KR101146718B1

KR101146718B1 - 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환，폐암 또는 통증의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101146718B1
Application number: KR1020080125790A
Authority: KR
Inventors: 이재동; 박동석; 최도영; 백용현; 허정은
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2008-12-11
Filing date: 2008-12-11
Publication date: 2012-05-17
Also published as: KR20100067301A

Abstract

본 발명은 봉독(Bee Venom) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환, 폐암 또는 통증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 봉독 추출물이 혈관세포에서 독성없이 혈관세포의 성장, 이동, 분화 및 혈관 형성을 억제하고, 폐암세포주의 성장을 억제하며, 동물 모델에서 암세포의 증식, 혈관형성 및 혈관형성 성장인자의 발현을 현저히 감소시키고 폐암의 전이를 억제시키며, 폐암동물 모델에서 카라기난(carrageenan) 및 포르말린에 의해 유발한 진통에 유용한 통증억제 효과를 가짐으로써, 독성이 없고 효과적이며 안전한 혈관신생 억제제, 폐암의 예방 및 치료용 조성물, 및 통증의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

봉독 추출물, 혈관 형성 억제, 폐암 성장 억제, 폐암 전이 억제, 통증 억제.

Description

봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환，폐암 또는 통증의 예방 및 치료용 조성물{Compositions comprising extracts of Bee Venom as an active ingredient for the angiogenesis?related diseases，lung cancer or pain}

본 발명은 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환, 폐암 예방 및 치료용 조성물, 또는 통증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

봉독(Bee Venom, 蜂毒)은 꿀벌의 산란관에서 나오는 독액으로서, 비중이 1.3, pH가 5.2, 쓴맛이 있고, 약한 방향성이 있다. 실온에서 증발시키면 약 30%의 건조물이 남으며 그 성분은 복잡하다. 봉독의 성분은 75%가 단백질이며, 그 주요 성분으로는 칼륨, 나트륨, 마그네슘, 인, 알라닌, 발린, 아르기닌, 트립토판, 메티오닌 및 히스티딘 등 다양한 물질이 함유되어 있다. 상기 봉독은 지금까지 류머티즘성 관절염을 조절하고 항암, 항염증(anti-inflammatory) 및 항통각(antinociceptive)의 효능을 가지는 것으로 알려져 있다.

봉독의 효능은 옛날부터 많이 알려져 왔다. 기원전 4세기경 히포크라테스가 사용했다는 기록이 있으며, 꿀벌의 뱃속에 있는 액은 사람에게 좋은 약으로 소개되고 있다. 우리나라에도 옛날부터 민간요법의 일종으로 벌침을 치료에 응용해 왔다. 봉독은 벌이 가진 독을 말하는 것으로 인체에 무해한 성분을 추출해내어 통증부위나 침을 놓는 경혈자리에 주입하여 인체의 면역력을 강화시켜 염증이나 이물질에 대해 스스로 이겨낼 수 있게끔 만드는 치료요법으로 사용되고 있다.

봉독의 주성분은 단백질의 일종인 멜리틴(melittin), 아파민(apamin), 아돌라핀(adolapin) 및 비반 세포 과립 감소 펩티드(mast cell degranulation peptide; MCD-peptide) 등으로 구성되어 있다. 봉독은 일단 몸속으로 들어가면 대사 작용을 활발히 하고, 면역작용을 극대화시켜 외부로부터 침입한 세균을 이겨낸다. 그러나 봉독의 주 약리작용인 면역기능의 활성화에 대한 정확한 기전은 아직 밝혀지지 않고 있다. 전통적으로 봉독을 가장 많이 응용해온 질환은 관절염, 결체조직과 기타 염증, 동통성 질환이다. 류마티스염, 급만성 관절염, 경추, 요추간판 탈충증, 척추관협착증, 섬유근통, 산후풍, 오십견, 만성염증등에 응용이 활발하다. 특히, 봉독의 항염작용은 iNOS와 COX-2의 발현뿐만 아니라 TNF-a, NF-B의 활성을 억제하고, 프로스타글라딘E2(prostagladin E2)의 생성을 억제한다는 연구결과들이 다수 보고되고 있다. 최근 서구에서는 다발성 경화증에 봉약침을 응용하려는 시도가 이어지고 있는데, 치료 후 몸이 가벼워지고 근육의 운동성이 좋아졌다는 사례들이 있다. 브라질에서는 천식에 봉약침을 사용하교 있고, 중국에서는 근골격 질환 등의 치료에 사용되고 있다.

