CN115161224A - 芽孢杆菌及其在咖啡发酵中的应用 - Google Patents

芽孢杆菌及其在咖啡发酵中的应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供芽孢杆菌及其在咖啡发酵中的应用。本申请的第一方面，提供芽孢杆菌，该芽孢杆菌包括蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HCL2022‑1、阿氏芽孢杆菌(Priestia aryabhattai)HCL2022‑2中的至少一种。上述两株芽孢杆菌从生咖啡豆的内表皮中分离出，这两株芽孢杆菌相比于酵母、芽孢杆菌属的其它已知种或同种的其它株，在应用到咖啡豆的发酵时可以使发酵后的咖啡豆产出更多的绿原酸。

Description

芽孢杆菌及其在咖啡发酵中的应用
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，尤其是涉及芽孢杆菌及其在咖啡发酵中的应用。
背景技术
咖啡是目前消费市场最大的几种饮料之一，其中存在许多促进健康的化合物，包括绿原酸(CGA)等，它们在预防炎症和改善新陈代谢方面具有重要作用，这也使得咖啡具有一些对人体有益的特性。绿原酸是由肉桂酸和奎尼酸酯化形成的酚类化合物，而肉桂酸和奎尼酸是生咖啡豆的主要成分(占干重的6％至14％)。绿原酸具有多种生物活性，包括抗菌、抗炎症，并能够降低患心血管疾病、2型糖尿病、高血压和阿尔茨海默病等代谢疾病的风险。因此，绿原酸含量较高的咖啡被认为具有更好的健康促进作用。因此，有必要提供一种在对咖啡豆进行发酵后能够高效产出绿原酸的微生物。
咖啡豆发酵过程能够增强内部化合物的释放，同时改善咖啡豆的风味特征。咖啡豆的发酵主要是自然发酵和酒桶发酵，这两种发酵过程的进行依赖于其中所含的微生物。在对这些微生物分离后研究发现，芽孢杆菌属的微生物占其中很大一部分，表明这些微生物在发酵过程中的主要作用。然而，关于芽孢杆菌的发酵作用缺乏进一步研究。因此，从生咖啡豆中表征这些内生微生物分离物，及研究它们在改善咖啡发酵过程中的作用是有益的。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种芽孢杆菌，这种芽孢杆菌用于咖啡豆发酵时可以高效产出绿原酸。
本申请的第一方面，提供芽孢杆菌，该芽孢杆菌包括以下至少一种：
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HCL2022-1(下文实施例中称PMT-1)，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62469，保藏日期为2022年5月17日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；
阿氏芽孢杆菌(Priestia aryabhattai)HCL2022-2(下文实施例中称PMT-2)，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62468，保藏日期为2022年5月17日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
根据本申请实施例的芽孢杆菌，至少具有如下有益效果：
上述两株芽孢杆菌从生咖啡豆的内表皮中分离出，这两株芽孢杆菌相比于酵母、芽孢杆菌属的其它已知种或同种的其它株，在应用到咖啡豆的发酵时可以使发酵后的咖啡豆产出更多的绿原酸。
本申请的第二方面，提供菌剂，该菌剂的活性成分包括前述的芽孢杆菌中的至少一种。其中，菌剂是指活菌制剂，例如可以是由作为活性成分的菌体的发酵液加工而成。采用包含前述至少一种芽孢杆菌作为活性成分的菌剂可以在发酵咖啡豆后增加其中的绿原酸含量，从而使发酵后的咖啡豆具有更佳的促进健康的作用。
在其中一些实施方式中，菌剂可以是液体、粉剂或颗粒型，例如直接由菌体的发酵液灌装而成的液态菌剂，或将发酵液经离心、干燥、浓缩等处理方式得到的粉剂菌剂，或将发酵液经载体吸附、造粒等处理方式得到的颗粒菌剂等。
在其中一些实施方式中，液态菌剂中芽孢杆菌的浓度为106～1010CFU/ml，例如可以是106CFU/ml、107CFU/ml、108CFU/ml、109CFU/ml、1010CFU/ml，进一步可以在107CFU/ml以上、在108CFU/ml以上。
