KR101576244B1 - 알로인을 함유하는 하이드로겔 기반의 창상피복제용 조성물과 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알로인을 함유하는 하이드로겔 기반의 창상피복제용 조성물과 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 폴리비닐알콜과 카르복시메틸셀룰로오스로 조성된 하이드로겔에 알로인을 첨가하여 창상 보호 및 치료에 효과적인 창상피복제용 조성물과 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 알로인을 함유하는 하이드로겔 기반의 창상피복제용 조성물은 하이드로겔에 알로인(aloin)이 함유한다. 그리고 본 발명의 알로인을 함유하는 하이드로겔 기반의 창상피복제용 조성물의 제조방법은 폴리비닐알콜과 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)가 용해된 혼합용액을 수득하는 제 1단계와, 혼합용액에 알로인(aloin)을 첨가하는 제 2단계와, 알로인이 첨가된 상기 혼합용액을 겔화시키는 제 3단계를 포함한다.

Description

알로인을 함유하는 하이드로겔 기반의 창상피복제용 조성물과 이의 제조방법{aloin loaded wound dressing composition based on hydrogel and manufacturing method thereof}

본 발명은 알로인을 함유하는 하이드로겔 기반의 창상피복제용 조성물과 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 폴리비닐알콜과 카르복시메틸셀룰로오스로 조성된 하이드로겔에 알로인을 첨가하여 창상 보호 및 치료에 효과적인 창상피복제용 조성물과 이의 제조방법에 관한 것이다.

상처치유는 매우 복합적이고, 단계별로 시간에 따라 조금씩 이루어진다. 지혈 및 염증 단계, 증식성 단계, 성숙 단계로 3단계가 중첩되면서 세포외기질(extracellular matrix)이 재형성된다.

상처가 생기는 즉시, 염증과 기저층의 반응으로 상처의 초기 단계에 응혈이 형성된다. 기저물질은 진피의 결합섬유 사이를 채우고 있는 물질로 점액성 뮤코다당체로 존재하며 다량의 수분을 보유하고 히알루론산, 콘트로이친 황산 등의 글리코스아미노 글리칸으로 구성되어 있다. 특히, 프로테오글리칸은 친수성 탄수화물 단백질 복합체이며 젤리와 같은 물질로 구성된다(M. P. Czubryt, Fibrogenesis Tissue Repair, 5, 19, 2012; Marchese A, and Shito G. Int. J. Antimicrobial Agents, 16, 25, 2001)

상처 치료제는 상처부위의 습기 유지에 따라 건조드레싱과 습윤(보습)드레싱으로 분류된다. 건조드레싱은 수십년 간 상처치료제로 밴드류(대일밴드 또는 기타 밴드류)와 연고(후시딘, 마데카솔 등)가 포함된다. 밴드류는 특별한 치료효과 없이 상처를 감싸주는 역할을 하며, 연고류는 항생제나 스테로이드 등 치료성분을 넣어 상처를 빨리 아물게 하고 추가 감염을 막아주는 역할을 한다. 하지만 건조드레싱의 단점으로 피나 진물 등 분비물이 말라 없어지면서 상처치유 세포까지 없어져 흉터를 남기며 밴드를 제거할 때 딱지가 함께 떨어져 2차 손상의 위험을 가진다. 연고류에 들어 있는 항생제 역시 상처치유 세포까지 영향을 받아 자가 치료효과가 떨어진다(T. Reynolds, and A.C. Dweck, J. Ethnopharmacol, 68, 3, 1999; M. Y. Park, H. J. Kwon, and M. K. Sung, Biosci. Biotechnol. Biochem., 73, 828, 2009).

이러한 건조드레싱의 단점을 보완하기 위한 습윤 드레싱의 소재로서 하이드로겔이 이용되고 있다.

하이드로겔(hydrogel)은 물을 분산 매체로 하는 삼차원 친수성 고분자 망상 구조를 가진 물질로서 다량의 수분을 흡수할 수 있고, 천연 조직과 같은 유연성을 가지고 있다.

이러한 특성을 갖는 하이드로겔은 인체의 세포 기질과 유사한 구조를 가지며, 불활성의 생체 적합성, 고무와 같은 탄성을 갖고 산소와 영양분의 투과가 뛰어나기 때문에 상처 드레싱, 콘택트렌즈, 약제 또는 미용제의 전달 매체, 보형물, 폐수 처리제 등 그 적용 분야가 다양화되고 있다.

현재 시중에 판매되고 있는 창상피복제용 하이드로겔의 대부분은 poly(vinyl alcohol)로 구성되어 있으며 alginate, chitosan이 혼용되어 의료용 소재로 활용되고 있다.

