CN113975456B - 杏鲍菇子实体制备甲壳素/葡聚糖复合止血海绵的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及杏鲍菇子实体制备的甲壳素/葡聚糖复合止血海绵的方法。本发明技术方案是：将杏鲍菇子实体浸泡于氢氧化钠水溶液中进行脱蛋白反应得到脱蛋白杏鲍菇子实体；将脱蛋白杏鲍菇子实体进行水洗至中性，冷冻干燥，之后浸泡于NaClO溶液中进行TEMPO氧化处理，洗至中性后，进行第二次冷冻干燥；将第二次冷冻干燥后海绵状脱蛋白杏鲍菇子实体浸泡于CaCl₂溶液中进行交联反应，而后洗去未交联的钙离子，冷冻干燥，得到甲壳素/葡聚糖复合止血海绵。本发明制备的复合止血海绵可快速形成血栓达到快速止血效果，制备方法简单，反应温和、能耗低、环境友好，原料成本低廉，简单易得。

Description

杏鲍菇子实体制备甲壳素/葡聚糖复合止血海绵的方法

技术领域

本发明属于医用高分子材料领域，具体涉及一种杏鲍菇子实体制备的甲壳素/葡聚糖复合止血海绵的方法。该海绵原料纯天然、具有生物相容性好、生物可降解性以及高效止血性能。

技术背景

不可控出血是在战场上、平民事故中、手术室中创伤死亡的主要因素。据报道，近三分之一的创伤死亡是由于大出血导致的，其中近50 %的死亡是发生在紧急医疗人员到达之前。因此，对于危及生命的外伤性出血，需要及时有效的止血。到目前为止，随着针对止血的研究不断推进，已经有一系列的止血材料，如止血带、明胶海绵、纱布、粉剂、纤维蛋白绷带、氧化再生纤维素和纤维蛋白胶等等，其中有一些止血材料已经被商业化，包括Celox^TM,HemCon^®，Tramadex^®，QuikClot^®等，但它们各自有一定的不足之处：常用的止血带和绷带无法对穿刺伤口（子弹、炸弹和炸药造成的、交通事故造成的或日常生活中造成的不规则且深窄的、不可压缩的伤口）进行及时的止血；明胶和胶原所使用的血纤维蛋白源自血液，可能会导致病毒感染；多孔沸石在吸收血液中的水分后会放出大量的热，容易导致伤口炎症。因此，制备一种能够对不规则形状的深部伤口进行高效止血的材料具有重要的意义。

甲壳素是一种天然高分子多糖，在天然储量上仅次于纤维素。由于它成本低廉，来源丰富，且具有良好的生物相容性和生物降解性，促使其在生物止血领域有广阔的应用前景。传统制备甲壳素多孔止血海绵通过溶解/再生技术，制备过程不仅繁琐、复杂，而且需要引入有毒的化学交联剂。与传统方法不同，本发明直接利用杏鲍菇子实体天然的三维网络结构，通过原位刻蚀去除蛋白质和部分多糖而保留以甲壳素/葡聚糖为主的骨架，构筑多孔止血海绵， 可有效避免使用有毒的化学交联剂。迄今为止，这种直接从天然菌类子实体入手制备甲壳素多孔止血海绵的方法尚未见报道。

发明内容

为了克服上述止血材料不能用应于深而狭窄的、不可按压的出血的技术问题，并制备无需任何交联剂、可降解且使用于不可按压伤口的高效止血海绵，本发明提供一种直接利用杏鲍菇子实体制备的甲壳素/葡聚糖复合多孔止血海绵的方法。本发明独创性地直接对杏鲍菇子实体制备多孔血海绵，仅通过简单的脱蛋白处理、表面氧化与钙离子的引入，即可得到无需任何化学交联剂的止血海绵。在脱蛋白过程中去除蛋白质、油脂与可溶性多糖等，得到所需的甲壳素/葡聚糖骨架，在TEMPO氧化过程中通过“造孔”与亲水基团的引入赋予海绵优异的血触变能力，最后通过钙离子的引入改善TEMPO氧化后海绵的压缩性能，确保其能在止血中对伤口进行有效的物理封堵。

