CN110423804A

CN110423804A - 一种筛查稽留流产风险的生物标志物集合及筛查方法

Info

Publication number: CN110423804A
Application number: CN201910740560.3A
Authority: CN
Inventors: 刘晓瑞; 林羿; 郭玉娜; 曹云云; 秦晓黎; 何晓英; 谢咸晶
Original assignee: International Peace Maternity & Child Health Hospital Of China Welfare Institute
Current assignee: International Peace Maternity & Child Health Hospital Of China Welfare Institute
Priority date: 2019-08-12
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2019-11-08
Anticipated expiration: 2039-08-12
Also published as: CN110423804B

Abstract

本发明公开了一种用于筛查稽留流产风险的生物标志物集合，使用该标志物集合能够提前预判稽留流产风险。本发明还公开了一种筛查稽留流产风险的方法，包括提取受试者的阴道分泌物中的DNA，扩增16S rDNA的V4区，利用测序方式分析扩增产物，进行结果判断；其中，结果判断使用如上所述的生物标志物集合。该生物标志物集合以及筛查方法有助于降低稽留流产的发生，提高IVF植入成功率，指导育龄妇女优生优育。

Description

一种筛查稽留流产风险的生物标志物集合及筛查方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种筛查稽留流产风险的生物标志物集合及筛查方法。

背景技术

稽留流产又称过期流产或死胎不下，是指胚胎停止发育后2个月尚未自然排出者,称为稽留流产。稽留流产后已死亡的胚胎及胎盘组织如在宫腔内稽留，胎盘机化，易与子宫壁紧密粘连、不易剥离，极易发生流产不全、流产感染；若稽留时间过长，退行性变的胎盘组织释放出凝血活酶进入母体循环，可导致严重的凝血功能障碍，继发弥散性血管内凝血，发生大出血等并发症，更有甚者需行子宫切除术以止血，严重者可致死亡。稽留流产给患者带来巨大的心理和生理压力。此外，稽留流产可能导致的复发性流产及体外受精-胚胎移植(IVF-ET)植入的“珍贵儿”流产给患者身心造成更大的伤害，也给患者家庭带来极大的痛苦。如何预防稽留流产的发生，尤其是如何快速准确的对染色体正常胚胎的怀孕母体进行稽留流产风险筛查，预防稽留流产的发生，是目前临床亟待研究解决的问题。

现行孕前检查项目包括静脉血检测血常规、肝功能、妇科内分泌、ABO溶血、脱畸全套、染色体异常；尿常规检测肾功能；阴道分泌物检测滴虫、霉菌、支原体、衣原体等妇科炎症和性传播疾病，尚未涉及稽留流产的高风险筛查。因此，提供有效诊疗靶标，建立稽留流产高风险筛查的孕前检查技术以有效指导育龄妇女优生优育显得尤为重要。

女性生殖道是人体重要的微生态区，其中有多种微生物生长于阴道粘膜表面，在这一局部微生态系统中，微生物与微生物之间、微生物与宿主之间相互作用，达到平衡，使微生物与宿主形成共生状态。健康的阴道微生物菌群是由一种或几种乳酸杆菌(Lactobacillus)占主导地位的微环境结构，特别是在妊娠期间，阴道微生物菌群结构向着主要由一种或两种乳酸杆菌的结构转变。在正常阴道微生物菌群中，优势菌乳酸杆菌通过分泌乳酸(维持酸性环境)、分泌抑菌素、竞争营养物质(如糖原)、空白占位(竞争粘附阴道上皮细胞)，以及刺激阴道局部免疫来抑制其他寄生菌生长，从而抵御病原体的入侵。异常的阴道菌群或阴道微生态紊乱会导致不良妊娠结局和辅助生殖成功率低等生殖健康问题。近年来，病原体感染引起的流产、早产和孕中期胎膜早破等问题已被重视，输卵管不孕、早产等妊娠相关疾病在一定程度上与阴道微生物组成变化有关。母体-阴道细菌之间的相互作用有可能在决定妊娠结局方面发挥着重要作用。

高通量测序技术是新一代测序技术，此技术可以同时对数百万个短序列读长进行测序。测序时间短，结果精确，测序成本低，目前已广泛应用于基因组序列分析。目前此方法还未报道用于阴道菌群微生物测序。