상처치료제로 많이 알려져 있고 손쉽게 쓰이는 식물로 알로에(aloe)가 알려져 있다. 알로에는 치료 특성 때문에 식품, 의약품, 화장품으로 다양하게 쓰이고 있다.

특히, 알로인(aloin)은 알로에 내에 존재하는 화합물로 항균, 항산화, 항염증에 효과적이며 상처치유제로 활용되고 있다. 안트라퀴논배당체성분인 알로인은 지혈에 효능이 있는 것으로 알려져 있다(W. Chen, B. E. V Wyk, I. Vermaak, and A.M.Viljoen, Phytochemistry Letters, 5, 1, 2012; A. Femenia, E. S. Sanchez, S. Simal, and C. Rossello, Carbohydr. Polym., 39,109, 1999).

창상의 치유과정은 일반적으로 염증단계, 증식단계 및 성숙단계의 3단계로 구분할 수 있으며 창상의 치유 단계는 확실한 구분 없이 중첩되면서 연속적으로 진행되는 특징을 갖는다(H. J. Lim, H. T. Kim, E. J. Oh, J. H. Chio, H. D. Ghim, D. G. Pyun, S. B. Lee, D. J. Chung, and H. Y. Chung, Polymer(korea), 34, 363, 2010).

창상은 화농, 삼출물, 괴사성 조직 형성 및 세균에 의해 pH 지수가 달라지게 되며 이에 따라 창상의 회복 거동이 영향을 받게 된다. 이상적인 창상피복제로 창상 부위를 외부 환경에 노출되는 것을 차단하여 감염을 예방하고 초기 삼출물을 적절히 흡수하여 염증반응을 억제할 수 있어야 한다.

본 발명은 폴리비닐알콜과 카르복시메틸셀룰로오스로 조성된 하이드로겔에 창상치유 효과가 우수한 알로인을 첨가하여 창상 보호 및 치료에 효과적인 하이드로겔 기반의 창상피복제용 조성물과 이의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 알로인을 함유하는 하이드로겔 기반의 창상피복제용 조성물은 하이드로겔에 알로인(aloin)이 함유된 것을 특징으로 한다.

상기 하이드로겔은 폴리비닐알콜과 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)로 조성된 것을 특징으로 한다.

그리고 상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 알로인을 함유하는 하이드로겔 기반의 창상피복제용 조성물의 제조방법은 폴리비닐알콜과 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)가 용해된 혼합용액을 수득하는 제 1단계와; 상기 혼합용액에 알로인(aloin)을 첨가하는 제 2단계와; 상기 알로인이 첨가된 상기 혼합용액을 겔화시키는 제 3단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 혼합용액은 상기 폴리비닐알콜이 물에 용해된 제 1용액과 상기 카르복시메틸셀룰로오스가 물에 용해된 제 2용액을 혼합하여 형성시킨 것을 특징으로 한다.

상기 혼합용액은 상기 제 1용액 30 내지 70부피%, 상기 제 2용액 30 내지 70부피%로 혼합되는 것을 특징으로 한다.

상기 제 2단계에서 상기 알로인은 상기 혼합용액 중 0.125중량%로 첨가되는 것을 특징으로 한다.

상기 제 3단계는 상기 혼합용액을 교반시킨 후 냉동 및 해동을 반복하여 상기 하이드로겔을 형성시키는 것을 특징으로 한다.

상술한 바와 같이 본 발명은 알로인을 함유한 하이드로겔 기반의 창상피복제를 제공함으로써 창상부위를 외부 환경에 노출되는 것을 차단하여 감염을 예방하고, 초기 삼출물을 적절히 흡수하여 염증반응을 효과적으로 억제함으로써 창상 보호 및 치료에 효과적이다.

또한, 본 발명은 하이드로겔 조성물의 습윤환경이 창상조직을 치유하는데 도움을 주며 알로인이 창상 치유율을 앞당기고 세포 재생에 도움을 주어 창상 치료를 위한 창상피복제로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 제 1용액과 제 2용액의 혼합비율에 따른 제조예(aloin-hydrogel)와 비교예(con-hydrogel)의 하이드로겔의 겔화율을 나타낸 그래프이고,
도 2는 제 1용액과 제 2용액의 혼합비율에 따른 제조예(aloin-hydrogel)와 비교예(con-hydrogel)의 하이드로겔의 팽윤도를 나타낸 그래프이고,
도 3은 제 2제조예와 비교예의 하이드로겔의 분해도를 측정하여 나타낸 그래프이고,
도 4는 제조예와 비교예의 하이드로겔 강도를 측정하여 나타낸 그래프이고,
도 5는 제조예의 하이드로겔의 알로인 방출 특성을 나타낸 그래프이고,
도 6은 하이드로겔의 농도별 용출액의 세포독성 평가를 MTT assay를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 7은 창상유발군에서 선택한 동일 개체의 창상부분의 변화를 조직을 관찰한 사진이고,
도 8은 창상유발군의 창상치유율 및 창상치유점유율을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 창상피복제용 조성물과 이의 제조방법에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명의 일 실시 예에 따른 창상피복제용 조성물은 하이드로겔 형태로 제공된다. 본 발명의 창상피복제용 조성물은 하이드로겔에 알로인이 함유되어 있다.

