KR102559349B1 - 그라비올라 잎 추출물을 포함하는 약학 조성물 및 건강기능식품 - Google Patents
그라비올라 잎 추출물을 포함하는 약학 조성물 및 건강기능식품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 그라비올라 잎 추출물을 포함하는 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 그라비올라(graviola) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하며, 인슐린 저항성 개선 효과가 있을 뿐만 아니라, 근감소증 예방 또는 치료효과가 있는 약학 조성물 및 근감소증 예방 또는 개선 효과가 있는 건강기능식품에 관한 것이다.
Description
본 발명은 그라비올라 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 근감소증 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 근감소증 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
근육 기능 저하는 대사성질환 및 노화로 야기되는 사회적인 문제로, 건강수명을 증진시키고 삶의 질 향상을 위해서는 근육 건강이 필수적이다.
골격근의 해당과정, 간의 당신생경로를 연결하는 코리회로 및 골격근의 글리코겐과 단백질 분해산물을 간으로 운반하여 포도당 재생에 기여하는 알라닌 회로를 통해 간과 근육조직은 상호작용하며 에너지 항상성을 유지한다.
간의 인슐린 저항성과 근감소증은 긴밀한 관계를 가지며, 근감소증 환자에게서 비알코올성 지방간 발생 비율은 최대 4배까지 높다. 또한 근감소증을 겪는 그룹은 비만 상태와 무관하게 근감소증을 겪지 않는 그룹보다 2배 이상 비알코올성 지방간으로 진행될 확률이 높다. 근육량의 감소로 인해 증가한 인슐린 저항성은 포도당 대사의 불균형을 초래하여 에너지 대사를 방해하고, 이로 인해 에너지 대사의 중심기관인 간 조직에서 유래한 다양한 산화적스트레스 및 염증반응 인자들은 골격근의 당 흡수를 방해하여 인슐린 민감성을 감소시킨다.
따라서 간과 근육조직을 동시에 타겟 가능한 다장기 표적 물질의 발견이 필수적이며 특히 부작용이 적은 식품 유래 천연물 기반의 기능성 소재를 이용한 연구가 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 천연물 기반의 간과 근육조직을 동시에 타겟 가능한 인슐린 저항성 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 천연물 기반의 인슐린 저항성 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 천연물 기반의 간과 근육조직을 동시에 타겟 가능한 근감소증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 천연물 기반의 간과 근육조직을 동시에 타겟 가능한 근감소증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면에 따른 인슐린 저항성 예방 또는 치료용 약학 조성물은 그라비올라(graviola) 잎 추출물을 유효성분으로 포함한다.
상기 인슐린 저항성 예방 또는 치료용 약학 조성물의 그라비올라(graviola) 잎 추출물의 유효 투여용량은 10 내지 500 mg/kg bw/day일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 그라비올라(graviola) 잎 에탄올 추출물의 경우 유효 투여용량이 10 내지 80 mg/kg bw/day일 수 있다. 또는 상기 그라비올라(graviola) 잎 열수 추출물의 경우 유효 투여용량은 150 내지 300 mg/kg bw/day일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 인슐린 저항성 예방 또는 개선용 건강기능식품은 그라비올라 잎 추출물을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따른 근감소증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 그라비올라 잎 추출물을 유효성분으로 포함한다.
상기 근감소증 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 그라비올라(graviola) 잎 추출물의 유효 투여용량은 10 내지 500 mg/kg bw/day, 보다 구체적으로 10 내지 80 mg/kg bw/day 일 수 있다.
상기 근감소증은 인슐린 저항성 증가로 유발된 근감소증일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따른 근감소증 예방 또는 개선용 건강기능식품은 그라비올라 잎 추출물을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 그라비올라 잎 추출물은 항산화 소재로서, 인슐린 신호 전달 촉진 및 에너지 대사 조절로 다양한 요인에 의해 발생 되는 간 질환뿐만 아니라 근감소증 또한 예방 및 개선시킬 수 있다.
또한 본 발명은 안정성이 높아 약학적 조성물 뿐만 아니라 건강식품으로 활용이 용이하다.
도 1의 그라비올라 잎 추출물의 최종당화산물 생성을 측정한 그래프이다.
도 2는 그라비올라 잎 추출물의 최종당화산물 파쇄를 측정한 그래프이다.
도 3은 그라비올라 잎 추출물의 세포독성과 NO 생성 저해를 나타내는 그래프이다.
도 4는 그라비올라 잎 추출물의 혈당 감소 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 그라비올라 잎 추출물의 혈장 헤모글로빈 감소 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 그라비올라 잎 추출물의 경구 포도당 내성 감소 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 도 6의 그래프 아래 면적을 나타낸 그래프이다.
도 8은 그라비올라 잎 추출물의 인슐린 농도 감소 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 그라비올라 잎 추출물의 HOMA-IR 감소 효과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 그라비올라 잎 추출물의 ALT 농도 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 그라비올라 잎 추출물의 지방구 축적 감소 효과를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 12는 도 11에서 관찰된 지방구 축적을 수치적으로 비교한 그래프이다.
도 13은 그라비올라 잎 추출물의 간 내 지방 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 그라비올라 잎 추출물의 간 내 지방구 축적 감소 효과를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 15는 그라비올라 잎 추출물의 간 내 지방구 축적 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 그라비올라 잎 추출물의 인슐린 신호전달 및 에너지 대사 향상 효과를 나타낸 것이다.
도 17은 그라비올라 잎 추출물의 간의 지질 대사 및 지방구의 자가사멸(lipophagy) 기전 효과를 나타낸 것이다.
도 18은 그라비올라 잎 추출물의 간의 산화적 스트레스 완화 효과를 나타낸 것이다.
도 19는 그라비올라 잎 에탄올 추출물의 근육 섬유 크기 감소 회복 효과를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 20은 그라비올라 잎 에탄올 추출물의 근육 섬유 크기 감소 회복 효과를 수치적으로 나타낸 그래프이다.
도 21은 그라비올라 잎 열수 추출물의 근육 섬유 크기 감소 회복 효과를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 22는 그라비올라 잎 열수 추출물의 근육 섬유 크기 감소 회복 효과를 수치적으로 나타낸 그래프이다.
도 23은 그라비올라 잎 추출물의 근육 인슐린 신호전달 관련 인자 정상화 효과를 나타낸 것이다.
도 24는 그라비올라 잎 추출물의 근육의 유비퀴틴 단백질 분해 완화 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 그라비올라 잎 추출물의 최종당화산물 파쇄를 측정한 그래프이다.
