로 전환시킴으로써 혈청내 포도당 수준을 증가시켜 포도당신생과정(gluconeogenesis)에 중요한 역할을 한다. 따라서 BWCBVA 치료에 의한 SGOT와 SGPT수치의 감소는 STZ-유도 당뇨병에 의해 유발된 간 손상을 유의적으로 완화시킬 잠재력이 있음을 시사한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
제조예 1: BW로 코팅된 수용성 BV 분획( BWCBVA )의 제조
인슐린(insulin, RayBio, GA, USA)과 당화 헤모글로빈(glycosylated hemoglobin, HbA1c: Crystal Chem INC, Spain)을 제조사의 지침에 따라 시판용 키트를 사용하여 생화학적 평가를 측정하였다.
봉독 ( BV ) 수집 및 밀랍(BW) 준비
BV와 BW는 비센바이오(Beesenbio. Co., 대전, 대한민국)에서 구입하였다. BV 채취기(P10-1003672, 비센바이오, 대전, 대한민국)를 사용하여 꿀벌로부터 대량의 BV를 채취하고, 종래의 방법으로 BW를 분리 정제하였다. 요약하면, 부러진 BW들을 두꺼운 자루에 포장하여 물로 채워진 커다란 냄비에 담고, 자루에 있는 BW들을 물에서 약 60℃로 가열하였다. 자루에서 녹은 BW를 수면에 띄워 수집하기 위해 12시간 동안 냉각시켰다. 마지막으로, BW 하단의 모든 불순물들은 칼을 사용해 제거하고, 이렇게 수집된 BW를 모든 실험에 사용하였다.
BV의 정제 및 BV의 수용성 분획( BVA )의 제조
수집된 BV를 50㎛ 메쉬를 사용하여 정제하였다. 약 50mg의 정제된 BV를 동등 량의 물과 에틸아세테이트(ethyl acetate, EA)와 혼합한 다음 20분 동안 교반하여 수용성 BV 분획 및 EA 가용성 분획을 분리하였다. BV의 정제된 수용성 분획을 10분 동안 초음파 처리하고 0.2㎛ 필터를 사용해 감압 여과한 후 동결 건조하여 BV의 순수한 수용성 분획의 분말(BVA)을 얻었다.
BW로 코팅된 BV의 수용성 분획( BWCBVA )의 제조
약 114mg의 BVA 및 2g의 메틸셀룰로오스를 증류수에 용해시킨 후 1% 알긴산 용액 10ml를 첨가하였다. 정제된 BW를 이 용액에 첨가한 후, 일정한 교반하에 8% 염화칼슘 2ml를 점적하여 첨가하였다. 이를 최종적으로 동결 건조하여 BWCBVA을 얻었다. 봉독의 활성을 확인하기 위해 BVA를 제외한 모든 성분(BWC)과 밀랍(BW)을 함유한 음성 대조군 제제를 만들었다.
BWCBVA 표면의 형태학적 분석
FIB-SEM (Focused Ion Beam-SEM: LYRA3 XMU, TESCAN)을 사용하여 5 kV의 가속 전압에서 표면의 형태학적 검사 및 비드의 내부 구조를 조사하였다. 샘플을 카본(carbon) 접착 테이프를 사용하여 스터브(stub)에 놓고, 미세 코팅 이온 스퍼터(fine coat ion sputter, CRESSINGTON SPUTTER COATER 208HR)를 사용하여 금 합금(gold alloy)으로 코팅하고, FIB-SEM으로 분석하였다. 또한, 비드를 스틸 블레이드(steel blade, FEATHER SURGICAL BLADE)로 반으로 자르고 내부 구조를 분석하였다.
BWC와 BWCBVA의 표면 형태는 FIB-SEM 이미지로 분석하였다. 도 1의 (A)는 BWC의 표면 형태이고, (B)는 BWCBVA의 표면 형태이며, (C)는 BWC에 대한 내부 구조의 표면 형태이고, (D)는 BWCBVA에 대한 내부 구조의 표면 형태를 나타낸 것이다. 제조된 비드의 FIB-SEM 이미지는 거의 구형 모양을 보여준다. BWC 비드는 BWCBVA보다 표면이 더 매끄럽다(도 1의 (A) 및 (B)). 구형의 단면은 약물이 없을 때(BWC) Ca2+과 알긴산 사이의 교차결합이 도 1의 (C)와 같이 균질하지 않으나 BWCBVA는 비교적 균질화된 내부표면을 나타낸다(도 1의 (D)).