알로인(aloin)은 알로에 내에 존재하는 화합물로 항균, 항산화, 항염증에 효과적이며 지혈에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

하이드로겔(hydrogel)은 물을 분산 매체로 하는 삼차원 친수성 고분자 망상 구조를 가진 물질로서 다량의 수분을 흡수할 수 있고, 천연 조직과 같은 유연성을 가지고 있다. 이러한 하이드로겔 기반의 창상피복제는 창상부위를 외부 환경에 노출되는 것을 차단하여 감염을 예방하고, 초기 삼출물을 적절히 흡수하여 염증반응을 억제할 수 있다.

본 발명에 적용되는 하이드로겔은 수용성이며 무독성인 폴리비닐알콜(poly vinyl alcohol, PVA)과 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC)로 조성된다. 가령, 폴리비닐알콜과 카르복시메틸셀룰로오스를 용매에 용해시킨 후 교반시킨 다음 냉동 및 해동을 반복하여 하이드로겔을 형성시킬 수 있다.

본 발명의 창상피복제용 조성물의 제조방법은 일 예로, 폴리비닐알콜을 물에 용해시킨 제 1용액과, 카르복시메틸셀룰로오스를 물에 용해시킨 제 2용액을 혼합하여 혼합용액을 형성한다. 혼합용액 전체 부피에서 제 1용액의 부피는 30 내지 70%, 제 2용액의 부피는 30 내지 70%가 되도록 제 1용액과 제 2용액을 혼합한다.

제 1용액과 제 2용액이 혼합된 혼합용액을 준비한 후 알로인을 첨가한다. 알로인은 혼합용액 중 0.125중량%로 첨가될 수 있다. 알로인이 첨가된 혼합용액을 충분히 교반시킨 다음 -80℃에서 3시간 냉동시킨 후 상온(20℃)에서 6시간 동안 해동시키는 과정을 2 내지 4회 반복하여 알로인이 첨가된 하이드로겔 형태의 창상피복제용 조성물을 제조할 수 있다.

이하, 하기 실험 예를 통하여 본 발명에 대해 설명하고자 한다. 다만, 하기의 실험 예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 하기의 실험 예로 한정하는 것은 아니다.

<창상피복제용 조성물의 제조>

1. 재료

본 실험에 사용한 Poly(vinyl alcohol)(PVA, Mw 70,000~100,000), sodium carboxyl methyl cellulose(CMC, Mw 90,000)은 Sigma Aldrich Co., Ltd (St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다. 알로인(aloin)은 Fluka에서 구입하여 사용하였다. 그 밖의 시약은 정제과정 없이 사용되었으며 증류수는 3차 증류수를 사용하였다.

2. 제조방법

PVA를 3차 증류수에 용해시켜 6% 농도의 제 1용액을 만들었다. 그리고 CMC를 3차 증류수에 용해시켜 3% 농도의 제 2용액을 만들었다. 제 1용액과 제 2용액을 각각 3:7, 5:5, 7:3 부피비로 혼합하여 3종류의 혼합용액 100mL씩을 각각 제조하였다. 제조된 혼합용액을 호모게나이저(Basic T25 IKA Co., Wilmington, NC, USA)(12500rpm)로 10분간 혼합시킨 후, 고압멸균기(AC-13, Lap Camp Co., Ltd, Korea) (121℃ 20분)을 이용하여 멸균하였다. 그리고 혼합용액에 알로인을 0.125wt% 첨가하고 500rpm에서 3시간 교반 시킨 후 혼합 용액을 메스실린더에 넣어 기포를 제거하였다. 기포가 빠진 혼합용액을 페트리 접시에 7g씩 넣고 -80℃에서 3시간 냉동시킨 후 상온(20℃)에서 6시간 동안 해동시키는 과정을 총 3회 반복하여 알로인이 함유된 하이드로겔(aloin-hydrogel)을 각각 제조하였다.