도 3은 그라비올라 잎 추출물의 세포독성과 NO 생성 저해를 나타내는 그래프이다.
도 4는 그라비올라 잎 추출물의 혈당 감소 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 그라비올라 잎 추출물의 혈장 헤모글로빈 감소 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 그라비올라 잎 추출물의 경구 포도당 내성 감소 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 도 6의 그래프 아래 면적을 나타낸 그래프이다.
도 8은 그라비올라 잎 추출물의 인슐린 농도 감소 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 그라비올라 잎 추출물의 HOMA-IR 감소 효과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 그라비올라 잎 추출물의 ALT 농도 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 그라비올라 잎 추출물의 지방구 축적 감소 효과를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 12는 도 11에서 관찰된 지방구 축적을 수치적으로 비교한 그래프이다.
도 13은 그라비올라 잎 추출물의 간 내 지방 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 그라비올라 잎 추출물의 간 내 지방구 축적 감소 효과를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 15는 그라비올라 잎 추출물의 간 내 지방구 축적 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 그라비올라 잎 추출물의 인슐린 신호전달 및 에너지 대사 향상 효과를 나타낸 것이다.
도 17은 그라비올라 잎 추출물의 간의 지질 대사 및 지방구의 자가사멸(lipophagy) 기전 효과를 나타낸 것이다.
도 18은 그라비올라 잎 추출물의 간의 산화적 스트레스 완화 효과를 나타낸 것이다.
도 19는 그라비올라 잎 에탄올 추출물의 근육 섬유 크기 감소 회복 효과를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 20은 그라비올라 잎 에탄올 추출물의 근육 섬유 크기 감소 회복 효과를 수치적으로 나타낸 그래프이다.
도 21은 그라비올라 잎 열수 추출물의 근육 섬유 크기 감소 회복 효과를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 22는 그라비올라 잎 열수 추출물의 근육 섬유 크기 감소 회복 효과를 수치적으로 나타낸 그래프이다.
도 23은 그라비올라 잎 추출물의 근육 인슐린 신호전달 관련 인자 정상화 효과를 나타낸 것이다.
도 24는 그라비올라 잎 추출물의 근육의 유비퀴틴 단백질 분해 완화 효과를 나타낸 것이다.
이하, 도면을 참고하여 본 발명을 상세하게 설명한다.
이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들은 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명의 일 측면에 따른 인슐린 저항성 예방 또는 치료용 약학 조성물은 그라비올라(graviola) 잎 추출물을 유효성분으로 포함한다.
상기 그라비올라 잎 추출물은 에탄올 추출 또는 열수 추출 등의 방법으로 추출될 수 있으나, 추출방법에 제한되는 것은 아니며, 여과시킨 추출액을 농축 후 건조하여 사용할 수 있다.
상기 추출물은 예를 들어, 1) 그라비올라 잎에 추출용매를 가하여 추출하는 단계; 2) 상기 추출물을 여과하는 단계; 및 3) 상기 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있다.
상기 그라비올라 잎은 건조된 원물 또는 분쇄기로 분쇄된 것을 사용할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 그라비올라 잎의 추출물의 추출 방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류냉각 추출 또는 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있다.
상기 감압 농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 예를 들어 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조일 수 있으며, 동결건조하는 것이 바람직하나 상기 예시에 한정하지 않는다.
그라비올라 잎 추출물의 유효 투여용량은 그라비올라 잎 추출물을 농축한 후 건조된 시료를 기준으로 할 수 있다.
그라비올라 잎 추출물은 농축 후 건조된 시료를 기준으로 유효 투여용량이 10 내지 500 mg/kg bw/day인 것이 바람직하다. 그라비올라 잎 추출물의 유효 투여용량이 10 mg/kg bw/day 미만인 경우, 인슐린 저항성에 대하여 예방 또는 치료효과가 미미할 수 있으며, 500 mg/kg bw/day 초과인 경우에도 인슐린 저항성에 대하여 효과가 떨어지는 문제가 발생할 수 있다.
구체적으로 그라비올라 잎 에탄올 추출물의 경우, 저농도의 그라비올라 추출물이 인슐린 저항성에 보다 효과적일 수 있으며 구체적으로 과잉 지방구 축적이 감소하여, 중성지방 농도가 감소하는 효과가 있을 수 있다. 상기 저농도는 예를 들어, 유효 투여용량이 10 내지 80 mg/kg bw/day일 수 있으나, 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
그라비올라 잎 열수 추출물의 경우는 고농도의 그라비올라 추출물이 인슐린 저항성에 보다 효과적일 수 있으며, 예를 들어, 150 내지 300mg/kg bw/day일 수 있으나, 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 실시예인 인슐린 저항성 예방 또는 개선용 건강기능식품은 그라비올라 잎 추출물을 유효성분으로 포함하며, 건강기능식품은 육류, 스낵류, 낙농제품, 음료수 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니고, 통상적인 건강기능식품을 모두 포함하는 개념으로 이해될 수 있다.
본 발명의 일 실시예는 그라비올라 잎 추출물을 유효성분으로 포함하며, 근감소증을 예방 또는 치료하는 목적의 약학적 조성물일 수 있다. 간과 근육조직이 에너지 항상성을 위하여 서로 상호작용하는 점을 이용하여, 상기 그라비올라 잎 추출물을 유효성분으로 포함한 조성물은 인슐리 저항성 증가로 유발된 근감소증을 예방 또는 치료하는 목적으로 사용될 수 있다.
근감소증은 근육량 및 근력의 저하를 의미하며 노화 및 다양한 대사질환에 의해 초래된다. 근육은 체내 포도당의 80% 이상이 대사되는 조직으로 근육건강 유지는 신체기능 및 신체 전반적인 대사를 조절을 위해 필수적이다. 근육 손상은 다양한 요인에 의한 산화적 스트레스 및 염증반응에 의한 인슐린 저항성이 기여할 수 있다. IRS-1, Akt의 불활성화 및 이로 인한 GLUT4의 자리 ?김(translocation) 저하로 인한 근육조직 내 포도당 흡수 저하는 근육조직의 에너지대사 불균형을 초래하고 근손상을 유발한다. 또한 전사인자 Foxo3a의 활성화는 근육 단백질 datradation에 기여하는 Atrogin-1과 Mulrf1의 발현을 증가시켜 근육조직의 단백질 분해를 촉진하여 근감소증을 유발한다.