그러나, 봉독의 혈관형성 억제 효과, 폐암의 전이 억제 효과, 및 폐암에 의해 유발되는 진통 억제 효과 등은 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 봉독의 치료적 기전연구 및 치료 범위의 확장을 위하여 연구를 실시한 결과, 봉독 추출물이 혈관세포 및 동물모델에서 혈관형성을 유효하게 억제하였고, 폐암동물 모델에서 독성 없이 혈관형성 억제를 통한 암세포의 성장 및 전이를 억제하였으며, 폐암동물 모델에서 진통억제를 유효하게 억제하였음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 봉독(Bee Venom)을 이용하여 혈관신생 억제제, 혈관신생 관련 질환 예방 및 치료용 조성물, 폐암 예방 및 치료용 조성물, 및 통증 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 봉독(Bee Venom) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 폐암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 폐암 전이 억제용 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 통증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 봉독 추출물은 혈관세포에서 독성없이 혈관세포의 성장, 이동, 분 화 및 혈관 형성을 억제하고, 폐암세포의 성장을 억제하며, 폐암의 전이를 억제시키며, 폐암에 의해 유발되는 진통에 유용한 통증억제 효과를 가짐으로써, 독성이 없고 효과적이며 안전한 혈관신생 억제제, 폐암의 예방 및 치료용 조성물, 및 통증의 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 혈관신생 관련 질환 또는 폐암의 증상을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 혈관신생 관련 질환 또는 폐암의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 조성물을 투여하여 혈관신생 관련 질환 또는 폐암의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 봉독(Bee Venom) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제제를 제공한다.

상기 봉독은 벌의 독선에서 분비되는 분비물을 의미하며, 벌의 독선 분비물이기만 하면 특별히 한정되지 않는다.

상기 혈관신생 관련 질환은 혈관종, 혈관섬유종, 관절염, 당뇨병성 망막증, 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막질환, 퇴화반, 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염 및 여드름으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 봉독 추출물은 그 성분이 하기 표 1에 기재된 국제표준함량에 충족하는 것이면 특별히 제한하지 않으며, 멜리틴(Melitin) 성분이 40% 이상 함유하는 것을 사용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에서는 봉독 추출물이 혈관세포의 성장, 이동 및 분화를 억제하는 효능을 가지는지 알아보기 위해, 혈관세포에서 VEGF 성장인자를 이용하여 성장, 이동 또는 분화를 유도한 후 다양한 농도의 봉독 추출물을 처리하여 ELISA 리더기 및 현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과, 봉독 추출물이 상기 성장인자에 유도된 혈관세포의 증식만을 억제하였고, 혈관세포의 이동 및 분화를 유의하게 억제하였다(도 1 내지 도 3 참조).

본 발명에서는 봉독 추출물이 생체 내에서 혈관신생을 억제하는 효능을 가지는지 알아보기 위해, 쥐의 피하 내 마트리겔(Matrigel)에 VEGF 성장인자 및 봉독 추출물을 투여한 후, 마트리겔을 꺼내어 ELISA 리더기 및 현미경을 이용하여 조직관찰, 적혈구수 및 헤모글로빈량을 측정하였다. 그 결과, 봉독 추출물이 상기 성장인자에 증가된 혈관형성을 감소시켰고, 봉독 추출물의 농도 의존적으로 적혈구수 및 헤모글로빈량을 유의하게 감소시켰다(도 4 참조).

따라서, 본 발명의 봉독 추출물은 혈관세포의 성장, 이동, 분화 및 혈관 형성을 억제함으로써 혈관신생 억제제, 또는 혈관신생에 의해 유발되는 질환 예방 및 치료에 이용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에서는 봉독 추출물이 폐암세포주에 대한 특이적인 세포독성을 가지는지 알아보기 위해, 폐암세포주, 대장암세포주, 간암세포주, 유방암 세포주, 전립선암세포주, 림파종 세포주 및 정상세포주에 각각 다양한 농도의 봉독 추출물을 처리한 후 세포독성을 분석하였다. 그 결과, 봉독 추출물의 농도가 약 3.0 ~ 8.0 ㎍/㎖에서 대장암세포주, 간암세포주, 유방암세포주, 전립선암 및 림파종 세포를 50% 정도 사멸시킨 반면에, 폐암세포주는 약 0.5 ~ 1.3 ㎍/㎖의 저농도에서 50% 정도 억제하였으며, 정상세포주에는 세포독성이 거의 없었다(표 2 참조).