제조된 aloin-hydrogel은 제 1용액과 제 2용액의 혼합비율에 따라 3종류로 구분하였다. 제 1용액:제2용액이 3:7로 혼합된 aloin-hydrogel은 제 1제조예, 제 1용액:제2용액이 5:5로 혼합된 aloin-hydrogel은 제 2제조예, 제 1용액:제2용액이 7:3으로 혼합된 aloin-hydrogel은 제 3제조예라고 하였다.

한편 비교예로서 알로인이 함유되지 않은 하이드로겔(con-hydrogel)을 제조하였다. 즉, 제 1용액과 제 2용액이 혼합된 혼합용액을 메스실린더에 넣어 기포를 제거한 후 페트리 접시에 7g씩 넣고 -80℃에서 3시간 냉동시킨 후 상온(20℃)에서 6시간 동안 해동시키는 과정을 총 3회 반복하여 제조하였다.

<하이드로겔의 특성실험>

1. 실험방법

(1)겔화율

겔화(가교반응)에 참여하지 않고 남아있는 고분자를 제거하기 위하여 제조예와 비교예의 하이드로겔을 25℃에서 24시간 동안 물에 침지시켰다. 침지과정을 거친 하이드로겔을 꺼내어 표면의 물기를 닦아 55℃ 건조기에 넣고 24시간 동안 건조시켰다. W_d는 건조된 하이드로겔의 무게이고, W_i는 초기 사용한 고분자무게(PVA+CMC 중량)이다.

겔화율은 다음의 식에 대입하여 산출하였다.

겔화율(%) = (W_d / W_i)×100

(2)하이드로겔의 팽윤성

제조예와 비교예의 하이드로겔을 60℃ vacuum oven에서 12시간 동안 건조시킨 후 무게(W_a)를 측정하였다. 그리고 pH7.4 phosphate buffer solution(PBS)용액에 하이드로겔 조각을 적셔 놓고 37℃에서 24시간 동안 방치한 후 무게(W_s)를 측정하였다. 팽윤도는 다음의 식에 대입하여 산출하였다.

팽윤도(%) = (W_s / W_a) x100

(3)하이드로겔의 분해율

제조예와 비교예의 하이드로겔 분해율을 측정하였다.

하이드로겔을 55℃ 건조기에 넣고 24시간 동안 건조시킨 후 하이드로겔의 무게(W_d)를 측정하였다. 건조된 하이드로겔을 37℃ pH7.4 PBS에 담그고 시간에 따른 무게변화를 측정하였고 측정하기 전 여과지를 사용하여 하이드로겔 표면에 과량으로 묻어있는 물을 제거하였다. 팽윤비의 변화와 하이드로겔의 무게 손실을 일정 시간마다 측정하였다. Ws는 팽윤되었을 때 겔의 무게이다. 분해율은 다음의 식에 대입하여 산출하였다.

분해율(%)= (W_s / W_d) x100

(4)하이드로겔의 물성

제조예와 비교예의 하이드로겔 강도를 측정하여 기계적 물성을 예측하였다. 하이드로겔의 압축강도는 만능물성시험기(Compac-100, Sun Scientific Co., Ltd, Tokyo, Japan)를 이용하여 상온에서 평가하였다. 하이드로겔의 시편 두께는 3 ± 0.5 mm, 지름은 10 mm로 준비하였고 압축강도 측정 시 크로스 헤드(cross head) 속도는 120 mm/min, 시편이 50% 이상 변형이 이루어질 때의 값을 측정하였다.

(5)알로인의 방출실험.

알로인 함유 하이드로겔로부터 알로인의 방출 패턴을 살펴보기 위해 제조예의 aloin-hydrogel(5g)을 50 mL의 pH 7.4와 pH 5.5 용액에 각각 담근 후 shaking incubator(VS-8480SF, Vision Scientific Co., Daejon, Korea)에 80 rpm으로 37 ℃에서 일정한 시간 간격으로 상등액을 1mL을 취하여UV/VIS spectrophotometer(shimadzu-160A, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 이용하여 측정하였다.

(6)세포독성

하이드로겔 세포 독성을 측정하기 위해 ISO 10993 근거하여 멸균된 하이드로겔을 세포배양액(DMEM, Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco)에 넣어 37 ℃에서 24시간 이상 배양하여 용출액을 제조하였다. 96 well tissue culture plate에 1×10⁵ cells/mL로 각 well 당 100 μL씩 분주하여, 24시간 동안 배양한 RAW 264.7에 대조군으로 배지만 처치하였고 실험군에는 하이드로겔 용출액(100 μL)을 처리하였다.