상기 근감소증을 예방 또는 치료를 목적으로 하는 약학적 조성물의 그라비올라(graviola) 잎 추출물 유효 투여용량은 10 내지 500 mg/kg bw/day일 수 있다. 그라비올라 잎 추출물의 유효 투여용량이 10 mg/kg bw/day 미만인 경우, 근감소증에 대하여 예방 또는 치료효과가 미미할 수 있으며, 500 mg/kg bw/day 초과인 경우에도 근감소증에 대하여 효과가 떨어지는 문제가 발생할 수 있다.
구체적으로 그라비올라 잎 추출물의 경우, 용매에 관계없이 저농도의 그라비올라 추출물이 근감소증으로의 이행 위험을 보다 효과적으로 예방 및 완화할 수 있다. 상기 저농도는 예를 들어, 유효 투여용량이 10 내지 80 mg/kg bw/day일 수 있으나, 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 실시예인 근감소증 예방 또는 개선용 건강기능식품은 그라비올라 잎 추출물을 유효성분으로 포함하며, 건강기능식품은 육류, 스낵류, 낙농제품, 음료수 등을 예시로 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 통상적인 건강기능식품을 모두 포함하는 개념으로 이해될 수 있다.
상기 조성물은 경구 투여를 위해 고형 제제 또는 액상 제제일 수 있으며, 예를 들어, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다.
상기 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있다. 이러한 고형제제는 상기 그라비올라 잎 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.
상기 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
[제조예 1 : 그라비올라 잎 에탄올 추출물 제조]
그라비올라 잎 추출물 제조를 위해 건조된 그라비올라 잎 1.5kg을 50% 에탄올 15L를 사용해 상온에서 24시간씩 2회 반복 추출하고 여과하였다. 여과액을 감압 증류하고 동결건조한 결과 추출물(120g/ 수득률 8%)을 수득하였다. 동결건조된 시료는 분말형태로 분쇄된 뒤 -20℃ 냉동고에서 냉동보관하여 사용되었다.
[제조예 2 : 그라비올라 잎 열수 추출물 제조]
그라비올라 잎 추출물 제조를 위해 건조된 그라비올라 잎을 분쇄하여 121℃ 에서 4~6시간 고압증기 멸균하여 여과시킨다. 여과시킨 추출액은 농축 후 건조하여 냉동보관하여 그라비올라 잎 추출물 시료로 사용하였다.
[실험예 1 : 그라비올라 잎 에탄올 추출물의 최종당화산물 생성 및 파쇄 측정]
최종당화산물 (AGEs) 생성의 경우, PBS (ph 7.4), 5mg/mL의 알부민 (Bovine Serum Albumin; BSA), GO 또는 MGO 5 mM과 반응하여 7일 간 37 ℃에서 배양한 후 VICTORTM X3 multilabel plate reader(PerkinElmer社)를 이용하여 excitation/emission wavelengths (370/440 nm)로 측정하여 하기 표 1와 도 1의 그래프로 나타냈다.
도 1의 (a)와 (b)는 본 발명의 실시예인 그라비올라 추출물 1, 5, 10 mg/ml의 GO-AGEs 와 MGO-AGEs 형성 저해 효과를 나타낸 그래프이다. 그라비올라 잎 추출물이 농도 의존적으로 GO와 MGO로 인한 최종당화산물의 생성을 저해함이 관찰되었다.
시료 | 처리농도 | 최종당화산물 (GO-AGEs)생성량 % | 최종당화산물 (MGO-AGEs)생성량 % |
Control (BSA) | - | 29.96±2.51 | 13.86±0.66 |
음성 대조군 (AGEs) | - | 100±2.37 | 100±2.92 |
양성대조군 (AG): mM | 1 | 72.71±1.09 | 49.42±0.64 |
그라비올라 잎 50% EtOH 추출물 : mg/mL |
1 | 104±1.28 | 72.05±1.1 |
5 | 75.95±0.46 | 48.32±0.15 | |
10 | 70.86±1.26 | 40.39±0.69 |
최종당화산물 (AGEs) 파쇄의 경우, PBS (pH 7.4), 알부민 (Bovine Serum Albumin; BSA), GO 또는 MGO 5 mM과 반응하여 7일간 37 ℃에서 배양한 것을 농축, 탈염관 (desalting column)으로 필터한 뒤 동결건조기를 이용하여 파우더 형태로 만들었다.
그 후, Control (1 mg/ml BSA; C), Negative control (1 mg/ml MGO-AGEs or GO-AGEs; N), Positive control (1 mg/ml MGO-AGEs or GO-AGEs + AG 1 mM; P), Sample (추출물 농도별 0.1, 0.5, 1mg/mL) 군을 24시간 incubation 시키고 2% TNBSA+4% Sodium bicarbonate를 넣고 2시간 반응 후, 10% SDS+1N HCl을 넣어 반응을 멈추고 96 웰 플레이트에 옮겨 microplate reader를 이용하여 340 nm 파장에서 측정하여 하기 표 2와 도 2의 그래프로 나타냈다.
도 2 (a)에서 그라비올라 추출물 0.1 mg/ml에서 유의한 GO-AGEs 분해 효과를 보였으며, 도 2의 (b)는 그라비올라 추출물 1 mg/ml에서 유의한 MGO-AGEs 분해 효과가 관찰되었다.
산화적 스트레스로 인하여 생성되는 최종당화산물(advanced glycation end products, AGEs)은 근감소증의 주요한 원인 중 하나로 AGEs의 생성을 효과적으로 저해 또는 분해를 증가시킨다는 점에서 그라비올라 추출물이 근감소증 완화제로 가능성이 있음을 시사한다
시료 | 처리농도 | GO-AGEs Free amine percent (%) | MGO- AGEs Free amine percent (%) |
음성 대조군 (AGEs) | - | 16.59±0.27 | 59.31±0.16 |
양성대조군 (AG): mM | 1 | 33.42±0.28 | 77.07±2.91 |
그라비올라 잎 50% EtOH 추출물 : mg/mL |
0.1 | 23.22±0.72 | 66.47±2.33 |
1 | 19.48±1.42 | 71.87±4.13 |
[실험예 2 : 그라비올라 잎 에탄올 추출물의 LPS 유도 세포독성 보호효과 측정]
그라비올라 잎 에탄올 추출물의 세포독성을 측정하기 위해 MTT-assay를 측정하였다.
RAW 264.7 세포주를 96-well plates에 4×10^4/well로 총 볼륨 100 ㎕가 되도록 분주한 뒤, 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 FBS와 1% antibiotics가 첨가되지 않은 배지에 각 시료를 농도 별(10μg/mL, 50μg/mL)로 제조한 후 세포에 30분 간 전처리 후, 100 ng/ml LPS를 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 50 ㎕의 상층액을 채취하여 그리스 반응용액(0.1 % N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride and 1 % sulfanilamide in 5 % phosphoric acid)과 1:1로 반응시키고 540 nm 흡광도를 측정하여 도 3 (a)에 나타내었다.
