CN109091699B - 一种止血海绵的制备方法及其制备的止血海绵 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种止血海绵的制备方法，步骤如下：（1）将氧化纤维素粉末分散到水中制成质量分数为0.1wt%～2.0wt%的氧化纤维素分散液，然后对氧化纤维素分散液进行高压均质处理，得到纳米氧化纤维素悬浮液；（2）将纳米氧化纤维素悬浮液注入模具中，进行1～7次冻融循环处理，得到纳米纤维素水凝胶，将纳米纤维素水凝胶冷冻定型，然后经冷冻干燥处理，得到止血海绵；其中，一次冻融过程为：在‑40℃～‑18℃冷冻8～16h，然后在4～25℃解冻8～16h。本发明还提供了一种利用该制备方法制备的止血海绵。该止血海绵羧基含量高，有较高孔隙率和吸水能力，能够快速吸收伤口表面多余的血液，达到有效止血的目的。

Description

一种止血海绵的制备方法及其制备的止血海绵
技术领域
本发明属于医用高分子材料领域，具体涉及一种止血海绵的制备方法及利用该制备方法制得的止血海绵。
背景技术
血液是向机体输送氧气的重要载体，人体因受伤而失血过多时，器官和细胞会发生功能障碍，发生衰竭，影响生命安危。未受控制的出血一直都是战争或重大事故中人员伤亡的主要原因。现代战争中，战场上75％的伤亡事件是由爆炸性碎片和枪伤造成的，出血依然是战场创伤的主要死因，有效止血能够大幅度降低创伤的死亡率。由于防弹衣、头盔等个人防护用具的保护作用，战场创伤多发生于四肢及肢体连接部位如腋窝、腹股沟、颈部等，这些部位无法用止血带或者通过人工压迫进行止血，容易导致出血性休克甚至死亡。美军在阿富汗与伊拉克战争中死亡的1000例尸检报告显示，可挽救性死亡中出血占85％，其中无法常规压迫性出血占69％。因此有效地快速止血，是在战场上或者重大事故中提高伤员生存率的关键。
目前报道的快速止血材料主要有粉末类(沸石、胶原粉末和马铃薯淀粉)、多孔海绵(明胶海绵、胶原海绵)、氧化再生纤维素和纤维蛋白胶等，它们各自有一定的不足之处：明胶和胶原的组织粘附力较差，两者的止血功能均依赖于足量的血小板和凝血因子；血纤维蛋白源自血液，可能会导致病毒感染；多孔沸石和马铃薯淀粉在吸收血液中的水分后会放出大量的热，容易导致伤口炎症。
申请号为201510581018.X的发明专利公开了一种用于组织工程支架的氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵材料的制备方法，该制备方法是利用纤维素与胶原蛋白之间的氢键作用使纤维素与胶原蛋白较好的相溶，通过氧化纳米纤维素增强胶原蛋白，使得胶原蛋白的物理机械性能提高，解决胶原蛋白在单独使用过程中力学性能差、降解速度过快的问题，同时不会在体系中引入其他有毒的物质，使其不具备细胞毒性，更好的应用于组织工程支架材料。但是，制备的氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵材料的吸水率下降了50％～60％。对于快速大量失血，该氧化纳米纤维素/胶原蛋白复合海绵材料不能有效快速止血，同时其吸水膨胀效果差。
鉴于现有止血材料存在的缺陷和局现性，有必要研究新的方法制备具有较高孔隙率和吸水率，能够快速吸收伤口表面多余血液，达到快速有效止血，促进创面凝血的新产品。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的旨在提供了一种止血海绵的制备方法及其制备的止血海绵。该止血海绵具有高孔隙率和吸水率，能够快速吸收创面多余的血液，实现快速有效止血。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明首先提供了一种止血海绵的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)将氧化纤维素粉末分散到水中制成质量分数为0.1wt％～2.0wt％氧化纤维素分散液，然后对氧化纤维素分散液进行高压均质处理，得到纳米氧化纤维素悬浮液；
(2)将纳米氧化纤维素悬浮液注入模具中，进行1～7次冻融循环处理，得到纳米纤维素水凝胶，将纳米纤维素水凝胶冷冻定型，然后再对其进行冷冻干燥处理，得到止血海绵；其中，一次冻融过程为：在-40℃～-18℃冷冻8～16h，然后在4～25℃解冻8～16h。
根据上述的止血海绵的制备方法，优选地，步骤(2)中在注入模具前，先对纳米氧化纤维素悬浮液进行浓缩处理，得到质量分数为0.6wt％～5wt％的浓缩纳米氧化纤维素悬浮液。
根据上述的止血海绵的制备方法，优选地，步骤(1)中所述高压均质处理的压强为1000bar～1250bar，高压均质处理的次数为20～80次。
根据上述的止血海绵的制备方法，优选地，步骤(1)中高压均质处理过程中，控制氧化纤维素分散液的温度不超过70℃。
根据上述的止血海绵的制备方法，优选地，步骤(2)中，一次冻融过程为：在-20℃冷冻15h，然后在25℃解冻9h。
根据上述的止血海绵的制备方法，优选地，步骤(2)中进行5次冻融循环处理。
根据上述的止血海绵的制备方法，优选地，步骤(2)中所述冷冻定型的冷冻温度为-18～-24℃，经实验验证，在该温度范围内进行冷冻定型均能满足本发明要求。
根据上述的止血海绵的制备方法，优选地，步骤(1)中所述氧化纤维素粉末按照下述方法制备得到：
1)将纤维素粉末加入无机强碱水溶液中搅拌混合均匀，40℃～80℃下持续搅拌反应1～5h，然后用去离子水将碱处理后的纤维素粉末洗涤至中性，干燥后得到碱处理的纤维素粉末；
2)将经步骤1)处理后的纤维素粉末采用TEMPO-NaBr-NaClO氧化体系进行氧化处理，然后用去离子水将氧化后的纤维素粉末洗涤至中性，离心并冷冻干燥，得到氧化纤维素粉末。