24시간 후 약물이 포함되어 있는 배지에 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra-zolium bromide) 용액을 처리하여 37 ℃에서 4시간 동안 반응시킨 후 570 nm에서 ELISA reader(ELX808, Biotek Instruments, Vermont, USA)을 이용하여 측정하였다.

(7)동물실험

실험대상 SD Rat를 마취 전 24시간 동안 절식시켰고, 물은 공급하였다. 모든 실험군에서 창상유발 한 시간 전에, 졸레틸50과 럼푼을 1:2비율로 혼합하여 30μL 사용하여 근육 주사로 마취시킨 후, 전기 제모기로 백서의 등 부위 털을 제거하였다. 등 부위에 10% povidine-iodine과 70% 에탄올을 각각 도포하여 소독한 뒤, 등 부위에 소독된 수술용 가위를 이용하여 직경 2cm x 2cm의 크기로 진피층을 포함한 전층 결손 창상을 유발하였다.

총 세 그룹으로 나뉘어 실험을 진행하였다. 알로인이 첨가되지 않은 도포형 겔 군, 알로인이 첨가된 도포형 겔 군, 그리고 알로인이 첨가된 하이드로겔(제 2제조예)을 처치한 세 그룹으로 나뉘어 창상 치유 효과를 측정하였다. 항균 역할을 하는 알로인이 첨가되지 않은 하이드로겔은 외부환경의 균주들을 억제하기 못해 무독성인 CMC에 미생물이 서식하여 동물실험에 사용하지 않았다.

실험에 사용된 도포형 겔 제형의 구성은 하기 표 1에 나타냈다.

Ingredients	Formulations
	알로인 첨가 도포형 겔	알로인 무첨가 도포형 겔
aloin(%, w/w)	1	0
Carbopol 934(%, w/w)	2	2
Propylene glycol	2 mL	2 mL
Ethanol	5 mL	5 mL
Triethanolamin	q.s to neutralize the gel base	q.s to neutralize the gel base
Water	q.s	q.s

(Total volume : 100 mL, q.s: Quantum satis, quantum sufficit)

각각의 처치군은 4마리씩 실험에 사용하였다. 이후 각 처치군의 동일한 환경을 제공하고자 멸균된 거즈(Tegaderm; 3M Health Care, USA)를 덮고, 그 위에 탄력밴드(Cobanl; 3M Health Care, USA)로 움직임에 지장이 없도록 감아주었다. 동물실험은 전남대학교 용봉캠퍼스 동물실험 윤리 위원회에 적합함을 승인 받고(CNU IACUC YB-2012-36) 실험하였다.

상처치료의 진행 과정을 관찰하기 위해 창상 유발 시작 점부터 5일 간격으로 digital camera(CAMEDIATM, Olympus Co., Tokyo, Japan)을 이용하여 각 군별로 일정 거리에서 촬영하여 상처의 변화를 육안적으로 관찰하였다. 또한 객관적인 지표로 나타내기 위하여 Digital calliper(Mitutoyo Co., Kawasaki, Japan)로 창상의 면적을 아래와 같은 방법으로 측정하였다.

창상 치유율(%) =

기간별 치료 점유율(%) =

(Wo: 창상 유발 직후 창상부 면적, Ui: 측정일 창상부 면적, Ub: 이전 측정일 창상부 면적)

창상유발 후 20일 경과한 후 실험동물은 보건복지부고시 제88-9호의 실험동물 관리 지침서 등에 관한 기준에 명시된 향정신성 약의 과잉투여에 의한 방법에 따라 ethyl ether를 이용하여 조직 검사용 실험동물을 안락사시켰다. 원형 창상 전체가 포함된 조직을 채취하고, 10% 중성 formalin 용액에 24시간 고정한 후, 창상 중앙을 통과하는 절편을 취하여 탈 수 시킨 후 paraffin 블록에 포매하였다. 조직을 조직절편기를 이용하여 절단한 다음 polylysin으로 coating된 slide에 붙여 paraffin 제거 및 함수과정을 거친 후 Hematoxylin-Eosin 염색을 실시하였다.

(8)통계처리

모든 실험 결과는 평균값(mean)과 표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다. 대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 paired t-test로 비교하였으며 P가 0.05 이하인 것과 0.01 이하인 것만 유의한 것으로 하였다.