BWCBVA의 BV 지표성분의 HPLC 분석
BWCBVA의 HPLC 분석은 Agilent 1290 HPLC 장비(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. 35℃에서 Waters Acquity UPLC C18 칼럼(1.7 ㎛, 2.1x100 mm)을 사용하여 비드의 성분을 분리하였다. 이동상은 2가지 용매로 구성된다: 용매 A는 물에 0.1% 포름산(formic acid)으로 구성되는 반면, 용매 B는 아세토니트릴에 0.1% 포름산을 함유한다. 주입 부피는 2 ㎕이었고, 유속 0.2 mL/분, 55% A + 45% B에서 15.0-20.0분, 유속 0.3 mL/분의 100% A에서 0-5분의 기울기 용리/점변용리로(gradient elution), 0.3 mL/min의 유속으로 100% B에서 20.1-25.0분, 0.2 mL/min 유속으로 100% A 에서 25.1-30.0분의 조건으로 분석하였다. UV vis-스펙트럼은 220 nm에서 기록하였고, 검출된 화합물은 적절한 표준을 사용하여 확인되었다.
BWCBVA의 BV 성분 중 포스포리파아제(phospholipase) A2 (PLA2, 피크 1 및 2)와 멜리틴(melittin, 피크 3)의 HPLC 분석에서 각 피크의 RT는 각각 13.46, 13.758 및 16.59min(도 2의 (A))에 나타나고. 검출된 물질의 표준은 동일한 HPLC 조건 하에서 분석을 진행하였다(도 2의 (B) 및 (C)). 도 2(B)는 PLA 2 표준의 HPLC 크로마토그래피이고, 도 2(C)는 멜리틴 표준의 HPLC 크로마토그래피이다.
BWCBVA의 BW 지표 성분의 GC 분석
BWCBVA는 GC-Agilent Varian CP-2800, Inc, USA에서 GC 분석을 진행하였다. 사용된 칼럼은 VF-5ms 30m x 0.25mm로 필름 두께는 0.25㎛ (J & W Scientific, CA, USA)이었다. 오븐의 초기 온도는 150℃에서 분당 4℃의 증가 속도로 15분에 걸쳐 320℃까지 상승되었다. 인젝터와 검출기 온도는 300℃에서 유지되었으며 총 분석 시간은 35분, 모든 화합물의 체류시간은 해당 표준 스펙트럼으로 확인되었다.
BWCBVA의 BW 화합물의 GC 분석에서 피크 1: tetracosanol (C24, 30.022min); 피크 2: 1-hexacosanol (C26, 33.334min); 피크 3: 1-octacosanol (C28, 36.443min); 피크 4: triacontanol (C30, 39.374min)(도 3(A)). 검출된 화합물은 각각의 표준과 비교하여 확인되었다(도 3(B), (C), (D) 및 (E)).
실시예 1: STZ -유도 당뇨병 쥐에서 BV , BWC 및 BWCBVA의 항당뇨병 활성 확인
수컷 Wistar albino 랫트(180-220g)는 한국의 Dooyeol biotech lab에서 구입하였다. 쥐들은 충북 대학교 동물보호사에서 생육하였으며 모든 동물은 24℃에서 유지, 정상 사료를 섭취하였다.
경구 포도당 내성 검사(Oral Glucose Tolerance Test, OGTT )
정상 쥐를 OGTT 받기 전에 밤새 약 16시간 동안 금식시켰다. 동물을 5군(n=4)으로 나누고, BWCBVA(0.125, 0.25 및 0.50 mg/kg) 및 표준약물(Glimepride 10 mg/kg)을 투여하였다. BWCBVA와 표준약물 투여 30분 후에 포도당(2g/kg b.w)을 투여하고 포도당 투여 후 30, 60, 120분에 포도당 분석을 위해 꼬리정맥에서 채혈하였다. 포도당 수치는 포도당산화효소(glucose Oxidase, GOD) 및 과산화효소(peroxidase, POD) 측정으로 확인하였다.
당뇨병의 유도
당뇨병은 60 mg/kg STZ (Sigma-Aldrich, South Korea)를 복강 내 투여함으로써 유도하였다[Daisy et al., 2009, Journal of Ethnopharmacology 126 (2009) 339~344]. 일주일 후 공복 혈당이 250mg/dL 이상인 쥐를 당뇨병으로 간주하여 실험에 포함시켰다. 모든 실험은 충북대학교(CBNUA-886-15-01)의 윤리적 절차에 따라 수행되었다.
STZ 유도 당뇨병 쥐에서 BV , BWC 및 BWCBVA의 항 당뇨병 효과
실험 동물을 각각 6마리씩 8군으로 나누었다. 그룹 1: 정상대조; 그룹 2: 당뇨병 대조군, 단일 투여량의 STZ (60 mg/kg)의 복강내 주사; 그룹 3: 치료그룹, 복강, BV 0.25mg/kg 주 2 회 투여; 그룹 4: 치료그룹은 복강내 전체 BV 0.50 mg/kg을 주 2회 투여; 그룹 5: 치료그룹 BWC 0.25 mg/kg 매일 경구 투여; 그룹 6: 매일 BWC 0.50㎎/㎏ 경구 투여; 그룹 7: 매일 BWCBVA 0.25 mg/kg 경구 투여; 그룹 8: 매일 0.50 ㎎/㎏의 BWCBVA를 경구 투여함. 치료는 21일 동안 1일 1회 실시되었고, 실험 후, GOD 및 POD 분석에 의해 공복 혈청 포도당 수준을 측정하였다.