更加优选地，步骤1)中所述纤维素粉末为木质纤维素、竹纤维、剑麻纤维、微晶纤维素、棉纤维中的一种或多种；所述纤维素粉末的粒度为微米级。
更加优选地，步骤1)中所述无机强碱水溶液中无机强碱的质量分数为8wt％～12wt％；所述无机强碱为NaOH或KOH。
更加优选地，步骤1)中所述反应温度为60℃，反应时间为2h。
更加优选地，步骤2)中所述TEMPO-NaBr-NaClO氧化体系中TEMPO的用量为纤维素原料重量的0.5wt％～3wt％，所述NaBr的用量为纤维素原料重量的5wt％～20wt％；所述NaClO溶液的用量为2～16mmol/g纤维素原料，NaClO溶液的有效氯含量为5～20wt％；所述氧化反应的时间为1～5h。进一步地，步骤2)中所述TEMPO-NaBr-NaClO氧化体系中TEMPO的用量为纤维素原料重量的1.6wt％，所述NaBr的用量为纤维素原料重量的10wt％；所述NaClO溶液的用量为10mmol/g纤维素原料，NaClO溶液的有效氯含量为5wt％；所述氧化反应的时间为2.5h。更进一步地，采用TEMPO-NaBr-NaClO氧化体系对纤维素粉末进行氧化处理的具体过程为：在室温条件下，将经步骤1)处理后的纤维素粉末置于TEMPO-NaBr混合水溶液中充分搅拌均匀，在室温条件下向其中缓慢添加NaClO溶液开始氧化，氧化过程中持续搅拌并维持溶液pH在10左右。
本发明还提供了一种利用上述的制备方法制得的止血海绵，所述止血海绵的羧基含量为羧基含量为0.52～1.86mmol/g，孔隙率为96.85％～99.45％，密度为13.50～50.42mg/cm3。进一步地，可以通过浸渍或喷涂的方式将壳聚糖和止血药物负载到止血海绵上。更进一步的，可以根据受伤部位、伤口形状的不同，将本发明制备的止血海绵放入不同形状的模具中进行压制处理，压制后进行真空包装，进而得到特定形状的止血海绵，以满足不同伤口的止血需求，同时压制处理后的海绵便于储存、运输和携带。
本发明还提供了一种载药止血海绵的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
a.制备止血海绵：按照上述的止血海绵制备方法制备得到止血海绵；
b.配制壳聚糖-止血药物复合溶液：配制壳聚糖溶液，然后向壳聚糖溶液中加入止血药物，搅拌分散均匀，得到壳聚糖-止血药物复合溶液；
c.采用喷涂或浸渍的方法将壳聚糖-止血药物复合溶液负载到止血海绵上，冷冻定型后，再进行冷冻干燥，制得载药止血海绵。
优选地，所述壳聚糖为水溶性壳聚糖，所述水溶性壳聚糖为羧甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖和2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖中的一种或多种。
优选地，所述壳聚糖为脱乙酰度大于90％的酸溶性壳聚糖，酸溶性壳聚糖用0.01～0.5mol//L的稀醋酸做溶剂配制成壳聚糖溶液。更优选地，酸溶性壳聚糖用0.1mol//L的稀醋酸做溶剂配制成壳聚糖溶液。
优选地，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为0.1wt％～1wt％；所述壳聚糖-止血药物复合溶液中止血药物的质量分数为0.1wt％～1wt％；所述止血药物为维生素K1、维生素K3、维生素K4、醋甘氨酸乙二胺、卡巴克洛、卡络磺钠、云南白药、凝血酶中的一种或多种。
优选地，步骤c中所述喷涂是将壳聚糖-止血药物复合溶液加入喷枪中，均匀喷涂于止血海绵的表面。
优选地，步骤c中所述浸渍是将止血海绵浸入壳聚糖-止血药物复合溶液中浸泡2～5h。
优选地，步骤c中所述冷冻定型的冷冻温度为-18～-24℃，经实验验证，在该温度范围内进行冷冻定型均能满足本发明要求。
本发明还提供了一种利用上述的制备方法制得的载药止血海绵。进一步地，根据受伤部位、伤口形状的不同，可以将本发明制备的载药止血海绵放入不同形状的模具中进行压制处理，压制后进行真空包装，进而得到特定形状的止血海绵，以满足不同伤口的止血需求，同时压制处理后的海绵便于储存、运输和携带。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果：
(1)现有技术中通常采用高浓度的硫酸(50～70％硫酸)对纤维素原料进行处理，然后经洗涤、超声、冷冻干燥处理等操作才能得到纳米纤维素，本发明的制备方法将氧化纤维素分散液直接进行高压均质处理，高压均质过程中，在增压机构的作用下，高压分散液快速通过均质腔，分散液中的氧化纤维素会同时受到高速剪切、高频震荡、空穴效应和对流撞击等机械力作用和相应的热效应，氧化纤维素的纤维束逐渐被打开，更多的单根纤维裸露出来，纤维素的直径由微米级向纳米级转变，最终形成纤维素直径为纳米级的淡蓝色透明均一的纳米氧化纤维素悬浮液。因此，与现有技术相比，本发明氧化纤维素转变成纳米氧化纤维素的过程不需要用浓酸对纤维素原料进行处理，操作简单，安全环保。
(2)发明人实际研究中发现冻融循环处理次数对制得的止血海绵的密度和孔隙率有重要的影响，随着冻融循环次数的增加，止血海绵的纤维排列越来越规整，密度逐渐增大，孔隙率逐渐减少，密度的增大有利于提高止血海绵的结构稳定性，不易发生破裂；孔隙率逐渐减少导致吸水能力下降，但是，前5次冻融循环处理，止血海绵的吸水能力变化幅度不大，均维持在80g/g以上。因此，本发明的制备方法通过冻融循环处理次数的研究，得到了一种结构稳定、孔隙率高的止血海绵。