본 발명에서는 봉독 추출물이 생체 내에서 폐암세포의 증식을 억제하는지 알아보기 위해, 폐암동물 모델에 봉독 추출물을 투여한 후 희생시켜 현미경을 이용하여 조직을 분석하였다. 그 결과, 폐암세포주에 의해 증가한 혈관의 수가 봉독 추출물에 의해 농도 의존적으로 감소하였고, 봉독 추출물에 의해 폐암세포의 증식이 농도 의존적으로 억제되었으며, 혈관세포의 수 및 성장인자의 발현도 감소하였다(도 5 및 도 6 참조).

본 발명에서는 봉독 추출물이 생체 내에서 폐암세포의 성장 및 전이를 억제하는 효능을 가지는지 알아보기 위해, 폐암동물 모델에 봉독 추출물을 투여한 후 정기적으로 종양의 크기를 측정하였고, 희생시켜 폐로 전이된 조직을 적출하여 관찰하였다. 그 결과, 봉독 추출물이 농도 의존적으로 종양 크기를 유의적으로 감소시켰으며, 종양세포의 전이를 농도의존적으로 유의적으로 감소시켰다(도 7 및 도 8 참조).

따라서, 본 발명의 봉독 추출물은 폐암세포 특이적으로 높은 세포독성을 나타내고, 폐암세포주의 성장을 억제하며, 생체 내에서 암세포의 증식, 혈관형성 및 혈관형성 성장인자의 발현을 현저히 감소시키며, 폐암의 전이를 억제시킴으로써 폐암 예방 및 치료, 및 폐암의 전이 억제에 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에서는 봉독 추출물이 생체 내에서 통증 억제 효능을 가지는지 알아보기 위해, 폐암동물 모델에서 다양한 농도의 봉독 추출물을 투여한 후, 카라기닌(carrageenan) 또는 포르말린를 투여하여 진통을 유발시킨 다음, 통증 억제율을 측정하였다. 그 결과, 봉독 추출물은 카라기닌에 의해 유발된 통증 억제의 경우 소염진통제인 셀레콕시브(celecoxib)와 유사한 억제효과를 나타내었으며, 포르말린에 의해 유발된 통증 억제의 경우 셀레콕시브 보다 우수한 진통 효능을 나타내었다(표 3 및 표 4 참조).

따라서, 본 발명의 봉독 추출물은 폐암동물 모델에서 카라기난(carrageenan) 및 포르말린에 의해 유발한 진통에 유용한 통증억제 효과를 가짐으로써 통증 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 봉독 추출물을 포함하는 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 함유할 수 있다.

상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 피하 주입 또는 피부를 통한 국소 투여(경피 투여)가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001 ~ 100 mg/kg(체중)이 바람직하고, 0.01 ~ 10 mg/kg(체중)이 더욱 바람직하나 이에 한정되 지 않는다.

본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 봉독 추출물의 준비

본 발명자들은 유효성분이 많이 함유되고 안전성이 입증된 '유밀농원'에서 구입한 봉독을 사용하였다. 상기 봉독은 토밀(꿀, 배변 및 꽃가루)이 거의 없으며, 공기 중의 먼지제거를 위한 여과가 된 것이며, 봉독 6 g을 1 g으로 농축시켜 약효능을 증가시킨 것이다. 상기 봉독의 하기 표 1에서 보는 바와 같이 국제표준함량에 충족하는 것이다.

