KR20150137314A - 봉독, 멜리틴 또는 아파민 성분을 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 신장질환 예방 또는 개선용 식품조성물에 관한 것이다. 본 발명의 상기 조성물을 사용하는 경우, 신섬유화를 억제함으로써 만성신장질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

봉독, 멜리틴 또는 아파민 성분을 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING BEE VENOM, MELITTIN OR APAMIN FOR PREVENTION OR TREATMENT OF KIDNEY DISEASE}

본 발명은 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

봉독(Bee Venom, 蜂毒)은 꿀벌의 산란관에서 나오는 독액으로서, 비중이 1.3, pH가 5.2, 쓴맛이 있고, 약한 방향성이 있다. 실온에서 증발시키면 약 30%의 건조물이 남으며 그 성분은 복잡하다. 봉독의 성분은 75%가 단백질이며, 그 주요 성분으로는 칼륨, 나트륨, 마그네슘, 인, 알라닌, 발린, 아르기닌, 트립토판, 메티오닌 및 히스티딘 등 다양한 물질이 함유되어 있다. 상기 봉독은 지금까지 류머티즘성 관절염을 조절하고 항암, 항염증(anti-inflammatory) 및 항통각(antinociceptive)의 효능을 가지는 것으로 알려져 있다. 봉독의 효능은 옛날부터 많이 알려져 왔다. 기원전 4세기경 히포크라테스가 사용했다는 기록이 있으며, 꿀벌의 뱃속에 있는 액은 사람에게 좋은 약으로 소개되고 있다. 우리나라에도 옛날부터 민간요법의 일종으로 벌침을 치료에 응용해 왔다. 봉독은 벌이 가진 독을 말하는 것으로 인체에 무해한 성분을 추출해내어 통증부위나 침을 놓는 경혈자리에 주입하여 인체의 면역력을 강화시켜 염증이나 이물질에 대해 스스로 이겨낼 수 있게끔 만드는 치료요법으로 사용되고 있다. 봉독의 주성분은 단백질의 일종인 멜리틴(melittin), 아파민(apamin), 아돌라핀(adolapin) 및 비반 세포 과립 감소 펩티드(mast cell degranulation peptide; MCD-peptide) 등으로 구성되어 있다. 봉독은 일단 몸속으로 들어가면 대사 작용을 활발히 하고, 면역작용을 극대화시켜 외부로부터 침입한 세균을 이겨낸다. 그러나 봉독의 주 약리작용인 면역기능의 활성화에 대한 정확한 기전은 아직 밝혀지지 않고 있다. 전통적으로 봉독을 가장 많이 응용해온 질환은 관절염, 결체조직과 기타 염증, 동통성 질환이다. 류마티스염, 급만성 관절염, 경추, 요추간판 탈충증, 척추관협착증, 섬유근통, 산후풍, 오십견, 만성염증등에 응용이 활발하다. 특히, 봉독의 항염 작용은 iNOS와 COX-2의 발현뿐만 아니라 TNF-a, NF-B의 활성을 억제하고, 프로스타글라딘 E2(prostagladin E2)의 생성을 억제한다는 연구결과들이 다수 보고되고 있다. 최근 서구에서는 다발성 경화증에 봉약침을 응용하려는 시도가 이어지고 있는데, 치료 후 몸이 가벼워지고 근육의 운동성이 좋아졌다는 사례들이 있다. 브라질에서는 천식에 봉약침을 사용하교 있고, 중국에서는 근골격 질환 등의 치료에 사용되고 있다.

한편, 만성　신질환(chronic kidney disease: CKD)은 심혈관 질환 발병율과 사망률이 연령대조군 보다 10배 이상 높은 심각한 질환으로, 최근 들어 이 질환을 겪는 환자가 기하급수적으로 증가하고 있다(비특허문헌 1).

