CN115887735A

CN115887735A - 一种菌类杆茎脱细胞止血海绵的制备方法

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Publication number: CN115887735A
Application number: CN202211358075.8A
Authority: CN
Inventors: 邢孟秋; 魏伟; 郭瀛军; 刘抗
Original assignee: Hunan Depus Medical Technology Co ltd
Current assignee: Hunan Depus Medical Technology Co ltd
Priority date: 2022-11-01
Filing date: 2022-11-01
Publication date: 2023-04-04

Abstract

一种菌类杆茎脱细胞止血海绵及其制备方法。所述制备方法包括如下步骤：(1)、将蘑菇菌类清洗干净，并将蘑菇菌类的菌盖与杆茎分离；(2)、将杆茎沿着横截面方向切割成片状圆柱体；(3)、浸泡入SDS溶液中；(4)、将上述浸泡后的材料放置于室温下的摇床上，摇匀1‑10天；(5)、将上述摇匀后的材料浸泡于乙醇溶液中；(6)、利用无菌PBS溶液清洗材料3‑10次；(7)、将步骤(6)清洗后的材料冷冻、干燥形成海绵结构；(8)、进行灭菌，制成止血海绵。该方法通过对菌类杆茎进行脱细胞处理制成一种止血海绵，止血海绵可高效吸收血液、可压缩，且具备形状记忆功能，能适用于不可加压伤口的止血，且该海绵在体内能够被降解。

Description

一种菌类杆茎脱细胞止血海绵的制备方法

技术领域

本发明涉及医药用品，特别是一种菌类杆茎脱细胞止血海绵的制备方法。

背景技术

失控的出血是创伤引起死亡的一个主要原因，它导致大量失血，血液循环和器官的血液供应减少，严重时导致休克或直接死亡。控制出血的常用方法是利用压力，通常采用的操作是使用纱布与绷带对创面进行加压操作，然而，这仅适用于可加压的出血伤口。

控制创伤出血时，对伤口或出血部位的不适当覆盖可能会延长出血时间，从而增加死亡率，尤其对于不可加压的出血创面，无法使用常见的对创面进行加压的操作。不可加压创面引起的止血失控是长期以来困扰创面急救的重要临床难题。特别是内脏出血领域，由于无法使用绷带加压等技术对创面进行加压止血，如何对创面进行封堵止血更是重点医学研究方向。

传统上，对于不可加压的出血创面主要依靠输血，而输血的缺点是成本高，来源有限，有可能引起免疫学副作用和疾病的交叉感染，因此，迫切需要找到一种高效的止血方法，以减少不施加外部压力情况下的失血量。理想的止血材料应易于使用，价格合理，生物相容性好，并能快速有效地阻止内脏器官、动脉或静脉的出血。尽管目前的止血材料，如绷带、纱布、沸石快速凝血剂和明胶海绵，已被开发并应用于创伤护理中数十年，但它们对于不可加压的伤口，特别是内脏器官出血无法有效止血。为了解决这些问题，目前已开发了Xstat^TM疗法应用于伤口治疗。Xstat^TM疗法是通过注射一些微型纤维素海绵进行的。当海绵被注射到伤口部位，特别是不可加压的伤口时，它会膨胀以填充伤口并提供压力以阻止出血。其不足是压缩膨胀止血海绵缺乏高吸附能力，无法在短时间内快速吸附血液促进止血，此外，由于压缩膨胀止血海绵缺乏降解性能，其在内脏止血的应用中还需对患者进行手术将止血材料取出，对临床工作造成了极大的不便，会造成二次伤害和产生更高的治疗费用。因此，开发一种具备高效吸附能力，可压缩、可降解的止血材料对于临床止血应用，尤其是不可加压伤口的止血具有重要意义。

关于Xstat^TM疗法，可参考新浪科技于2014年07月01日发表的“十佳发明：XStat医疗装置可数秒内闭合伤口”，另外，百度上有大量的参考资料。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种菌类杆茎脱细胞止血海绵及其制备方法，所述制备方法通过对菌类杆茎进行脱细胞处理制成一种止血海绵，该止血海绵可高效吸收血液、可压缩，且具备形状记忆功能，能适用于不可加压伤口的快速止血，且该海绵在体内能够被降解。

为了解决上述现有技术问题,本发明的技术方案如下:

一种菌类杆茎脱细胞止血海绵，它通过对菌类杆茎进行脱细胞处理制成，所述菌类杆茎脱细胞处理后，所述菌类杆茎的菌丝体的菌丝的细胞壁仍然存在，而细胞核、细胞质和蛋白质被去除，形成一个排列整齐的微管和多孔结构；

