CN107823717A - 一种抗钙化生物补片的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗钙化生物补片的制备方法。本发明以脱细胞真皮基质或猪小肠黏膜下层为原料，加入环氧壳聚糖季铵盐，在碱性条件下反应一段时间后制备出抗钙化生物补片。由于本发明中采用的交联剂是环氧壳聚糖季铵盐，其分子中的环氧基可以与脱细胞真皮基质或猪小肠黏膜下层产生交联作用，克服了传统醛基交联方法易引起补片钙化的缺陷。同时由于该生物补片中引入了壳聚糖季铵盐结构，因而具有良好的抗菌抑菌和止血功能。本方法得到的生物被片是新一代多功能型植入材料，可以广泛应用于医学领域。

Description

一种抗钙化生物补片的制备方法
技术领域
本发明涉及一种抗钙化生物补片的制备方法，应用于生物医学材料领域。
背景技术
生物补片是指取自同种、异种的组织，经脱细胞处理去除组织中含有的各种细胞而完整保留细胞外基质的三维框架结构并能用于修复人体软组织的材料。生物补片作为生物工程支架，可通过空间诱导和组织替代作用进行缺损组织修复。由于去除了引起宿主免疫排斥反应的所有成分，因而具有良好的组织生物相容性，现已广泛应用于临床切口疝及腹壁缺损的修复重建等领域，取得了良好的效果。
为了降低生物补片的免疫原性、提高其耐降解性、改善其物理机械性能，生物补片常需要进行交联。生物补片常用交联方法为戊二醛交联法,戊二醛分子中含有两个反应活性的醛基，能够在生物补片的分子之间形成共价交联，有效降低补片的抗原性，提高其耐降解能力。戊二醛交联虽然可以稳定和修饰生物瓣上含磷丰富的结构，但当这些结构暴露于含钙量高的细胞外基质中时，可能成为钙化的位置点，产生“钙化”现象，导致血充动力学性能下降，在薄弱部位出现穿孔或撕裂，最终致生物材料功能失效。此外，戊二醛交联材料生物相容性较差，细胞毒性较高。因此，戊二醛交联法受到了很大的限制。
为了克服戊二醛交联生物补片容易产生的“钙化”缺陷，目前主要采取两种措施：（1）对交联后的生物补片进行处理，降低钙沉积的能力，从而达到抗钙化的目的。常见的方法如α-氨基油酸处理法、表面活性剂处理法、离子竞争抑制法、封闭残余游离醛基法、局部控制性缓释抗钙药物法、醇类处理等。（2）新型交联剂交联法。不采用戊二醛交联，而采用新型的交联剂（如环氧氯丙烷、多聚环氧化合物、京尼平等）进行交联，得到的交联材料具有一定的抗钙化能力。相对而言，第二种方法能够从源头解决抗钙化的问题，因而是比较推荐的方法。
常见的多聚环氧合物是通过有机化学方法合成的“外源性”化合物，加之因纯度不足或交联不完全等原因，易产生试剂残留，对生物相容性产生不利影响。京尼平是从栀子的果实分离再经酶解得到的环烯醚萜，生物相容性良好，且具有一定的抗钙化能力。但京尼平价格昂贵，交联材料颜色较深，且不易实现规模化生产，使其应用受到了限制。此外，京尼平在功能化方面具有局限性，它不能增强或赋予交联材料以更好的止血、抗菌抑菌功能。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种抗钙化生物补片的制备方法，它是由以下技术措施来实现的。
一种抗钙化生物补片的制备方法，其特征是在20～47℃温度下，称取100重量份的脱细胞真皮基质或猪小肠黏膜下层放入反应器中，加入50～300重量份的注射水，处理10～30分钟；然后加入2～20重量份的环氧壳聚糖季铵盐进行交联改性，处理20～60分钟；加入碱或碱性溶液，将pH值调至8.0～10.5，反应4～72小时；用酸或酸性溶液将pH调节至6.5～7.5，弃去反应液；然后加入100～300重量份的注射水，清洗60～120分钟，弃去清洗液；再加入100～300重量份的注射水，清洗60～120分钟，弃去清洗液；加入10～300重量份的RPMI-1640培养基处理2～8小时；用300～1000重量份的注射水清洗1～2h，弃去清洗液；再用300～1000重量份的注射水清洗1～2h；将交联后的脱细胞真皮基质或猪小肠黏膜下层取出，冷冻干燥，得到抗钙化生物补片。
根据权利要求1所述的一种抗钙化生物补片的制备方法，其中所述的碱或碱性溶液是指碳酸钠、氢氧化钠或碱性物质溶解于水中形成的溶液。
根据权利要求1所述的一种抗钙化生物补片的制备方法，其中所述的酸或酸性溶液是指醋酸、乳酸或酸性物质溶解于水中形成的溶液。
本发明制备的抗钙化生物补片具有以下特性：
（1）优良的抗钙化性能：本方法在交联的过程中，使用的交联剂是环氧壳聚糖季铵盐，其分子结构中不含有醛基，而用环氧基代替常规的醛基进行交联，因而克服了常见的醛基交联剂（如戊二醛等）交联的材料易产生钙化的缺陷，具有优良的抗钙化能力；
（2）良好的抗菌抑菌功能：环氧壳聚糖季铵盐与脱细胞真皮基质或猪小肠黏膜下层能形成共价键结合，引入的壳聚糖季铵盐分子具有广谱抗菌抑菌能力，从而赋予生物补片以良好的抗菌抑菌功能；
（3）优良的止血性能：胶原和壳聚糖是公认的优良的止血材料，本发明得到的生物补片同时拥有胶原和壳聚糖结构，因而具有双重的止血效果，止血性能优良；
（4）良好的耐降解性能：由于环氧壳聚糖季铵盐分子中含有多个环氧基，因而能够与脱细胞真皮基质或猪小肠黏膜下层发生化学交联作用，从而赋予补片以良好的耐降解性能。可以通过控制交联条件（如用量、温度、时间、pH等）来控制交联程度，调控其降解性能；
（5）生物相容性好：本方法得到的生物补片，主要结构为胶原和壳聚糖，而两者均具有良好的生物相容性。在制备过程中，当交联反应结束后，采用培养基进行了后处理，封闭了未反应的活性基团，因而得到的补片生物相容性好；
（6）良好的亲水性能：胶原和季铵盐结构都具有良好的亲水性能，因而制备的补片亲水性良好；
（7）颜色浅淡：戊二醛交联材料呈黄色，京尼平交联材料呈深蓝色，而本补片则为白色。
综上所述，本发明以脱细胞真皮基质或猪小肠黏膜下层为原料，采用环氧壳聚糖季铵盐进行交联，得到了一种抗钙化的生物补片，它同时兼具良好的抗菌抑菌、止血、耐降解等性能，是新一代多功能型生物补片。
具体实施方式
下面通过实例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，本实例只用于对本发明的进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
1.称取100克的脱细胞猪真皮基质放入锥形瓶中，加入100克的注射水到锥形瓶中，再将锥形瓶置于盛水的控温摇架中，打开加热开关，将温度调节到37℃，振摇10分钟；
2.称取8克环氧壳聚糖季铵盐加入到锥形瓶中，振摇20分钟，至环氧壳聚糖季铵盐完全溶解并渗透到脱细胞猪真皮基质中；
3.称取10克氢氧化钠，溶解在50克水中，得到氢氧化钠溶液；
4.缓慢滴加氢氧化钠溶液，将反应液的pH调节至10.0±0.5，保温振摇72小时；
5缓慢滴加乳酸，将反应液的pH调节至中性，倒掉反应液；
6.加入300克的注射水，振摇60分钟，倒掉反应液；再加入300克的注射水，振摇60分钟，倒掉反应液；
7.加入300克RPMI-1640培养基，振摇2小时；
8.取出脱细胞猪真皮基质，采用冷冻干燥机将其冻干，得到抗钙化生物补片。
实施例2
1.称取10Kg胎牛皮脱细胞真皮基质放入转鼓中，加入30Kg注射水，打开加热开关，将转鼓温度调节到47℃，转动30分钟；
2.加入2Kg环氧壳聚糖季铵盐到转鼓中，转动60分钟；
3.称取碳酸钠1Kg，缓慢加入到转鼓中，同时不断检测反应pH值，至pH达到9.0～9.5，则不再加碳酸钠；然后继续转动，反应24小时；
4. 称取氯化铵1Kg，缓慢加入到转鼓中，同时不断检测反应pH值，至pH达到7.0±0.5，倒掉反应液；
5.加入10Kg注射水，转动120分种，倒去反应液；
6.再加入10Kg注射水，转动120分种，倒去反应液；
7.加入1Kg RPMI-1640培养基，转动8小时，倒去培养基；
8.加入20Kg注射水，清洗2小时，倒掉反应液；再加入20Kg注射水，清洗2小时，倒掉反应液；
9.取出猪小肠黏膜下层，采用冷冻干燥机将其冻干，得到抗钙化生物补片。
实施例3
1.称取50Kg胎牛皮脱细胞真皮基质放入转鼓中，加入25Kg注射水，打开加热开关，将转鼓温度调节到20℃，转动20分钟；
2.加入1Kg环氧壳聚糖季铵盐到转鼓中，转动30分钟；
3.加入硼酸-硼砂缓冲溶液，将pH调节至8.0±0.5，转动48小时；
4.缓慢滴加醋酸，同时不断检测反应pH值，至pH达到7.0，倒掉反应液；
5.加入50Kg注射水，转动60分种，倒去反应液；
6.再加入150Kg注射水，转动120分种，倒去反应液；
7.加入10Kg RPMI-1640培养基，转动2小时，倒去培养基；
8.加入250Kg注射水，清洗2小时，倒去清洗液；再加入250Kg注射水，清洗2小时，倒去清洗液；
9.取出胎牛皮脱细胞真皮基质，冷冻干燥，得到抗钙化生物补片。