(3)本发明制备的止血海绵的羧基含量高(羧基含量为0.52～1.86mmol/g)，羧基可与血浆中的钙离子作用，促使氧化纤维素与血红蛋白反应，形成凝血块，从而起到有效止血的作用。而且，本发明制备的止血海绵还具有较高孔隙率(孔隙率达到了96.85％～99.45％)和吸水能力，能够迅速吸收血液中的水分，吸附红细胞及白细胞，聚集血小板，达到快速有效止血的目的。
(4)根据受伤部位、伤口形状的不同，可以将本发明制备的止血海绵放入不同形状的模具中进行压制处理，压制后进行真空包装，进而得到特定形状(如片状、楔形、钉型等)的止血海绵，以满足不同伤口的止血需求；而且，压缩后的止血海绵在10s内基本可实现吸附平衡，膨胀体积达到自身体积的6倍以上，因此，压缩后的止血海绵塞入伤口处能迅速吸血膨胀，占据并挤压大面积创伤特别是贯穿伤的空间，在起到压迫止血作用的同时，还可降低细菌侵入伤口的可能性，尤其适用于四肢及肢体连接部位如腋窝、腹股沟、颈部等无法利用止血带或者人工压迫止血的部位，从而提高战场或者重大事故现场可挽救性死亡人的生存率。此外，压缩后的海绵便于储存、运输和携带。
(5)本发明的止血海绵上可以负载壳聚糖和止血药物，一方面，壳聚糖具有促进血液凝固(壳聚糖的止血机理是壳聚糖表面含有大量的氨基基团，带正电的氨基基团与带负电的红细胞作用，使红细胞粘附聚集，从而使血液凝聚)、灭菌、促进伤口愈合、吸收伤口渗出物、不易脱水收缩等作用，另一方面，止血药物具有止血、凝血、消炎等作用，因此，通过将壳聚糖、止血药物与止血海绵相配合，三者相辅相成，能够有效促进创面凝血，实现快速止血。
(6)本发明止血海绵材料质地轻而柔软，富有弹性，不会对伤口产生刺激和摩擦。
(7)本发明提供的制备方法条件温和，不使用任何交联剂，不存在有害物质残留，安全性高，而且工艺简单，易操作。
附图说明
图1为不同浓度浓缩纳米氧化纤维素悬浮液制得的止血海绵的扫描电镜图；
图2为不同冻融循环次数制得的止血海绵的扫描电镜图；
图3为止血海绵吸水膨胀实验效果图；
图4为不同载药止血海绵的抑菌(inhibitory rate)性能检测结果图；
图5为不同止血海绵的凝血时间检测结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明做进一步详细说明，但并不限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的原料、化学试剂均为常规市售商品，所用的技术手段为本领域技术人员所公知的常规手段。
(一)止血海绵制备方法中浓缩纳米氧化纤维素悬浮液浓度的探讨：
为了探讨浓缩纳米氧化纤维素悬浮液浓度对制得的止血海绵的密度、孔隙率和吸水能力的影响，发明人分别做了以下实验，即实施例1～5，其对应的浓缩纳米氧化纤维素悬浮液浓度分别为：0.6wt％、1wt％、2wt％、3wt％、4wt％。实验结果见表1。
实施例1：
一种止血海绵的制备方法，包括以下步骤：
(1)将氧化纤维素粉末分散到水中制成质量分数为0.5wt％氧化纤维素分散液，然后对氧化纤维素分散液进行高压均质处理，得到纳米氧化纤维素悬浮液；其中，所述高压均质处理的压强为1000bar，高压均质处理的次数为30次，高压均质处理过程中控制氧化纤维素分散液的温度不超过70℃；
(2)将经步骤(1)处理后的纳米氧化纤维素悬浮液进行浓缩处理，得到质量分数为1wt％的浓缩纳米氧化纤维素悬浮液，将浓缩纳米氧化纤维素悬浮液置于模具中，进行5次冻融循环处理，得到纳米纤维素水凝胶，将纳米纤维素水凝胶在-20℃冷冻定型，然后再对其进行冷冻干燥，得到止血海绵；其中，一次冻融过程为：在-20℃冷冻15h，然后在25℃解冻9h。
实施例2：
实施例2的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：浓缩纳米氧化纤维素悬浮液的质量分数为0.6wt％。
实施例3：
实施例3的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：浓缩纳米氧化纤维素悬浮液的质量分数为2wt％。
实施例4：
实施例4的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：浓缩纳米氧化纤维素悬浮液的质量分数为3wt％。
实施例5：
实施例5的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：浓缩纳米氧化纤维素悬浮液的质量分数为4wt％。
表1不同浓缩纳米氧化纤维素悬浮液浓度对制得的止血海绵性能的影响
Figure BDA0001777325860000071
Figure BDA0001777325860000081
由表1可知，随着氧化纤维素浓度的提高，止血海绵的密度逐渐增大，孔隙率与吸水能力逐渐下降，这是由于体系中氧化纤维素固含量的提高，纤维素分子链之间自组装更紧密，孔隙变小，从而降低止血海绵的吸水能力。图1为不同浓度的浓缩纳米氧化纤维素悬浮液制得的止血海绵的扫描电镜图；其中，a、b、c、d、e分别代表的浓缩纳米纤维素悬浮液的浓度为0.6wt％、1wt％、2wt％、3wt％、4wt％；由图1可以明显看出，当纤维素浓度为0.6wt％时，纤维素海绵的微观形貌表现为无规蜂窝状，当纤维素浓度为1wt％时，纤维素海绵的微观形貌开始出现取向排列的多孔结构，同时随着纤维素浓度的提高，这种结构越来越明显，同时孔径之间也越来越紧凑。取向排列和致密孔径结构能够增加纤维素海绵的力学强度，在保证较好吸水能力的前提下，能够给伤口提供较高的压迫力，以抵消动脉血管的内压力，从而更快更好地止血。
(二)止血海绵制备方法中高压均质的压强的探讨：