本申请的第三方面，提供前述的芽孢杆菌或前述的菌剂的以下任一种应用：
a1)咖啡豆发酵；
a2)制备发酵咖啡豆；
a3)提高咖啡豆绿原酸含量；
a4)提取绿原酸；
a5)改善咖啡风味。
采用上述芽孢杆菌或菌剂对咖啡豆进行发酵后所制得的发酵咖啡豆中绿原酸的含量大大提升，同时咖啡因的含量略有提升或基本维持在原有水平，并且从香气、甜度等多种方面改善了咖啡的风味。
本申请的第四方面，提供咖啡豆的发酵方法，包括将前述的芽孢杆菌或前述的菌剂接种到咖啡豆进行发酵的步骤。利用该发酵方法通过上述的芽孢杆菌或菌剂对咖啡豆进行发酵，可以使其中的绿原酸含量大大提升，从而起到增强咖啡促进健康的效果。
在其中一些实施方式中，发酵前将咖啡豆进行灭菌处理。具体的，采用高压灭菌处理。
在其中一些实施方式中，咖啡豆与芽孢杆菌的比例为20g：(108～1010CFU)。
在其中一些实施方式中，发酵处理的温度为20～50℃，具体的，可以是20℃、25℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、45℃、50℃。进一步的，发酵处理的温度为30～40℃，更进一步约为37℃。
在其中一些实施方式中，发酵处理的时间为1～10天。具体的，可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天。进一步的，发酵处理的时间为1～5天，2～5天、3～5天、4～5天。
在其中一些实施方式中，发酵处理前还包括添加碳源的步骤。具体的，碳源可以是糖，例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉等。
本申请的第五方面，提供发酵咖啡豆，该发酵咖啡豆采用前述的发酵方法获得。
本申请的第六方面，提供发酵咖啡豆提取物，该发酵咖啡豆提取物由前述的发酵咖啡豆提取得到。该发酵咖啡豆提取物可以是水或有机溶剂中至少一种的提取物，有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、石油醚等其中至少一种。具体的，可通过浸提、萃取等方式中的至少一种进行。
本申请的第七方面，提供组合物，该组合物的制备原料包括前述的发酵咖啡豆或前述的发酵咖啡豆提取物。
在其中一些实施方式中，组合物可以是食品、饮料等，经上述发酵后的发酵咖啡豆或其提取物中含有更大量的绿原酸，并且咖啡因的含量略有提升或未发生明显变化，且具有改善的风味，因而可以作为原料成分制备更加促进健康或特殊风味的食品、饮料等。
本申请的第八方面，提供前述的发酵咖啡豆或前述的发酵咖啡豆提取物或前述的组合物在制备以下任一种产品中的应用：
b1)抗炎产品；
b2)预防和/或治疗炎症性疾病的产品；
b3)抗溶血产品；
b4)预防和/或治疗溶血性疾病的产品。
其中，炎症性疾病包括但不限于感染诱发的炎症性疾病、自身免疫性炎症性疾病、移植物排斥等，具体的，可以是炎性反应、败血症、炎性肠病、急性呼吸窘迫症、肺纤维化等。溶血性疾病包括但不限于先天性溶血病或后天性溶血病，其中，后天性溶血病包括免疫性溶血、物理性溶血(例如微血管内溶血、大血管内溶血、撞击性溶血、热诱导溶血等)、感染性溶血等。
在本申请的实施例中，通过抗溶血实验来评估发酵提取物的抗炎特性时发现，发酵后的咖啡豆提取物相比于发酵前可使红细胞活力上升2倍左右，因而发酵咖啡豆或其提取物或组合物具有更好的抗炎、抗溶血方面的作用。
本申请的第九方面，提供绿原酸的制备方法，包括将前述的芽孢杆菌或前述的菌剂接种到发酵底物中进行发酵，并从发酵产物中提取绿原酸的步骤。
在其中一些实施方式中，发酵底物可以是咖啡豆或本领域所熟知的能够利用芽孢杆菌发酵产出绿原酸的其它生物材料。进一步的，在采用包含咖啡豆的发酵底物时，具体的发酵过程参考前文所述。
在其中一些实施方式中，从发酵产物中提取绿原酸包括以下步骤：
将发酵产物(例如发酵后的咖啡豆)与甲醇-水溶液混合，过滤后上清液加入二氯甲烷混合，待甲醇-二氯甲烷相分离后，回收甲醇相，待液体蒸发后获得包含绿原酸的样品，然后通过色谱分离，得到绿原酸。
在其中一些实施方式中，从发酵产物中提取绿原酸包括以下步骤：将发酵产物(例如发酵后的咖啡豆)在沸水中浸提，上清通过色谱分离，得到绿原酸。