만성 신질환은 epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) 및 세포외기질 (extracellular matrix: ECM) 단백의 축적을 특징으로 하고, 대표적인 병리학적 소견으로는 사구체 모세혈관 기저막의 비후, 혈관간질의 확장, 세뇨관 간질의　섬유화, 사구체 및 신장의 비대 그리고 단백뇨 등이 있다. 신장 조직 섬유화에 관련되는 인자로서 전환성장인자(transforming growth factor-β1: TGF-β1)는 다양한 자극에 의한 세포외기질 단백의 생산의 최종 매개인자로서 섬유화의 지표로 인식되고 있다(비특허문헌 2). 한편 만성　신질환　중 하나인 당뇨병성 신증(diabetic kidney disease: DKD)은 만성신부전증(end-stage renal disease: ESRD)을 유발하는 가장 흔한 원인이다(비특허문헌 3). 당뇨병성 신증을 비롯한 만성 신질환이 만성신부전증으로 진행되는 것을 억제하기 위하여 현재까지 알려진 치료 방법은 철저한 혈압 조절, 레닌안지오텐신계(renin-angiotensin system: RAS) 차단제의 사용이 시행되고 있으나 여전히 완벽한 신 보호효과를 지닌 치료제 개발이 절실한 실정이다(비특허문헌 4).

이에, 본 발명자들은 본 발명의 봉독, 멜리틴 또는 아파민이 신장　섬유화　억제 효과가 있음을 발견하였으며 이들이 신장질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-0758814　호

1. Schieppati A, Remuzzi G: Chronic renal diseases as a public health problem: epidemiology, social, and economic implications. Kidney Int Suppl. 98:S7-S10, 2005(1) 2. Qian Y, Feldman E, Pennathur S, Kretzler M, Brosius FC 3rd: From fibrosis to sclerosis: mechanisms of glomerulosclerosis in diabetic nephropathy. Diabetes. 57: 1439-45, 2008 3. U.S. Renal Data System, USRDS 2011 Annual Data Report: Atlas of End-Stage Renal Disease in the United States, National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, Bethesda, MD, 2011 4. Zhang MZ, Wang S, Yang S, Yang H, Fan X, Takahashi T, Harris RC: The Role of Blood Pressure and the Renin-Angiotensin System in Development of Diabetic Nephropathy (DN) in eNOS-/- db/db Mice. Am J Physiol Renal Physiol. Epub ahead of print, 2011

본 발명의 목적은 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 신장질환 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 신장질환 예방 및/또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "봉독(bee venom; BV)"은 꿀벌(Apis mellifera)의 복부에서 생성되는 산성 및 염기성 분비물의 혼합물로서 무색의 쓴 액체형태를 띠며, 그 주된 성분은 펩타이드인 멜리틴(melittin), 아파민(apamin), 및 비만세포 탈과립화(mast cell degranulating; MCD) 펩타이드 및 효소인 포스포리파아제 A2(phospholipase A2; PLA2) 등이며, 이외 여러 가지 미량의 성분을 포함한다. 본 발명의 구체예에서, 국내산 양봉산물로부터 분리한 주요 성분을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 용어, “멜리틴” 및 “아파민”은 상기 봉독으로부터 분리한 주요 성분을 말한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 신장질환의 증상을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 신장질환 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 상기 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 신장질환은 당뇨병성 신증, 고혈압성 신증, 사구체 신염, 신우 신염, 간질성 신염, 루프스 신장염, 다낭성 신장질환 및 신부전증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상일 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 멜리틴 또는 아파민은 꿀벌 유래 봉독에서 분리되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 국내산 꿀벌 유래 봉독에서 분리된 것일 수 있다.