표 1은 정상 및 STZ-유도 당뇨병 쥐에서 완전한 BV, BWC 및 BWCBVA의 항당뇨병 활성을 나타내었다.
정상 및 STZ-유도 당뇨병 쥐에서 BV, BW 및 BWCBVA의 항당뇨병 효과에 대한 평가
Treatment Glucose (mg/dL)
Normal control 154.7 ±11.52 b
Diabetic control 658.4±7.00
Diabetic + BV 0.25 mg/kg 639.7±42.85
Diabetic + BV 0.50 mg/kg 593.1± 45.02 a
Diabetic + BWC 0.25 mg/kg 535.0±14.65 a
Diabetic + BWC 0.50 mg/kg 485.8± 10.74 b
Diabetic + BWCBVA 0.25 mg/kg 462.1± 81.72 b
Diabetic + BWCBVA 0.50 mg/kg 437.4± 47.99 b
Values are given as mean ± S.D. (n = 6).Statistical significance (a p <0.05; b p < 0.01, Student's t-test)
as compared with diabetic control.
0.25와 0.50 mg/kg의 BV의 복강투여에서는 0.25와 0.50mg/kg의 혈장 포도당 수준을 각각 2.85와 9.91% 감소시켰고, BWC 경구투여에서는 혈장 포도당을 각각 18.25와 26.34% 감소시켰다. BWCBVA 0.25 및 0.50 mg/kg의 경구투여시 당뇨병 대조군에 비해 각각 29.82 및 33.56%의 포도당 수준을 현저하게 감소시켰다. 이러한 결과는 경구투여 된 BW 및 복강 투여된 전체 BV과 비교하여 BWCBVA의 포도당 저하특성을 제시, BWCBVA로 보다 정교한 항 당뇨병 활성을 입증하였다.
OGTT 연구에서 BWCBVA는 표준 항 당뇨약물인 glimepride(10mg/kg)가 60시간과 120시간에 혈당수치를 유의하게 억제하는 반면(표 2) BWCBVA는 30분 후부터 혈당수치가 감소하였다(표 2).
글루코스 경구부하시험(OGTT)에 대한 BWCBVA의 효과
Treatment Glucose (mg/dL)
0 min 30 min 60 min 120 min
Normal control 95.7 ±8.21 147.5±11.45 151.1±6.02 141.5± 12.14
Normal + BWCBVA 0.125 mg/kg 96.0±2.41 139.1±9.65 147.2±3.22 129.8±6.87
Normal + BWCBVA 0.25 mg/kg 96.2±5.08 118.7±8.74 124.8±5.65 121.7±2.74
Normal + BWCBVA 0.50 mg/kg 98.5±3.11 125.3±4.52 123.8±8.47 108.2±6.14 a
Normal + glimepiride 10 mg/kg 97.4±3.47 118.4±3.82 121.7±6.25 99.2±6.45 a
Values are given as mean ± S.D. (n = 4).Statistical significance (a p <0.05, Student's t-test) as compared
with normal control.
실시예 2: STZ -유발 당뇨병 쥐에서 BWCBVA의 항당뇨병 활성의 용량 의존적 평가
그룹당 6 마리의 랫트로 전체 42 마리의 쥐(12마리의 정상 쥐 + 30마리의 당뇨병 쥐)가 BWCBVA를 1일 1회씩 3주 동안(치료 그룹) 경구 투여하였다. 그룹 1: 정상 대조; 그룹 2: 정상 쥐에 BWCBVA 0.50mg/kg 경구투여; 그룹3: 당뇨병 대조군, 단일 용량의 STZ(60mg/kg) 복강내 주사; 그룹 4: 치료그룹 BWCBVA 0.125mg/kg 경구투여; 그룹 5: 치료그룹 BWCBVA 0.25mg/kg 경구투여; 제6 군: BWCBVA 0.50mg/kg 경구투여; 그룹 7: 글리메피리드(10mg/kg) 경구투여. 모든 쥐의 혈당과 체중을 치료 첫날과 마지막 날에 측정했다. 희생 당일에 혈청을 전혈(whole blood)에서 분리하고 공복 혈당, 지질 및 혈청표지효소 평가를 위해 -80℃에서 보관하였다. 혈장 인슐린 수치는 ELISA를 사용하여 분석하였다. 췌장과 간을 해부하고 식염수로 씻었다. 간장은 웨스턴 블롯(western blot) 분석을 위해 액체 질소에 저장하고 췌장은 조직 병리학적 연구를 위해 10% 포르말린(formalin)에 저장하였다.