16S rDNA是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中。16SrDNA种类少，含量大(约占细菌DNA含量的80％)，分子大小适中，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，因此，16S rDNA扩增子测序技术已经成为微生物群落结构研究的一种成熟有效的技术，但尚无报道将此方法应用于分析阴道菌群种类和丰度，并判断阴道菌群与稽留流产相关性。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种筛查稽留流产风险的生物标志物集合，以及稽留流产风险筛查方法。

发明内容

限于已有孕前检查技术及DNA测序技术的成本高、时间长等因素，目前尚未建立筛查稽留流产风险的生物标志物集合及筛查方法，本发明所要解决的技术问题是提供一种筛查稽留流产风险的生物标志物集合及筛查方法。

本发明的第一个方面提供了一种用于筛查稽留流产风险的生物标志物集合，包括：

选自下组中一种或多种的菌属：Proteobacteria(变形菌门)、Spirochaetae(螺旋菌门)、Verrucomicrobia(疣微菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Clostridiales(梭菌目)、Bacteroidales(拟杆菌目)、Bacillales(芽孢杆菌目)、Burkholderiales(伯克氏菌目)、Desulfovibrionales(脱硫弧菌目)、Lactobacillus(乳酸杆菌属)、Bacteroides(拟杆菌属)、Halomonas(盐单胞菌属)、Miscellaneous Crenarchaeotic group(杂色泉古菌属)、Bacillus(芽孢杆菌属)、Staphylococcus(葡萄球菌属)、Escherichia(埃希氏菌属)、Shigella(志贺氏菌属)、Acetobacter(醋酸杆菌属)、Fusobacterium(梭杆菌属)、Parabacteroides(副杆状菌属)、Ruminococcacease(瘤胃菌科)、Brevundimonas(短波单胞菌属)、Spirochaetes(螺旋体属)、Nitrospira(硝化螺菌属)和Roseburia(罗氏菌属)；和/或

选自下组中一种或多个的操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTU)：如SEQ ID NO.1所示的OTU554、如SEQ ID NO.2所示的OTU3557、如SEQ ID NO.3所示的OTU8004、如SEQ ID NO.4所示的OTU8286、如SEQ ID NO.5所示的OTU4876、如SEQ ID NO.6所示的OTU7047、如SEQ ID NO.7所示的OTU7360、如SEQ ID NO.8所示的OTU2951、如SEQ IDNO.9所示的OTU897、如SEQ ID NO.10所示的OTU2753、如SEQ ID NO.11所示的OTU2190、如SEQ ID NO.12所示的OTU915、如SEQ ID NO.13所示的OTU1446、如SEQ ID NO.14所示的OTU3826、如SEQ ID NO.15所示的OTU727和如SEQ ID NO.16所示的OTU5608。

可选地，稽留流产分为胚胎停育和空囊；其中，

胚胎停育的生物标志物集合包括菌属Lactobacillus、MiscellaneousCrenarchaeotic group、Clostridiales、Bacteroidales、Bacillales、Burkholderiales和Desulfovibrionales；和/或选自下组中一种或多个的操作分类单元：OTU554，OTU3557，OTU8004，OTU8286，OTU4876，OTU7047，OTU7360，OTU2951，OTU897，OTU2753，OTU2190和OTU915；

空囊的生物标志物集合包括Lactobacillus、Roseburia和Acetobacter；和/或选自下组中一种或多个的操作分类单元：OTU1446，OTU3826，OTU727，OTU5608。

本发明的第二个方面提供了上述用于筛查稽留流产风险的生物标志物集合的应用，该生物标志物集合用于判断发生胚胎停育和空囊的风险；其中，

若受试者的样品中Lactobacillus相对丰度低，下组中的一种或多种菌属的相对丰度高：Miscellaneous Crenarchaeotic group、Clostridiales、Bacteroidales、Bacillales、Burkholderiales和Desulfovibrionales；和/或下组中的一个或多个操作分类单元的相对丰度高：OTU554，OTU3557，OTU8004，OTU8286，OTU4876，OTU7047，OTU7360，OTU2951，OTU897，OTU2753，OTU2190，OTU915，则受试者发生胚胎停育的风险高；

若受试者的样品中Lactobacillus相对丰度低，Roseburia和/或Acetobacter的相对丰度高；和/或下组中的一个或多个操作分类单元的相对丰度高：OTU1446，OTU3826，OTU727，OTU5608，则受试者发生空囊的风险高。