为了探讨高压均质处理的压强对制得的止血海绵的密度、孔隙率和吸水能力的影响，发明人分别做了以下实验，即实施例1、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9，其对应的高压均质处理的压强分别为：1000bar、250bar、500bar、750bar、1250bar。实验结果见表2。
实施例6：
一种止血海绵的制备方法，包括以下步骤：
(1)将氧化纤维素粉末分散到水中制成质量分数为0.5wt％氧化纤维素分散液，然后对氧化纤维素分散液进行高压均质处理，得到纳米氧化纤维素悬浮液；其中，所述高压均质处理的压强为250bar，高压均质处理的次数为30次，高压均质处理过程中控制氧化纤维素分散液的温度不超过70℃；
(2)将经步骤(1)处理后的纳米氧化纤维素悬浮液进行浓缩处理，得到质量分数为1wt％的浓缩纳米氧化纤维素悬浮液，将浓缩纳米氧化纤维素悬浮液置于模具中，进行5次冻融循环处理，得到纳米纤维素水凝胶，将纳米纤维素水凝胶在-20℃冷冻定型，然后再对其进行冷冻干燥，得到止血海绵；其中，一次冻融过程为：在-20℃冷冻15h，然后在25℃解冻9h。
实施例7：
实施例7的内容与实施例6基本相同，其不同之处在于：高压均质处理的压强为500bar。
实施例8：
实施例8的内容与实施例6基本相同，其不同之处在于：高压均质处理的压强为750bar。
实施例9：
实施例9的内容与实施例6基本相同，其不同之处在于：高压均质处理的压强为1250bar。
表2高压均质处理的压强对制得的止血海绵性能的影响
Figure BDA0001777325860000091
在研究过程中发现，当高压均质压强为250bar时，氧化纤维素分散液经高压均质后呈现浑浊的悬浮液，静置1h就会出现分层现象，将其注入模具中，在冻融循环处理过程中会出现分层现象，最终无法形成纳米纤维素水凝胶；随着压强增加到500bar时，氧化纤维素分散液经高压均质后呈现均匀的悬浮液，静置过程不会形成分层现象，但其经过冻融循环处理过程形成的纳米纤维素水凝胶比较脆弱，同时伴有液体水存在，冷冻干燥形成的止血海绵结构不稳定，很容易破碎；当压强高于750bar时，高压均质后氧化纤维素悬浮液逐渐从乳白色半透明的悬浮液向淡蓝色透明均一的悬浮液转变，同时在冻融循环处理过程中能够形成稳定的纳米纤维素水凝胶。这是由于高压均质过程中，在增压机构的作用下，高压分散液快速通过均质腔，分散液中的氧化纤维素会同时受到高速剪切、高频震荡、空穴效应和对流撞击等机械力作用和相应的热效应，氧化纤维素的纤维束逐渐被打开，更多单根纤维裸露出来，纤维素的直径由微米级向纳米级转变；同时，高压均质的压强越高，纤维束被打开的几率就越大，形成的纳米氧化纤维素就会越多，悬浮液就会变得更透明，在后续冻融循环过程中，随着悬浮液中纳米氧化纤维素的增多，纳米氧化纤维素自组装进程也越多(自组装进程是指纳米氧化纤维素悬浮液在进行冻融循环处理过程中，纳米氧化纤维素分子间发生交联反应形成纳米氧化纤维素水凝胶的过程)，形成的止血海绵结构越稳定。当压强为1000bar时，氧化纤维素分散液经高压均质处理，最终形成纤维素的直径为纳米级的淡蓝色透明均一的纳米氧化纤维素悬浮液，经冻融循环处理后，制得的止血海绵结构稳定。但压强高于1000bar时，止血海绵的各种性能变化不大，同时考虑能源消耗及机器磨损情况等，采用压强为1000bar为最优。
由表2也可看出，当压强大于750bar时，随着压强逐渐增大，止血海绵的密度先减小后增大，孔隙率和吸水能力逐渐降低，当压强为1000bar和1250bar时，止血海绵的密度、孔隙率和吸水能力变化不大。随着压强的增大，纤维素被充分剪切和剥离，溶液中出现更多的纳米纤维素，纳米纤维素在冻融过程中，自组装的几率增大，纤维素之间结构更加紧密，止血海绵的密度相应提高，从而提高止血海绵的结构的稳定性。当压强小于1000bar时，这种现象很明显，但当压强大于1000bar时，止血海绵的密度趋于稳定，再次提高压强，效果不明显，故采用压强1000bar为最优。
(三)止血海绵制备方法中高压均质处理次数探讨：
为了探讨高压均质处理次数对制得的止血海绵的密度、孔隙率和吸水能力的影响，发明人分别做了以下实验，即实施例1、实施例10、实施例11、实施例12、实施例13，其对应的高压均质处理的次数分别为：30次、20次、40次、60次、80次。实验结果见表3。
实施例10：
一种止血海绵的制备方法，包括以下步骤：
(1)将氧化纤维素粉末分散到水中制成质量分数为0.5wt％氧化纤维素分散液，然后对氧化纤维素分散液进行高压均质处理，得到纳米氧化纤维素悬浮液；其中，所述高压均质处理的压强为1000bar，高压均质处理的次数为20次，高压均质处理过程中控制氧化纤维素分散液的温度不超过70℃；
(2)将经步骤(1)处理后的纳米氧化纤维素悬浮液进行浓缩处理，得到质量分数为1wt％的浓缩纳米氧化纤维素悬浮液，将浓缩纳米氧化纤维素悬浮液置于模具中，进行5次冻融循环处理，得到纳米纤维素水凝胶，将纳米纤维素水凝胶在-20℃冷冻定型，然后再对其进行冷冻干燥，得到止血海绵；其中，一次冻融过程为：在-20℃冷冻15h，然后在25℃解冻9h。
实施例11：
实施例11的内容与实施例10基本相同，其不同之处在于：高压均质处理的次数为40次。
实施例12：
实施例12的内容与实施例10基本相同，其不同之处在于：高压均质处理的次数为60次。
实施例13：
实施例13的内容与实施例10基本相同，其不同之处在于：高压均质处理的次数为80次。
表3高压均质处理的次数对制得的止血海绵性能的影响
Figure BDA0001777325860000111