본 발명에서 사용한 국내산 꿀벌(Apis mellifera)의 봉독은 전기충격법을 이용한 봉독 채집장치를 이용하여 꿀벌의 피해 없이 순수한 봉독만을 다량으로 채취하여, 이물질을 제거한 후 동결 건조하여 정제 봉독을 얻을 수 있다. 상기 봉독은 꿀벌의 산란관에서 나오는 독액으로서, 생봉독, 건조봉독, 봉독추출물 및 봉독, 멜리틴 또는 아파민을 포함하는 것이다. 봉독에는 멜리틴(Melittin), 아파민(Apamin), 비만세포 과립감소 펩티드(MCD-Peptide, Mast Cell Degranulation Peptide, Op), 단백효소 억제제(Protease Inhibitor), 세카르핀(Secarpin), 터치아핀(Tertiapin), 프로카민(Procamine) 등 다양한 펩타이드를 함유하고 있는 것으로 알려져있다. 생봉독은 건조 또는 정제과정을 거치지 않은 것으로서 비중이 1.1 내지 1.3이고, 산도(pH)가 5.2 내지 5.5 범위이며, 70~80중량%는 단백질 또는 펩타이드로 이루어진다. 봉독 추출물은 당 업계에 공지된 다양한 추출방법을 이용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 물, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 이러한 저급알코올과 물과의 혼합용매, 아세톤, 에틸 아세테이트, 부틸렌글리콜을 추출용매로 하여 얻을 수 있다. 보다 바람직하게는 봉독을 물로 현탁하고, 에틸 아세테이트를 용매로 수회 추출하여 분리된 수층을 다시 부탄올(butanol)로 추출하며, 각 층을 감압 농축하여 얻는 것이다. 봉독, 멜리틴 또는 아파민은 상술한 추출용매에 의한 추출물 이외에 통상적인 정제 과정을 거쳐 얻거나, 다양한 추출방법 및 정제방법을 이용하여 얻을 수 있으며, 가장 바람직하게는 대한민국 등록 특허 제10-0758814에 기재된 봉독 정제방법을 통해 얻을 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체예에서, 상기 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유효성분은, 이에 제한되는 것은 아니나, 0.001 내지 1.0 mg/kg의 농도로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 봉독 및 멜리틴의 경우 0.05 내지 0.15 mg/kg, 가장 바람직하게는 0.1 mg/kg로 포함될 수 있다. 아파민의 경우 0.01 내지 0.1 mg/kg, 가장 바람직하게는 0.05 mg/kg로 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 만성　신질환(chronic kidney disease: CKD)을 예방 및/또는 치료하는 효과를 제공하는데, 만성 신질환은 EMT (epithelial-to-mesenchymal transition) 및 세포외기질 (extracellular matrix: ECM) 단백의 축적을 특징으로 하고, 대표적인 병리학적 소견으로는 사구체 모세혈관 기저막의 비후, 혈관간질의 확장, 세뇨관 간질의　섬유화, 사구체 및 신장의 비대 그리고 단백뇨 등이 있다. 신장 조직 섬유화에 관련되는 인자로서 전환성장인자(transforming growth factor-β1: TGF-β1)는 다양한 자극에 의한 세포외기질 단백의 생산의 최종 매개인자로서 섬유화의 지표로 인식되고 있다.

본 발명의 구체예에서, 봉독, 멜리틴 또는 아파민은 신섬유화 유발 사이토카인(Cytokine) 및 신섬유화 인자의 발현을 억제할 수 있다. 상기 신섬유화 유발 사이토카인은 바람직하게는 신섬유화 과정에서 발생하는 염증성 사이토카인일 수 있으며, 보다 바람직하게는 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha) 일 수 있다. 상기 신섬유화 인자는 신섬유화 과정에서 발생하는 TGF-β1(Transforming growth factor beta 1)일 수 있다. 또한 본 발명의 상기 조성물은 신섬유화 과정 중 발생하는 세포외기질 중 하나인 콜라겐 Ⅰ형(Collangen type 1)의 발현을 억제할 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 동물모델에 편측성 요관 폐색(unilateral ureteral obstruction, UUO)을 유도하고, 본 발명의 봉독, 멜리틴, 아파민을 처리하였을 때, 신섬유화에 과정에서 증가된 염증성 사이토카인인 TNF-α와 섬유화 관련 성장인자인 TGF-β1의 발현이 유의하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(도 1). 특히, 봉독과 멜리틴의 유효한 농도는 0.1 ㎎/㎏이며, 아파민은 0.05㎎/㎏의 농도에서 가장 효과가 있음을 알 수 있었다.