本发明是通过以下技术方案实现的：

1、将杏鲍菇子实体浸泡于氢氧化钠水溶液中进行脱蛋白反应，得到海绵状脱蛋白杏鲍菇子实体；

2、将海绵状脱蛋白杏鲍菇子实体进行水洗至中性，除去杏鲍菇子实体中的水溶性多糖，冷冻干燥；

3、将冷冻干燥的海绵浸泡于NaClO溶液中进行TEMPO 氧化处理，氧化处理后的海绵洗至中性，进行第二次冷冻干燥；

4、将第二次冷冻干燥后海绵状脱蛋白杏鲍菇子实体浸泡于 CaCl₂ 溶液中进行交联反应，而后洗去未交联的钙离子，冷冻干燥，得到甲壳素/葡聚糖复合止血海绵。

步骤1中，所述的氢氧化钠溶液浓度为10～20 wt%，脱蛋白反应温度为50～80 ℃，脱蛋白反应时间为2～6 h。

步骤3中，所述的NaClO溶液浓度为5～30mmol。

步骤3中，所述的TEMPO 氧化处理，氧化程度为5～30 mmol，氧化处理时间为1～3h。

步骤4中，所述的CaCl₂浓度为2～10 wt%，交联反应时间为2～6 h。

与现有技术相比，本发明方法具有以下有益的效果：

1、本发明采用以上技术方案，甲壳素/葡聚糖复合止血海绵可借由其多孔结构与亲水基团的协同作用对不可按压伤口进行完美填充，并对伤口施加一定压力，完成及时的物理封堵，在物理封堵的基础上，钙离子有效地促进凝血级联反应，从而达到快速止血效果。

2、本发明所述的止血海绵原料纯天然，未使用任何交联剂，不存在有害物质残留，对人体安全无害且无抗原性。

3、本发明所述的止血海绵为甲壳素/葡聚糖复合物。

4、本发明所述的止血海绵具有血触变能力，能快速对伤口进行物理封堵，在起到压迫止血作用的同时，还可降低细菌侵入伤口的可能性，而钙离子作为凝血因子，可激发内源性凝血级联，快速形成血栓。

5、本发明制备止血海绵的方法简单，反应温和、能耗低、环境友好，原料成本低廉，简单易得。

6、本发明的止血海绵可压缩保存，直接作用于一般出血伤口、深部出血伤口及手术操作难以达到的部位出血伤口，使用简单方便，且便于储存、运输和携带。

附图说明

图1为本发明所利用的杏鲍菇子实体、对比例1制备的仅脱蛋白的海绵状杏鲍菇子实体、对比例2制备的多孔氧化海绵以及实施例3制备的甲壳素/葡聚糖复合止血海绵的扫描电镜图。

图2为本发明对比例1制备的仅脱蛋白海绵状杏鲍菇子实体、对比例2制备的多孔氧化海绵以及实施例3制备的甲壳素/葡聚糖复合止血海绵的吸水率。

图3为本发明对比例1制备的仅脱蛋白海绵状杏鲍菇子实体、对比例2制备的多孔氧化海绵以及实施例3制备的甲壳素/葡聚糖复合止血海绵在应变为40%、60%与80%下的一次性循环压缩性能。

图4为本发明对比例1制备的脱蛋白的海绵状杏鲍菇子实体、对比例2制备的多孔氧化海绵、实施例3制备的甲壳素/葡聚糖复合止血海绵、医用纱布和明胶海绵的体外凝血指数。

图5为本发明对比例1制备的仅脱蛋白状杏鲍菇子实体海绵、对比例2制备的多孔氧化海绵、实施例3制备的甲壳素/葡聚糖复合止血海绵、医用纱布和明胶海绵在大鼠肝穿刺模型伤口的止血情况和出血量。

具体实施方式

下面结合附图以具体实施例方式对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

图1 A1、A2中，杏鲍菇子实体由菌丝缠绕而成，在脱蛋白处理过程中，蛋白质和可溶性多糖的溶解，使菌丝分裂，暴露出甲壳素/葡聚糖复合物，相邻的甲壳素/葡聚糖复合物通过氢键作用维系海绵的三维结构，其中甲壳素起主要支撑作用，经由TEMPO氧化处理后，多糖的断裂溶解使海绵的孔径变大，但甲壳素作为支撑骨架依旧保留海绵的结构。此外，钙离子的引入对海绵结构未造成较大影响。

