KR20220122531A - 봉독 유래 멜리틴 함유 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상당한 정도의 멜리틴을 포함하는 봉독 유래 멜리틴 함유 조성물 및 이의 항바이러스 용도 또는 신장 손상의 예방 또는 완화 용도를 제공한다.
본 발명의 봉독 유래 멜리틴 함유 조성물은 봉독 내 존재하는 부작용 유발 물질이 효과적으로 제거되고, 멜리틴을 고함량으로 포함하여 각종 바이러스에 대한 억제 효과 및 사멸 효과와, 신장 손상의 예방 또는 치료 효과를 발휘하므로, 바이러스 질환 및 신장 질환 분야에서 항바이러스 용도 및 신장 손상의 예방 또는 완화 용도의 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

봉독 유래 멜리틴 함유 조성물 및 이의 용도{Composition containing melittin derived from bee venom and uses thereof}

본 발명은 멜리틴 함유 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 봉독을 정제하여 얻은 멜리틴 함유 조성물 및 이의 항바이러스 용도 또는 신장 손상의 예방 또는 완화 용도에 관한 것이다.

봉독(Bee Venom)은 벌이 가지고 있는 독으로, 주요 성분인 멜리틴(melittin)은 약 40~50 %로 함유되어 있다. 멜리틴을 포함하여 주요 구성성분들은 복잡한 구조의 펩티드와 단백질, 또한 낮은 분자량의 활성아민 등을 포함하여 40가지 이상의 물질로 구성되어 있다.

봉독은 항균작용, 항염증 작용, 또한 피부미용적인 항산화 및 주름개선 작용에 관여한다고 알려져 있으며, 사람에게는 관절염, 동맥경화, 요통 및 피부상처 등을 치료하는 목적으로 사용되고 있다. 또한, 면역기능 활성화에 관여하여 질병을 치료하는 효과를 나타내기 때문에 봉침액을 이용하여 가축의 질병 예방에도 사용되고 있다.

한편, 바이러스는 감염을 일으키는 병원성 입자로서, 핵산과 단밸질로 구성되어 있으며, 크기는 세균여과지(0.22um)를 통과한다. 이러한 바이러스성 질환의 특징은 여러 종류의 바이러스가 유사한 증상을 나타낼 수 있다는 것이다.

바이러스성 질환 관련하여, 세포가 바이러스에 감염되면 세포의 변성, 괴사, 염증 등이 발생할 수 있고, 종양의 원인이 될 수도 있다. 바이러스성 질환의 치료는 대증요법을 중심으로 백신에 의한 예방을 최우선으로 하고, 세균의 2차 감염 예방과 치료의 목적으로 항생제를 사용할 수 있다.

대표적인 바이러스로서, 인플루엔자 바이러스(Influenza Virus)는 오르토믹스 바이러스와 인플루엔자 바이러스 속에 속하며 상기도(upper airway)의 점막에 침입하여 호흡기질환을 일으키는 바이러스로, 이 바이러스 종류들은 전염성이 매우 크고, 기관지 폐렴, 급성전염병(acute infectious disease) 등을 일으키며, 고이환율, 저폐사율 등의 특징을 갖는다. 인플루엔자 바이러스는 항원 자극의 면역학적 기억이 매우 길고, 동물체 내에서 증식하여 분절 교환이 일어나며, 사람 외에 돼지, 말, 오리 등에서도 분리될 수 있다.

또한, 수포성 구내염 바이러스(Vesicular Stomatitis Virus)는 수포성 구내염의 병인(病因)이 되는 비분절형의 음성가닥 RNA를 기본형으로 하는 바이러스이며, 랍도바이러스(rhabdovirus)과로 분류되고 있다. 이 바이러스 RNA의 뉴클레오시드 껍질은 나선 대칭형이고, 비리온(virion, 바이러스입자)에는 외막이 있으며, 그 구조는 포탄형이다. 비리온 표면에는 1종류의 바이러스 특이적 단백질(G단백질)이 존재하며, 입자 내부에는 바이러스 특이적 RNA 의존성 RNA 중합효소가 있다.

또한, 헤르페스 바이러스(Herpes Simplex Virus)는 바이러스 입자가 둥근 모양으로, 피막(envelope) 내부에는 지름 100 nm 전후의 정 20면체상의 캡시드가 있다. 유전체는 2중 가닥 DNA이며 그 크기는 예를 들면 단순 헤르페스 바이러스 1형은 152,260염기쌍, EB 바이러스가 172,282염기쌍, 사이토메가로 바이러스가 229,400염기쌍을 갖는다.

헤르페스 바이러스는 숙주의 세포핵에서 증식하고 포일겐 반응(Feulgen reaction) 양성의 봉입체를 만들며, 바이러스가 감소하면 포일겐 반응 음성, 에오신호성(호산성)의 Cowdry A형 봉입체로 변하는 특징 때문에 A형 핵내봉입체(NITA) 바이러스군이라고도 한다.