또한 본 발명의 구체예에서, 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 통해 신장조직의 형태학적 변화를 관찰한 결과, 편측성 요관 폐색(UUO)을 유도한 신조직은 세뇨관 간질 조직의 확장과 함께 단핵세포들의 침윤을 관찰할 수 있었으며, 세뇨관 간질의 염증세포 침윤과 더불어 경한 세뇨관 위축 및 간질의 섬유화가 관찰되었다. 이에 반해, 봉독, 멜리틴, 아파민을 투여한 실험군의 신장에서는 염증세포의 침윤정도, 섬유화 및 세뇨관 위축정도가 정상대조군의 조직학적 형태와 유사함을 관찰할 수 있었다(도 2).

또한 본 발명의 구체예에서, 편측성 요관 폐색(UUO)이 유도된 신섬유화 과정에서 봉독, 멜리틴, 아파민의 효능을 확인하기 위하여 마손 트리크롬(Masson’s Trichrome) 염색을 시행하였다. 그 결과 편측성 요관 폐색(UUO)으로 인해 증가된 콜라겐 Ⅰ형(collaen type 1)의 발현은 봉독, 멜리틴, 아파민 투여 시 효과적으로 억제됨을 확인할 수 있었다(도 3).

따라서 본 발명에 따른 봉독, 멜리틴 또는 아파민은 만성신장질환의 주요 원인인 신섬유화 예방 및/또는 치료에 이용할 수 있는 우수한 조성물임을 알 수 있다.

본 발명의 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 약학조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19thed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태, 바람직하게는 현탁제, 동결건조제제, 비수성 주사제, 또는 수성 주사용액의 형태, 보다 더 바람직하게는 멸균 주사용액제제로 제형화하여 사용될 수 있으며, 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 당업계에서 통상적으로 사용하는 용제, 용해보조제, 완충제, 등장화제, 안정제, 항산화제, 무통화제, 현탁화제 등을 사용하여 조제가능하며, 상기 용제, 첨가제 및 희석제로는 멸균증류수, 생리식염수, pH 조절제, 알부민, 염화나트륨, 만니톨, 링겔주사액, 포도당 등을 들 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 또는 그 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 개체에 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용), 경구 투여하거나 피하 주입 또는 피부를 통한 국소 투여(경피 투여) 또는 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피내, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사를 통할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001 ~ 100 mg/kg(체중)이 바람직하고, 0.01 ~ 10 mg/kg(체중)이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 그러나, 가장 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 약학조성물은 1일 8 마이크로그램 내지 5 밀리그램, 바람직하게는 8 마이크로그램 내지 2 밀리그램, 보다 바람직하게는 16 마이크로그램 내지 1 밀리그램의 투여량으로, 바람직하기로는 주사제, 보다 더 바람직하기로는 근육내 주사법으로 투여하는 것이 바람직할 것이다. 투여 회수는 1일 1회, 1일 수회, 2일 내지 1주일간 1회 등으로 투여가능하나, 그 투여횟수에는 그 제한이 없다. 상기 투여량, 투여횟수 및 투여방법은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 약학조성물은 염증성 피부 질환 또는 알러지성 피부 질환의 예방 및/또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 약학조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제, 코팅제 또는 필터충진제의 제조에 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 신장질환 예방 및/또는 개선용 식품조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다. 본 발명의 식품조성물에서 포함할 수 있는 필수 성분으로서 상기 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 식품조성물 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 식품보조첨가제를 추가로 첨가할 수도 있는바 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품보조첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 식품조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 식품조성물은 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다. 또한, 본 발명은 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물로 제공될 수도 있다. 본 발명에 따른 화장료 조성물에는 pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조방법으로 화장수, 젤, 수용성 파우더, 지용성 파우더, 수용성 리퀴드, 크림 또는 에센스 등으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 점안제 또는 접안제 및 피하주사제로 제조하여 이를 생체에 접종할 수 있고, 점안제나 주사제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물은 신섬유화를 억제함으로써 신장질환을 예방 및/또는 치료할 수 있는 효과를 제공한다. 또한 국내산 양봉산물의 주요 성분인 봉독, 멜리틴, 아파민을 사용하는바 국내 양봉농가의 소득원을 창출할 수 있으며, 천연물 신약으로서의 봉독, 멜리틴 및 아파민의 효용가치를 극대화할 수 있다.