나머지, 50 ㎕가 들어있는 세포가 부착 된 세포는 0.5 mg/ml MTT solution을 통해서 세포독성을 관찰하였다. 이후 DMEM의 10분의 1에 해당하는 MTT용액 (5 mg/mL)을 가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
이후 암실에서 30분 동안 건조시킨 뒤 dimethyl sulfoxide (DMSO, Duksan general science, seoul, Korea)를 100 ㎕ 분주하여 잘 녹여준 뒤 570 nm에서 흡광도를 측정하여 도 3 (b)에 나타내었다.
그 결과, 그라비올라 잎 추출물은 50ug/mL의 농도에서 LPS에 의해 유도되는 세포 독성과 유의한 차이를 나타내지 않았지만, 염증의 매개인자인 NO의 생성량은 양성대조군 (20uM L-NMA)보다 우수하게 감소시켰다. 이는 그라비올라 잎의 추출물이 염증반응을 수반하는 질병의 완화제로 가능성이 있음을 시사한다.
[실험예 3 : 인슐린 저항성이 증가한 쥐에서의 그라비올라 잎 에탄올 추출물의 혈당 변화, 혈장 헤모글로빈 A1c (HbA1c) 농도, 경구 포도당 내성 검사, 혈장 인슐린 농도 및 HOMA-IR 효과 측정]
4주령 수컷 C57BL/6 쥐를 대조군으로 하여 4주령 수컷 C57BL/6 쥐를 60mg/kg B.W.으로 2회 streptozotocin (STZ) 투여와 고지방식이를 통해 인슐린 저항성이 증가된 제2형 당뇨 모델을 유도하였다.
이후 지속적으로 혈당이 250mg/dl 이상인 쥐를 제 2형 당뇨로 판정하여 실험군으로 설정하였다. 제2형 당뇨가 유도된 쥐 중 일부에 50mg/kg B.W.의 그라비올라 잎 에탄올 추출물(low dosage of Annona muricata, 이하 LAM) 및 100mg/kg B.W.의 그라비올라 잎 에탄올 추출물(high dosage of Annona muricata, 이하 HAM)을 각각 살균된 3차 증류수에 녹여 1회/일 9주간 경구 투여하였다.
매주 공복 혈당을 측정하였으며, 경구 포도당 내성 검사를 시행하였다. 또한, 혈장에서 헤모글로빈A1c(Hemoglobin A1c, 이하 HbA1c) 및 인슐린 농도를 측정하였고 인슐린 저항성 지표인 homeostatic model assessment estimated insulin resistance (HOMA-IR)을 계산하였다.
그 결과, 인슐린 저항성이 증가된 당뇨 대조군(DMC)에서 정상군(CON)에 비해 높은 혈당, HbA1c 농도를 보였다. 그러나 공복혈당을 나타낸 하기 표 3 및 도 4를 참고하면, 인슐린 저항성이 증가된 쥐에 그라비올라 잎 추출물을 처리한 결과 LAM군에서 투여 3주 이후부터 공복 혈당(Fasting Blood Glucose, FBG)에서 유의적인 혈당 감소 효과가 나타났다.
CON | DMC | LAM | HAM | |
처리 전 | 146.82±5.79 | 321.73±18.98 | 297.56±11.23 | 308.78±19.92 |
처리 후 | 146.36±4.55 | 291.64±26.97 | 235.33±7 | 282.33±20.67 |
단위: mg/dl
또한 HbA1c 농도를 나타낸 하기 표 4 및 도 5를 참고하면, 인슐린 저항성이 증가된 쥐에 그라비올라 잎 추출물을 처리한 결과 HbA1c 농도가 LAM군 및 HAM군에서 모두 정상군(CON)에 가까운 HbA1c 농도를 보였다.
CON | DMC | LAM | HAM | |
HbA1c 농도(%) | 5.01±0.07 | 5.94±0.23 | 5.25±0.17 | 5.18±0.21 |
경구 포도당 내성 측정(OGTT) 결과, 당뇨 대조군(DMC)에서 정상군(CON)에 비해 높은 포도당 내성을 보였다. 반면, 도 6을 참조하면, 공복 상태의 쥐에 경구로 포도당 수용액 2g/kg을 투여한 후 30분과 60분 경과하였을 때, 그라비올라 잎 추출물 투여군 (LAM과 HAM 모두)에서 당뇨 대조군(DMC)에 비해 유의적으로 낮은 혈당 수준을 보였다. 또한, 도 7 및 하기 표 5를 참고하면, 도 6의 그래프 아래 면적(area under the curve, AUC) 계산 결과인 도 7 및 표 5에서도 비슷한 경향을 보였다. 따라서, 그라비올라 잎 추출물을 처리한 결과 당뇨 대조군(DMC)에서 높아진 포도당 내성이 유의적으로 완화되었음을 확인하였다.
CON | DMC | LAM | HAM | |
AUC(mg/dl x min) | 22783.64±632.52 | 59448.41±1787.91 | 53017.5±2126.34 | 52435.83±3538.9 |
도 8 및 하기 표 6을 참조하면, 혈장 인슐린 농도가 인슐린 저항성이 증가된 당뇨 대조군(DMC)에서 정상군(CON)에 비해 높은 수치를 보였다. 그러나 인슐린 저항성이 증가된 쥐에 그라비올라 잎 추출물을 처리한 결과 인슐린 농도가 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.
CON | DMC | LAM | HAM | |
혈장 인슐린 농도 (μU/ml) | 10±1.23 | 22.49±5.36 | 9.52±2.68 | 14.14±3 |
도 9 및 하기 표 7을 참조하면, 인슐린 저항성이 증가된 당뇨 대조군(DMC)에서 정상군(CON)에 비해 높은 HOMA-IR 수치를 보였다. 하지만 인슐린 저항성이 증가된 쥐에 그라비올라 잎 추출물을 처리한 결과 HOMA-IR가 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.
CON | DMC | LAM | HAM | |
HOMA-IR (mmol/L x μU/ml) | 3.65±0.51 | 16.01±3.6 | 5.74±1.71 | 10.08±2.41 |
실험예 3의 결과는 상기 그라비올라 잎 추출물이 당뇨병으로 인해 높아진 혈당, 포도당 내성, 인슐린 저항성에 우수한 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.