在高压均质过程中发现，随着均质次数增多，均质后氧化纤维素悬浮液逐渐从有明显分层向均一悬浮液转变，同时氧化纤维素悬浮液的颜色从乳白色半透明向淡蓝色透明转变，当均质次数为20次时，均质氧化纤维素悬浮液呈现乳白色半透明悬浮液，随着均质次数的增加，当均质次数为30次时，均质后氧化纤维素悬浮液溶液呈现透明均一的淡蓝色，随后再次增加均质次数，溶液颜色保持淡蓝色不变。增加均质次数，纤维束被破碎解离成更多的纳米氧化纤维素，溶液变得更透明，在羧基基团的作用下，纳米氧化纤维素自组装进程和几率增大，分子间的作用力更强，最终制得的止血海绵结构更稳定。
由表3也可看出，随着均质次数的增大，止血海绵的密度、孔隙率和吸水能力逐渐降低，如同增加压强原理一样，增大均质次数，等于增加剪切和剥离纤维素的时间，延长均质时间，能使纤维素被充分剪切和剥离，溶液中出现更多的纳米纤维素，纳米纤维素在冻融过程中，自组装的几率增大，纤维素之间结构更加紧密，止血海绵的密度相应提高，从而提高止血海绵的结构稳定性。当均质次数大于30次时，止血海绵的密度、孔隙率和吸水能力趋于稳定，再次增加均质次数对于提高止血海绵的稳定性意义不大。对不同均质次数制备的止血海绵进行反复吸水按压实验(吸水按压实验是将止血海绵放入水中，吸水饱和后按压止血海绵，观察止血海绵形状恢复能力以及按压过程中止血海绵是否出现坍塌和破裂，如果止血海绵经过反复吸水按压，形状恢复好，而且未出现坍塌和破裂，说明止血海绵结构稳定)，检测止血海绵的结构稳定性。结果发现，当均质次数大于等于30次时，止血海绵的结构稳定性变化不大。考虑能源消耗及机器磨损情况等，采用均质次数为30次时为最优。
(四)止血海绵制备方法中冻融循环的循环次数探讨：
为了探讨冻融循环的循环次数对制得的止血海绵的密度、孔隙率和吸水能力的影响，发明人分别做了以下实验，即实施例1、实施例14、实施例15、实施例16，其对应的冻融循环的循环次数分别为：5次、1次、3次、7次。实验结果见表4。
实施例14：
一种止血海绵的制备方法，包括以下步骤：
(1)将氧化纤维素粉末分散到水中制成质量分数为0.5wt％氧化纤维素分散液，然后对氧化纤维素分散液进行高压均质处理，得到纳米氧化纤维素悬浮液；其中，所述高压均质处理的压强为1000bar，高压均质处理的次数为30次，高压均质处理过程中控制氧化纤维素分散液的温度不超过70℃；
(2)将经步骤(1)处理后的纳米氧化纤维素悬浮液进行浓缩处理，得到质量分数为1wt％的浓缩纳米氧化纤维素悬浮液，将浓缩纳米氧化纤维素悬浮液置于模具中，进行1次冻融循环处理，得到纳米纤维素水凝胶，将纳米纤维素水凝胶在-20℃冷冻定型，然后再对其进行冷冻干燥，得到止血海绵；其中，一次冻融过程为：在-20℃冷冻15h，然后在25℃解冻9h。
实施例15：
实施例15的内容与实施例14基本相同，其不同之处在于：冻融循环的循环次数3次。
实施例16：
实施例16的内容与实施例14基本相同，其不同之处在于：冻融循环的循环次数7次。
表4高压均质处理的冻融循环的循环次数对制得的止血海绵性能的影响
Figure BDA0001777325860000131
由表4可知，冻融循环的循环次数主要影响纳米氧化纤维素自组装进程，随着冻融循环次数的增加，止血海绵的密度逐渐增大，当循环次数增大到7次时，止血海绵密度有稍微的下降，这可能是过多的冻融循环造成止血海绵的结构部分坍塌；同时，止血海绵的孔隙率和吸水能力逐渐下降。对制备的止血海绵进行反复吸水按压实验检测其结构稳定性，结果发现冻融循环次数为5次时，止血海绵的结构稳定性最优。图2为不同冻融循环次数制得的止血海绵的扫描电镜图；其中，A、B、C、D、E分别代表的冻融循环次数为0、1、3、5、7次；a、b、c、d、e为A、B、C、D、E的放大图；由图2可知，当冻融次数为0时，止血海绵微观结构表现为无规蜂窝状，且孔径分布不均匀，增加冻融循环次数，止血海绵的微观结构表现出取向结构排列的多孔结构，孔径分布逐渐变得均匀，孔与孔之间结合更加紧密，当冻融次数增加到7次时，止血海绵的多孔结构发生部分坍塌，故选择冻融循环5次为最优。
实施例17：
实施例17的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤(2)中，一次冻融过程为：在-40℃冷冻8h，然后在20℃解冻12h；冷冻定型的温度为-18℃。
实施例18：
实施例18的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：步骤(2)中，一次冻融过程为：在-18℃冷冻16h，然后在4℃解冻16h；冷冻定型的温度为-24℃。
实施例19：
实施例19的内容与实施例1基本相同，其不同之处在于：
步骤(1)中：将氧化纤维素粉末分散到水中制成质量分数为1wt％氧化纤维素分散液，然后对氧化纤维素分散液进行高压均质处理，得到纳米氧化纤维素悬浮液；
步骤(2)中：将经过步骤(1)处理后的纳米氧化纤维素悬浮液不经浓缩处理直接置于模具中，进行5次冻融循环处理；其中，一次冻融过程为一次冻融过程为：在-20℃冷冻15h，然后在25℃解冻9h。
实施例20：实施例1中所述氧化纤维素粉末的制备方法
1)、将粒度为微米级的纤维素粉末加入无机强碱水溶液中搅拌混合均匀，在60℃水浴中持续搅拌反应2h，然后用去离子水将碱处理后的纤维素粉末洗涤至中性，干燥后得到碱处理的纤维素粉末；其中，所述纤维素粉末为微晶纤维素，所述无机强碱水溶液中无机强碱的质量分数为10wt％；所述无机强碱为NaOH；
2)、将经步骤1)处理后的纤维素粉末采用TEMPO-NaBr-NaClO氧化体系进行氧化处理，氧化处理后采用去离子水将氧化后的纤维素粉末洗涤至中性，然后经离心、冷冻干燥，得到氧化纤维素粉末；其中，所述TEMPO-NaBr-NaClO氧化体系中TEMPO的用量为纤维素原料重量的1.6wt％，所述NaBr的用量为纤维素原料重量的10wt％；所述NaClO溶液的有效氯含量为10wt％，其用量为5mmol/g纤维素原料；所述氧化反应的时间为2.5h。