도 1 은 본 발명의 구체예에 따른 봉독(BV), 멜리틴(Melittin), 아파민(Apamin)이 신섬유화 과정에서 발생하는 염증성 사이토카인인 TNF-α와 섬유화 관련 인자인 TGF-β1의 발현변화에 미치는 영향을 나타낸 웨스턴 블롯 밴드이다(0.01: 0.01 mg/kg 처리군; 0.05: 0.05 mg/kg 처리군; 0.1: 0.1 mg/kg 처리군; NC: 무처리군; UUO: 편측성 요관 폐색 유도군; 1, 2, 3: 각각 동물 실험군 1, 2, 3).
도 2는 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 통해 편측성 요관 폐색(UUO)이 유도된 동물모델에서 봉독, 멜리틴, 아파민이 신섬유화에서 미치는 영향을 신장조직의 형태학적 변화를 통해 관찰한 도이다(NC: 정상대조군(Normal control); UUO: UUO수술을 시행한 대조군; UUO+BV: UUO 수술 시행 후 봉독 투여 실험군; UUO+Mel: UUO 수술 시행 후 멜리틴 투여 실험군; UUO+Apa: UUO 수술 시행 후 아파민 투여 실험군).
도 3은 봉독, 멜리틴, 아파민이 편측성 요관 폐색(UUO)이 유도된 신섬유화 신장조직에서 발생하는 콜라겐 Ⅰ형 (collagen type 1)의 발현에 미치는 영향을 마손트리크롬 (Masson’s Trichrome) 염색으로 확인한 도이다(NC: 정상대조군(Normal control); UUO: UUO수술을 시행한 대조군; UUO+BV: UUO 수술 시행 후 봉독 투여 실험군; UUO+Mel: UUO 수술 시행 후 멜리틴 투여 실험군; UUO+Apa: UUO 수술 시행 후 아파민 투여 실험군).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 봉독 , 멜라틴 및 아파민의 만성신질환 억제 효과

실시예 1-1. 동물모델 제작 및 실험군 설정

신섬유화 실험을 위한 동물모델은 편측성 요관 폐색(UUO) 동물로써 수컷 Balb/b 마우스를 이용하였다. 마우스 좌측 신장의 요관을 5-0 실크 봉합사를 이용하여 상하로 결찰 시켰다. 수술 직후 봉독과 멜리틴, 아파민을 0.01, 0.05, 0.1 ㎎/㎏의 농도로 각각 신장 주위로 도포하였으며, 수술 3일 후 봉독, 멜리틴, 아파민을 0.01, 0.05, 0.1 ㎎/㎏의 농도로 각각 복강 주사하였다. 수술 직후 상기 봉독, 멜리틴, 아파민을 처리한 이유는 수술 부위의 상처가 빠르게 치유하게 하기 위해서이며, 수술 3일 후 처리는 신섬유화 방지효과를 확인하기 위한 것이다. 수술 7일 후 신장을 적출하여, 신장의 변화 양상을 관찰하였다.

실험군은 정상대조군(Normal control, NC), UUO수술을 시행한 대조군(UUO), UUO수술 시행 후 봉독과 멜리틴, 아파민을 0.01, 0.05, 0.1 ㎎/㎏의 농도로 투여한 실험군으로 구분하여 시험하였다.

실시예 1-2. 단백질의 분리 및 웨스턴 블롯 분석

분리한 간세포는 IPH 용리 완충액(50 mM pH 8.0 Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% NP-40, 100 mM PMSF, 1 mg/mL 류펩틴, 1 mg/mL 아프로티닌 및 1 M DTT)를 첨가한 후, 4˚C에서 30분 동안 반응시키고 12,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리 후 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질을 브래드포드법(Bradford)법(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)으로 정량하였으며, 정량한 단백질은 SDS-PAGE로 전기영동하고 PVDF 멤브레인(Milipore, USA)에 옮겼다. 멤브레인은 일차 항체 항-TNF-α, 항-TGF-β와 반응시키고 TBS-T로 15분간 2회 세척 후 멤브레인을 2차 항체로 2시간 반응시켰다. 항체들에 대한 발현 분석은 HRP(horseradish peroxidase-linked) 이차항체에 의해 발현되는 ECL 웨스턴 블롯 분석(enhanced chemiluminescence Western Blot Analysis (Amersham, NJ, USA) 시스템을 이용하였으며 X-ray 필름에 현상하여 비교 분석 하였다.