	봉독 국제표준함량	본 연구에 사용한 봉독
수분 (%)	12 미만	4.2
회분 (%)	2 미만	1.2
시알우론산분해효소 (IU/mg)	70 이상	100
인산지방질효소 A2 (IU/mg)	100 이상	160
용혈반응 (sec)	480 미만	350
물에 녹지않는성분 (%)	10 미만	0
멜리틴 (%)	40 이상	40 이상

<실험예 1> 봉독의 혈관세포 성장 억제 효능 확인

<1-1> 혈관세포의 배양

경희의료원으로부터 산모의 탯줄을 분리 받아 정맥으로부터 혈관세포를 분리하였다. Cord buffer(0.2% glucose phosphate buffered saline)로 혈관을 세척 후, 0.2% 제 1형 콜라게나제(type I collagenase)를 정맥에 약 5 ml 가량 넣은 후 37℃에서 5분간 방치하였다. 실온에서 cord buffer 20 ml을 정맥에 넣고 다른 반대편에서 분리되어 나온 혈관세포를 수집하였다. 다시 한번 cord buffer만을 혈관에 주입 후 37℃에서 반응시킨 후 혈관세포를 수집하고 세척하였다. 0.1% 젤라틴(gelatin)이 코팅(coating)된 조직 배양 플라스크(tissue culture flask)(T75 cm²)에 배양하여 계대번호 4부터 7까지 사용하였다.

<1-2> 혈관세포의 성장 측정

혈관세포를 EGM 배지에서 키운 후 0.1% 젤라틴(gelatin) 코팅(coating)된 96 웰 플레이트(well plate)에 5 × 10³cell/ml로 배양하였다. 24시간 후에 무혈청(serum free) 배지로 갈아주고 성장인자(VEGF: 20 ng/ml)와 봉독 추출물을 농도별(0, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10 및 20 ㎍/㎖)로 처리하였다. 37℃에서 72시간 배양한 후에 BrdU 10 ul를 각각 분주하고, 다시 37℃에서 12시간 배양하였다. 세포를 고정하고 anti-BrdU-POD를 첨가하여 반응시킨 후 TMB substrate 발색으로 반응을 종료하였다. 480-650 nm의 흡광도에서 ELISA 리더기(reader)로 분석하였다. 그 결과는 음성대조군에 대한 시료처리군의 흡광도에 대한 %로 표시하였다.

상기 실험 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 VEGF 성장인자가 처리되지 않고 봉독 추출물만을 농도별로 처리하였을 경우 세포의 증식억제가 나타나지 않은 반면에, VEGF 성장인자가 처리된 후 봉독 추출물을 처리하였을 경우 유의하게 세포의 증식억제가 나타났다. 따라서 봉독 추출물은 VEGF 성장인자에 유도된 혈관세포의 증식만을 억제하는 것을 알 수 있다(도 1).

<실험예 2> 봉독의 혈관세포 이동 억제 효능 확인

혈관세포(1 × 10⁶/ml)를 48 웰 보이든 챔버(well boyden chamber) 아래칸에 30 ul씩 분주하고 젤라틴(gelatin)이 코팅(coating)된 막(membrane)을 방치하고 2시간 동안 배양하였다. Upper chamber에 음성대조군, 양성대조군(VEGF; 20ng/ml)과 함께 봉독 추출물(0.2, 1, 5 ug/ml)을 처리하여 2시간 동안 반응시켰다. 상기 막을 고정하고 염색한 후 현미경으로 관찰하여 이동된 혈관의 개수를 카운팅(counting)하였다.

상기 실험 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 VEGF 성장인자에 의해 혈관세포의 이동이 촉진되었고, 봉독 추출물 처리에 의해 혈관세포의 이동이 농도 의존적으로 유의하게 억제되었다(도 2).

<실험예 3> 봉독의 혈관세포 분화 억제 효능 확인

마트리젤(Matrigel)을 48 웰(well)에 200 ul씩 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 방치한 후 혈관세포를 0.4 × 10⁵cell/ml로 마트리젤 위에 분주하였다. 성장인자(VEGF; 20 ng/ml)와 상기 <실시예 1>의 봉독 추출물(BV; 0.2, 1 및 5 ug/ml)을 분주한 후 약 12시간 동안 배양하였다.

상기 실험 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 VEGF 성장인자에 의해 혈관세포의 분화가 촉진되었고, 봉독 추출물 처리에 의해 혈관세포의 분화가 농도 의존적으로 유의하게 감소되었다(도 3).

<실험예 4> 생체 내( in vivo )에서 봉독의 혈관신생 억제 효능 분석

<4-1> 마트리겔(Matrigel)의 조직형태학적 관찰

C57BL/6 쥐의 피하 내에 마트리겔(Matrigel)에 VEGF 성장인자 및 봉독 추출물을 잘 섞어서 1 ml 주사하였다. 1 주일 후 복강내에서 마트리겔을 꺼내어 사진촬영하였고, 10% 포르말린 용액에 고정 후 파라핀 블록을 만들었다. 조직을 5 um로 절단한 후 H&E 염색을 실시하여 현미경으로 관찰하였다.