实施例21：
氧化纤维素粉末还可以采用如下方法制备：
1)、将粒度为微米级的纤维素粉末加入无机强碱水溶液中搅拌混合均匀，在40℃水浴中持续搅拌反应5h，然后用去离子水将碱处理后的纤维素粉末洗涤至中性，干燥后得到碱处理的纤维素粉末；其中，所述纤维素粉末为微晶纤维素，所述无机强碱水溶液中无机强碱的质量分数为8wt％；所述无机强碱为NaOH；
2)、将经步骤1)处理后的纤维素粉末采用TEMPO-NaBr-NaClO氧化体系进行氧化处理，氧化处理后采用去离子水将氧化后的纤维素粉末洗涤至中性，然后经离心、冷冻干燥，得到氧化纤维素粉末；其中，所述TEMPO-NaBr-NaClO氧化体系中TEMPO的用量为纤维素原料重量的0.5wt％，所述NaBr的用量为纤维素原料重量的5wt％；所述NaClO溶液的有效氯含量为2wt％，其用量为5mmol/g纤维素原料；所述氧化反应的时间为5h。
实施例22：
实施例22的内容与实施例21基本相同，其不同之处在于：
步骤(1)中：在80℃水浴中持续搅拌反应1h，所述纤维素粉末为木质纤维素，所述无机强碱水溶液中无机强碱的质量分数为12wt％；
步骤(2)中：所述TEMPO-NaBr-NaClO氧化体系中TEMPO的用量为纤维素原料重量的3wt％，所述NaBr的用量为纤维素原料重量的20wt％；所述NaClO溶液的有效氯含量为20wt％，其用量为16mmol/g纤维素原料；所述氧化反应的时间为1h。
实施例23：
实施例23的内容与实施例21基本相同，其不同之处在于：
步骤(1)中：在60℃水浴中持续搅拌反应3h，所述纤维素粉末为木质纤维素，所述无机强碱水溶液中无机强碱的质量分数为8wt％；
步骤(2)中：所述TEMPO-NaBr-NaClO氧化体系中TEMPO的用量为纤维素原料重量的1.5wt％，所述NaBr的用量为纤维素原料重量的12wt％；所述NaClO溶液的有效氯含量为8wt％，其用量为12mmol/g纤维素原料；所述氧化反应的时间为2h。
实施例24：
实施例24的内容与实施例21基本相同，其不同之处在于：
步骤(1)中：在60℃水浴中持续搅拌反应2.5h，所述纤维素粉末为木质纤维素，所述无机强碱水溶液中无机强碱的质量分数为10wt％；
步骤(2)中：所述TEMPO-NaBr-NaClO氧化体系中TEMPO的用量为纤维素原料重量的1.6wt％，所述NaBr的用量为纤维素原料重量的8wt％；所述NaClO溶液的有效氯含量为6wt％，其用量为8mmol/g纤维素原料；所述氧化反应的时间为3h。
实施例25：
实施例25的内容与实施例20基本相同，其不同之处在于：步骤(1)中，所述无机强碱为KOH。
实施例26：
实施例26的内容与实施例20基本相同，其不同之处在于：步骤(1)中，所述纤维素粉末为剑麻纤维。
实施例27：
实施例27的内容与实施例20基本相同，其不同之处在于：步骤(1)中，所述纤维素粉末为竹纤维，所述无机强碱为KOH。
实施例28：
实施例28的内容与实施例20基本相同，其不同之处在于：所述纤维素粉末为棉纤维。
实施例29：
一种载药止血海绵的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
a.制备止血海绵：按照实施例1所述的止血海绵的制备方法，制备得到止血海绵；
b.配制壳聚糖-止血药物复合溶液：配制壳聚糖溶液，然后向壳聚糖溶液中加入止血药物，搅拌分散均匀，得到壳聚糖-止血药物复合溶液；其中，所述壳聚糖为脱乙酰度大于90％的酸溶性壳聚糖，酸溶性壳聚糖用0.1mol//L的稀醋酸做溶剂配制成壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为1wt％；所述壳聚糖-止血药物复合溶液中止血药物的质量分数为0.5wt％；所述止血药物为凝血酶；
c.将止血海绵浸入壳聚糖-止血药物复合溶液中浸泡2h，然后将吸附壳聚糖-止血药物复合溶液的止血海绵在-20℃冷冻定型，经冷冻干燥，制得载药止血海绵。
实施例30：
实施例30的内容与实施例29基本相同，其不同之处在于：步骤b中，所述壳聚糖溶液的质量分数为0.1wt％。
实施例31：
实施例31的内容与实施例29基本相同，其不同之处在于：步骤b中，所述壳聚糖溶液的质量分数为2wt％。
实施例32：
实施例32的内容与实施例29基本相同，其不同之处在于：步骤b中，所述壳聚糖为羧甲基壳聚糖，羧甲基壳聚糖用水作溶剂，配制成壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液的质量分数为1wt％。
实施例33：
实施例33的内容与实施例29基本相同，其不同之处在于：步骤b中，所述壳聚糖为羟丙基壳聚糖，羟丙基壳聚糖用水作溶剂，配制成壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液的质量分数为1wt％。
实施例34：
实施例34的内容与实施例29基本相同，其不同之处在于：步骤b中，所述壳聚糖为2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖用水作溶剂，配制成壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液的质量分数为1wt％。
实施例35：
实施例35的内容与实施例29基本相同，其不同之处在于：步骤b中，所述壳聚糖-止血药物复合溶液中止血药物的质量分数为1wt％；所述止血药物为卡巴洛克。
实施例36：