수세기 동안 봉독 요법은 급성 및 만성 인간 질병의 관리에 적용되어 있다. 최근 연구에 따르면, 봉독을 어느 정도 정제한 정제봉독(Purified Bee Venom, PBV)에 포함되어 있는 멜리틴이 마우스의 일측성 요관 폐쇄 후 신장 손상과 섬유증을 개선한 것으로 나타났다. 패혈증은 감염에 대한 비정상적인 면역 반응에 의해 유발되는 심각한 의학적 상태이며 병원에서 전 세계적으로 주요 사망 원인으로 남아 있으며, 급성 신장 손상(Acute Kidney Injury, AKI)은 패혈증의 동반 질환으로 자주 발생하며 중증 환자의 사망률 증가와 관련이 있다. 패혈증과 관련된 급성 신장 손상 환자를 위한 표준 요법에는 항생제의 신속한 투여와 적절한 수액 투여 또는 혈관 억제제 사용을 하지만, 현재의 치료법에는 한계가 있으며, 패혈증 관련 급성신장손상(AKI)을 안전하고 효과적으로 제어하기 위한 새로운 약리학적 제제의 개발은 심각한 질병 예방을 위한 보다 유망한 치료법을 제공할 것이다. 병원체 관련 분자 패턴 (PAMP)은 미생물에 의해 생성되고, PAMP 중 지질 다당류 (LPS)는 그람 음성 박테리아에 의해 생성되는 내 독소이다. 이 염증 매개체는 TLR (Toll-like receptors)과의 상호 작용을 통해 신 세뇨관 상피 세포와 면역 세포를 포함한 다양한 유형의 세포를 자극하여 산화 스트레스, 염증 및 세포 사멸을 유도한다.

정제봉독의 생리활성은 멜리틴에 의한 것이라고 알려져 있다. 정제봉독에는 멜리틴 외에도 많은 성분이 포함되어 있는데, 특히, 히스타민(histamin), 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)와 히알루로니다제(hyaluronidase) 등은 세포막 파괴, 혈액응고, 혈관확장 및 투과, 단백질의 가수분해 촉진 등의 작용을 하며, 강력한 알러지 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 정제봉독에 대한 과민성을 지닌 사용자는 매우 심각한 안전상의 문제를 일으킬 수 있으며, 이러한 부작용 때문에 안전성의 문제를 고려해 봉독의 사용을 제한하고 있으며, 생리활성 또한 충분히 구현되지 못하는 문제가 발생할 수 있다. 이를 해결하기 위하여 정제봉독의 유효성분만을 얻기 위한 더욱 정밀한 정제 공정이 필요하다.

정제봉독은 채집 장치를 이용하여 벌로부터 채집된 봉독 원료를 자연건조, 수용정제, 멸균 및 동결건조 등의 공정을 거쳐 가공한 결과물이며, 정제봉독과 봉독 원료의 생리활성은 유사한 것으로 알려져 있다. 정제봉독을 얻는 공정으로서 기존에는 양봉 농가로부터 회수한 봉독으로서 흙, 화분, 이물질 등 불순물들이 포함된 조(crude) 봉독으로부터 정제 과정을 거쳐 약 50-60%의 회수율로 정제하는 방법을 사용하고 있었다. 그러나, 기존의 봉독 정제법에서는 봉독의 변성 최소화 및 순도 측면에서 3차에 이르는 여과를 수행하였는데, 여과 과정에서 필터의 소모량이 많고, 대량 정제 공정으로 사용하기에는 시간 및 비용 소모가 크다는 단점이 있었다.

대한민국 특허공개 제10-2015-0137314호(2015.12.09.)

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 정제봉독에 포함되어 있는 멜리틴 외에, 세포막 파괴, 혈액응고 등 부작용 및 강력한 알러지 반응을 유발하는 기타 성분을 효과적으로 제거하고, 고가인 봉독의 회수율을 높일 수 있는 효율적인 대량 정제 공정을 제공하는 것으로서, 기존의 한외여과 단계에서 분리 과정에 소요되는 비용과 공정의 복잡함을 최소화하면서도, 크로마토그래피에서 주입되는 고가의 봉독을 높은 수율로 회수할 수 있는 대량 정제 공정 및, 이에 의해 얻어진 상당 정도의 멜리틴을 함유하는 봉독 유래 멜리틴 함유 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 상기 상당 정도의 멜리틴을 함유하는 봉독 유래 조성물이 항바이러스 활성 및 신장 손상 완화 효과를 나타내어 항바이러스 용도 및 신장 손상의 예방 또는 완화 용도로 사용될 수 있음을 밝히는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 해결 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 해결 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면에 따라, 봉독 또는 정제봉독을 물에 녹여 3 내지 19 mg/mL의 봉독 용액을 제조하는 단계; 상기 봉독 용액을 2 내지 20 kDa의 한외여과막으로 여과하여 여과물을 얻는 단계; 및 상기 여과물을 크로마토그래피 컬럼에 용리시켜 멜리틴(melittin)이 포함된 분획물을 얻는 단계를 포함하는 정제방법에 의해 얻어진, 고형 성분 총 중량을 기준으로 65 내지 75 중량%의 멜리틴 함유 조성물이 제공된다.

일 구현예에서, 상기 멜리틴 함유 조성물은 항바이러스용 조성물일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 멜리틴 함유 조성물은 신장 손상의 예방 또는 완화용 조성물일 수 있다.

본 발명에 의해, 특정 정제 공정을 거친 본 발명의 멜리틴 함유 조성물은 봉독으로부터 유래한 멜리틴을 상당한 정도(고형 성분 총 중량을 기준으로 65 내지 75 중량%)로 포함하되, 봉독 내 존재하는 부작용 유발 물질이 효과적으로 제거된 것으로서, 기존의 봉독 정제법을 개선하여 고효율, 저비용으로 봉독을 효율적으로 대량 정제할 수 있는 공정에 의해 얻어졌으며, 이러한 개선된 봉독의 정제 공정을 이용하면 봉독의 대량 정제 시스템의 구축이 가능하여, 상당한 정도의 멜리틴을 포함하는 봉독 유래 멜리틴 함유 조성물이 효과적으로 제조될 수 있다. 또한, 이러한 정제 공정에 의해 얻어진 멜리틴 함유 조성물은 다양한 바이러스에 대한 생장 억제 및 사멸 효과와, 신장 손상의 예방 또는 완화 효과를 나타낸다는 것이 밝혀졌다.