상기 관찰 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 성장인자에 의해서 혈관형성이 증가되어 마트리겔이 붉은색을 띄었으나, 봉독 추출물 처리에 의해 붉은색이 감소되었다. 또한, 마트리겔의 조직형태학적 관찰 결과, 마트리겔에 성장인자가 주입된 슬라이드에서는 다량의 혈관과 적혈구가 있었으나, 봉독 추출물 처리에 의해 혈관과 적혈구 수가 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(도 4).

<4-2> 마트리겔(Matrigel)의 헤모글로빈 정량

상기 실험예 <4-1>의 마트리겔을 잘게 부수고 으깨어 ELISA 리더기를 이용하여 파장 540 nm에서 흡광도를 측정하여 헤모글로빈량을 측정하였다.

상기 실험 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 성장인자에 의해 헤모글로빈량은 음성대조군에 비해 유의하게 증가하였으나, 봉독 추출물 처리군에서는 농도 의존적으로 감소하였다(도 4).

<실험예 5> 봉독의 세포독성 효능 확인

<5-1> 다양한 종양세포주 및 정상세포의 배양

한국세포주은행으로부터 분양받은 폐암세포주(LLC 및 A549), 대장암 세포주(Colo205 및 HT29), 간암세포주(Hep3B 및 HepG2), 유방암 세포주(MCF7 및 MDA-MB231), 전립선암세포주(PC-3, DU145 및 LNCaP), 림파종 세포주(THP-1, K562 및 U937) 및 정상세포(Raw 264.7)를 각각 100 units/㎖ 페니실린(penicillin)(SIGMA, USA) 및 10% 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum: Hyclone)을 포함한 complete RPMI 1640 배지에 3 × 10⁶ 세포/10 ㎖로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

<5-2> 세포독성 측정

상기 실험예 <5-1>에서 배양된 각종 암세포주와 정상 단핵구 세포주를 5 × 10³cell/well로 96 웰 플레이트(well plate)에 분주하고 5% CO₂, 37℃에서 배양하였다. 24시간 후에 봉독 추출물을 다양한 농도(0, 0.5, 1, 3, 5, 8, 10, 50 및 100 ㎍/㎖)로 처리한 후, 48시간 동안 배양하였다. WST-8(water-soluble tetrazolium salt)를 20 ul씩 첨가한 후 2시간 반응시키고 포르마잔(formazan)이 형성되어 발색되면 450 nm의 흡광도에서 ELISA 리더기(reader)로 측정하였다.

상기 실험 결과, 표 2에서 보는 바와 같이 봉독 추출물의 농도가 약 3.0 ~ 8.0 ㎍/㎖에서 대장암세포주, 간암세포주, 유방암세포주, 전립선암 및 림파종 세포를 50% 정도 사멸시킨 반면에, 폐암세포주는 약 0.5 ~ 1.3 ㎍/㎖의 저농도에서 50% 정도 억제하였다(표 2).

기원	세포주	세포생존율(IC₅₀)
Mouse Lewis Lung Carcinoma	LLC	0.5 ㎍/ml
Human Lung Adenocarcinoma	A549	1.3 ㎍/ml
Human Colon Cancer	Colo205	4.4 ㎍/ml
Human Colon Cancer	HT29	5.2 ㎍/ml
Human Hepatocellular Carcinoma	Hep3B	6.1 ㎍/ml
Human Hepatocellular Carcinoma	HepG2	5.2 ㎍/ml
Human Breast Cancer (Estrogen sensitive)	MCF7	4.0 ㎍/ml
Human Breast Cancer (Estrogen insensitive)	MDA-MB 231	5.8 ㎍/ml
Human Prostate Cancer (Androgen-independent)	PC-3	4.1 ㎍/ml
Human Prostate Cancer (Androgen-independent)	DU145	3.5 ㎍/ml
Human prostate Cancer (Androgen-dependent)	LNCaP	8.0 ㎍/ml
Human T cell Leukemia	THP-1	3.0 ㎍/ml
Human Erythrocyte Leukemia	K562	3.1 ㎍/ml
Human Monocytic Leukemia	U937	3.3 ㎍/ml
Murine Monocyte	Raw 264.7	> 20.0 ㎍/ml