本申请的第十方面，提供改善咖啡风味的方法，包括将前述的芽孢杆菌或前述的菌剂接种到咖啡豆中进行发酵的步骤。利用上述发酵后的咖啡豆冲泡得到咖啡时，这些咖啡风味有比较明显的改善，例如在香气、干净度、甜度、酸度、醇厚、风味、余味、平衡、一致性和整体等其中至少一个方面有改善。
在其中一些实施方式中，改善咖啡风味的方法包括将PMT-1或活性成分包含其的菌剂接种到咖啡豆中进行发酵后，使咖啡具有果香。
在本申请实施例中，由咖啡豆的内表皮中分离鉴定出两株芽孢杆菌，这两株芽孢杆菌的发酵液发酵咖啡豆后，咖啡豆中绿原酸的浓度发生了明显变化，而且其风味特征也出现了改变。因而利用上述芽孢杆菌对咖啡进行发酵可以增强咖啡的治疗价值，同时呈现独特的风味特征。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
图1是本申请的实施例中两株微生物的系统发育树，分支上的数字表示进化分支长度。
图2是本申请的实施例中两株微生物在共聚焦显微镜下的观察结果(1000×)，从左到右分别是PMT-1、PMT-2的结果。
图3是本申请的实施例中发酵过程监测结果。其中，A～D分别为PMT-1、PMT-2、酿酒酵母Sc和布氏酵母Sb的监测结果。
图4是本申请的实施例中未烘培的F组咖啡豆发酵前后CGA和咖啡因含量变化的分析结果。
图5是本申请的实施例中不同类型咖啡豆提取物样品对于热诱导溶血后的细胞存活率结果。
图6是本申请的实施例中不同发酵类型咖啡豆的风味评估结果的雷达图。其中，A～E分别是PMT-1、PMT-2、酿酒酵母Sc和布氏酵母Sb和未发酵对照的结果，雷达图坐标分别代表(1)香气、(2)干净度、(3)甜度、(4)酸度、(5)醇厚、(6)风味、(7)余味、(8)平衡、(9)一致性、(10)整体性。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例1
1.菌株的筛选
取中国广东省肇庆市海拔150米处收获成熟的咖啡果(Coffea arabicaL.var.Typica，阿拉比卡小果咖啡-铁皮卡品种)，晒干并水洗后，将最终水分控制在10-12％，得到生咖啡豆，并在室温下密闭储存。
从生咖啡豆浸泡液中分离出内果皮微生物，将分离出的微生物用LB琼脂板在37℃下培养其中的总细菌，使用YPD琼脂板在30℃下培养酵母，使用MRS琼脂板在37℃下培养乳酸菌。进行连续的平板划线以确定菌落形态，其中具有一致形态的分离株被冷冻保存并送去鉴定。
2.菌株的鉴定
用氢氧化钠溶液处理上述分离细菌后，从中提取16S rRNA。使用TaKaRa ExTaq系统进行扩增，扩增体系如下：
表1.PCR扩增体系
Figure BDA0003681747960000061
其中，引物27F的序列为AGAGTTTGATCCTGGCTCA(SEQ ID No.1)；
引物1492R的序列为GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID No.2)。
通过16S/18S/ITS Amplicon Sequencing Services(由华大基因提供)鉴定琼脂凝胶中具有清晰信号的PCR产物。后续使用NCBI比对搜索工具BLAST研究16S rRNA基因测序结果的相似性。为绘制系统发育树，使用Tamura-Nei模型和最大似然法分析最高同一性得分的BLAST结果，绘制使用MEGA 11软件完成。
分子生物学鉴定结果如表2和图1所示，从表中可以看出，两株微生物的16S rRNA与已知序列具有超过99.9％的一致性和覆盖率。
表2.微生物菌种分子鉴定结果
Figure BDA0003681747960000062
对平板上培养的分离物进行形态观察，PMT-1、PMT-2表现出典型的芽孢杆菌特征。共聚焦显微镜观察结果如图2所示，从图中可以看出，这两株均为棒状细菌(长度为2～10μm，宽度为0.5～2μm)。另外，PMT-1菌落形成乳白色颗粒，表面呈蜡状；PMT-2菌落形成淡黄色、粘稠/融合的颗粒，表面有光泽。PMT-1、PMT-2的革兰氏染色结果均为阳性。