实施例36的内容与实施例29基本相同，其不同之处在于：步骤b中，所述壳聚糖-止血药物复合溶液中止血药物的质量分数为0.1wt％；所述止血药物为卡络磺钠。
实施例37：
实施例37的内容与实施例29基本相同，其不同之处在于：步骤b中，所述止血药物为云南白药；步骤c中，冷冻定型的温度为-18℃。
实施例38：
实施例38的内容与实施例29基本相同，其不同之处在于：步骤b中，所述止血药物为维生素K1；步骤c中，冷冻定型的温度为-20℃。
实施例40：
实施例40的内容与实施例29基本相同，其不同之处在于：步骤b中，所述止血药物为维生素K3。
实施例41：
实施例41的内容与实施例29基本相同，其不同之处在于：步骤b中，所述止血药物为维生素K4。
实施例43：
实施例43的内容与实施例29基本相同，其不同之处在于：步骤b中，所述止血药物为维生素醋甘氨酸乙二胺。
实施例44：
实施例44的内容与实施例29基本相同，其不同之处在于：步骤c中，在止血海绵表面均匀喷涂壳聚糖-止血药物复合溶液，然后将喷涂后的止血海绵在-20℃冷冻定型，再冷冻干燥，得到载药止血海绵。
性能测试实验：
1、吸水膨胀实验
以实施例1制备的止血海绵来研究止血海绵的吸水性能。具体操作为：将实施例1制备的止血海绵(直径为2cm、高度6cm的圆柱形木质纤维素海绵)用甲基红进行染色(染色的目的是为了更加清晰地观察止血海绵吸水膨胀的现象)，然后将染色后的止血海绵压缩成直径2cm、高度1cm的圆柱形压缩止血海绵，然后将压缩止血海绵置于去离子水中，观察压缩止血海绵的吸水膨胀能力，结果见图3。图3中，a为未染色的止血海绵，b为染色后的止血海绵，c为压缩的止血海绵，d为压缩的止血海绵放入去离子水0s时的状态，e、f、g、h分别为压缩的止血海绵放入去离子水中1s、2s、3s、4s时的状态。由图3可以看出，压缩止血海绵放入水中后能够在短时间内迅速吸水溶胀，其经过4s的充分吸水后，压缩止血海绵基本可以恢复到其压缩前的状态，这表明，压缩止血海绵在较短时间内能够迅速吸水膨胀至自身体积的6倍左右。因此，当压缩木质纤维素海绵片放入较大动脉伤口处，不仅能够迅速吸收血液中的水分，使血液迅速凝固，而且快速膨胀体积的海绵能够提供足够的压迫力作用，堵塞伤口避免细菌感染，同时压迫动脉血管以防再次出血。
2、载药止血海绵抗菌性能测试
采用抑菌圈法对实施例29～33制备的载药止血海绵进行抗菌测试，以研究采用不同种类、不同浓度酸溶壳聚糖溶液制备的载药止血海绵的抗菌性能，实施例29-33对应的壳聚糖种类以及壳聚糖溶液的质量分数参见表5。抗菌测试的具体实验操作为：将载药止血海绵剪成1mm厚的直径为10mm的圆片，于紫外灯下照射杀菌5min。配置琼脂固体培养基，高压灭菌、铺板，待培养基冷却凝固后，取100μL的细菌(金黄色葡萄球菌)菌悬液(～106CFU/mL)均匀涂抹在固体培养基表面，随后将圆片状样品轻轻粘在培养基表面，37℃下培养24h。观察拍照，测量抑菌圈的大小。结果如图4所示。
表5实施例29～33对应的壳聚糖种类以及壳聚糖溶液的质量分数
实施例 壳聚糖种类 壳聚糖的质量分数 制备的产品
实施例29 酸溶性壳聚糖 1wt％ 载药止血海绵
实施例30 酸溶性壳聚糖 0.1wt％ 载药止血海绵
实施例31 酸溶性壳聚糖 2wt％ 载药止血海绵
实施例32 羧甲基壳聚糖 1wt％ 载药止血海绵
实施例33 羟丙基壳聚糖 1wt％ 载药止血海绵
实施例1 -- -- 止血海绵
图4中，A为采用不同浓度酸溶壳聚糖溶液制备的载药止血海绵抑菌性能检测结果，B为采用不同种类壳聚糖溶液(壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为1wt％)制备的载药止血海绵抑菌性能检测结果，C为实施例1制备的止血海绵与实施例29制备的载药止血海绵抑菌性能对比结果。由A可以观察到，随着酸溶壳聚糖质量分数的增加，复合海绵的抑菌率逐渐增大，表明富含高浓度酸溶壳聚糖的复合海绵对金黄色葡萄球菌有较强的抗菌能力，但在研究中还发现，当酸溶壳聚糖的质量分数达到2wt％时，其粘度迅速增大，不容易浸泡或喷涂于纤维素海绵表面，在本实验中，取质量分数为1wt％的酸溶性壳聚糖为最优结果。由B可以看出，多糖的抑菌能力是酸溶壳聚糖＞羟丙基壳聚糖＞羧甲基壳聚糖。从C可以清晰的看出，载药止血海绵的抑菌率为98.12％，而未载药的止血海绵基本没有抑菌效果；这是因为载药止血海绵中，主要是由壳聚糖起着主要的抗菌作用，而氧化纤维素和止血药物不具备抗菌能力，因此，选择合适的壳聚糖对止血海绵的抗菌能力至关重要。
3、止血海绵凝血时间测定
采用试管法凝血时间来测定未载药止血海绵、仅负载止血药物的止血海绵、仅负载壳聚糖的止血海绵、负载壳聚糖-止血药物的载药止血海绵的止血能力。其中，未载药止血海绵为实施例1制得的止血海绵；仅负载止血药物的止血海绵的制备方法与实施例29基本相同，但是仅负载了止血药物(止血药物的质量分数为0.5wt％)；仅负载壳聚糖的止血海绵的制备方法与实施例29基本相同，但是仅负载了壳聚糖(壳聚糖的质量分数为1wt％)；负载壳聚糖-止血药物的载药止血海绵为实施例29制备的载药止血海绵；未载药止血海绵、仅负载止血药物的止血海绵、仅负载壳聚糖的止血海绵和负载壳聚糖-止血药物的载药止血海绵的具体载药情况参见表6。
表6未载药止血海绵、仅负载止血药物的止血海绵、仅负载壳聚糖的止血海绵和负载壳聚糖-止血药物的载药止血海绵的具体载药情况
Figure BDA0001777325860000201