[실험예 4 : 인슐린 저항성이 증가된 쥐에서의 그라비올라 잎 에탄올 추출물의 혈장 내 간 손상 관련 효소 농도 완화효과 측정]
정상군(CON)과 당뇨 대조군(DMC)에는 살균 3차 증류수를, 저농도(LAM)와 고농도(HAM) 각각 50mg/kg B.W., 100mg/kg B.W.의 그라비올라 잎 에탄올 추출물을 살균 3차 증류수에 녹여 1회/일 9주 동안 경구 투여한 후 쥐의 혈장에서의 간 손상 관련 효소의 농도를 측정하였다.
간 손상 관련 효소인 alanine aminotransferase (ALT) 농도를 혈장에서 측정하였다. 이 효소는 간 조직에 높은 농도로 존재하여 간 조직 손상 시 혈액으로 유출되어 수치가 증가한다.
간 손상 관련 효소 측정 결과를 도 10 및 하기 표 7에 나타냈으며, 도 10 및을 하기 표 8을 참조하면, 간 손상에 민감한 지표인 ALT가 정상군(CON)에 비해 당뇨 대조군(DMC)에서 유의적으로 높게 나타났으며 그라비올라 잎 추출물 투여군(LAM, HAM)에서 회복이 일어나며, 특히 저농도 그라비올라 잎 추출물 투여군(LAM)에서 회복이 더욱 빠르게 일어나는 것을 확인하였다.
CON | DMC | LAM | HAM | |
ALT (IU/L) | 8.54±1.34 | 41.7±14.26 | 13.69±2.43 | 23.83±5.46 |
실험예 4의 결과는 그라비올라 잎 추출물이 당뇨로 인해 증가한 간 조직 손상을 완화할 수 있는 효능을 가지고 있음을 시사한다.
[실험예 5 : 인슐린 저항성이 증가된 쥐에서의 그라비올라 잎 에탄올 추출물의 간의 조직학적 변화 확인 및 간 지질 농도 변화 측정]
정상군(CON)과 당뇨 대조군(DMC)에는 살균 3차 증류수를, 저농도(LAM)와 고농도(HAM) 각각 50mg/kg B.W., 100mg/kg B.W.의 그라비올라 잎 에탄올 추출물을 살균 3차 증류수에 녹여 1회/일 9주 동안 경구 투여한 후 쥐의 간 조직 일부를 채취하였다. 이후 그라비올라 잎 추출물의 간 손상 완화 효과를 확인하기 위해, 인슐린 저항성이 증가된 쥐의 간 지방구 축적 정도 및 간 지질 농도를 측정하였다.
채취한 간 조직을 10% 포르말린에 고정시키고 파라핀으로 포매시킨 후, 조직을 4μm 두께로 박절하여 조직 절편을 제작하였다. 이후 hematoxylin&eosin (H&E) 염색을 실시하여 조직 절편을 광학현미경으로 관찰하였다. 도 11은 광학현미경으로 관찰된 조직 절편을 나타낸 사진이며, 도 12 및 하기 표 9은 각 군의 지방구 축적을 나타낸 나타낸 것이다.
CON | DMC | LAM | HAM | |
Lipid accumulation (%) | 0.73±0.41 | 33.19±1.45 | 3.91±0.66 | 13.58±2.94 |
도 11, 도 12 및 표 9를 참조하면, 인슐린 저항성이 증가된 당뇨 대조군(DMC)에 비해 그라비올라 잎 추출물을 투여한 LAM 및 HAM 군에서 과잉 지방구의 축적이 현저히 감소함을 확인하였다.
하기 표 10과 도 13은 각 군의 간 내 지질 함량(Hepatic lipid content)을 나타낸 것이다.
CON | DMC | LAM | HAM | |
Total glyceride | 11.73±2.37 | 43.65±5.07 | 24.04±4.71 | 42.34±6.1 |
Total cholesterol | 1.37±0.12 | 1.41±0.04 | 1.25±0.04 | 1.36±0.09 |
(단위: mg/g liver weight)
표 10과 도 13을 참조하면, 간 조직에서 측정한 지질 농도에서 중성지방 농도가 당뇨대조군(DMC)에서 정상군(CON)에 비해 유의적으로 증가하였다. 간 내 중성지방 농도는 LAM군에서 당뇨대조군(DMC)에 비해 유의적으로 감소하였다.
실험예 5의 결과를 통해 그라비올라 잎 추출물의 투여가 당뇨 상태에서 과잉으로 합성된 간 조직 내 중성지방 농도를 감소시키고 비정상적인 간 지방구 축적을 저해함을 확인할 수 있다. 이는 그라비올라 잎 추출물의 투여가 인슐린 저항성의 증가로 유도된 당뇨병성 지방간으로의 이행 위험을 효과적으로 예방 및 완화할 수 있음을 시사한다.
[실험예 6 : 인슐린 저항성이 증가된 쥐에서의 그라비올라 잎 열수 추출물의 간의 조직학적 변화 확인]
정상군(CON)과 당뇨 대조군(DMC)에는 살균 3차 증류수를, 저농도와(LAM) 고농도(HAM) 각각 100mg/kg B.W., 200mg/kg B.W.의 그라비올라 잎 열수 추출물을 살균 3차 증류수에 녹여 1회/일 9주 동안 경구 투여한 후 쥐의 간 조직 일부를 채취하였다. 이후 그라비올라 잎 추출물의 간 손상 완화 효과를 확인하기 위해, 인슐린 저항성이 증가된 쥐의 간 지방구 축적 정도 및 간 지질 농도를 측정하였다.
채취한 간 조직을 10% 포르말린에 고정시키고 파라핀으로 포매시킨 후, 조직을 4μm 두께로 박절하여 조직 절편을 제작하였다. 이후 hematoxylin&eosin (H&E) 염색을 실시하여 조직 절편을 광학현미경으로 관찰하였다.
도 14는 H&E 염색을 실시하여 조직 절편을 광학현미경으로 관찰한 사진이고, 도 15는 각 군의 간 지방구 축적 정도를 나타낸 그래프이다.
그 결과, 도 14 및 도 15에서 확인할 수 있듯이, 인슐린 저항성이 증가된 당뇨 대조군(DMC)에 비해 고농도 그라비올라 잎 추출물을 투여한 HAM 군에서 과잉 지방구의 축적이 현저히 감소하였다.