그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 UUO로 유도된 마우스의 신섬유화에 과정에서, 증가된 염증성 사이토카인인 TNF-α와 섬유화 관련 성장인자인 TGF-β1의 발현은 봉독, 멜리틴, 아파민을 처리한 후 유의하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 특히, 봉독과 멜리틴의 유효한 농도는 0.1 ㎎/㎏이며, 아파민은 0.05㎎/㎏의 농도에서 가장 효과가 있었다. 이러한 결과를 토대로 봉독, 멜리틴, 아파민의 적정농도를 결정하고 각 유효농도대로 다음 실험을 수행하였다.

실시예 1-3. 헤마톡실린&에오신 ( Hematoxylin & Eosin , H&E) 염색

실험군 사이의 염증성 침윤 정도를 평가하기 위해 H&E 염색을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다. 적출된 신장 조직을 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정하고 흐르는 물에 수세한 다음, 탈수(에탄올 70%, 80%, 95%, 100%), xylene으로 투명, 파라핀 침투과정을 거쳐 포매하고 마이크로톰(microtome)을 이용하여 4μm 두께의 박절편을 제작하여, 자일렌(xylene)에 탈 파라핀(paraffin)한 후, 함수 과정을 거처, 흐르는 물에 수세하였다. 해리스 헤마톡실린(Harris hematoxylin) 용액에 옮겨 5분간 핵을 염색한 후 흐르는 물에 수세하고 1% HCl-알코올 용액으로 3회 침적 후 충분히 수세하여 1% 암모니아 용액으로 청색화 하며 Eosin 용액에 3분간 세포질을 염색한 후 80% 에탄올로 이동하여, 95%, 95%, 100%, 100% 에탄올을 사용하여 탈수시켰다. 청명 과정을 거친 후 캐나다 발삼(Canada balsam)으로 봉입 후 현미경 검경하였다.

H&E 염색을 통해 신장조직의 형태학적 변화를 관찰한 결과(도 2), UUO를 시행한 신조직은 세뇨관 간질 조직의 확장과 함께 단핵세포들의 침윤을 관찰할 수 있었으며, 세뇨관 간질의 염증세포 침윤과 더불어 강한 세뇨관 위축 및 간질의 섬유화가 관찰되었다. 이에 반해, 봉독, 멜리틴, 아파민을 투여한 실험군의 신장에서는 염증세포의 침윤정도, 섬유화 및 세뇨관 위축정도가 정상대조군의 조직학적 형태와 유사함을 관찰할 수 있었다.

실시예 1-4. 마손 트리크롬 ( Masson ’s Trichrome ) 염색

병변 부위 섬유화 정도를 확인하기 위해 마손 트리크롬(Masson’s Trichrome) 염색을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다. 4μm 두께의 박절편을 제작하여 탈 파라핀, 함수, 증류수에 수세한 후 마손(Masson) 방법에 따라 보우인(Bouin) 용액에 옮겨 56℃ 1시간 매염 처리한 후 흐르는 물에 수세하고 웨이거트 아이언 페마톡실린(Weigert iron hematoxylin) 용액에 10분간 염색한 후, 수돗물에 10분간 수세하였다. 바이브리치 스칼렛 에시드 푸치신(Biebrich scarlet acid fuchsin) 용액에 5분간 염색 후 증류수에 행구었다. 포스포몰리비딕-포스포텅구스틱 애시드(Phosphomolybdic-phosphotungstic acid) 용액으로 15분간 분별 염색 후 아닐린 블루(Aniline blue) 용액에 5분간 염색하였다. 0.5% 글라시얼 아세틱 애시드(glacial acetic acid) 용액에 3분간 감별 후 탈수, 청명 과정을 거친 후 캐나다 발삼(Canada balsam)으로 봉입, 광학현미경 검경하였다.