具体实验操作为：取相同质量的未载药止血海绵、仅负载止血药物的止血海绵、仅负载壳聚糖的止血海绵、负载壳聚糖-止血药物的载药止血海绵，然后按相同的压缩比对各止血海绵进行压缩，得到压缩的止血海绵；然后分别称取0.05g各压缩的止血海绵，送至直径为2cm的玻璃试管底部，每种止血海绵设三个平行样。采集新鲜血液3mL，将血液沿试管壁缓慢注入试管中，每管1mL，轻轻混匀3s，然后将试管放入37℃电热恒温水浴锅中，每隔5s倾斜一次试管，直至试管中血液不流动，记录全血凝固时间。具体结果见图5。
图5中，1为实施例1制备的未载药止血海绵，2为仅负载止血药物的止血海绵，3为仅负载壳聚糖的止血海绵，4为实施例29制备的负载壳聚糖-止血药物的载药止血海绵。由图5可知，未载药止血海绵的凝血时间为20s左右，这是由于止血海绵胶羧基含量高而且具有较高的孔隙率和吸水能力，迅速吸收血液中的水分，吸附红细胞及白细胞，聚集血小板而达到止血目的；仅负载止血药物的止血海绵的凝血时间和未载药止血海绵的凝血时间相当，这是由于止血海绵的快速吸收血液中水分而聚集红细胞、血小板等止血，时间较短，而药物如卡巴克洛是促进毛细血管收缩，降低毛细血管通透性，增进断裂毛细血管断端的回缩，起到止血作用，药物作用止血时间还未明显起效，这可能在随后的更进一步止血有明显效果；仅负载壳聚糖的止血海绵与负载壳聚糖-止血药物的载药止血海绵凝血时间相当，而且凝血时间均在14s左右，止血海绵表面负载有壳聚糖，壳聚糖的止血机理不是传统的依赖于血小板和凝血因子的瀑布机制，壳聚糖表面具有大量的氨基基团，带正电的氨基基团与带负电的红细胞作用，使红细胞粘附聚集，从而使血液凝聚，氧化纤维素和壳聚糖相辅相成，促进血液凝固，从而达到止血目的。同时发明人还做了分别负载维生素K1、维生素K3、维生素K4、醋甘氨酸乙二胺、卡巴克洛、卡络磺钠、云南白药、凝血酶的载药止血海绵的凝血时间测定实验，结果发现凝血酶较其他药物具有较好的止血能力。
以上所述仅为本发明的部分实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种止血海绵的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：
（1）将氧化纤维素粉末分散到水中制成质量分数为0.1wt%～2.0wt%的氧化纤维素分散液，然后对氧化纤维素分散液进行高压均质处理，得到纳米氧化纤维素悬浮液；所述高压均质处理的压强为1000bar～1250 bar，高压均质处理的次数为20～80次；
（2）将纳米氧化纤维素悬浮液注入模具中，进行1～7次冻融循环处理，得到纳米纤维素水凝胶，将纳米纤维素水凝胶冷冻定型，然后再对其进行冷冻干燥处理，得到止血海绵；其中，一次冻融过程为：在-40℃～-18℃冷冻8～16h，然后在4～25℃解冻8～16h；在注入模具前，先对纳米氧化纤维素悬浮液进行浓缩处理，得到质量分数为0.6wt%～5wt%的浓缩纳米氧化纤维素悬浮液。
2.根据权利要求1所述止血海绵的制备方法，其特征在于，步骤（1）中高压均质处理过程中，控制氧化纤维素分散液的温度不超过70℃。
3.根据权利要求1所述止血海绵的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述氧化纤维素粉末按照下述方法制备得到：
1）将纤维素粉末加入无机强碱水溶液中搅拌混合均匀，40℃～80℃下持续搅拌反应1～5h，然后用去离子水将碱处理后的纤维素粉末洗涤至中性，干燥后得到碱处理的纤维素粉末；
2）将经步骤1）处理后的纤维素粉末采用TEMPO-NaBr-NaClO氧化体系进行氧化处理，然后用去离子水将氧化后的纤维素粉末洗涤至中性，离心并冷冻干燥，得到氧化纤维素粉末。
4.一种利用权利要求1-3任一所述止血海绵的制备方法制得的止血海绵，其特征在于，所述止血海绵的羧基含量为0.52～1.86mmol/g，孔隙率为96.85%～99.45%，密度为13.50～50.42 mg/cm3。
5.一种载药止血海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a．制备止血海绵：按照权利要求1-3任一所述止血海绵的制备方法制得止血海绵；
b．配制壳聚糖-止血药物复合溶液：配制壳聚糖溶液，然后向壳聚糖溶液中加入止血药物，搅拌分散均匀，得到壳聚糖-止血药物复合溶液；
c．采用喷涂或浸渍的方法将壳聚糖-止血药物复合溶液负载到止血海绵上，冷冻定型后再进行冷冻干燥，制得载药止血海绵。
6.根据权利要求5所述载药止血海绵的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为0.1wt%～1wt%；所述壳聚糖-止血药物复合溶液中止血药物的质量分数为0.1wt%～1wt%；所述止血药物为维生素K1、维生素K3、维生素K4、醋甘氨酸乙二胺、卡巴克洛、卡络磺钠、云南白药、凝血酶中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述载药止血海绵的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖为水溶性壳聚糖，所述水溶性壳聚糖为羧甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖和2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖中的一种或多种。
8.根据权利要求5所述载药止血海绵的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖为脱乙酰度大于90%的酸溶性壳聚糖，酸溶性壳聚糖用0.01～0.5mol//L的稀醋酸做溶剂配制成壳聚糖溶液。
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