[실험예 7 : 인슐린 저항성이 증가된 쥐에서 간의 그라비올라 잎 에탄올 추출물의 인슐린 신호전달 기전 및 에너지대사 관련인자 효과 측정]
정상군(CON)과 당뇨 대조군(DMC)에는 살균 3차 증류수를, 저농도와 고농도 각각 50mg/kg, 100mg/kg의 그라비올라 잎 에탄올 추출물을 살균 3차 증류수에 녹여 1회/일 9주 동안 경구 투여한 후 쥐의 간 조직 일부를 채취하였다. 이후 그라비올라 잎 추출물의 간 손상 완화 기전을 확인하고자 간 조직에서의 인슐린 신호전달 및 에너지 대사 관련 인자의 발현량을 측정하였다.
그라비올라 잎 추출물을 투여한 쥐의 간 조직 일부를 단백질 추출 키트(nuclear/cytosol fractionation kit, biovision, milpitas, CA, USA)를 이용하여 단백질을 추출하였다. 얻은 추출액을 이용하여 BCA(Bichinchominic acid assay)를 통해 샘플 내 단백질을 정량한 뒤 562 nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선과 비교하여 시료 단백질 농도를 계산하였다. 개체 당 30 μg의 단백질이 포함되도록 하는 시료를 제작한 후 웨스턴 블롯 분석(western blot assay)을 실시하였다.
구체적으로, 시료를 6 ~ 15% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에서 전기영동하여 분리한 후 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 옮겼다. 멤브레인에 3% BSA(Bovine serum albumin) 로 다른 단백질이 붙지 않도록 블록킹(blocking) 한 후 원하는 단백질에 대한 항체 IRS-1 (Cell signaling Technology, MA, USA, 1:200), pAkt, Akt, GLUT2 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, 1:200), pAMPK, AMPK (Cell signaling Technology, MA, USA, 1:1000), SIRT3 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, 1:2000), PGC1α (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, 1:200) 및 α-tubulin (Sigma Aldrich, MO, USA, 1:5000)를 차례대로 반응시켰다. ECL 용액을 반응시킨 후 ChemiDoc XRS+ imaging system을 통하여 단백질 정도에 따른 밴드의 밝기 및 굵기로 그 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 16 에서 확인할 수 있듯이, 인슐린 저항성이 증가된 당뇨 대조군(DMC)에 비해 그라비올라 잎 추출물을 투여한 LAM 및 HAM 군에서 IRS-1, pAkt/Akt, GLUT2, pAMPK/AMPK, PGC1α의 발현이 증가하였다. 특히, 저농도의 그라비올라 잎 추출물 군 (LAM) 군에서 인슐린 신호전달과 에너지대사가 확연히 증가하였다.
실험예 7의 결과를 통해 그라비올라 잎 추출물 투여가 당뇨병으로 인해 감소한 간 조직의 인슐린 신호전달체계와 에너지 대사에 관여하는 인자들의 활성을 회복시키는 역할을 함을 알 수 있다. 따라서 그라비올라 잎 추출물 투여가 당뇨병으로 인한 간 대사의 불균형을 완화하여 당뇨병성 간 손상에 우수한 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.
[실험예 8 : 인슐린 저항성이 증가된 쥐에서 그라비올라 잎 에탄올 추출물의 간의 지질 대사 및 지방구의 자가사멸(lipophagy) 기전 효과 측정]
정상군(CON)과 당뇨 대조군(DMC)에는 살균 3차 증류수를, 저농도(LAM)와 고농도(HAM) 각각 50mg/kg, 100mg/kg의 그라비올라 잎 에탄올 추출물을 살균 3차 증류수에 녹여 1회/일 9주 동안 경구 투여한 후 쥐의 간 조직 일부를 채취하였다. 이후 그라비올라 잎 추출물의 간 손상 완화 기전을 확인하고자 간 조직에서의 지질 대사 및 지방구의 자가사멸(lipophagy) 관련 인자의 발현량을 측정하였다.
구체적으로, 시료를 6 ~ 15% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에서 전기영동하여 분리한 후 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 옮겼다. 멤브레인에 3% BSA(Bovine serum albumin)로 다른 단백질이 붙지 않도록 블록킹(blocking)한 후 원하는 원하는 단백질에 대한 항체 FAS, SREBP1c, PPARα, PPARγ (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, 1:200), LC3, C/EBPα (Cell signaling Technology, MA, USA, 1:1000), CPT1A (Abcam, Cambridge, UK, 1:200), nuclear Lamin B1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, 1:200) 및 α-tubulin (Sigma Aldrich, MO, USA, 1:5000)를 차례대로 반응시켰다. ECL 용액을 반응시킨 후 ChemiDoc XRS+ imaging system을 통하여 단백질 정도에 따른 밴드의 밝기 및 굵기로 그 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 17 의 (A), (B)에서 확인할 수 있듯이, 정상군(CON)에 비해 당뇨 대조군(DMC)에서 FAS, SREBP1c, C/EBPα 및 PPARγ와 같은 지방신생합성 인자는 증가하고 CPT1A, PPARα 와 같은 지방산 β 산화 관련 인자의 발현은 감소하였다. 반면, 당뇨 대조군(DMC)에 비해 저농도 그라비올라 잎 추출물군(LAM)에서 FAS, SREBP1c, C/EBPα, PPARγ 와 같은 지방신생합성 인자는 감소하고 CPT1A, PPARα 와 같은 지방산 β 산화 관련 인자의 발현은 증가하였다.
간의 과도한 지방구 축적을 저해하는 지방구의 자가사멸 과정(lipophagy)의 활성은 당뇨 대조군(DMC)에서 정상군(CON)에 비해 감소하였다. 그러나 도 17의(C)에서 확인할 수 있듯이, 그라비올라 잎 추출물 투여에 의해 LAM 및 HAM 군 모두에서 당뇨 대조군(DMC)에 비해 관련 인자의 활성이 증가함을 확인하였다.
당뇨 상태에서의 지질대사 불균형은 간 조직에서의 과도한 중성지방 합성을 증가시키고 지방산 분해는 감소시켜 앞선 실험예 5에서과 같이 간 조직의 과도한 중성지방 및 지방구 축적을 초래한다. 더하여, 간 조직의 지방구가 당뇨로 인해 감소된 지방구의 자가사멸 과정(lipophagy) 활성으로 제거되지 못하면서 과잉으로 축적되고 간 손상을 가속화시킨다. 그러나 상기 결과를 통해 특히 저농도 그라비올라 잎 추출물 투여군(LAM)에서 당뇨로 인한 간 지질대사 불균형이 정상화 되었음을 확인하였다. 위 결과는 앞선 실험예 5의 결과와도 같은 경향을 나타내어 그라비올라 잎 추출물이 당뇨상태에서 효과적으로 지질 대사를 조절할 수 있음을 보인다.