따라서, 본 발명의 멜리틴 함유 조성물은 질환 치료 분야에서 항바이러스 용도 및 신장 손상의 예방 또는 완화 용도의 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 봉독을 대량으로 정제하여 상당한 정도의 멜리틴 함유 봉독 유래 조성물을 얻는 공정의 개략도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 의해 분리된 멜리틴 조성물에 함유된 멜리틴 피크와 멜리틴 표준품의 피크를 비교하여 나타낸 크로마토그램(a) 및 PREP-HPLC를 이용한 분획 과정에서 멜리틴에 해당하는 피크를 나타낸 크로마토그램(b)이다.
도 3은 본 발명 멜리틴 조성물이 Vero 세포에서 수포성 구내염 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명 멜리틴 조성물이 HEK293T 세포에서 수포성 구내염 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명 멜리틴 조성물이 A549 세포에서 인플루엔자 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명 멜리틴 조성물이 HeLa 세포에서 콕사키바이러스(Coxsakievirus)에 대하여 항바이러스 활성을 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명 멜리틴 조성물이 Hep2 세포에서 호흡기 세포 융합 바이러스(Respiratory syncytial virus)에 대하여 항바이러스 활성을 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명 멜리틴 조성물이 Vero 세포에서 헤르페스 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명 멜리틴 조성물이 LPS 처리 후 혈장 및 신장의 사이토카인 및 NF-κB 신호 전달 수준에 대한 효과를 나타내는 도면이다.
도 10은 본 발명 멜리틴 조성물이 LPS 처리 후 관상 손상 마커의 발현에 대한 효과를 나타내는 도면이다.
도 11은 본 발명 멜리틴 조성물이 LPS 처리 후 신장으로 면역 세포 축적에 대한 효과를 나타내는 도면이다.
도 12는 본 발명 멜리틴 조성물이 LPS 처리 후 세뇨관 세포 사멸 및 괴사에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 13은 본 발명 멜리틴 조성물이 마우스에서 LPS 처리 후 생존율에 대한 개선 효과(a) 및 LPS로 인한 신장 손상이 개선되는 메커니즘을 개략적으로 나타내는 도면(b)이다.
도 14는 본 발명 멜리틴 조성물이 LPS 주입된 마우스의 신장 기능 및 신장 조직 구조에 대한 효과를 나타내는 도면이다.
도 15는 본 발명 멜리틴 조성물이 LPS 처리 후 산화 손상 및 산화 촉진제/항산화 단백질 발현에 대한 효과를 나타내는 도면이다.

본 발명은 봉독 또는 정제봉독을 물에 녹여 3 내지 19 mg/mL의 봉독 용액을 제조하는 단계; 상기 봉독 용액을 2 내지 20 kDa의 한외여과막으로 여과하여 여과물을 얻는 단계; 및 상기 여과물을 크로마토그래피 컬럼에 용리시켜 멜리틴(melittin)이 포함된 분획물을 얻는 단계를 포함하는 정제방법에 의해 얻어진, 고형 성분 총 중량을 기준으로 65 내지 75 중량%의 멜리틴 함유 조성물을 제공한다.

본 발명의 멜리틴 함유 조성물은 고형 성분 총 중량을 기준으로 65 내지 75 중량%의 멜리틴을 함유하는 봉독 유래 조성물로서, 하기 단계를 포함하는 정제방법에 의하여 제조될 수 있다:

(a) 봉독 또는 정제봉독을 물에 녹여 3 내지 19 mg/mL의 봉독 용액을 제조하는 단계;

(b) 상기 봉독 용액을 2 내지 20 kDa의 한외여과막으로 여과하여 여과물을 얻는 단계; 및

(c) 상기 여과물을 크로마토그래피 컬럼에 용리시켜 멜리틴(melittin)이 포함된 분획물을 얻는 단계.

상기 단계(a)는 봉독 또는 정제봉독을 물에 녹여 3 내지 19 mg/mL의 봉독 용액을 제조하는 단계로서, 봉독 내 존재하는 수용성 유효성분 이외의 불순물과 특정 범위의 한외여과막을 통과하지 못하는 크기의 물질을 제거하기 위한 막 여과 전단계이다.

본 단계에서 사용되는 정제봉독은, 봉독 내 존재하는 흙, 화분, 이물질 등 불순물들이 포함된 조(crude) 봉독 내 불순물을 제거한 봉독을 의미할 수 있으며, 당업계에 알려진 통상의 정제방법을 통해 정제된 봉독이면 족하며 정제방법에 특별한 제한은 없다. 또한, 상기 정제봉독은 그 형태에 있어서, 예를 들면, 액체의 형태, 고체의 형태, 구체적인 일 실시예에 따를 때 동결건조된 분말의 형태일 수 있으나, 정제한 봉독 내 멜리틴을 포함하는 유효성분이 변성되지 아니하고 온전히 포함될 수 있는 형태라면 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 단계에서 사용되는 물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 물이라면 제한없이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 순도 및/또는 멸균을 목적으로 증류수 또는 멸균증류수를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 정제 봉독을 증류수에 용해시키는 방법이나 조건에 특별한 제한은 없고, 증류수 내 정제한 봉독을 안정적이고 고르게 용해시킬 수 있는 방법이라면 당업계에 알려진 방법을 자유로이 택할 수 있다.