综合分子生物学和形态学的结果，将PMT-1鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)，PMT-2鉴定为阿氏芽孢杆菌(Priestia aryabhattai)。其中，阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)由于芽孢杆菌属内物种基于系统发育和分子证据的修订(Guptaet al.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.2020Nov；70(11):5753-5798.)，已从芽孢杆菌属划入新属Priestia中，更名为Priestia aryabhattai，在本申请中，中文名仍保留原有名称。
将上述两株芽孢杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，PMT-1命名为Bacilluscereus HCL2022-1，保藏编号为GDMCC No：62469，保藏日期为2022年5月17日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；PMT-2命名为Priestia aryabhattai HCL2022-2，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62468，保藏日期为2022年5月17日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2
1.初始发酵液的制备
将实施例1筛选出的两株细菌和两种常用的实验室级酵母(Saccharomycescerevisiae BY4741，Sc；Saccharomyces boulardii lyo，Sb)接种在YD培养基(10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖)中，在37℃(细菌)或30℃(酵母)和220rpm下过夜。在浓度达到约108CFU/ml后，得到初始发酵液。
2.咖啡豆的发酵
发酵前，生咖啡豆高压灭菌20min，灭菌完成后，称量20g生咖啡豆，浸入到500ml锥形瓶中的80ml去离子水中，向其中加入300ml YD肉汤，并接种1ml初始发酵液或1ml YD培养基作为未发酵的对照，每组设三个重复。将发酵瓶放置在37℃、220rpm的震荡培养箱中发酵5天，每24小时对发酵液进行收集取样。使用pH计测量样本pH值的动态变化，并通过对发酵液连续稀释的平板上进行菌落计数来检查微生物CFU浓度变化。
3.发酵后处理和样品制备
发酵结束后弃去发酵液，在60℃烘箱中将咖啡豆脱水直至水分降至11％，后续根据需求进行烘培。将咖啡豆分三组进行后续处理，分别为使用有机溶剂从未烘焙发酵咖啡豆提取(F)、使用有机溶剂从烘焙发酵咖啡豆中提取(FR)和使用沸水从烘培发酵咖啡豆中提取(FRW)。
有机溶剂提取的步骤如下：
(1)将1g咖啡豆磨碎后与20ml甲醇-水溶液(70％v/v)充分混合，通过旋转器(RevolverTMTube Mixer)旋转10小时。
(2)混合物通过滤纸过滤后，将上清液在真空浓缩器中浓缩至约5ml的体积，向其中加入5ml二氯甲烷以从甲醇相中提取咖啡因。再混合旋转10小时后，将混合物适当静置直至观察到甲醇-二氯甲烷相分离；分离上层(甲醇中的CGA)和下层(二氯甲烷中的咖啡因)液相，分别在真空浓缩器中浓缩，直到液体完全蒸发。
(3)提取物用甲酸水溶液(0.1％v/v)重新溶解为溶液。
沸水提取的步骤如下：
(1)将1g咖啡豆磨碎后用10ml 95℃水冲泡10分钟，将过滤后的上清液认定为CGA和咖啡因提取物的混合溶液。
4.超高效液相色谱(UHPLC)分析
色谱分析前，提取物溶液先通过0.2μm聚四氟乙烯(PTFE)过滤器过滤，过滤后用甲酸水溶液(0.1％v/v)进行稀释。其中，F和FR两组的稀释比为100倍，而FRW组稀释比为10倍。
将CGA和咖啡因的标准品溶解在甲酸水溶液(0.1％v/v)中至浓度为2μg/L，然后经过连续稀释，制备得到浓度分别200、100、40、20、10、5和1ng/L的CGA和咖啡因的标准品溶液。