图3中，一次性循环压缩性能应变率为40%、60%与80%；对比例1制得的仅脱蛋白的状杏鲍菇子实体在40 %的应变下就有较大的机械滞后，说明其未有良好的形状记忆能力，即不能在止血过程快速溶胀封堵伤口，而经过TEMPO 氧化处理后可以看出，对比例2制得的多孔氧化海绵在应变为80 %的情况下都未出现机械滞后现象，说明TEMPO氧化过程的“造孔”和引入亲水基团的协同作用促使海绵具有快速触水回弹的能力，但其压缩模量有较大幅度的下降，可能存在无法有效对穿刺伤口进行有效物理封堵的情况。实施例3制得的甲壳素/葡聚糖复合多孔止血海绵不仅显示出了优异的回弹性能，还解决了多孔氧化海绵压缩模量下降的问题。

实施例1

本实施例涉及一种利用杏鲍菇子实体制备甲壳素/葡聚糖复合多孔止血海绵的方法，包括如下步骤：

1、将杏鲍菇子实体用浓度为10 wt% 的氢氧化钠溶液于65 ^oC进行脱蛋白反应4 h，除去杏鲍菇子实体中的蛋白质和可溶性多糖，洗至中性后冷冻干燥，得到脱蛋白的海绵状杏鲍菇子实体；

2、将干燥的脱蛋白海绵状杏鲍菇子实体用20 mmol NaClO溶液进行TEMPO 氧化处理，氧化程度为30 mmol，氧化处理时间为3 h。将氧化处理后的海绵洗至中性，进行第二次冷冻干燥，得到海绵状脱蛋白杏鲍菇子实体；

3、将第二次冷冻干燥后海绵状脱蛋白杏鲍菇子实体置于5 wt% CaCl₂ 溶液中进行交联反应4 h；洗去未交联的钙离子，冷冻干燥，得到甲壳素/葡聚糖复合多孔止血海绵。其电镜图如图1中的A1、A2。

实施例2

本实施例涉及一种利用杏鲍菇子实体制备甲壳素/葡聚糖复合多孔止血海绵的方法，包括如下步骤：

1、将杏鲍菇子实体用浓度为15 wt% 的氢氧化钠溶液于60 ^oC进行脱蛋白反应3h，除去杏鲍菇子实体中的蛋白质和可溶性多糖，洗至中性后冷冻干燥，得到脱蛋白海绵；

2、将干燥的脱蛋白海绵用20 mmol NaClO溶液进行TEMPO 氧化处理，氧化程度为5mmol，氧化处理时间为1 h。将氧化处理后的海绵状杏鲍菇子实体洗至中性，并进行第二次冷冻干燥；

3、将第二次冷冻干燥后海绵置于10 wt% CaCl₂ 溶液中进行交联反应5 h；洗去未交联的钙离子，冷冻干燥，得到甲壳素/葡聚糖复合多孔止血海绵。其电镜图如图1中的D1、D2。

实施例3

本实施例涉及一种利用杏鲍菇子实体制备甲壳素/葡聚糖复合多孔止血海绵的方法，包括如下步骤：

1、将杏鲍菇子实体用浓度为20 wt% 的氢氧化钠溶液于50 ^oC进行脱蛋白反应5 h，除去杏鲍菇子实体中的蛋白质和可溶性多糖，洗至中性后冷冻干燥，得到脱蛋白海绵状杏鲍菇子实体；

2、将干燥的海绵状杏鲍菇子实体用20 mmol NaClO溶液进行TEMPO 氧化处理，氧化程度为20mmol，氧化处理时间为3 h。将氧化处理后的海绵状杏鲍菇子实体洗至中性，并进行第二次冷冻干燥；

3、将第二次冷冻干燥后海绵状杏鲍菇子实体置于2 wt% CaCl₂ 溶液中进行交联反应6 h；洗去未交联的钙离子，冷冻干燥，得到甲壳素/葡聚糖复合多孔止血海绵。

实施例4

1、将杏鲍菇子实体用浓度为15 wt% 的氢氧化钠溶液于70 ^oC进行脱蛋白反应3 h，除去子实体中的蛋白质和可溶性多糖，洗至中性后冷冻干燥，得到脱蛋白海绵状杏鲍菇子实体；

2、将干燥的海绵用20 mmol NaClO溶液进行TEMPO 氧化处理，氧化程度为20mmol，氧化处理时间为3 h。将氧化处理后的海绵状杏鲍菇子实体洗至中性，且不再溶胀后进行第二次冷冻干燥；