可选地，样品为阴道分泌物。

可选地，通过扩增样品中DNA的16S rDNA的V4区判断菌属的相对丰度。

本发明的第三个方面提供了一种上述生物标志物集合在制备筛查稽留流产风险的试剂中的应用。

本发明的第四个方面提供了一种用于筛查稽留流产风险的试剂盒，其该试剂盒包括检测如下组中一种或多种的菌属的试剂：Proteobacteria、Spirochaetae、Verrucomicrobia、Bacteroidetes、Clostridiales、Bacteroidales、Bacillales、Burkholderiales、Desulfovibrionales、Lactobacillus、Bacteroides、Halomonas、Miscellaneous Crenarchaeotic group、Bacillus、Staphylococcus、Escherichia、Shigella、Acetobacter、Fusobacterium、Parabacteroides、Ruminococcacease、Brevundimonas、Spirochaetes、Nitrospira和Roseburia。

本发明的第五个方面提供了一种稽留流产风险筛查的方法，包括提取受试者的阴道分泌物中的DNA，扩增16S rDNA的V4区，利用测序方式分析扩增产物，进行结果判断；

其中，结果判断使用如上所述的用于筛查稽留流产风险的生物标志物集合。

可选地，扩增16S rDNA的V4区的引物对如SEQ ID NO.17所示的520F和如SEQ IDNO.18所示的802R，其中，在引物502F的5’端还添加有用于区分不同样本的条码序列。可选地，其中引物520F中的条码序列为一个7个碱基的寡核苷酸序列，用来区分同一文库中的不同样本。

可选地，测序为高通量测序。

在一个可选的实施方式中，孕前稽留流产风险筛查的检测方法，包括如下步骤：

步骤一，收集阴道分泌物；

步骤二，提取样品DNA，PCR法扩增，回收扩增产物；

步骤三，建立DNA文库，进行高通量测序；

步骤四，分析测序结果，筛查稽留流产风险。

本实施方式中，将可用于筛查稽留流产发生风险的微生物菌群的方法和将操作分类单元(OTU)应用于阴道微生物菌群中。其中OTU是人为给某一个分类单元(品系，种，属，分组等)设置的同一标志。通常按照97％的相似性阈值将序列划分为不同的OTU，每一个OTU通常被视为一个微生物物种。相似性小于97％就可以认为属于不同的种，相似性小于93％-95％，可以认为属于不同的属。样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度都是基于对OTU的分析。

本实施方式中的目的菌优选的为Proteobacteria、Spirochaetae、Verrucomicrobia、Bacteroidetes、Clostridiales、Bacteroidales、Bacillales、Burkholderiales、Desulfovibrionales、Lactobacillus、Bacteroides、Halomonas、Miscellaneous Crenarchaeotic group、Bacillus、Staphylococcus、Escherichia、Shigella、Acetobacter、Fusobacterium、Parabacteroides、Ruminococcacease、Brevundimonas、Spirochaetes、Nitrospira和Roseburia等。

所述的OTU优选的有OTU554，OTU3557，OTU8004，OTU8286，OTU4876，OTU7047，OTU7360，OTU2951，OTU897，OTU2753，OTU2190，OTU915，OTU1446，OTU3826，OTU727，OTU5608。

可选地，阴道菌群中目的菌丰度为待测阴道分泌物中目的菌在所述阴道菌群中的含量。

阴道分泌物中目的菌在所述阴道菌群中的含量为待测阴道菌群中目的菌/OTU的16S核糖体RNA基因的第4可变区(V4)扩增产物的DNA片段个数与待测阴道菌群中所有细菌16S核糖体RNA基因的V4区扩增产物的DNA片段个数的百分比。

可选地，待测阴道分泌物为备孕女性、发生稽留流产(胎停或空囊)患者和相近孕周正常妊娠孕妇的阴道分泌物。

本实施方式的具体实施步骤如下：

在步骤一中，阴道分泌物的取样，可采用目前存在的所有阴道分泌物取样方法；本研究中采用窥阴器，使用一次性医用棉拭子，采集阴道后穹窿(Posterior fornix)处的分泌物，插回套管，暂存于生物样本运输箱，并在取样4小时内转移至-80℃冰箱保存，或直接进行DNA提取。样本DNA的提取可将样本置于含无菌的PBS缓冲液的试管内，超声振荡20s洗脱重悬，使用QIAGEN公司QIAampBiOstic Bacteremia DNA Kit试剂盒提取DNA(但不局限于该DNA提取试剂盒)，具体步骤根据试剂盒说明书操作。