BWCBVA가 정상 및 STZ -유도 당뇨병 쥐의 체중에 미치는 영향
표 3은 정상 및 STZ-유도된 당뇨 쥐의 체중 변화를 나타낸다. 3주의 연구 기간 중, BWCBVA를 투여한 정상 쥐는 체중이 증가되었으나 당뇨병 대조군은 0일째 체중과 비교하여 상당한 체중 감소가 관찰되었다. 반대로 BWCBVA (0.125, 0.25, 0.50 mg/kg) 및 글리메피리드(glimepiride, 10 mg/kg)로 치료한 당뇨병 쥐는 체중 감소로부터 상당한 보호를 나타냈다(표 3).
BWCBVA가 정상 및 STZ-유도 당뇨병 쥐를 치료 시간 간격으로 체중에 미치는 영향
Treatment 0 day (g) 21st day (g)
Normal control 241±3.77 305±6.40 b
Normal + BWCBVA 0.50 mg/kg 243±4.92 279±6.50 a
Diabetic control 224±3.58 212±6.31
Diabetic + BWCBVA 0.125 mg/kg 226±8.16 277±14.34 a
Diabetic + BWCBVA 0.25 mg/kg 235±4.33 279±13.44 a
Diabetic + BWCBVA 0.50 mg/kg 222±6.00 248±6.80 a
Diabetic + glimepiride 10 mg/kg 234±6.21 286±6.21 b
Values are given as mean ± S.D. (n = 6).Statistical significance (a p <0.05; b p < 0.01, Student's t-test)
as compared with diabetic control.
정상 및 STZ -유발 당뇨병 쥐의 혈당치에 대한 BWCBVA의 효과
표 4에 나타낸 바와 같이, 당뇨병 쥐는 약 670 mg/dL의 증가된 당수치를 가진다. 대조적으로, 0.25 mg/kg 및 0.5 mg/kg BWCBVA의 3주 경구 투여는 공복 혈청 당 수치가 각각 42.23 및 45.67%로 용량 의존적인 감소를 나타냈다. 표준 약물인 글리메피리드(10mg/kg)는 0일째의 각 수준과 비교했을 때 혈당치가 54.62% 감소하였다.
치료 시간 간격에 따라서 정상 및 STZ 유도 당뇨병 쥐에서 공복 혈당 수치에 대한 BWCBVA의 효과
Treatment 0 day (mg/dL) 21st day (mg/dL)
Normal control 113±10.33 114±10.63 b
Normal + BWCBVA 0.50 mg/kg 115±9.65 99±9.65 b
Diabetic control 517±32.52 670±32.52
Diabetic + BWCBVA 0.125 mg/kg 548±75.50 387±75.50 a
Diabetic + BWCBVA 0.25 mg/kg 540±75.38 364±75.38 b
Diabetic + BWCBVA 0.50 mg/kg 517±52.18 304±52.00 b
Diabetic + glimepiride 10 mg/kg 537±34.86 306± 34.86 b
Values are given as mean ± S.D (n = 6).Statistical significance (a p <0.05; b p < 0.01, Student's t-test)
as compared with diabetic control.
혈장 인슐린, 당화 헤모글로빈( HbA1c ), 지질 분석표 및 혈청 간 마커 효소에 대한 BWCBVA의 효과
당뇨병 랫트는 감소된 혈장 인슐린 수치를 보인다. 대조적으로 BWCBVA 처리 군[0.125, 0.25 및 0.50 mg/kg 및 글리메피리드(10 mg/kg)]에서는 혈장 인슐린 수치가 향상되었다(32.11, 41.02, 49.57 및 63.79 %)(표 5). 당화된 헤모글로빈(HbA1c) 수치는 정상 대조군과 비교하여 STZ-유발 당뇨병 랫트에서 유의하게 증가한다(표 5). BWCBVA(0.50 mg/kg)와 글리메피리드(10 mg/kg)를 투여 받은 당뇨병 랫트는 HbA1c 수치가 유의하게 감소하였다.
치료 21일 후에 정상 및 STZ 유도 당뇨병 쥐에 대해서 혈장 인슐린 및 HbA1c 수치에 대한 BWCBVA의 효과
Treatment Insulin (μU/ml) HbA1c (%)
Normal control 17.56±4.53 b 5.11±0.53 b
Normal + BWCBVA 0.50 mg/kg 16.50±1.70 b 4.07±0.49 b
Diabetic control 3.96±0.80 17.47±0.97
Diabetic + BWCBVA 0.125 mg/kg 12.07±0.70 b 17.56±0.56
Diabetic + BWCBVA 0.25 mg/kg 14.32±0.67 b 14.98±0.27 a
Diabetic + BWCBVA 0.50 mg/kg 16.48±3.92 b 8.69±0.45 b
Diabetic + glimepiride 10 mg/kg 20.07±1.59 b 5.69±0.67 b
Values are given as mean ± S.D. (n = 6).Statistical significance (a p <0.05; b p < 0.01, Student's t-test)
as compared with diabetic control.