이러한 마손 트리크롬(Masson’s Trichrome) 염색 실험은 UUO로 유도된 신섬유화 과정에서 봉독, 멜리틴, 아파민의 효능을 확인하기 위함이다. 그 결과는 도3과 같다. UUO 대조군에서는 파란색으로 나타난 증가된 콜라겐 Ⅰ형의 발현이, 본 발명의 봉독, 멜리틴, 아파민 투여 시에는 현저하게 줄어들었다. 이를 통해 본 발명의 봉독, 멜리틴, 아파민이 신섬유화를 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 실시예를 통해, 본 발명에 따른 봉독, 멜리틴, 아파민을 유효성분으로 포함하는 신섬유화 치료용 약학 조성물은 신섬유화 동물 모델에 투여한 결과 신섬유화 및 신섬유화와 관련된 사이토카인의 생산량이 감소함을 확인할 수 있었다. 또한, 신섬유화 과정 중 발생하는 세포외기질 중 하나인 콜라겐 Ⅰ형(collagen type 1)의 발현을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 봉독, 멜리틴, 아파민이 만성신장질환을 일으키는 주요 원인인 신섬유화 억제에 큰 역할을 할 수 있는 우수한 조성물임을 알 수 있다.

< 제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

본 발명의 봉독, 멜리틴 또는 아파민 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

본 발명의 봉독, 멜리틴 또는 아파민 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

본 발명의 봉독, 멜리틴 또는 아파민 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 환의 제조

본 발명의 봉독, 멜리틴 또는 아파민 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<1-5> 과립의 제조

본 발명의 봉독, 멜리틴 또는 아파민 50 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

< 제조예 2> 식품의 제조

<2-1> 밀가루 식품의 제조

본 발명의 봉독, 멜리틴 또는 아파민 0.01~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다.

<2-2> 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 봉독, 멜리틴 또는 아파민 0.01~5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

<2-3> 그라운드 비프(ground beef)의 제조

본 발명의 봉독, 멜리틴 또는 아파민 1 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

<2-4> 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 봉독, 멜리틴 또는 아파민 1~5 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<2-5> 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

본 발명의 봉독, 멜리틴 또는 아파민 분말을 준비하였다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 본 발명의 봉독, 멜리틴 또는 아파민 분말를 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

본 발명의 봉독, 멜리틴 또는 아파민(3 중량부),

영지(0.5 중량부),

지황(0.5 중량부)

< 제조예 3> 음료의 제조

<3-1> 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(94.5%)과 같은 부재료와 본 발명의 봉독, 멜리틴 또는 아파민(0.5 %)을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조하였다.

<3-2> 야채 주스의 제조

본 발명의 봉독, 멜리틴 또는 아파민 5 g을 토마토 또는 당근 주스 1,000 ㎖에 가하여 야채 주스를 제조하였다.

<3-3> 과일 주스의 제조

본 발명의 봉독, 멜리틴 또는 아파민 1 g을 사과 또는 포도 주스 1,000 ㎖ 에 가하여 과일 주스를 제조하였다.

Claims (10)

1. 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 신장질환은 당뇨병성 신증, 고혈압성 신증, 사구체 신염, 신우 신염, 간질성 신염, 루프스 신장염, 다낭성 신장질환 및 신부전증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 신장질환인 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 멜리틴 또는 아파민은 꿀벌 유래 봉독에서 분리되는 것을 특징으로 하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유효성분은 0.001 내지 1.0 mg/kg의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
5. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 신섬유화 유발 사이토카인(Cytokine) 및 신섬유화 인자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
6. 제 5항에 있어서,
   상기 신섬유화 유발 사이토카인은 TNF-α 인 것을 특징으로 하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
7. 제 5항에 있어서,
   상기 신섬유화 인자는 TGF-β1인 것을 특징으로 하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
8. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 콜라겐 Ⅰ형의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
9. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
10. 봉독, 멜리틴 및 아파민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 신장질환 예방 또는 개선용 식품조성물.

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