<실험예 6> 폐암동물 모델에서 봉독의 세포 증식 억제 효능 분석

<6-1> 종양 공급 혈관수 측정

폐암 세포(Lewis lung carcinoma; LLC)(5 × 10⁵cell)를 C57BL/6 쥐의 등에 피하내로 주사하였다. 3일째부터 봉독 추출물을 5회 동안 흉추 3번째에 있는 등 경혈점에 0.05 cc씩 양쪽으로 주사하였다. 7일 째에 희생시킨 후 종양 부위 피부(tumor-inoculated skin)를 도려내어 분리한 후 현미경을 이용하여 종양 공급(tumor-supplying) 혈관수를 측정하였다.

상기 실험 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 폐암세포주에 의해 혈관의 수가 증가하였으나, 봉독 추출물의 처리군에서는 농도 의존적으로 혈관의 수가 감소하였다(도 5).

<6-2> 면역조직학적 분석

상기 실험예 <6-1>에서 분리한 암 조직들을 10% 포르말린 용액에 고정하였고, 파라핀 블록을 제작하였다. 파라핀 포매된 조직을 마이크로톰으로 5 마이크론으로 절단하여 절편을 제작하였다. 탈파라핀 과정을 거친 후, 과산화수소를 처리하여 내재성 효소를 억제시켰다. 단백분해효소인 proteinase K 등을 사용하여 포르말린 고정에 의하여 형성된 교차결합을 원상태로 되돌렸다. VEGF, CD31 및 PCNA 항체(Sigma, USA)를 반응시킨 후 반응하지 않은 항체를 세척하였다. 퍼록시다제(Peroxidase)가 표지된 2차 항체와 스트렙토-아비딘(strepto-avidin)으로 표지시킨 후 발색하였다.봉입 후 현미경 관찰하여 사진을 찍었고, 증식억제효과, 혈관형성억제 효과를 분석하였다.

상기 실험 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 봉독 추출물에 의해 암세포의 증식이 농도 의존적으로 억제되었고, 혈관세포의 수 및 성장인자의 발현도 감소하였다(도 6).

<실험예 7> 폐암동물 모델에서 봉독의 세포 성장 및 전이 억제 효능 분석

<7-1> 폐암 성장억제 측정

폐암 세포(Lewis lung carcinoma; LLC)(2 × 10⁴cell)를 C57BL/6 쥐의 옆구리에 피하내로 주사하였다. 3일 후에 봉독 추출물 1, 10 및 100 ug/ml를 각각 2일 간격으로 0.05 cc씩 2군데에 12회 주사하였다. 3일 간격으로 종양의 크기와 체중을 측정하였다.

상기 측정 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 봉독 추출물의 농도 의존적으로 종양 크기가 유의적으로 감소하였다(도 7).

<7-2> 폐암의 전이 억제 효과 측정

상기 실험예 <7-1>의 쥐를 3주 후에 희생시켜 폐로 전이된 조직을 적출하여 노들의 수를 헤아려 전이 억제 정도를 분석하였다.

상기 관찰 결과, 도 8에서 보는 바와 같이 음성대조군은 폐에 검은점과 노들이 다량 존재한 반면, 봉독 추출물 처리군에서는 폐로 전이된 종양세포의 덩어리가 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다(도 8).

<실험예 8> 폐암동물 모델에서 봉독의 통증 억제 효능 분석

<8-1> Paw pressure 실험

폐암 세포(Lewis lung carcinoma; LLC)(2 × 10⁴cell)를 C57BL/6 쥐의 옆구리에 피하내로 주사하여 폐암동물 모델을 제조한 후, 3주째에 진통실험을 실시하였다. 실험군으로 봉독 추출물을 농도별(1, 10 및 100 ug/ml)로 주사하고, 양성 대조군으로 비스테로이드계 소염진통제인 셀레콕시브(celecoxib)를 주사한 후, 카라기닌(carrageenan)을 좌측 후지에 피하 투여하고 analgesic meter를 사용하여 통증을 회피 반응을 보일 때까지의 무게를 측정하여 증류수만을 투여한 음성대조군에 대비하여 억제율을 계산하였다.