당뇨병 랫트에서 BWCBVA과 글리메피리드 3주간 경구 투여를 통해서 TC (total cholesterol) 및 TG (triglycerides) 수준이 현저하게 감소하는 반면, STZ-유도는 TC 및 TG 수준을 증가시킨다(표 6). STZ-유도 당뇨병 대조군 랫트는 간 지표 효소 예를 들어, SGOT (glutamic oxaloacetic transaminase) 및 SGPT (serum glutamate pyruvate transaminase) 수치가 급격히 증가하고, BWCBVA (0.125, 0.25 및 0.50 mg/kg)와 글리메피리드(10 mg/kg) 3주간 투여 후 간 지표 효소의 수치가 감소하였다(표 7). 0.50 mg/kg BWCBVA를 투여 받은 정상 대조군 랫트는 생화학적 변화가 없었다.
BWCBVA가 STZ유도된 당뇨병 쥐의 21일 치료 후에 총 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준에 미치는 영향
Treatment T.C (mg/dL) T.G (mg/dL)
Normal control 74.3±3.10 149±26.09 b
Normal + BWCBVA 0.50 mg/kg 72.50±7.4 150±77.08 b
Diabetic control 122±17.42 512±0.05
Diabetic + BWCBVA 0.125 mg/kg 92±14.49 165±19.30 b
Diabetic + BWCBVA 0.25 mg/kg 82±7.21 144±6.20 b
Diabetic + BWCBVA 0.50 mg/kg 79±10.15 114±13.09 b
Diabetic + glimepiride 10 mg/kg 73±13.54 107.6±3.70 b
Values are given as mean ± S.D. (n = 6).
Statistical significance (b p < 0.01, Student's t-test) as compared
with diabetic control.
BWCBV가 21 일간의 치료 후 STZ 유도 당뇨병 쥐의 혈청 간 표지 효소 수준에 미치는 영향
Treatment SGOT (IU/L) SGPT (IU/L)
Normal control 67.93±1.87 b 48.73±6.10 a
Normal + BWCBVA 0.50 mg/kg 67.93±2.85 b 35.96±1.27 a
Diabetic control 210.33±11.56 136.30±4.8
Diabetic + BWCBVA 0.125 mg/kg 71.60±0.87 b 77.70±2.94 a
Diabetic + BWCBVA 0.25 mg/kg 54.50±1.21 b 45.20±9.69 a
Diabetic + BWCBVA 0.50 mg/kg 71.6±3.38 b 50.06±4.20 a
Diabetic + glimepiride 10 mg/kg 77.23±12.06 b 44.20±11.90 a
Values are given as mean ± S.D (n = 6). Statistical significance (a p <0.05; b p < 0.01, Student's t-test) as compared with diabetic control.
실시예 3: BWCBVA 처리된 정상 랫트 및 당뇨병 랫트에서 간 PI3K -p85 서브유닛 및 글루코키나아제의 웨스턴 블롯 분석
단백질 농도는 키트 프로토콜에 따라 측정하였다. 동등한 양의 단백질을 전기영동기술(electrophoresis technique)을 사용하여 분리하고 PVDF 멤브레인 으로 옮겼다. 멤브레인을 4℃에서 1시간 동안 블로킹(blocking) 완충액으로 블로킹한 후, 1차 항체(희석비 1:1000)로 4℃에서 밤새 블롯팅(blotting)하였다. 멤브레인을 TBST 완충액에서 10분 동안 4회 세척하고, 2차 항체(1:10000)와 함께 실온에서 2시간 동안 배양하고, TBST 중에서 각각 10분 동안 4회 세척하였다. 결합된 항체는 향상된 화학발광(ECL 키트; Millipore, Billerica, MA, USA)에 의해 시각화되었다. 멤브레인을 X-ray 필름에 노출시키고 Scion Image를 사용하여 밴드강도를 정량화하였다. PI3K-p85 및
Figure 112018092068648-pat00002
-actin에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였고, 글루코키나아제에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)에서 구입하였다.