在步骤二中，对样本进行PCR扩增和产物回收。使用引物对520F(5′-barcode+AYTGGGYDTAAAGNG-3′)和802R(5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′)扩增提取从阴道分泌物提取到的DNA上的16S rDNA的V4区。其中520F引物中的barcode为一个7个碱基的寡核苷酸序列，用来区分同一文库中的不同样本。(PCR按照《分子克隆技术》操作步骤进行，其中所用高保真聚合酶可为目前市售任意品牌聚合酶，可选的为NEB Q5DNA高保真聚合酶)。PCR扩增获得的产物经2％琼脂糖凝胶电泳，得到目的条带，切胶回收后用凝胶回收试剂盒回收，或选择磁珠(如Beckman公司的AMPure XP磁珠)对PCR产物进行纯化。利用Quant-iTPicoGreen dsDNAAssay Kit试剂盒对纯化后的PCR产物进行定量，然后按照每个样本所需数据量进行混样。

在步骤三中，对扩增产物进行文库构建和高通量测序。对所收集的PCR产物可采用目前已有测序技术进行测序，如利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library PrepKit建库。取1μL文库，用Agilent High Sensitivity DNA Kit对文库质检，单一峰的文库为合格文库。可使用已有高通量测序仪，本发明优选使用Illumina Miseq Reagent Kit V3(600cycles)进行2×300bp双端测序。

在步骤四中，根据测序结果进行微生物种类及含量的生物信息学分析。

将测序产生的DNA片段按照barcode拆分到各个样本，生成各个样本的DNA片段集合。利用USEARCH8.0对测序原始数据预处理：提取0错配序列；过滤掉成对测序读长(reads)拼接重叠区小于50bp，错配率大于0.1的序列；过滤掉拼接序列长度小于400bp的序列。利用Usearch OTU分析流程，按照97％相似性对非重复序列(除去单序列和嵌合体)进行OTU聚类，生成OTU表格。采用RDP classifier贝叶斯算法对97％相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并在界门纲目科属种各水平统计每个样本的群落组成。

步骤四中，稽留流产风险的判断标准如下

(1)、如果阴道分泌物中Lactobacillus相对丰度低，且MiscellaneousCrenarchaeotic group、Clostridiales、Bacteroidales、Bacillales、Burkholderiales和Desulfovibrionales等对应的OTUs相对丰度较高，或12个可作为稽留流产(胎停)区别于正常妊娠的OTU-标志物(OTU554，OTU3557，OTU8004，OTU8286，OTU4876，OTU7047，OTU7360，OTU2951，OTU897，OTU2753，OTU2190，OTU915)的相对丰度高，则该个体发生稽留流产(胎停)的风险较高，

(2)、若Lactobacillus相对丰度低，Roseburia和Acetobacter属的相对丰度过高，4个可作为稽留流产(空囊)区别于正常妊娠的OTU-标志物(OTU1446，OTU3826，OTU727，OTU5608)相对丰度高，则该个体发生稽留流产(空囊)的风险较高。

通过本发明的用于筛查稽留流产风险的生物标志物集合，结合高通量测序技术对阴道菌群的16sRNA序列进行快速测定，判断与稽留流产相关的菌群在阴道菌群种所占丰度，提前预判稽留流产风险，有助于降低稽留流产的发生，提高IVF植入成功率，指导育龄妇女优生优育。

以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个实施例中样本中检测到微生物在属水平统计每个样本的群落组成，具体为差异菌属在各组样本中的相对丰度直方图；

图2为正常妊娠、稽留流产(空囊与胚胎停育)患者中，不同群落间菌群差异的PCoA图；

图3为正常妊娠、稽留流产(空囊与胚胎停育)患者中，不同群落差异的菌群生物标志物图；

图4为正常妊娠、稽留流产(空囊与胚胎停育)患者中，各样本OTU水平的聚类热图；

图5为用来区分正常妊娠与稽留流产(胚胎停育)患者的随机森林分类模型和预测模型的概率值；图5a随机森林分类模型，确定了12个OTU标志物；图5b是构建阶段的预测模型的概率值(AUC)图；图5c是验证阶段的预测模型的概率值(AUC)图；