실험예 8의 결과는 그라비올라 잎 추출물이 간 지질 대사에 관여하는 인자들의 활성을 회복시킴으로써, 인슐린 저항성 증가로 인한 간 손상을 완화시키는 우수한 효과를 가짐을 시사한다.
[실험예 9 : 인슐린 저항성이 증가된 쥐에서 그라비올라 잎 에탄올 추출물의 간의 산화적 스트레스 완화 효과 측정]
정상군(CON)과 당뇨 대조군(DMC)에는 살균 3차 증류수를, 저농도(LAM)와 고농도(HAM) 각각 50mg/kg, 100mg/kg의 그라비올라 잎 에탄올 추출물을 살균 3차 증류수에 녹여 1회/일 9주 동안 경구 투여한 후 쥐의 간 조직 일부를 채취하였다. 이후 그라비올라 잎 추출물의 간 손상 완화 기전을 확인하고자 간 조직에서의 산화적 스트레스 관련 인자의 발현량을 측정하였다.
그라비올라 잎 추출물을 투여한 쥐의 간 조직 일부를 단백질 추출 키트(nuclear/cytosol fractionation kit, biovision, milpitas, CA, USA)를 이용하여 단백질을 추출하였다. 얻은 추출액을 이용하여 BCA(Bichinchominic acid assay)를 통해 샘플 내 단백질을 정량한 뒤 562 nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선과 비교하여 시료 단백질 농도를 계산하였다. 개체 당 30 μg의 단백질이 포함되도록 하는 시료를 제작한 후 웨스턴 블롯 분석(western blot assay)을 실시하였다.
구체적으로, 시료를 6 ~ 15% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에서 전기영동하여 분리한 후 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 옮겼다. 멤브레인에 3% BSA(Bovine serum albumin)로 다른 단백질이 붙지 않도록 블록킹(blocking) 한 후 원하는 단백질 assay kit인 4-HNE (BD Biosciences, NJ, USA), protein carbonyls (Abcam, Cambridge, UK) 혹은 원하는 단백질에 대한 항체 nuclear Nrf2 (Cell signaling Technology, MA, USA, 1:1000), nuclear Lamin B1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, 1:200), NQO1 (Abcam, Cambridge, UK, 1:1000) 및 α-tubulin (Sigma Aldrich, MO, USA, 1:5000)를 차례대로 반응시켰다. ECL 용액을 반응시킨 후 ChemiDoc XRS+ imaging system을 통하여 단백질 정도에 따른 밴드의 밝기 및 굵기로 그 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 18에서 확인할 수 있듯이, 당뇨 대조군(DMC)에 비해 그라비올라 잎 추출물을 투여한 LAM 및 HAM 군에서 4-HNE, protein carbonyls, Nrf2, NQO1의 발현이 유의적으로 감소하였다. 특히 저농도 그라비올라 잎 추출물 투여군(LAM)에서 당뇨로 인해 증가한 간 조직의 산화적 스트레스가 현저히 완화되었음을 확인하였다.
실험예 9의 결과는 그라비올라 잎 추출물이 인슐린 저항성 증가로 인한 간 조직의 산화적 스트레스를 완화시킴으로써 관련 인자의 활성이 저하되었음을 시사한다.
[실험예 10 : 인슐린 저항성이 증가된 쥐에서의 그라비올라 잎 에탄올 추출물의 근육의 조직학적 변화 확인]
정상군(CON)과 당뇨 대조군(DMC)에는 살균 3차 증류수를, 저농도(LAM)와 고농도(HAM) 각각 50mg/kg, 100mg/kg의 그라비올라 잎 에탄올 추출물을 살균 3차 증류수에 녹여 1회/일 9주 동안 경구 투여한 후 쥐의 간 조직 일부를 채취하였다. 이후 그라비올라 잎 추출물의 근육 손상 완화 효과를 확인하기 위해, 인슐린 저항성이 증가된 쥐의 근육 단면적을 측정하였다.
채취한 근육 조직을 10% 포르말린에 고정시키고 파라핀으로 포매시킨 후, 조직을 4μm 두께로 박절하여 조직 절편을 제작하였다. 이후 hematoxylin&eosin (H&E) 염색을 실시하여 조직 절편을 광학현미경으로 관찰한 결과를 도 19 내지 도 20에 나타냈다.
그 결과, 도 19 내지 도 20에서 알 수 있듯이, 인슐린 저항성이 증가된 당뇨 대조군(DMC)에서 근섬유 크기가 감소하였으며, 이에 비해 그라비올라 잎 추출물을 투여한 LAM 및 HAM 군의 근섬유 크기가 회복되었다.
상기 결과를 통해 그라비올라 잎 추출물의 투여가 대사 불균형으로 유도된 근육조직의 근섬유 크기 감소를 정상화시키는 것을 확인할 수 있다. 이는 그라비올라 잎 추출물의 투여가 근감소증으로의 이행 위험을 효과적으로 예방 및 완화할 수 있음을 시사한다.
[실험예 11 : 인슐린 저항성이 증가된 쥐에서의 그라비올라 잎 열수 추출물의 근육의 조직학적 변화 확인]
정상군(CON)과 당뇨 대조군(DMC)에는 살균 3차 증류수를, 저농도(LAM)와 고농도(HAM) 각각 50mg/kg, 100mg/kg의 그라비올라 잎 열수 추출물을 살균 3차 증류수에 녹여 1회/일 9주 동안 경구 투여한 후 쥐의 간 조직 일부를 채취하였다. 이후 그라비올라 잎 추출물의 근육 손상 완화 효과를 확인하기 위해, 인슐린 저항성이 증가된 쥐의 근육 단면적을 측정하였다.
채취한 근육 조직을 10% 포르말린에 고정시키고 파라핀으로 포매시킨 후, 조직을 4μm 두께로 박절하여 조직 절편을 제작하였다. 이후 hematoxylin&eosin (H&E) 염색을 실시하여 조직 절편을 광학현미경으로 관찰한 결과를 도 21 내지 도 22에 나타냈다..
그 결과, 도 21 내지 도 22에서 확인할 수 있듯이, 인슐린 저항성이 증가된 당뇨 대조군(DMC)에서 근섬유 크기가 감소하였으며, 이에 비해 저농도 그라비올라 잎 추출물을 투여한 LAM 군의 근섬유 크기가 회복되었다.
상기 결과를 통해 그라비올라 잎 추출물의 투여가 대사 불균형으로 유도된 근육조직의 근섬유 크기 감소를 정상화시키는 것을 확인할 수 있다. 이는 그라비올라 잎 추출물의 투여가 근감소증으로의 이행 위험을 효과적으로 예방 및 완화할 수 있음을 시사한다.