Claims (3)

1.一种抗钙化生物补片的制备方法，其特征是在20～47℃温度下，称取100重量份的脱细胞真皮基质或猪小肠黏膜下层放入反应器中，加入50～300重量份的注射水，处理10～30分钟；然后加入2～20重量份的环氧壳聚糖季铵盐进行交联改性，处理20～60分钟；加入碱或碱性溶液，将pH值调至8.0～10.5，反应4～72小时；用酸或酸性溶液将pH调节至6.5～7.5，弃去反应液；然后加入100～300重量份的注射水，清洗60～120分钟，弃去清洗液；再加入100～300重量份的注射水，清洗60～120分钟，弃去清洗液；加入10～300重量份的RPMI-1640培养基处理2～8小时；用300～1000重量份的注射水清洗1～2h，弃去清洗液；再用300～1000重量份的注射水清洗1～2h；将交联后的脱细胞真皮基质或猪小肠黏膜下层取出，冷冻干燥，得到抗钙化生物补片。
2.根据权利要求1所述的一种抗钙化生物补片的制备方法，其中所述的碱或碱性溶液是指碳酸钠、氢氧化钠或碱性物质溶解于水中形成的溶液。
3.根据权利要求1所述的一种抗钙化生物补片的制备方法，其中所述的酸或酸性溶液是指醋酸、乳酸或酸性物质溶解于水中形成的溶液。
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