图6为用来区分正常妊娠与稽留流产(空囊)患者的随机森林分类模型和预测模型的概率值；图6a随机森林分类模型，确定了4个OTU标志物；图6b是构建阶段的预测模型的概率值(AUC)图；图6c是验证阶段的预测模型的概率值(AUC)图。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，所采用试剂盒按照试剂盒自带说明书进行操作，设备使用制造厂商所建议的条件。

实施例

确定与稽留流产相关微生物种类

经B超检查，将具有完整孕囊且内含无胎心率胚胎(胚芽长(CRL)>5mm)或具空囊且确定孕周大于6周为稽留流产(胎停或空囊)，相近孕周具有正常发育胚胎的孕妇为正常对照。孕周由末次月经和最早期超声数据确定。收集35例稽留流产(22例胎停和13例空囊)患者和15例正常对照孕妇为分析比较对象，找出三组孕妇的阴道菌群差别，从而确定能够判断稽留流产(胎停或空囊)发生的菌种指标。

阴道分泌物取样及待测阴道分泌物样本DNA的提取

然后以窥阴器撑开阴道，使用一次性医用棉拭子，采集阴道后穹窿(Posteriorfornix)处的分泌物，插回套管，暂存于生物样本运输箱，并在取样4小时内转移至-80℃冰箱保存，或直接进行DNA提取。

取出拭子，置于含无菌的PBS缓冲液的试管内，超声振荡20s洗脱重悬，使用QIAGEN公司QIAampBiOstic Bacteremia DNA Kit试剂盒提取DNA，具体步骤根据试剂盒说明书操作。

16S rDNA V4区的PCR扩增、纯化及定量

接着使用引物对520F(5′-barcode+AYTGGGYDTAAAGNG-3′)和802R(5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′)扩增所得DNA的16S rDNA V4区。其中前引物中的barcode为一个7个碱基的寡核苷酸序列，用来区分同一文库中的不同样本。PCR采用NEB Q5DNA高保真聚合酶，PCR体系按照选用的高保真聚合酶说明书操作。扩增获得的PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，切去目的条带，用Axygen凝胶回收试剂盒回收对PCR产物进行纯化。利用Quant-iTPicoGreen dsDNA Assay Kit对纯化后的PCR产物进行定量，然后按照每个样本所需数据量进行混样。

文库构建和高通量测序

利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit对PCR产物进行建库。取1μL文库，用Agilent High Sensitivity DNA Kit对文库质检，单一峰的文库为合格文库。使用IlluminaMiseq Reagent Kit V3(600cycles)进行2×300bp双端测序。

微生物种类及含量的生物信息学分析

最后将测序产生的DNA片段按照barcode拆分到各个样本，生成各个样本的DNA片段集合。利用USEARCH8.0对测序原始数据预处理：提取0错配序列；过滤掉成对测序读长(reads)拼接重叠区小于50bp，错配率大于0.1的序列；过滤掉拼接序列长度小于400bp的序列。利用Usearch OTU分析流程，按照97％相似性对非重复序列(除去单序列和嵌合体)进行OTU聚类，生成OTU表格。采用RDP classifier贝叶斯算法对97％相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并在界门纲目科属种各水平统计每个样本的群落组成，属水平差异结果如图1所示。

样本间多样性分析

利用主坐标分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)分析三组人群群落组成的差异性和相似性，结果如图2所示。利用LEfSe分析对三组比较，找到组件在丰度上有显著差异的物种(即biomarker生物标志物)，并利用线性判别分析(LDA)对生物标志物进行评估差异显著的物种影响力(即LDA score)，最终获得生物标志物如图3所示。利用R语言“pheatmap”包对关键的OTUs做热图，并对数据进行样本和物种间丰度相似性聚类，结果显示50个样本聚类为2支，稽留流产(空囊)组单独分为一支，稽留流产(胎停)和正常对照组聚类为一支且分为2个亚支(图4)。其中绝大多数稽留流产(胎停)患者阴道分泌物中Miscellaneous Crenarchaeotic group、Clostridiales、Bacteroidales、Bacillales、Burkholderiales和Desulfovibrionales对应的OTUs相对丰度较高。