상기 봉독 용액은 3 내지 19 mg/mL 농도로 제조될 수 있으며, 이는 봉독 용액 내 존재하는 멜리틴의 회수율과 순도를 동시에 상승시키기 위한 목적으로서, 상기 범위 미만하거나 초과하는 경우 회수율과 순도 동시에 상승시키기 어려울 수 있다. 바람직하게는, 5 내지 15 mg/mL 농도, 더욱 바람직하게는, 7 내지 13 mg/mL 농도, 가장 바람직하게는, 8 내지 12 mg/mL 농도로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계(b)는 상기 봉독 용액을 2 내지 20 kDa의 한외여과막으로 여과하여 여과물을 얻는 단계로서, 봉독 용액에 용해되어 있는 유효성분 이외의 불순물과 상기 특정 범위[2 내지 20 kDa]의 컷-오프 크기를 갖는 막을 통과하지 못하는 큰 범위 크기의 물질을 제거하기 위함이다.

상기 봉독 용액은 멜리틴, 아파민, 아돌라핀, 포스포리파아제 A2(PLA2) 및 히스타민 등 다양한 물질들을 포함하고 있는 것으로서, 멜리틴을 고함량으로 포함하되 불필요한 물질을 여과하게 되는데, 한외여과(ultrafiltration) 막으로 여과하는 방법으로 수행한다. 이 때, 멜리틴을 고함량으로 포함하되, 세포막 파괴나 알러지 반응을 유발하는 히스타민과 포스포리파아제 A2를 효과적으로 제거하기 위해, 상기 특정 범위[2 내지 20 kDa]의 한외여과막을 사용하게 되는데, 상기 범위에 미달하는 경우 멜리틴을 고함량으로 포함하기 어려울 수 있고, 상기 범위를 초과하는 경우 히스타민과 포스포리파아제 A2를 효과적으로 제거하기 어려울 수 있다.

상기 여과에 있어서, 여과시의 압력은 실험자가 처한 환경에 따라 적절히 변형되어 설정할 수 있는 것이고, 예를 들면, 5 내지 40 psi, 5 내지 35 psi, 5 내지 30 psi, 5 내지 25 psi, 5 내지 20 psi, 5 내지 15 psi 또는 5 내지 10 psi 압력 조건일 수 있으며, 멜리틴의 회수율 및 순도를 동시에 고려하는 측면에서 바람직한 일 실시예에 따르는 5 내지 10 psi 압력 조건일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 단계(c)는 상기 여과물을 크로마토그래피 컬럼에 용리시켜 멜리틴이 포함된 분획물을 얻는 단계로서, 상기 여과물에 포함되어 있는 다양한 물질을 크로마토그래피의 용리 원리에 따라 용리시켜, 특정 시간대에 멜리틴이 용리되는 분획만을 수득함으로써 멜리틴이 고함량으로 함유된 조성물을 얻기 위함이다.

상기 크로마토그래피(HPLC)에 사용되는 컬럼은 통상적으로 사용되는 역상 컬럼을 사용할 수 있고, 바람직하게는 소수성이 높은 물질 분리에 사용되는 컬럼을 사용할 수 있다. 구체적인 예로서 C4 컬럼 또는 TMS 컬럼을 사용할 수 있으며, 고함량/고순도의 멜리틴을 수득하면서 분리시간을 단축시키는 측면에서, 바람직한 일 실시예에 따르는 TMS 컬럼을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 TMS 컬럼을 사용하여 소수성이 큰 화합물을 단시간에 효율적으로 용출시킬 수 있다.

상기 HPLC에 주입되는 주입액은, 여과 단계에 의해 여과된 하층액을 포함하는 용액의 형태일 수 있고, 구체적인 일 실시예에 따를 때, 여과된 하층액을 동결건조한 후 증류수에 용해시킨 형태일 수 있으나, 여과액 또는 이로부터 얻은 고형물의 용액을 포함하는 형태로서 HPLC에 주입될 수 있는 형태라면 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 주입액의 농도는 HPLC의 구체적인 조건에 따라 농도와 비율을 통상 실험자가 적절히 변형할 수 있을 것이고, 구체적인 예로서, 농도 30 내지 250 mg/mL, 30 내지 240 mg/mL, 30 내지 230 mg/mL 또는 30 내지 220 mg/mL, 40 내지 200 mg/mL, 50 내지 150 mg/mL, 60 내지 140 mg/mL, 70 내지 130 mg/mL, 80 내지 120 mg/mL 또는 90 내지 110 mg/mL일 수 있으며, 멜리틴의 회수율을 상승시키면서 PLA2를 효과적으로 제거시키는 측면에서 가장 바람직하게는 90 내지 110 mg/mL일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물은 상기 순차적인 단계에 의해 수득된 분획물을 포함하되, 멜리틴을 조성물 총 중량 대비 65 내지 75 중량%로 포함하는 것인데, 보다 구체적으로, 히스타민과 포스포리파아제 A2가 효과적으로 제거되어 봉독의 알러지 반응이나 세포 파괴 등의 부작용을 억제하면서도, 본 발명의 효과를 발휘하는 유효성분인 멜리틴을 상당한 정도(고형 성분 총 중량을 기준으로 65 내지 75 중량%)로 포함하는 것이다.