2. 실험결과

(1)하이드로겔의 겔화율

하이드로겔의 동결융해에 의한 겔화율 형성은 분자들의 재배열에 의한 물리적인 가교로 설명할 수 있다. 분자량이 작은 알로인(Mw 418.4)의 경우 분자들의 재배열에 영향을 줄만큼의 분자크기를 갖지 않고 단순히 점성적인 특성을 가진다.

도 1에 제 1용액과 제 2용액의 혼합비율에 따른 제조예(aloin-hydrogel)와 비교예(con-hydrogel)의 하이드로겔의 겔화율을 나타내었다. 도 1에서 PVA:CMC의 비율은 제 1용액과 제 2용액의 혼합비율을 의미한다.

도 1을 참조하면, 알로인의 유무에 따른 겔화율은 큰 차이를 나타내지 않았다.

(2)하이드로겔의 팽윤도

상처발생시 그에 따른 삼출물이 나오게 되며 삼출물을 흡수할 수 있는 처지제의 사용은 초기 상처 면을 효과적으로 안정시킬 수 있으며, 초기의 scar부분의 조직감염도 방지할 수 있다. 그러기 위해서는 하이드로겔의 흡수력이 필수적이다.

도 2는 제 1용액과 제 2용액의 혼합비율에 따른 제조예(aloin-hydrogel)와 비교예(con-hydrogel)의 하이드로겔의 팽윤도를 나타내었다. 도 2에서 PVA:CMC의 비율은 제 1용액과 제 2용액의 혼합비율을 의미한다.

도 2를 참조하면, 하이드로겔의 팽윤도는 CMC의 농도가 높을수록 다른 조성에 비해 팽윤도가 높았다. 그 이유는 CMC의 Hydroxy Group(-OH)을 친수성인 Sodium carboxymethyl group(-CH₂COON_a)으로 치환시켜 수용성을 부가한 CMC의 친수도 때문에 물과 결합력이 높아진 것으로 생각된다. 또한, 제조예와 비교예의 비교시 알로인의 함유에 따른 하이드로겔의 팽윤도의 변화는 큰 차이가 없는 것을 알 수 있었다.

(3)하이드로겔의 분해도

도 3에 제 2제조예의 하이드로겔(aloin PVA/CMC(5:5) hydrogel)과 비교예의 하이드로겔(PVA/CMC hydrogel)의 분해도를 측정하여 나타냈다. 도 3에서 비교예는 제 1용액과 제 2용액의 혼합비율이 5:5인 것을 의미한다.

도 3을 참조하면, 알로인이 함유된 제 2제조예의 하이드로겔은 알로인의 방출과 함께 겔이 분해되는 것을 관찰할 수 있었으며, 7일을 지나서도 50% 이상의 형태를 유지하는 것을 알 수 있었다.

그리고 도시되지 않았지만 제조예나 비교예 모두 제 1용액 대 제 2용액의 비율에 따른 큰 차이를 관찰하지 못했다.

(4)하이드로겔의 강도

도 4는 제조예와 비교예의 하이드로겔 강도를 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 4에서 PVA:CMC의 비율은 제 1용액과 제 2용액의 혼합비율을 의미한다.

도 4를 참조하면, CMC의 농도가 높을수록 하이드로겔의 강도가 낮은 것을 관찰하였다. 이 결과는 glucan의 성질처럼 PVA와 혼합된 CMC는 제조된 겔의 연성을 늘려주는 역할을 하며 수소결합과 분자간의 상호결합 때문이라 여겨진다. 약물로 사용하는 알로인의 함유에 따른 하이드로겔의 강도의 변화는 큰 차이가 없는 것을 알 수 있었다.

(5)알로인의 방출실험

정상 조직과 염증병소의 pH를 고려하여 알로인 방출한 실험은 pH 7.4 와 pH 5.5 조건에서 각각 수행하였다.

도 5는 제조예의 하이드로겔의 알로인 방출 특성을 나타낸 그래프이다. 도 5를 참조하면, CMC의 농도가 증가된 하이드로겔일수록 pH 7.4와 pH 5.5 버퍼에서 12시간 동안 알로인의 방출양이 증가되는것을 관찰하였다. 특히, 제 1용액 대 제 2용액이 3:7 비율에서 각각 96.27±1.164%와 74.46±4.82%의 방출을 보였다.(P>0.05)

약산성의 성질을 가진 알로인의 수소이온(H+)은 산성 조건에서 안정하게 잘 결합한 상태로 존재하여 방출량이 적었으며, 염기성 조건에서는 알로인의 수소이온(H+)과 수산화 이온(-OH)이 결합하면서 하이드로겔 내에 존재하는 알로인의 방출량이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다.