通过带有SPD-M20A二极管阵列检测器的Shimadzu系统进行UHPLC分析。色谱柱为Shim-pack Scepter C18-120色谱柱(1.9μm，2.1×50mm)，温度为40℃，流动相为0.1％v/v甲酸水溶液(A)和乙腈(B)，进样量为4μl。洗脱程序设置为：0min 95％A，5％B；10分钟94％A，6％B；11分钟0％A，100％B；12分钟0％A，100％B；13分钟95％A，5％B；15分钟95％A，5％B。使用上述标准样品溶液绘制校准曲线并对实验样品进行定量。其中，两种化学物质最大吸光度的检测波长：CGA为324nm，咖啡因为272nm。
发酵过程中的pH和微生物浓度变化如图3所示，从图中可以看出，两株芽孢杆菌PMT-1和PMT2都具有类似的生长曲线，在发酵24小时后达到稳定期，细胞密度约为108～109CFU/ml，并在随后的发酵过程中维持在该密度附近。相比之下，酵母(Sc和Sb)在发酵2～3天后才达到稳定期。而且，与本申请分离出的芽孢杆菌相比，酵母在稳定期的细胞密度降低了两个数量级，密度为106～107CFU/ml。可能是因为这些芽孢杆菌本身是由咖啡豆中分离出来的，所以更加适应以咖啡豆作为发酵底物，从而能够在发酵过程中大量成生长。
在发酵过程中，芽孢杆菌发酵会导致酸化，其中PMT-1和PMT-2培养物在培养24小时后pH维持在5。发酵咖啡豆通常因为其中的芽孢杆菌发酵产生乳酸而具有酸味并赋予发酵咖啡豆独特的风味。相反，对照的酵母组的pH值则没有显著的变化。
对咖啡豆进行F、FR和FRW这三种不同处理方式(是否烘培、沸水提/有机溶剂提)主要是考虑到在本实施例中：
首要目的是测试发酵后，咖啡豆中绿原酸、咖啡因实际含量，对此，多项文献(参考Navarra,G.et al.J CHEM-NY 2017,2017,6435086；Craig,A.P.et al.J.TALANTA 2016,154,481-485)显示利用有机溶剂提取绿原酸、咖啡因是一种高效率的方法，而且经过烘培可能会对其中的绿原酸、咖啡因的含量造成较大的改变，因此在本实施例中主要通过使用有机溶剂从未烘焙发酵咖啡豆提取(F)来体现其实际含量；
次要目的为测试实际饮用时，咖啡冲剂中绿原酸、咖啡因的含量，所以使用沸水从烘焙发酵咖啡豆中提取(FRW)得到模拟结果进行体现。
发酵前后咖啡豆中绿原酸和咖啡因含量的变化如表3所示：
其中，在未经烘培(F)的各组咖啡豆中，参考图4，PMT-1-F(即F的PMT-1发酵咖啡豆，下同)和PMT-2-F的绿原酸含量相比未发酵的对照分别增加了38％和31％。相比之下，两种酵母发酵后绿原酸的含量增加不明显(Sc，+1.3％)甚至还有下降(Sb，-2.2％)。而类似条件下，采用枯草芽孢杆菌经30天发酵后，咖啡豆中绿原酸的含量的提升也仅有25％左右(参考Kim B,et al..J Med Food.2019Mar；22(3):305-313.)。
在经过烘培的FR和FRW的各组咖啡豆中，PMT-1-FR和PMT-1-FRW的绿原酸相比于未发酵的对照分别增加了18.5％和40.8％。但PMT-2-FR和PMT-2-FRW的绿原酸则分别下降了49.6％和43％，这可能是因为PMT-2发酵咖啡豆的过程破坏了咖啡豆的完整性，导致更多的绿原酸在烘焙过程中分解。
使用上述两株芽孢杆菌发酵咖啡豆对咖啡因水平的影响较小，PMT-1-F的咖啡因水下降了4.8％，PMT-2-F的咖啡因水平上升了10.7％，表明这两株芽孢杆菌发酵可以维持或略微增加咖啡因水平。相比而言，使用酵母发酵可以降低咖啡豆中的咖啡因含量。Sc-F和Sb-F的结果显示咖啡因水平分别降低了40.2％和38.0％。另外在水提物Sc-FRW和Sb-FRW中也观察到咖啡因水平的下降，分别是32.8％和40.6％。
表3.发酵前后绿原酸和咖啡因的含量
Figure BDA0003681747960000091
表3中使用邓肯检验(平均值±标准差)，每行带有相同字母的平均值无显着差异(P>0.05)。
实施例3
体外抗炎试验
红细胞悬液按照以下方案制备：通过自体采血试剂盒从健康志愿者身上采集28份新鲜血液，并与等体积的Alsever溶液(4.2g/L氯化钠、8.0g/L柠檬酸钠二水合物、0.5g/L柠檬酸一水合物和20.5g/L D-葡萄糖)混合。将混合物以3000rpm离心5分钟，弃去上清液，将红细胞沉淀洗涤3次，最后用生理盐水(0.9％氯化钠)以10％w/v重悬。