PI3K-p85가 DM에서 인슐린 신호 전달에 결정적인 역할을 하기 때문에, 우리는 BWCBVA의 저혈당 메커니즘을 연구하기 위해 웨스턴 블롯법을 사용하여 간 PI3K-p85 단백질 발현을 검사하였다. PI3K-p85 서브유닛의 발현 수준은 당뇨병 조절에서 상향 조절되었다. 반대로, BWCBVA 및 글리메피리드로 처리한 당뇨병 랫트는 PI3K-p85 서브유닛의 발현을 하향 조절하여 P13K 활성화되었다[도 4 (A)]. PI3K의 활성화는 포도당 대사에 영향을 준다. β-액틴(actin)을 대조군으로 사용하여 글루코키나아제의 발현을 분석하였다. 예상대로, 간 글루코키나아제의 단백질 발현은 BWCBVA 및 글리메피리드 처리 당뇨병 군에서 증가되었고, 글루코키나제 수준은 당뇨병 대조군에서 하향 조절되었다[도 4 (B)].
실시예 4: 췌장의 조직학적 분석
췌장을 절개하고, 식염수를 사용하여 혈전을 제거하고, 10% 포르말린으로 수집하여 조직학적 분석을 수행하였다. 표본을 파라핀 왁스에 삽입하기 전에 에탄올 상승등급으로 탈수시켰다. 절편을 6 ㎛ 두께로 자르고 헤마톡실린 (hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하고 현미경으로 검사하였다 (Nirmala A et al., J Pharmacog Phytother 2009; 2: 25-30). 각 실험 동물에 대해 적어도 3개의 슬라이드를 준비하였다.
정상 대조군과 BWCBVA로 처리한 정상 랫트의 췌장 구조를 확인해 보면 정상 췌장 소포(pancreatic acini.)와 변화가 없었다[도 5 (A), (B)]. STZ 유도 당뇨 대조군 랫트의 췌장 소포에서 퇴행 및 파괴된 β-세포를 나타내어 불 균일한 액포(vacuoles)가 발견되었다[도 5 (C)]. 대조적으로, BWCBVA (0.125, 0.25 및 0.50 mg/kg) 및 글리메피리드(10 mg/kg)로 처리된 당뇨병 랫트는 섬세포(islet cells)의 증가 및 β-세포 손상 감소의 개선 효과를 보였다[도 5 (D), (E) 및 (G)].
실시예 5: BWCBVA의 칼슘 이온 및 칼륨 이온( Ca 2 + , K + ) 채널에 대한 저혈당 활성 의존성 확인
BWCBVA와 Ca2 + 및 K+ 채널의 조절자(regulator)들을 조합한 당뇨 치료에 대하여 확인하였다. 총 24마리의 수컷 Wistar 쥐를 4그룹으로 6마리씩 나누어 이 분석을 실시하였다. 그룹 1: 정상 대조; 그룹 2: 당뇨병 대조군, STZ(60mg/kg) 복강 내 투여. 그룹 3 및 4: BWCBVA 0.25mg/kg+nicorandil (6.8mg/kg), 칼륨 채널 opener 또는 nifedipine(13.6mg/kg) (칼슘채널 차단제)을 각각 경구 투여 한 당뇨병 쥐에 대해 Accu check를 사용하여 0일과 21일에 혈당을 측정하였다.
통계 분석을 위해 Student's t-test를 사용하여 통계적 유의성을 확인하였다. 그 값은 '평균값± S.D'로 나타냈다.
BWCBVA는 0.25 mg/kg (44.32%), 0.125 mg/kg (33.5%), 0.50 mg/kg (25.14%)의 글루코스 수준을 현저히 감소시켰다. 따라서 인슐린 분비 특성을 더 분석하기 위해 0.25 mg/kg BWCBVA를 선택하였다. 인슐린 분비가 칼륨 이온 채널 폐쇄와 칼슘 이온의 유입에 의해 조절된다는 것은 보고된 바 있다(Koster JC et al., Diabetes 2005; 54(11): 3065-3072). 따라서 칼륨과 칼슘 채널의 상태와 BWCBVA의 인슐린 분비 특성 사이의 상관관계를 분석하였다. 요약하면, 니페디핀(nifedipine)과 니코란딜(nicorandil)의 조합으로 0.25mg/kg BWCBVA를 21일 동안 투여했을 때, BWCBVA의 항당뇨병 성질이 당뇨병 대조군에 비해 니페디핀과 니코란딜에 의해 저지되었다(표 8). 이것은 BWCBVA가 칼슘이온 유입을 강화하고 칼륨이온 채널을 방해함으로써 인슐린 분비에 미치는 효과를 나타낸다.
Ca2+ 및 K+ 이온 채널에 대한 BWCBVA의 저혈당 활성 의존성 결과
Treatment 0 day
(mg/dL)
 21st day
(mg/dL)
Normal control 111±7.8 104±5.8 a
Diabetic control 514±40.2 559±13.6
Diabetic + BWCBVA 0.25 mg/kg + Nicorandil (6.8 mg/kg) 529±32.92 526±16.46
Diabetic + BWCBVA 0.25 mg/kg + Nifedipine (13.6 mg/kg) 528±20.24 515±8.57
Values are given as mean ± S.D (n = 6); Statistical significance (a p <0.05, Student's t-test) as compared with diabetic control.