稽留流产OTU标志物的建立与验证

从本批样本的每个分组中选取2/3为训练组，1/3为验证组。利用非参数Mann-Whitney U检测两组间的显著性差异。选择相对丰度大于0.001且p<0.05的OTUs作为优选标志物。然后利用随机森林模型进行五倍交叉验证，绘制ROC曲线并计算ROC曲线下面积(AUC)，评估模型效率。图5显示12个OTUs可作为稽留流产(胎停)区别于正常妊娠的OTUs标志物，其预测模型的概率值(AUC)在构建阶段为86.76％，在验证阶段为93.33％，这12个OTUs为OTU554，OTU3557，OTU8004，OTU8286，OTU4876，OTU7047，OTU7360，OTU2951，OTU897，OTU2753，OTU2190，OTU915；图6显示了4个OTUs可作为稽留流产(空囊)区别于正常妊娠的OTU-标志物，其预测模型的概率值(AUC)在构建阶段为96.67％，在验证阶段为77.78％，这4个OTUs为OTU1446，OTU3826，OTU727，OTU5608。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国福利会国际和平妇幼保健院

<120> 一种筛查稽留流产风险的生物标志物集合及筛查方法

<130> 01823-19001PIX

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attgggttta aagtgtccgt agccggttta gtaagttcct ggtaaaatcg ggtagcttaa 60

ctatctatat gctaggaata ctgctatact agagggcggg agaggtctga ggtactacag 120

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<210> 2

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<210> 4

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<212> DNA

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<212> DNA

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acattaactg acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga tacccgagta 240

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ctatccgtat gctaggaata ctactatact agagggcggg agaggtctga ggtactacag 120

gggtaggggt gaaatcttat aatccttgta ggaccaccag tggcgaaggc gtcagactgg 180

aacgcgcctg acggtgaggg acgaaagcca ggggagcgaa ccggattaga tacccgggta 240

<210> 8

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

attgggttta aagcgtgcgc aggcggtttg ctaagaccga tgtgaaatcc ccgggctcaa 60

cctgggaact gcattggtga ctggcaggct agagtatggc agaggggggt agaattccac 120

gtgtagcagt gaaatgcgta gagatgtgga ggaataccga tggcgaaggc agccccctgg 180

gccaatactg acgctcatgc acgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccccagta 240

<210> 9

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

actgggcata aagggcacgc aggcggtgac ttaagtgaga tgtgaaagcc ccgagcttaa 60

cttgggaatt gcatttcata ctgggtcgct agagtacttt agggaggggt agaattccac 120

gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaataccga aggcgaaggc agccccttgg 180

gaatgtactg acgctcatgt gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga tacccgtgta 240