(6)하이드로겔의 세포독성

도 6에 하이드로겔의 농도별 용출액의 세포독성 평가를 MTT assay를 이용하여 측정한 결과를 나타내었다. 도 6에서 aloin PVA/CMC(5:5) hydrogel은 제 2제조예이고, PVA/CMC(5:5) hydrogel은 제 1용액과 제 2용액이 5:5의 비율로 조성된 비교예이고, aloin carbomer 934 gel은 상기 표 1의 알로인 첨가 도포형 겔을 의미한다.

도 6을 참조하면, 알로인이 첨가된 제 2제조예의 하이드로겔과 알로인 첨가 도포형 겔에서 80% 이상 독성이 없는 것을 확인하였다.

(7)창상에 대한 육안적, 조직학적 평가

도 7에서 오른쪽 그림은 창상유발 당일에서 창상유발 후 20일 경과시점까지 창상유발군에서 선택한 동일 개체의 창상부분을 5일 간격으로 촬영하여 상처면적의 변화를 나타낸 것이고, 왼쪽 그림(a,b,c)은 피부의 H&E 염색 후 조직학적으로 관찰한 사진이다.

도 7에서 Control은 알로인이 첨가되지 않은 도포형 겔을 처리한 군(대조군), Aloin carbomer 934 gel group은 알로인이 첨가된 도포형 겔을 처리한 군, 그리고 Aloin PVA/CMC(5:5) hydrogel group은 제 2제조예의 하이드로겔을 처리한 군을 의미한다.

도 7을 참조하면, 육안적으로 관찰되듯이 창상유발 당일에는 모든 창상유발 군에서 염증과 삼출액이 분비되고, 급성 염증의 변화는 창상유발 후 10일에서 처치군에 따라 삼출액 분비와 부종의 감소가 관찰되었다. 특히 창상유발 5일 경과 후 알로인이 함유되지 않은 도포형 겔을 도포한 군과 알로인이 함유된 도포형 겔을 처리한 군은 차이를 보였다.

도 7의 (a)는 창상유발 당일에서부터 창상유발 후 20일 경과시점까지 창상유발군의 대조군(control group)으로 다른군에 비하여 염증성 삼출액 및 혈소판과 혈장 속의 섬유소가 엉겨 붙어 창상 위에 피딱지가 관찰되었다. 도 7의 (b)는 알로인이 첨가된 도포형 겔을 처치한 군은 15일이 경과시 상처면적이 현저히 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 하지만 상처주변에 알로인 고유의 색이 피부에 잔존해 있었다.

도 7의 (c)에 나타난 제 2제조예의 하이드로겔을 처치한 군을 살펴보면, 10일 경과 후부터 상처반경이 감소하면서 상처가 빠르게 회복되기 시작했으며 효과적으로 염증기간을 단축하면서 콜라겐합성을 증가시켜 상피가 성숙되어 각화층이 관찰되었고 모낭과 피지선도 관찰되었다. 즉, 일차적으로 scar에 습윤 상태가 유지되고 알로인의 방출로 대조군에 비해 섬유아세포의 증식 및 교원질의 형성을 관찰할 수 있고 특히, 모낭의 재생을 촉진시켜 창상부위의 재생 효과가 뛰어난 것을 확인하였다. Jettanacheawchankit 등의 보고와 같이 알로인의 acemannan은 keratinocyte의 성장인자 -1와 혈관내피세포증식인자(VEGF)로 섬유아세포를 활성화 시키는 연구 결과보고를 바탕으로 알로인이 첨가된 도포형 겔은 상처재생시 혈관혈성에 필요로 하는 영양분과 산소를 공급하여 상처치유에 도움을 줄 것으로 판단하였다(S. Jettanacheawchankit, S. Sasithanasate, and P. Sangvanich, J. Pharmacol Sci., 109, 525, 2009). Singer등의 연구에서와 같이 창상이 유발되면서 상처 발생 즉시 염증반응이 시작되어 삼출액이 분비되며, 이 과정은 염증기가 끝날 때까지 지속되고 이후 치료과정에서 염증반응이 억제되고 재상피화가 완료되면 상처 수축이 되는 과정을 보고하였다(A. J. Singer and R.A. Clark. N Engl J Med, 341,738, 1999).

한편, 도 8에 창상치유율 및 창상치유점유율을 나타내었다. 도 8에서 Control-carbomer 934 gel은 알로인이 첨가되지 않은 도포형 겔을 처리한 군, Aloin carbomer 934 gel은 알로인이 첨가된 도포형 겔을 처리한 군, 그리고 Aloin PVA/CMC(5:5) hydrogel은 제 2제조예의 하이드로겔을 처리한 군을 의미한다.