일 구현예에서, 상기 멜리틴 함유 조성물은 항바이러스 용도로 사용되어 약학 조성물로 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물이 항바이러스용으로 사용되는 경우, 바이러스로 분류되는 당업계 알려진 바이러스는 모두 적용대상일 수 있으며, 예를 들면, 구내염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 콕사키바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 및 헤르페스 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

일 구현예에서, 상기 멜리틴 함유 조성물은 신장 손상의 예방 또는 완화 용도로 사용되어 약학 조성물로 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물이 신장 손상의 예방 또는 치료용으로 사용되는 경우, 상기 신장 손상은 급성 신장 손상일 수 있다. 상기 신장 손상은 신체 기관으로서의 신장이 손상되어 발생할 수 있는 모든 하위 질환들을 포함하는 개념일 수 있고, 구체적인 예로서, 급성 신부전 또는 신장 손상으로 인한 요로 질환까지 모두 포함하는 것일 수 있다.

상기 약학 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물로 제공될 수 있다.

상기 "약학적으로 허용되는"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.

나아가 상기 약학 조성물은 종래에 알려져 있는 항바이러스 물질 또는 신장 손상 치료물질과 혼합하여 제공될 수도 있다. 즉, 상기 약학 조성물은 항바이러스 효과 또는 신장 손상 치료효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

상기 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, "개체"란 바이러스에 감염되었거나, 신장 손상이 발생하였거나 발생할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있으며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 크림제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 함유되는 유효성분의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 유효성분 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르며, 환자에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 예를 들면, 상기 유효성분은 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.001 내지 90 % 중량백분율로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면, 경구, 피부, 복강, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 봉독의 대량 정제

(1) 정제봉독(PBV) 분말로 봉독 용액을 제조하는 1단계

봉독 채집 장치를 통해 수거된 봉독을 봉독 무게의 10배 정도되는 3차 증류수에 충분히 용해시킨 후, 진공 펌프를 사용하여 3 ㎛ 기공 크기의 여과지를 통해 여과하였다. 양봉 농가에서 수거한 봉독에는 먼지, 모래, 미세곤충, 화분, 프로폴리스, 왁스 등의 성분이 함께 포함되어 있어, 이러한 비수용성 물질을 제거하기 위함이다. 이어서, 0.45 ㎛ 막 필터(membrane filter)와 0.2 ㎛ PES(Polyethersulfone, SARTORIUS STEDIM LABS Ltd.)를 이용하여 튜브형 펌프(tubing pump)로 여과하였다. 여과된 정제봉독을 -56 ℃ 내지 -75 ℃의 온도로 동결건조한 후, 분말 형태로 병에 담아 밀봉하여 냉동보관하였다.

정제봉독 분말과 여과한 멸균증류수를 이용하여 정제봉독 용액을 10 mg/mL로 제조하였다. 10 mg/mL보다 더 낮은 농도인 1 - 2 mg/mL의 농도로 한외여과법으로 분리시 멜리틴 함량이 상대적으로 높게 나왔지만, 농도가 낮음에 따라 1회 분리량이 10 mg/mL 제조시보다 적고, 증류수의 비율이 많아져 대량으로 생산 시 용액의 농축 시간 및 동결건조 시간이 길어져 문제점이 발생하게 된다. 이에 봉독 용액을 10 mg/mL의 농도로 제조하였다. 또한, 이보다 높은 농도로 제조시 단백질 침전 및 변형이 발생하였으며, 20 mg/mL에서는 PLA2가 완전히 제거되지 않았다.

(2) 상기 용해된 정제봉독 용액을 컷오프(cut-off)가 10 kDa인 한외여과 막(ultra filtration membrane)으로 여과하여 13 kDa 이상인 단백질을 분리하는 2단계(PLA2 제거)

봉독 성분의 요약하면, 히알루로니다제(Hyaluronidase)(38 kDa), 포스포리파아제 A2(Phospholipase A2, PLA2) (13 kDa), 멜리틴 2.8 kDa, 아파민(Apamin) (2.0 kDa), 히스타민(Histamine) (111.5 Da) 등이 포함된다. 한외여과법으로 멜리틴 함량 65% 정도의 조성물을 얻기 위하여는 3단계 공정(30 kDa, 10 kDa, 1 kDa 순서)을 수행하여 최종적으로 1 kDa 멤브레인 여과액의 상층액(아파민,멜리틴)을 거쳐야 하고, 이러한 경우에도 멜리틴 함량 최대 65%이며, 비용이나 시간적인 측면에서 비효율적이었다.

이에, 한외여과(Ultra-filtration) 방법을 이용하여, 봉독의 유효성분인 멜리틴과 알레르기 유도성분인 히알루로니다제(Hyaluronidase), 포스포리파아제 A2(Phospholipase A2, PLA2)를 효과적으로 분리하기 위하여 하기와 같이 분리 공정을 수행하였다.

상기에서 제조한 정제봉독 용액(10 mg/mL)으로부터 분자량 13 kDa 이상인 단백질 효소 포스포리파아제 A2와 히알루로니다제를 제거하기 위하여 컷-오프 크기 10 kDa의 한외여과막을 선정하였고, UHP-150K(Advantec사) 및 5~40 psi의 질소가스 가압필터를 이용하여 봉독 용액을 여과하였다. 이후, 용기 내의 봉독 용액이 2-3 mL이 될 때까지 여과하였다.