咖啡豆提取物样品按照以下方法制备：将1g磨碎的FRW各组咖啡豆在20ml去离子水中煮沸20分钟，然后通过0.2μm PTFE过滤器过滤。
发酵咖啡豆的抗炎功效以细胞活力为特征。向0.05ml红细胞悬液中加入1ml 1X无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)，然后分别用0.15ml以下溶液处理：咖啡豆提取物样品、CGA标准溶液(最终梯度浓度范围为25至250μg/ml)和PBS(阴性参考)。所有组均在60℃孵育20分钟，然后以2500rpm的转速离心3分钟。使用酶标仪在540nm处测量上清液的吸光度。
热诱导溶血下的细胞活力通过公式计算：细胞活力％＝100％×(1–AT/AC)，其中AT可替换为参考组或治疗组的吸光度，AC是阴性对照。
本实施例通过热诱导抗溶血试验作为初步研究来评估提取物、特别是其中的绿原酸的抗炎特性，具体而言，利于发酵咖啡豆的FRW提取物来评估饮料制备中典型提取过程后的抗炎特性。结果如图5所示，从图中可以看出，与未发酵咖啡豆相比，芽孢杆菌发酵咖啡提取物的抗溶血特性大约高出两倍。具体而言，PMT-1-FRW和PMT-2-FRW提取物的红细胞活力分别为46.5％和38.6％，而未发酵的FRW为24.6％，其生物活性增加到1.9倍和1.6倍，采用上述两株细菌发酵后提取物的红细胞活力与未发酵的对照组相比，差异具有统计学上的显著性。同时，酵母发酵后，FRW提取物的细胞活力与未发酵的对照组之间的差异则并无统计学上的显著性。
实施例4
咖啡风味特征评估
评估方式参考美国精品咖啡协会(SCAA)制定的相关方法，具体如下：每100毫升水冲煮5克咖啡粉。来自SCAA认证会员(南科大咖啡协会)的20位综合专家小组在随后的嗅探、啜饮和回味程序后对咖啡样品进行评分。风味特征从香气(Fragrance/Aroma)、干净度(Clean cup)、甜度(Sweetness)、酸度(Acidity)、醇厚(Body)、风味(Flavor)、余味(Aftertaste)、平衡(Balance)、一致性(Uniformity)和整体(Overall)等十个综合方面进行评价。此外，专家小组成员还描述了每种咖啡的特色风味。
评分结果如图6所示，PMT-1取得总分80.75分，PMT-2取得总分76.5分。根据SCAA评分要求，得分高于80的可作为特色咖啡，因此，本申请实施例所提供的PMT-1发酵咖啡能够作为特色咖啡，利用这些菌株发酵对咖啡风味有相对显著的改善。相比之下，未发酵组的SCAA得分为75，而Sc和Sb的得分分别为74、74.5，可见使用其他微生物发酵后相比于未发酵的咖啡未改善其风味。此外，专家小组成员一致将PMT-1发酵豆描述为具有浓郁的果香，而其他发酵产品的强度和风味都较弱，例如Sb发酵豆产生的味道清淡，其原因可能在于酵母发酵抑制了烘焙咖啡豆的风味。
实施例5
由广东麦吉基因生物科技有限公司对实施例1分离筛选出的芽孢杆菌PMT-1和PMT-2进行了全基因组测序，根据测序结果进行代谢基因分析，具体方法如下：
全基因组测序过程包括：(1)全基因组鸟枪法建库，(2)文库高通量测序通过下一代(Illumina HiSeq)和第三代(Oxford Nanopore Technology)测序，以及(3)全基因组的组装和分析。原始测序数据被过滤成具有高质量读数的干净数据，并通过SMRT Link或Unicycler组装，并通过Arrow软件进一步优化。PHAST、IslandPath-DIOMB和CRISPRdigger对其他基因组组成进行了分析，例如前噬菌体序列、基因组岛和成簇的定期间隔短回文重复(CRISPR)序列。全基因组序列的功能注释通过非冗余(NR)蛋白质数据库、Swiss-Prot、蛋白质直系同源群(COG)、京都基因和基因组百科全书(KEGG)、基因本体论(GO)、Pfam数据库、碳水化合物活性酶(CAZy)数据库、病原体宿主相互作用(PHI)数据库、毒力因子数据库(VFDB)、综合抗生素耐药性数据库(CARD)等等进行。通过平均核苷酸同一性(ANI)和共线性分析对整个基因组序列进行比较分析。整个基因组序列由Circos基于组装和注释结果进行可视化。