<210> 10

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

attgggttta aagcgtccgt agccggctta gcaagtctcc tgttaaattc agcgacctaa 60

tcgttgagcc gcgggagata ctactaggct aggaggcggg agaggccgac ggtacttccg 120

gggtaggggt gaaattctat aatcccgggc ggaccaccag tggcgaaggc tgtcggctag 180

aacgcgctca acaatgaggg acgaaagctg ggggagcgaa ccggattaga taccctagta 240

<210> 11

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

attgggttta aagggtgcgt aggcggacag ttaagtcagc ggtcaaaacg ggcggctcaa 60

ccgcctgccg ccgttgaaac tggcagtcta gagtgggcga gaagtacgcg gaatgcgcgg 120

tgtagcggtg aaatgcatag atattgcgca gaactccgat tgcgaaggca gcgtaccggc 180

gcccgactga cgctgaggca cgaaagcgtg gggatcgaac aggattagat accccagta 239

<210> 12

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

attgggttta aagggcatgt aggcggtaat ctaagcttgg tgtgaaaggc aggggcttaa 60

ctcctggaca gcattgagaa ctggattgct agagttactg aagtgaaatc agaattccag 120

gtgtaggggt gaaatctgta gatatctgga agaataccaa tggcgaaggc aggtttcagg 180

cagataactg acgctgaggt gcgaaggtgc ggggagcaaa caggattaga taccccagta 240

<210> 13

<211> 239

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

attgggttta aagggtgcgt aggcgggttg ctaagtcagt ggtaaaagcg tgtggctcaa 60

ccataccaag ccattgaaac tggcgatctt gagtgtaaac gaggtaggcg gaatgtgacg 120

tgtagcggtg aaatgcttag atatgtcaca gaaccccgat tgcgaaggca gcttaccagc 180

atacaactga cgctgaggca cgaaagcgtg ggtatcaaac aggattagat accccagta 239

<210> 14

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

attgggttta aagggtgcgt aggctgcgcg gaaagttggg tgtgaaagcc ctcagctcaa 60

ctggggaatt gcattcaaaa ctaccgtgct cgagggagac agaggtaagc ggaactcaag 120

gtggagcggt gaaatgcgtt gatatcttga ggaacaccgg tggcgaaggc ggcttactgg 180

gtctcttctg acgctgaggc acgaaagcta aggtagcaaa cgggattaga taccccagta 240

<210> 15

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

attgggttta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa 60

ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac 120

gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg 180

tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccccagta 240

<210> 16

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

attgggttta aagggagcgt agacgggaga ttaagtcagc tgtgaaagtt tgaggcccaa 60

ccttaaaatt gcagttgata ctggtttcct tgagtgcggt tgaggtgtat ggaattcgtg 120

gtgtagcggt gaaatgctta gatatcacga agaactccga ttgcgaaggc agtacactaa 180

gccgtaactg acgttgaggc tcgaaagtgt gggtatcaaa caggattaga taccccagta 240

<210> 17

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aytgggydta aagng 15

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tacnvgggta tctaatcc 18

Claims

1.一种用于筛查稽留流产风险的生物标志物集合，其特征在于，所述集合包括：

选自下组中一种或多个的操作分类单元：如SEQ ID NO.1所示的OTU554、如SEQ IDNO.2所示的OTU3557、如SEQ ID NO.3所示的OTU8004、如SEQ ID NO.4所示的OTU8286、如SEQID NO.5所示的OTU4876、如SEQ ID NO.6所示的OTU7047、如SEQ ID NO.7所示的OTU7360、如SEQ ID NO.8所示的OTU2951、如SEQ ID NO.9所示的OTU897、如SEQ ID NO.10所示的OTU2753、如SEQ ID NO.11所示的OTU2190、如SEQ ID NO.12所示的OTU915、如SEQ ID NO.13所示的OTU1446、如SEQ ID NO.14所示的OTU3826、如SEQ ID NO.15所示的OTU727和如SEQID NO.16所示的OTU5608。

2.如权利要求1所述的用于筛查稽留流产风险的生物标志物集合，其特征在于，所述稽留流产分为胚胎停育和空囊；

所述胚胎停育的生物标志物集合包括菌属Lactobacillus、MiscellaneousCrenarchaeotic group、Clostridiales、Bacteroidales、Bacillales、Burkholderiales和Desulfovibrionales；和/或选自下组中一种或多个的操作分类单元：OTU554，OTU3557，OTU8004，OTU8286，OTU4876，OTU7047，OTU7360，OTU2951，OTU897，OTU2753，OTU2190和OTU915；

所述空囊的生物标志物集合包括Lactobacillus、Roseburia和Acetobacter；和/或选自下组中一种或多个的操作分类单元：OTU1446，OTU3826，OTU727，OTU5608。

3.如权利要求1所述的用于筛查稽留流产风险的生物标志物集合的应用，其特征在于，所述生物标志物集合用于判断发生胚胎停育和空囊的风险；其中，

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述样品为阴道分泌物。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，通过扩增所述样品中DNA的16S rDNA的V4区判断所述菌属的相对丰度。

6.一种如权利要求1或2所述的用于筛查稽留流产风险的生物标志物集合在制备筛查稽留流产风险的试剂中的应用。

7.一种用于筛查稽留流产风险的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测如下组中一种或多种的菌属的试剂：Proteobacteria、Spirochaetae、Verrucomicrobia、Bacteroidetes、Clostridiales、Bacteroidales、Bacillales、Burkholderiales、Desulfovibrionales、Lactobacillus、Bacteroides、Halomonas、MiscellaneousCrenarchaeotic group、Bacillus、Staphylococcus、Escherichia、Shigella、Acetobacter、Fusobacterium、Parabacteroides、Ruminococcacease、Brevundimonas、Spirochaetes、Nitrospira和Roseburia。

8.一种稽留流产风险筛查的方法，其特征在于，提取受试者的阴道分泌物中的DNA，扩增16S rDNA的V4区，利用测序方式分析扩增产物，进行结果判断；

其中，结果判断使用如权利要求1或2所述的用于筛查稽留流产风险的生物标志物集合。

9.如权利要求8所述的稽留流产风险筛查的方法，其特征在于，扩增16S rDNA的V4区的引物对如SEQ ID NO.17所示的520F和如SEQ ID NO.18所示的802R，其中，在引物502F的5’端还添加有用于区分不同样本的条码序列。

10.如权利要求8所述的稽留流产风险筛查的方法，其特征在于，所述测序为高通量测序。