구분	농도 (ug/ml)	통증 억제율 (%)
봉독 추출물	1	23.6 ± 1.4
봉독 추출물	10	48.9 ± 3.4
봉독 추출물	100	52.1 ± 4.1
셀레콕시브	100	49.9 ± 3.3

상기 실험 결과, 표 3에서 보는 바와 같이 봉독 추출물의 통증 억제율이 셀레콕시브(celecoxib)와 유사한 억제효과를 나타내어 우수한 진통효과를 확인할 수 있었다(표 3).

<8-2> 포르말린(Formalin) 동물모델 시험

폐암 세포(Lewis lung carcinoma; LLC)(2 × 10⁴cell)를 C57BL/6 쥐의 옆구리에 피하내로 주사하여 폐암동물 모델을 제조한 후, 3주째에 진통실험을 실시하였다. 실험군으로 봉독 추출물을 농도별(1, 10 및 100 ug/ml)로 주사하고, 양성 대조군으로 비스테로이드계 소염진통제인 셀레콕시브(celecoxib)를 주사한 후, 1% 포르말린(formalin)을 후지에 피하 투여한 다음, 후지 바닥을 핥는 시간을 측정하여 증류수만을 투여한 음성대조군을 대비하여 억제율을 계산하였다.

구분	농도 (ug/ml)	통증 억제율 (%)
봉독 추출물	1	30.1 ± 2.2
봉독 추출물	10	53.8 ± 6.3
봉독 추출물	100	66.9 ± 4.8
셀레콕시브	100	59.1 ± 7.2

상기 실험 결과, 표 4에서 보는 바와 같이 봉독 추출물의 통증 억제율이 셀레콕시브(celecoxib)보다 우수한 억제효과를 나타내어 우수한 진통효과를 확인할 수 있었다(표 4).

본 발명은 혈관형성 억제 치료와 관련된 약제, 폐암의 항암 치료와 관련된 약제, 폐암의 전이 억제 치료와 관련된 약제, 및 폐암의 통증 등 진통 억제 치료에 관련된 약제의 개발, 및 이들을 이용한 개선 또는 치료 방법 연구에 이용될 수 있다.

도 1은 혈관세포에 VEGF 성장인자가 처리되지 않고 봉독 추출물만을 농도별로 처리하였을 경우(오른쪽), 및 VEGF 성장인자가 처리된 후 봉독 추출물을 농도별로 처리하였을 경우(왼쪽)에서 혈관세포의 증식 정도를 나타낸 그래프이다.

도 2는 봉독 추출물이 처리되지 않은 대조군, 혈관세포에 VEGF 성장인자가 처리된 경우, 및 봉독 추출물을 농도별로 처리하였을 경우에 혈관세포의 이동을 관찰한 결과를 나타낸 그림이다.

도 3은 봉독 추출물이 처리되지 않은 대조군, 혈관세포에 VEGF 성장인자가 처리된 경우, 및 봉독 추출물을 농도별로 처리하였을 경우에 혈관세포의 분화를 관찰한 결과를 나타낸 그림이다.

도 4는 생체 내에 VEGF 성장인자 및 봉독 추출물을 투여한 후, 추출한 마트리겔(Matrigel)의 혈관 및 적혈구를 보기 위해 조직형태학적 관찰한 결과를 나타낸 그림이고(위쪽), 상기 마트리겔에서 헤모글로빈량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(아래쪽).

도 5는 폐암동물 모델에서 봉독 추출물을 농도별로 투여한 후 종양 공급(tumor-supplying) 혈관수를 측정한 결과를 나타낸 그림이다.

도 6은 폐암동물 모델에서 봉독 추출물을 농도별로 투여한 후 분리한 암세포에서 VEGF, CD31 및 PCNA의 발현량을 나타낸 그림이다.

도 7은 폐암동물 모델에서 봉독 추출물을 농도별로 투여한 후 3일 간격으로 종양의 크기를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 폐암동물 모델에서 봉독 추출물을 농도별로 투여한 후 3주째 희생시켜 폐를 적출하여 폐로 전이된 종양세포의 덩어리를 관찰한 결과를 나타낸 그림이다.

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봉독을 유효성분으로 함유하는 폐암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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봉독을 유효성분으로 함유하는 폐암 혈관신생 억제용 약학적 조성물.
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봉독을 유효성분으로 함유하는 폐암에 의해 유발된 통증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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