실시예 6: 제2형 당뇨병에 대한 BWCBVA 의 항당뇨 효과
마우스(mouse)를 8주간 고칼로리 사료(HFD, High Fat Diet)를 섭식 시켜 당뇨를 유발시킨 후, 12주간 봉독을 경구 투여하였다. 부검 전 12시간 절식 후, 에테르 마취한 다음, 채혈을 통하여 안락사 시킴. 혈액에서 혈청을 분리하여 혈청 지질 지수(Total cholesterol, Triglycerides, HDL-cholesterol and LDL-cholesterol), 당(glucose) 농도, 인슐린 농도를 측정하였다. 췌장(이자)은 차가운 식염수로 세척하여 혈액을 충분히 제거 후 10% 포르말린에 저장한 후 조직분석 (histological analysis)에 사용하였다.
- 실험군 및 군별 사용 동물 수: 총 6개 실험군 = 60 마리.
실험군 1: 정상 mouse (0.9% saline), n= 10 마리
실험군 2: 정상 mouse + Bee venom (2 mg/kg), n= 10 마리
실험군 3: 당뇨병 유도 mouse (0.9% saline), n= 10 마리
실험군 4: 당뇨병 유도 mouse + Bee venom (0.5 mg/kg), n= 10 마리
실험군 5: 당뇨병 유도 mouse + Bee venom (1 mg/kg), n= 10 마리
실험군 6: 당뇨병 유도 mouse + Bee venom (2 mg/kg), n= 10 마리
- 사육관리 및 순화방법: 충북대학교 실험동물지원센터에 공급된 실험동물은 7일 간 실험실 환경적응 기간을 가지며 외관증상 관찰을 통해 검수 및 검역과정을 거쳤다.
- 시험물질의 투여: BV는 복강투여(IP), 밀랍 코팅 봉독(BWCBV=BWV)은 경구 투여(per os)하였으며, 투여 량은 0.5~2 mg/kg이었다.
- 혈액 및 간으로부터 시료채취는 시험물질의 투여기간 중 12시간 절식한 후, 에테르 마취 및 방혈 방법으로 안락사 시킨 다음 시료를 1회 채취하였다.
- 검사항목은 사료섭취량, 증체율 등의 측정 및 활성검사[총콜레스테롤, high density lipoprotein (HDL)-콜레스테롤, low density lipoprotein (LDL)-콜레스테롤, 혈당(glucose) 및 인슐린 농도 등의 변화를]를 실시하였고 간독성은 GOT, GPT를 조사하였으며, 부고환 지방 무게 측정 및 장기 무게 측정(간, 콩팥) 그리고 췌장의 조직 소견(Oil red O 염색, H&E 염색) 등을 관찰하였다.
1) 혈중 당(glucose) 농도 변화
8주간 비만 사료를 급여하여 비만 및 당뇨 상태를 유도한 후, 12주간 BWV을 경구로 투여하면서 매주 혈액 중 당 농도를 측정한 결과는 도 6과 같다. 도 6에서 확인할 수 있듯이 정상 식이 급여 마우스와 비교하여 비만사료로 당뇨를 유도 마우스의 혈액 중 당 수치가 월등히 높았다. BWV을 투여한 실험군에서는 농도 의존적으로 글루코스 억제 효과가 우수한 것으로 나타났다.
2) 체중 변화
각 실험군의 당뇨 유도 전후 체중 변화를 관찰하였다. 도 7의 결과 에서와 같이 정상 마우스의 경우 체중이 10% 증가하였으나, 비만사료(HFD)로 당뇨병을 유도한 마우스는 체중이 점차 증가하여 12주 후 20% 증가하였다. BWCBV을 섭식한 실험군의 경우 0.5 mg/kg는 17%, 1 mg/kg는 19%, 2 mg/kg는 10% 증가되었다. 도 7의 결과로부터 BV의 경구투여는 비만성 당뇨에 의한 체중 증가를 부분적으로 억제함을 확인할 수 있었다. 도 8은 섭식한 사료량을 나타낸 그래프로서 전 실험 기간 동안 특이사항은 나타나지 않았다.
3) 조직의 무게 변화
12주간 BWV을 경구 투여한 후 부검하여 분리해낸 간, 신장, 부고환 지방의 무게 차이를 확인하여 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 간의 무게는 비만사료의 섭취에 의해 증가되었으며 BWV의 투여에 의해 감소하였다. 신장과 부고환 지방의 무게는 BWV의 투여에 의해 변화가 나타나지 않았다.