[실험예 12 : 인슐린 저항성이 증가된 쥐에서 그라비올라 잎 에탄올 추출물의 근육의 인슐린 신호전달 관련인자 정상화 효과 측정]
정상군(CON)과 당뇨 대조군(DMC)에는 살균 3차 증류수를, 저농도(LAM)와 고농도(HAM) 각각 50mg/kg, 100mg/kg의 그라비올라 잎 에탄올 추출물을 살균 3차 증류수에 녹여 1회/일 9주 동안 경구 투여한 후 쥐의 간 조직 일부를 채취하였다. 이후 그라비올라 잎 추출물의 근육 손상 완화 기전을 확인하고자 근육조직의 인슐린 신호전달 기전 관련 인자의 발현량을 측정하였다.
그라비올라 잎 추출물을 투여한 쥐의 근육 조직 일부를 단백질 추출 키트(nuclear/cytosol fractionation kit, biovision, milpitas, CA, USA)를 이용하여 단백질을 추출하였다. 얻은 추출액을 이용하여 BCA(Bichinchominic acid assay)를 통해 샘플 내 단백질을 정량한 뒤 562 nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선과 비교하여 시료 단백질 농도를 계산하였다. 개체 당 30 μg의 단백질이 포함되도록 하는 시료를 제작한 후 웨스턴 블롯 분석(western blot assay)를 실시하였다.
구체적으로, 시료를 6 ~ 15% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에서 전기영동하여 분리한 후 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 옮겼다. 멤브레인에 3% BSA(Bovine serum albumin)로 다른 단백질이 붙지 않도록 블록킹(blocking) 한 후 원하는 원하는 단백질에 대한 항체 IRS-1, pAkt, Akt, GLUT4 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, 1:200), α-tubulin (Sigma Aldrich, MO, USA, 1:5000)를 차례대로 반응시켰다. ECL 용액을 반응시킨 후 ChemiDoc XRS+ imaging system을 통하여 단백질 정도에 따른 밴드의 밝기 및 굵기로 그 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 23에서 알 수 있듯이, 정상군(CON)에 비해 당뇨 대조군(DMC)에서 pAkt, GLUT4 와 같은 인슐린 신호전달 관련 인자의 발현이 감소하였다. 반면 당뇨 대조군(DMC)에 비해 그라비올라 잎 추출물군(LAM, HAM)에서 이들의 발현이 증가하였다.
실험예 12의 결과는 그라비올라 잎 추출물이 근육의 인슐린 대사에 관여하는 인자들의 활성을 회복시킴으로써, 인슐린 저항성 증가로 인한 근육 손상을 완화시키는 우수한 효과를 가짐을 시사한다.
[실험예 13 : 인슐린 저항성이 증가된 쥐에서 그라비올라 잎 에탄올 추출물의 근육의 유비퀴틴 단백질분해 완화 효과 측정]
정상군(CON)과 당뇨 대조군(DMC)에는 살균 3차 증류수를, 저농도(LAM)와 고농도(HAM) 각각 50mg/kg, 100mg/kg의 그라비올라 잎 에탄올 추출물을 살균 3차 증류수에 녹여 1회/일 9주 동안 경구 투여한 후 쥐의 근육 조직 일부를 채취하였다. 이후 그라비올라 잎 추출물의 근육 손상 완화 기전을 확인하고자 근육조직에서 유비퀴틴 단백질 분해 관련 인자의 발현량을 측정하였다.
그라비올라 잎 추출물을 투여한 쥐의 근육 조직 일부를 단백질 추출 키트(nuclear/cytosol fractionation kit, biovision, milpitas, CA, USA)를 이용하여 단백질을 추출하였다. 얻은 추출액을 이용하여 BCA(Bichinchominic acid assay)를 통해 샘플 내 단백질을 정량한 뒤 562 nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선과 비교하여 시료 단백질 농도를 계산하였다. 개체 당 30 μg의 단백질이 포함되도록 하는 시료를 제작한 후 웨스턴 블롯 분석(western blot assay)을 실시하였다.
구체적으로, 시료를 6 ~ 15% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에서 전기영동하여 분리한 후 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 옮겼다. 멤브레인에 3% BSA(Bovine serum albumin)로 다른 단백질이 붙지 않도록 블록킹(blocking) 한 후 원하는 원하는 단백질에 대한 항체 Foxo3a, Atrogin-1, Mulrf1 (Cell signaling Technology, MA, USA, 1:1000), PCNA (Abcam, Cambridge, UK, 1:2000), α-tubulin (Sigma Aldrich, MO, USA, 1:5000)를 차례대로 반응시켰다. ECL 용액을 반응시킨 후 ChemiDoc XRS+ imaging system을 통하여 단백질 정도에 따른 밴드의 밝기 및 굵기로 그 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 24에서 확인할 수 있듯이, 정상군(CON)에 비해 당뇨 대조군(DMC)에서 Foxo3a, Atorgin-1, Mulrf-1의 발현이 증가하여 근육 조직의 단백질 분해가 증가하였다. 반면, 그라비올라 잎 추출물 투여군에서 Foxo3a 및 Atorgin-1, Mulrf-1의 발현은 감소하였다.
실험예 13의 결과는 그라비올라 잎 추출물이 근육의 유비퀴틴 단백질 분해기전에 관여하는 인자들의 활성을 저하시킴으로써, 단백질 분해 증가로 인한 근육 손상을 완화시키는 우수한 효과를 가짐을 시사한다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
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- 그라비올라(graviola) 잎 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는, 근감소증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 그라비올라(graviola) 잎 에탄올 추출물의 유효 투여용량이 10 내지 500 mg/kg bw/day인, 근감소증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 그라비올라(graviola) 잎 에탄올 추출물의 유효 투여용량이 10 내지 80 mg/kg bw/day인, 근감소증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 그라비올라 잎 에탄올 추출물은 그라비올라 잎을 50% 에탄올을 사용하여 추출한 것인, 근감소증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 그라비올라(graviola) 잎 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는, 근감소증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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CN111904988A (zh) | 2020-09-23 | 2020-11-10 | 海南医学院 | 一种刺果番荔枝果提取物在制备抗糖尿病的药物或保健品中的应用 |
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CN111904988A (zh) | 2020-09-23 | 2020-11-10 | 海南医学院 | 一种刺果番荔枝果提取物在制备抗糖尿病的药物或保健品中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
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Diabetes & metabolism, 2005, 31, 5S20-5S26* |
Folia biologica, 2019, 65(5/6), 275-284* |
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