수득된 10 kDa 여과 하층액은 동결건조 방법으로 -56 ℃ 내지 -75 ℃의 온도로 3일간 동결건조한 후, 분말형태로 건조하였다. 동결건조 후 얻어진 분말의 함량 조성은 아파민 4.12%, PLA2 0%, 멜리틴 51.4%였다.

(3) PREP-HPLC를 이용하여 멜리틴 분획물을 수득하는 3단계

Prep-HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 멜리틴 분획물을 하기와 같이 분리하였다. 이때 사용된 용매로는 용매 A: 증류수(0.2% TFA)와 용매 B: 에탄올(0.22% TFA, Ethyl alchol, 삼전순약공업, 식물성 에탄올)을 사용하였다.

컬럼을 안정화하기 위해, 컬럼에 유속 6.0 mL/min으로 용매 A:B (50:50%)을 흘려주며 안정화 시켰다. 이후, 동결건조한 봉독 분말을 90 mg/mL ~ 100 mg/mL 농도로 제조한 용액(증류수에 녹임)을 1,000 μL 주입한 후, 용매의 유속을 6.0 mL/min으로 흘려주면서, A와 B 용매를 농도구배(gradient)를 주면서 멜리틴을 분리하여 그 분획물을 수득하였다. 구체적인 조건은 하기 표 1과 같다.

Instrument	Pump Detector collector	Waters 2525u binary HPLC pump Waters 996 photodiode array Waters 2767u sample manager
	Mobile phase	A: 0.2% TFA in water B: 0.22% TFA in Ethyl alchol
	UV absorbance	220 nm
	Column	YMC-pack TMS, 12nm, S-10um 250 X 20 mm
	Injection volume	1,000 ㎕ (100 mg/mL)
	Flow rate	6.0 mL/min
	Gradient	min A(%)/B(%) Ini. 50/50 9분 50/50 10분 20/80 16분 20/80 17분 50/50

용출된 분획들 중 멜리틴 피크(13분-15분 구간에서 용출)만 분획물 수집기(fraction collector)로 모았으며(도 2(b)), 에틸알코올(ethyl alcohol)과 TFA(trifluoroacetic acid)를 진공회전농축기로 제거하였다. -75 ℃ 온도로 동결 건조하고 분말 형태의 멜리틴 분획물을 얻었다(65 - 75% w/w).

분리된 멜리틴 분획물의 크로마토그래피 상 피크를 시그마의 멜리틴 표준품(standard)과 비교하여 HPLC로 순도를 확인하였다(도 2(a)).

최종적으로 수득한 멜리틴 분획물을 이하 '멜리틴 조성물' 또는 '멜리틴(mellitin)'으로 명명하였으며, 상기 제조의 구체적인 공정을 모식적으로 도 1에 나타내었다.

실시예 2. 한외여과시 농도와 압력 조건에 따른 멜리틴 회수율 비교

상기 실시예 1에 있어서, 한외여과시 봉독 용액의 농도와, 여과 압력 조건을 달리하는 경우 멜리틴의 회수율이 어떻게 달라지는지 확인하고자, 비교실험을 실시하였다.

상기 실시예 1과 실험조건은 동일하되, ⅰ) 1L의 봉독 용액을 20-40 psi 조건에서 한외여과를 실시하는 경우(하기 표 2)와, ⅱ) 1L의 봉독 용액을 5-10 psi 조건에서 한외여과를 실시하는 경우(하기 표 3)로 나누었다.

상기 ⅰ)의 경우, 봉독 용액의 농도가 낮을수록 멜리틴의 평균 함량, 멜리틴의 회수율도 높은 결과를 나타내었다. 그러나, 상기 ⅱ)의 경우, 봉독 용액의 농도가 낮을수록 멜리틴의 평균 함량은 높게 나왔지만, 회수율은 10 mg/mL 농도에서 가장 높게 나왔다. 또한, 20 mg/mL 농도에서는 PLA2가 완전히 제거되지 않은 문제가 발생하였다.

이에, 봉독 용액을 10 mg/mL의 농도로 제조하는 것이 가장 바람직함을 확인하였다.

농도 (mg/mL)	멜리틴 평균 함량 (%)	1회 분리량 (한외 여과 후 동결건조 중량) (mg)	멜리틴 회수율 (%)
20.0	7.8	12079	4.7
10.0	20.1	9872	19.8
2.0	48.0	1098	26.4
1.0	54.3	528	28.7

농도 (mg/mL)	멜리틴 평균 함량 (%)	1회 분리량 (한외 여과 후 동결건조 중량) (mg)	멜리틴 회수율 (%)
20.0	8.1	13688	5.5
10.0	34.2	9951	34.0
2.0	42.6	1455	31.0
1.0	57.5	548	31.5

실시예 3. HPLC 분리시 컬럼의 종류와 주입 용액의 농도에 따른 멜리틴 회수율 비교

실시예 1의 PREP-HPLC 조건과 동일하게 실시하되, 통상적으로 사용하는 C4 컬럼을 사용하는 경우 멜리틴 피크를 검출하고 분리하는 데에 36분이 소요되었으나, TMS 컬럼(YMC-Pack TMS 컬럼, TM12S1-2520WT, carbon 함량 4%, YMC Korea)으로 변경하여 사용하는 경우 검출하고 분리하는 데에 총 20분이 소요되어, 공정시간을 현저하게 단축시킬 수 있었다. 이에, PREP-HPLC 실시시에 TMC 컬럼을 사용하는 것이 가장 바람직함을 확인하였다.