3、将第二次冷冻干燥后海绵状杏鲍菇子实体置于5 wt% CaCl₂ 溶液中进行交联反应3 h；洗去未交联的钙离子，冷冻干燥，得到甲壳素/葡聚糖复合多孔止血海绵。

对比例1

用浓度为10 wt% 的氢氧化钠溶液对杏鲍菇子实体于65 ^oC进行脱蛋白处理4 h，除去杏鲍菇子实体中的蛋白质，洗至中性后冷冻干燥，得到仅脱蛋白处理的海绵状杏鲍菇子实体。其电镜图如图1中的B1、B2。

对比例2

用浓度为10 wt% 的氢氧化钠溶液对杏鲍菇子实体于65 ^oC进行脱蛋白处理4 h，除去杏鲍菇子实体中的蛋白质，洗至中性后冷冻干燥，紧接着用20 mmol NaClO溶液进行TEMPO 氧化，洗至不再溶胀后冷冻干燥，得到经过脱蛋白处理和TEMPO 氧化处理的未经钙离子交联的多孔氧化海绵。其电镜图如图1中的C1、C2。

实施例5

本实施例涉及一种甲壳素/葡聚糖复合多孔止血海绵的止血效果检验，包括如下步骤：

1、在大鼠腹腔内注射1 mL 10％的水合氯醛使其麻醉；

2、在肝脏上制造0.3 cm × 0.3 cm × 0.3 cm的穿刺伤口；

3、立即将已知质量的甲壳素/葡聚糖复合多孔止血海绵（脱蛋白海绵、多孔氧化海绵、甲壳素/葡聚糖复合多孔止血海绵）和明胶海绵分别用注射器推至伤口内部，另外，用纱布对伤口进行短时间按压止血；

4、按压180 s后，称量，计算其出血量；

5、试验后大鼠按实验动物规范进行动物体后处理。

如图5所示，对照组纱布、明胶海绵，对比例1所用的脱蛋白海绵，对比例2所用的多孔氧化海绵以及实施例3所用的甲壳素/葡聚糖复合多孔止血海绵的出血量。与纱布、明胶止血海绵、对比例1 所用的脱蛋白海绵相比，对比例3所用的多孔氧化海绵和实施例3所用的甲壳素/葡聚糖复合多孔止血海绵止血效果有极大的改善，可以归结于TEMPO 氧化所带来的血触变能力，而钙离子的引入在及时对伤口进行物理封堵的同时，还赋予海绵激活凝血级联的能力，加速止血进程，失血量仅为纱布的8.4 %，明胶海绵的11 %，证明其在不可按压伤口上的优异止血能力。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (5)

1.一种杏鲍菇子实体制备甲壳素/葡聚糖复合止血海绵的方法，其特征在于：

1）将杏鲍菇子实体浸泡于氢氧化钠水溶液中进行脱蛋白反应，得到海绵状脱蛋白杏鲍菇子实体；

2）将海绵状脱蛋白杏鲍菇子实体进行水洗至中性，冷冻干燥；

3）将冷冻干燥的海绵浸泡于NaClO溶液中进行TEMPO 氧化处理，氧化处理后的海绵洗至中性，进行第二次冷冻干燥；

4）将第二次冷冻干燥后海绵状脱蛋白杏鲍菇子实体浸泡于 CaCl₂ 溶液中进行交联反应，而后洗去未交联的钙离子，冷冻干燥，得到甲壳素/葡聚糖复合止血海绵。

2.如权利要求1所述的一种杏鲍菇子实体制备甲壳素/葡聚糖复合止血海绵的方法，其特征在于步骤1）中所述的氢氧化钠溶液浓度为10～20 wt%，脱蛋白反应温度为50～80 ℃，脱蛋白反应时间为2～6 h。

3.如权利要求1所述的一种杏鲍菇子实体制备甲壳素/葡聚糖复合止血海绵的方法，其特征在于步骤3）中所述的NaClO溶液浓度为5～30mmol。

4.如权利要求1所述的一种杏鲍菇子实体制备甲壳素/葡聚糖复合止血海绵的方法，其特征在于步骤3）中所述的TEMPO 氧化处理，氧化程度为5～30 mmol，氧化处理时间为1～3h。

5.如权利要求1所述的一种杏鲍菇子实体制备甲壳素/葡聚糖复合止血海绵的方法，其特征在于步骤4）中，所述的CaCl₂浓度为2～10 wt%，交联反应时间为2～6 h。

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