4) 혈액화학검사
12주간 BWV을 경구 투여한 후 후 혈액으로부터 혈청을 분리하여 간 및 신장 독성 지수를 검사하였다. 도 10에서 확인할 수 있듯이 비만형 당뇨가 되면 간 지수인 SGOT와 SGPT는 급격하게 올라가는 것을 볼 있었으며, 봉독의 투여에 의해 간 독성 수치를 정상 마우스의 수준으로 되는 것을 확인할 수 있었다. 신장 독성 지수인 BUN은 정상 범위 내에서 정상사료와 비만사료 투여군의 차이가 나타났으나, BWV의 투여에 의한 변화는 나타나지 않았다.
5) 혈액당 및 지질 지수(lipid profile) 측정
동일한 혈청을 이용하여 혈액 당 및 지질 지수(lipid profile)를 측정하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 당(glucose)의 경우 당뇨병에 의해 혈액 중 당 농도가 증가되었다. BWV을 경구 투여할 경우 증가된 당 농도가 감소되었다. 지질 지수에 해당하는 총 콜레스테롤(total cholesterol)의 경우에는 당뇨병에 의해 상승된 수치가 BWV에 의해 저하되지 않았다. LDL-콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤은 정상대조군 대비 당뇨유도 실험군에서 보다 높게 나왔으나, BWV의 투여에 의해 감소되었다.
이상의 결과를 종합해 보면 비만에 의해 유도되는 당뇨병 증상은 BWV의 경구 투여에 의해 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인 할 수 있었다. 당뇨병 유도 마우스에 대한 BWV의 경구 투여는 실험이 진행되는 동안뿐만 아니라 실험 종료 후 혈청 검사에서도 당의 농도를 감소시켰다. 또한 BWV은 비만형 당뇨에 의한 체중증가를 억제하였다. BWV의 경구 투여에 의한 간 및 신장 독성 지표는 BWV의 농도에 따라 차이를 보였지만, 활성 농도에서는 독성이 없었으며 오히려 당뇨병에 의해 정상수치 이상으로 증가된 GOT와 GPT 수치를 낮추는 효과가 있었다.
STZ-유발 당뇨병 쥐에서의 인슐린 분비 및 인슐린 신호 전달에 영향을 미치는 BWCBVA 및 BWCBV(BWV)의 효능이 일부 입증되었으나 보다 정확한 방식으로 움직이는 분자를 가시적으로 정량화 할 수 있는 감마 신티그래피(gamma scintigraphy)와 같은 방법을 사용하여 BWCBVA의 약동력학적 성질을 확인하고 BWCBVA의 안정성 연구도 조사해 볼 필요가 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 밀랍으로 코팅된 봉독 비드는 멜리틴(melittin), 포스포리파제(phospholipase), 테트라코사놀, 옥타코사놀 또는 트리아콘타놀을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 봉독 100중량부에 대하여 500~1800중량부의 밀랍을 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 포도당 저하, 칼륨 채널 폐쇄 및 개방을 통한 인슐린 분비 증가, 췌장 β세포의 손상 감소, p13K-p85 서브유닛 억제, 결함이 있는 인슐린 신호전달 개선, 간 글루코키나아제 증가 및 손상된 글루코스 항상성 개선으로 구성된 군에서 선택되는 작용이 발생하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 다음 단계를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법:
    (a) 정제된 봉독으로부터 수용성 분획 분말을 수득하는 단계;
    (b) 봉독의 수용성 분획 분말을 용매에 용해시키고 알긴산 용액 및 정제된 밀랍을 첨가한 다음, 교반하면서 염화칼슘 수용액을 점적하여 구형의 겔을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 구형의 겔을 건조하여 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 제조하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 봉독의 수용성 분획 분말 100중량부를 기준으로 용매 10,000중량부, 1~3중량% 농도의 알긴산나트륨 용액 10,000중량부, 밀랍 500~1800중량부 및 4~8% 농도의 염화칼슘 수용액 40,000중량부를 첨가하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조방법.
  10. 밀랍으로 코팅된 봉독 비드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  11. 제10항에 있어서, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  12. 제10항에 있어서, 상기 밀랍으로 코팅된 봉독은 멜리틴(melittin), 포스포리파제(phospholipase), 테트라코사놀, 옥타코사놀 또는 트리아콘타놀을 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  13. 제10항에 있어서, 상기 봉독 100중량부에 대하여 500~1800중량부의 밀랍을 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  14. 제10항에 있어서, 포도당 저하, 칼륨 채널 폐쇄 및 개방을 통한 인슐린 분비 증가, 췌장 β세포의 손상 감소, p13K-p85 서브유닛 억제, 결함이 있는 인슐린 신호전달 개선, 간 글루코키나아제 증가 및 손상된 글루코스 항상성 개선으로 구성된 군에서 선택되는 작용이 발생하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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KR20150137314A (ko) * 2014-05-29 2015-12-09 대한민국(농촌진흥청장) 봉독, 멜리틴 또는 아파민 성분을 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물
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