또한, 동결건조된 여과물 용액의 주입 농도에 따라 멜리틴 회수율은 100 mg/mL에서 가장 높은 회수율을 나타내어(하기 표 4), HPLC에 대한 주입 농도를 100 mg/mL로 설정하는 것이 가장 바람직함을 확인하였다. 이에 더하여, 한외여과법 수행 후 PREP-HPLC를 수행하는 경우에는 히알루로니다제 및 포스포리파아제 A2가 제거되어 TMS 컬럼의 사용 주기도 연장될 것으로 예상되었다.

10 kDa 분리 후 샘플의 주입 농도 (mg/mL)	멜리틴 회수액 분석 피크의 면적	멜리틴 회수율 (%)
200.0	93,784,355	62.6
100.0	64,944,917	86.7
50.0	29,663,422	79.2

실험예 1. 멜리틴 조성물의 항바이러스 효능 평가

(1) 실험 방법

12시간 동안 미리 배양된 각각의 세포(Vero 세포, HEK293T 세포, A549 세포, HeLa 세포, Hep2 세포)에 멜리틴 조성물을 전처리한 후 다시 12시간을 배양시켰다. 이후, 시험 대상 바이러스에 따라, Green Fluorescence Protein(GFP)을 발현하는 수포성 구내염 바이러스(VSV-GFP), 인플루엔자 바이러스(PR8-GFP), 콕사키바이러스(H3-GFP), 호흡기 세포 융합 바이러스(Respiratory Syncytial virus)(RSV-GFP), 헤르페스 바이러스(HSV-GFP)로 감염시켰다. 감염된 세포를 다시 12시간 배양하여 바이러스 증식에 따른 GFP의 발현률을 측정하였다. GFP의 발현이 적게 될수록 바이러스 예방의 효과가 높은 것을 나타낸다.

(2) 결과

도 3 내지 8의 결과를 참조할 때, 본 발명 멜리틴 조성물을 처리한 경우, Vero 세포에서의 수포성 구내염 바이러스(도 3), HEK293T 세포에서의 수포성 구내염 바이러스(도 4), A549 세포에서의 인플루엔자 바이러스(도 5), HeLa 세포에서 콕사키바이러스(Coxsakievirus)(도 6), Hep2 세포에서의 호흡기 세포 융합 바이러스(Respiratory syncytial virus)(도 7), Vero 세포에서 헤르페스 바이러스(도 8) 모두에 대해 형광 발광이 감소하면서 바이러스 역가(titer)가 모두 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과에 의해 본 발명 멜리틴 조성물이 다양한 종류의 바이러스에 대해 항바이러스 효과를 나타냄을 확인하였다.

실험예 2. 멜리틴 조성물의 신장 손상 치료효능 평가

(1) 실험 방법

멜리틴 조성물의 신장 손상 치료 효능을 확인하기 위하여 마우스에 LPS를 주사하여 손상모델을 확립하고, ELISA를 통해 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6의 혈장 수준 변화를 확인하여 멜리틴의 효능을 평가하였다. 또한, 멜리틴이 내독소인 LPS로 유도된 NF-κB 신호전달 경로에 미치는 효능을 평가하기 위해 웨스턴 블럿(western blot)과 EMSA를 수행하여 NF-κB 신호전달 경로 인자들의 발현 변화를 확인하였다(도 9).

또한, 면역조직화학 염색을 통하여 관상 손상 마커인 NGAL과 Kim-1을 확인하여 치료 효능을 확인하고자 하였다(도 10).

또한, 마우스에 멜리틴 조성물과 LPS를 복강 주사하여 대식세포 마커인 Mac-2와 CD4 면역세포의 발현 변화를 확인하여 치료 효능을 확인하고자 하였다(도 11).

또한, 멜리틴 조성물이 LPS로 유도된 세뇨관 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여 TUNEL과 세포사멸 관련 인자들의 웨스턴 블럿(western blot) 실험을 수행하여 치료 효능을 확인하고자 하였다. 또한, 세포사멸의 또 다른 형태인 괴사(necroptosis)에 대한 멜리틴의 효능을 평가하기 위하여, 괴사 발현 인자들인 RIPK1, RIPK3, p-MLKL의 발현양을 확인하였다(도 12).

또한, LPS 처리 후 생존율에 대한 멜리틴 조성물의 치료 효능을 확인하기 위하여, 마우스에 LPS (20 mg/kg) 주사 1시간 전에 멜리틴 조성물(0.01 mg/kg)을 복강 내 투여하여 마우스의 생존율에 미치는 영향을 확인하고자 하였다(도 13).

또한, 본 발명 멜리틴 조성물이 LPS 주입된 마우스의 신장 기능 및 구조에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 본 발명 멜리틴 조성물을 처리하지 않은 군과 처리한 군에서 신장 기능(Plasma creatinine, Plasma BUN, Tubular injury score)을 확인하였고, 신장조직의 염색 사진을 확인하였다(도 14).

또한, 본 발명 멜리틴 조성물이 산화 손상 및 산화 촉진제 및 항산화 단백질 발현에 대한 효과를 확인하기 위하여, 본 발명 멜리틴 조성물을 처리하지 않은 군과 처리한 군에서 산화 손상 및 항산화 마커를 측정하여 확인하였다(도 15).

(2) 결과

도 9를 참조하면, LPS와 본 발명의 멜리틴 조성물을 함께 투여한 경우, LPS에 의해 증가한 혈장 내 TNF-α, IL-6의 발현이 멜리틴에 의해 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있다. 또한, mRNA 수준의 TNF-α, IL-6의 발현도 멜리틴에 의해 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 멜리틴 조성물이 NF-κB 신호전달 경로를 유의하게 조절하는 것을 확인할 수 있었다.