结果显示，PMT-1和PMT-2都表达了大量与氨基酸代谢相关的基因，分别为268和255个，其中包括负责L-苯丙氨酸生物合成的pheA。而氨基酸代谢基因的高水平可能表明苯丙氨酸的良好来源，有助于增加绿原酸的生成。这与图4中发酵咖啡豆绿原酸含量增加一致。另外，PMT-1和PMT-2与碳水化合物代谢相关的基因数量分别为244个和304个，这可能导致细菌积极利用咖啡豆和培养基中的碳源迅速增殖并释放乳酸等代谢产物。这对应于图3中所示的PMT-1和PMT-2的CFU的最大化以及第1天发酵液的剧烈酸化。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方科技大学
<120> 芽孢杆菌及其在咖啡发酵中的应用
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cctggctca 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.芽孢杆菌，其特征在于，包括以下至少一种：
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HCL2022-1，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62469；
阿氏芽孢杆菌(Priestia aryabhattai)HCL2022-2，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62468。
2.菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包括权利要求1所述的芽孢杆菌中的至少一种。
3.权利要求1所述的芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂的以下任一种应用：
a1)咖啡豆发酵；
a2)制备发酵咖啡豆；
a3)提高咖啡豆绿原酸含量；
a4)提取绿原酸；
a5)改善咖啡风味。
4.咖啡豆的发酵方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂接种到所述咖啡豆进行发酵的步骤。
5.发酵咖啡豆，其特征在于，所述发酵咖啡豆采用权利要求4所述的发酵方法获得。
6.发酵咖啡豆提取物，其特征在于，所述发酵咖啡豆提取物由权利要求5所述的发酵咖啡豆提取得到。
7.组合物，其特征在于，所述组合物的制备原料包括权利要求5所述的发酵咖啡豆或权利要求6所述的发酵咖啡豆提取物。
8.权利要求5所述的发酵咖啡豆，或权利要求6所述的发酵咖啡豆提取物，或权利要求7所述的组合物在制备以下任一种产品中的应用：
b1)抗炎产品；
b2)预防和/或治疗炎症性疾病的产品；
b3)抗溶血产品；
b4)预防和/或治疗溶血性疾病的产品。
9.绿原酸的制备方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂接种到发酵底物中进行发酵，并从发酵产物中提取绿原酸的步骤。
10.改善咖啡风味的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂接种到咖啡豆进行发酵的步骤。
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Citations (2)

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CN114231464A (zh) * 2021-12-31 2022-03-25 上海新溢生物科技工程研究中心(有限合伙) 凝结芽孢杆菌及其用途
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Title
FENG LIU等: "Characterization of the Therapeutic Properties and Flavor Profile of Coffee via Monoculture Fermentation with Endophytic Microbial Isolates", 《ACS FOOD SCI. TECHNOL.》, pages 1 - 3 *

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