도 8을 참조하면, 창상치유율 및 창상치유점유율은 습윤성을 가지는 하이드로겔을 처치한 군이 다른 군에 비해 높은 모습을 보였다.

도 7과 8의 실험결과를 통해, 알로인은 창상에 효과적인 것을 알 수 있었다. 특히, 알로인이 처리된 군(알로인이 첨가된 도포형 겔을 처리한 군과 제 2제조예의 하이드로겔을 처리한 군)은 창상 유발 직후부터 5일까지 활발하게 창상이 치유되는 경향을 보였으나, 대조군은 창상유발후 10일에서 15일 사이에 창상치유 활동이 활발하게 나타났다. 알로인이 처리된 군이 대조군에 비하여 창상 수축시기를 앞당겨진 것으로 판단할 수 있었으며, 대조군 또한 15일에 상피화를 관찰할 수 있었지만 20일이 경과 한 후 병리조직학적 검사를 한 결과 창상수축 기전에 대하여 아직까지 정확하게 밝혀진 것이 없지만 주로 알로인이 처리된 군에서만 세포와 세포외 기질 및 cyctokine 간의 상호작용에 의해 콜라겐의 침윤이 관찰되고 상피 재생의 진행을 확인할 수 있었다. 습윤 환경이 조성이 되는 제 2제조예의 하이드로겔 처치 군은 15일을 경과했을 때 93.33±0.38% 이었고, 이에 반해 대조군은 84.42±0.38로 측정되었다. 창상 유발 후 5일째부터 실험 종료까지 창상 치유율은 알로인 처리군이 대조군보다 유의성 있게 높았다.(p<0.05) 알로인을 창상치료에 활용하는 것은 초기에 창상의 수축을 활발하게 하여 창상 폐쇄기간을 줄여 세균 및 오염물질에 의한 2차 감염을 예방하고, 창상 치유과정 중 조직손상을 예방하며, 염증 반응이 조기에 줄어들면서 전체적인 치료 효과를 상승시켜 창상 치료제로 이용될 수 있다. 또한 하이드로겔의 습윤상태는 조직 내에 창상의 치유 촉진을 형성한 것으로 판단된다.

(8)결론

알로인의 창상치료제로 활용 가능성을 조사하기 위하여 랫의 등 부위에 창상을 유발한 후 알로인을 첨가한 도포형 겔과, PVA와 CMC로 조성한 알로인 첨가 하이드로겔을 각각 제조하여 실험을 진행하였다. 알로인의 피토케미칼의 활성으로 알로인이 첨가된 겔은 상처재생시 혈관혈성에 필요로 하는 영양분과 산소를 공급하여 상처 치유에 도움을 주었을 것으로 예상되며, 특히 하이드로겔의 습윤환경이 도포형 겔 보다 창상유발 후 20일째 상피가 성숙되고 각화층, 모낭, 피지선이 관찰되었다.

따라서, 창상의 치유 촉진 목적으로 알로인을 사용하게 되면, 창상 치유율을 앞당기고, 세포 재생에 도움을 주며 하이드로겔과 함께 적용 시켰을 때 전체적인 치료의 효과를 상승시킨 것을 알 수 있었다.

이상에서 본 발명은 일 실시 예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 정해져야 할 것이다.

Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 폴리비닐알콜과 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)가 용해된 혼합용액을 수득하는 제 1단계와;
   상기 혼합용액에 알로인(aloin)을 첨가하는 제 2단계와;
   상기 알로인이 첨가된 상기 혼합용액을 겔화시켜 하이드로겔을 형성시키는 제 3단계;를 포함하고,
   상기 제 2단계에서 상기 알로인은 상기 혼합용액 중 0.125중량%로 첨가되며,
   상기 혼합용액은 상기 폴리비닐알콜이 물에 6% 농도로 용해된 제 1용액과 상기 카르복시메틸셀룰로오스가 물에 3% 농도로 용해된 제 2용액을 혼합하여 형성시키고,
   상기 혼합용액은 상기 제 1용액 70부피%, 상기 제 2용액 30부피%로 혼합되어 pH 5.5인 산성 조건에서 상기 알로인의 방출속도를 늦추는 것을 특징으로 하는 알로인을 함유하는 하이드로겔 기반의 창상피복제용 조성물의 제조방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 제 3단계는 상기 혼합용액을 교반시킨 후 냉동 및 해동을 반복하여 상기 하이드로겔을 형성시키는 것을 특징으로 하는 알로인을 함유하는 하이드로겔 기반의 창상피복제용 조성물의 제조방법.

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