도 10을 참조하면, 면역조직화학 염색을 통하여 관상손상 마커인 NGAL과 Kim-1의 발현 정도를 확인하여, LPS 처리로 증가한 NGAL과 Kim-1의 발현이 본 발명의 멜리틴 조성물에 의해 유의하게 억제되었음을 알 수 있고, 이들의 발현은 단백질 수준에서도 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

도 11을 참조하면, LPS 처리로 증가한 Mac-2와 CD4(대식세포 마커)의 발현이 본 발명 멜리틴 조성물에 의해 현저하게 감소되었으며, 이는 멜리틴 조성물이 면역세포 침투를 억제하는 것을 보여주는 것이다.

도 12를 참조하면, 세포사멸은 내독소에 의한 신장 손상의 병태생리학에 기여하므로 내독소인 LPS에 의해 유도된 세포사멸에 멜리틴 조성물의 효능을 확인할 수 있는데, LPS 처리로 증가한 세포사멸은 멜리틴에 의해 현저하게 감소되는 것을 확인하였고, 세포사멸 관련 발현 인자인 caspase-3, PARP1, p53, BAX의 단백질 수준의 발현양도 멜리틴 조성물에 의해 감소되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 세포사멸의 또 다른 형태인 괴사에 대한 멜리틴의 효능을 평가하기 위하여 확인한 괴사 발현 인자들(RIPK1, RIPK3, p-MLKL)의 발현양이 LPS에 의하여 증가하였고, 본 발명 멜리틴 조성물의 처리에 의해 이들의 발현향이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

도 13을 참조하면, 본 발명 멜리틴 조성물은 LPS를 처리하여 손상을 유발시킨 마우스에서 생존율을 크게 향상시키는 것을 확인할 수 있다.

도 14를 참조하면, 본 발명 멜리틴 조성물은 LPS 주입된 마우스에서 저하된 신장 기능을 개선시켰으며, 신장조직 구조에 대한 손상을 회복시키는 효과를 나타내었다. LPS 처리 후 신장기능 장애 및 구조의 손상이 나타나, 신장 기능의 심각한 감소를 나타내는 크레아티닌과 BUN의 혈장 농도가 증가하였다. H&E, PAS 염색은 관상피 세포의 관상 확장 및 부종을 포함하여 조직 병리학적 변화를 나타내며, 신장기능 장애와 구조적 손상은 멜리틴 조성물에 의해 상당히 개선되었음이 확인되었다.

도 15는 LPS 처리 후 산화 손상 및 산화 촉진제 및 항산화 단백질 발현에 대한 멜리틴 조성물의 효과를 나타내는 도면이다. 염증 이외에도 산화 스트레스는 LPS로 인한 신장 손상의 병리학적으로 중요한 인자이므로, 이를 지표로 하여 멜리틴이 산화 스트레스에 미치는 영향을 평가하였으며, 이를 위하여 신장 조직에 대하여 4-HNE 염색을 수행하였다. 도 15(a), (b)에 나타난 바와 같이, 멜리틴 조성물 처리군(LPS+Mel)에서는 4-HNE 양성 세포의 수가 LPS 처리군 보다 현저하게 감소하였으며, 이는 멜리틴에 의해 산화 스트레스가 현저하게 감소했음을 나타내는 것이다. 이로써, 멜리틴 조성물은 산화 손상을 억제한다는 것을 알 수 있다.

또한, 신장 조직 손상시 신장의 MDA(oxygen free radical)는 신장 조직 내에서 과하게 축적되고, 세포막의 지방질이 파괴되면서, 그 발생량이 조직의 파괴 정도와 비례하는 수준으로 나타난다. 도 15(c)에 나타난 바와 같이, MDA 량이 멜리틴 조성물 처리군(LPS+Mel)에서 유의하게 감소하였음을 알 수 있다.

또한, NOX4는 LPS 유도 급성신장염에서 활성산소 종(ROS)의 주요 공급원 중 하나인데, 도 15(d), (e)에 나타난 바와 같이, NOX4의 mRNA 및 단백질 발현량이 멜리틴 조성물 처리군(LPS+Mel)에서 감소된 것을 확인하였다.

또한, 도 15(f), (g)에 나타난 바와 같이, 멜리틴 조성물 처리군(LPS+Mel)에서 Nrf2, HO-1의 단백질 발현량이 증가시켰으며, Nrf2의 또 다른 인자인 NQO1, HO-1 의 신장 mRNA도 멜리틴에 의해 향상되어, Nrf2 의존적 항산화 반응 경로가 더욱 활성화되었음을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (2)

1. 봉독 또는 정제봉독을 물에 녹여 8 내지 12 mg/mL의 봉독 용액을 제조하는 단계;
   상기 봉독 용액을 10 kDa의 한외여과막으로 여과하여 여과물을 얻는 단계; 및
   상기 여과물을 90 내지 110 mg/mL의 농도로 크로마토그래피 역상 TMS 컬럼에 주입하여 증류수 및 에탄올의 혼합용매로 용리시켜 멜리틴(melittin)이 포함된 분획물을 얻는 단계
   를 포함하는 정제방법에 의해 얻어진, 고형 성분 총 중량을 기준으로 65 내지 75 중량%의 멜리틴을 함유하는 멜리틴 분획물.
2. 제1항의 멜리틴 분획물을 포함하는, 급성 신장 손상 치료용 조성물.

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