所述微管和多孔结构具有形状记忆功能，能够被压缩，然后在解压时迅速恢复原有形状，在其恢复过程中，并伴随着高效的吸水作用，能够在短时间内吸收大量水分或血液；

所述微管和多孔结构呈现为一种排列整齐的薄壁微管结构，具有快速吸收血液的能力；

所述微管和多孔结构中几丁质成分的质量占比为60％～90％。

该止血海绵可高效吸收血液、可压缩，且该止血海绵具备形状记忆功能，能适用于不可加压伤口的止血，将止血海绵压缩后植入不可加压伤口，能促进体内止血过程。

如上所述的一种菌类杆茎脱细胞止血海绵的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)、将蘑菇菌类清洗干净，并将蘑菇菌类的菌盖与杆茎分离；

(2)、用无菌的刀片将步骤(1)中获得的杆茎沿着横截面方向切割成片状圆柱体，所述片状圆柱体的厚度为0.1-1厘米；

(3)、将步骤(2)切割后的材料清洗干净，然后浸泡入SDS溶液中，所述SDS溶液的质量体积浓度为0.05-20％，浸泡时间为1-10小时；

(4)、将上述浸泡后的材料放置于室温下的摇床上，摇匀1-10天，摇匀速度为10-100r/min，所述室温为10～30℃；

(5)、将上述摇匀后的材料浸泡于乙醇溶液中，所述乙醇溶液的浓度为75％-100％，浸泡时间为1-3小时；

(6)、利用无菌PBS溶液清洗材料3-10次，每次时间不少于5min；

(7)、将步骤(6)清洗后的材料冷冻、干燥形成海绵结构，所述冷冻、干燥反复进行；

(8)、通过紫外线、电子束辐射方法对上述海绵结构进行灭菌，制成止血海绵。

将上述制备方法制得的止血海绵压缩后植入不可加压伤口，能进行快速止血。

进一步，所述步骤(2)中，所述片状圆柱体根据伤口创面形状切割成方形、长方形或不规则形状，切割后的形状并进行组合；

可选地，所述步骤(3)包括步骤(9)：将SDS溶液浸泡后的材料捞出，放置于蒸馏水中浸泡8-12小时；

可选地，所述步骤(3)包括步骤(10)：将SDS溶液浸泡后的材料用蒸馏水清洗3-10遍，每次清洗时间大于5min；

进一步，所述步骤(3)还包括步骤(11)：将步骤(9)或步骤(10)清洗后的材料浸泡于0.01-3％的Triton-X-100与5-20％的亚氯酸钠溶液中，浸泡时间为12-96小时；

可选地，所述步骤(11)包括步骤(12)：将步骤(11)浸泡后的材料捞出，放置于蒸馏水中浸泡8-12小时；

可选地，所述步骤(11)包括步骤(13)：将步骤(11)浸泡后的材料用蒸馏水清洗3-10遍，每次清洗时间大于5min；

可选地，所述步骤(4)还包括步骤(14)：将摇匀后的材料浸泡于0.1-3％的NaOH溶液中，浸泡时间为15-120min；

可选地，所述步骤(14)包括步骤(15)：将上述浸泡后的材料捞出，放置于蒸馏水中浸泡8-12小时；

可选地，所述步骤(14)包括步骤(16)：将上述浸泡后的材料用蒸馏水清洗3-10遍，每次清洗时间大于5min。

所述制备方法中，步骤(9)或步骤(10)用于避免SDS溶液残留所造成的细胞毒性与生物相容性风险；步骤(12)或步骤(13)用于避免Triton-X-100与亚氯酸钠的试剂残留造成的细胞毒性与生物相容性风险；步骤(14)用于增强脱细胞效率、避免DNA残留风险，并对材料进行灭菌；步骤(15)或步骤(16)用于避免NaOH试剂残留造成的细胞毒性与生物相容性风险。

SDS是一种阴离子除垢剂，它和蛋白上的氨基酸残基1:1结合使蛋白带负电，这样就使得蛋白的二级结构完全打开并且都会带上负电。

PBS溶液又称磷酸盐缓冲溶液，一般选择Na2HPO4和KH2PO4配制，因为钠盐溶解的较慢。根据不同pH的溶液，称量不同质量的磷酸盐，也可以用pH计调溶液的pH，PBS一般用作支持电解质。

前体定义：在微生物的生物合成过程中，有些化合物能直接被微生物利用构成产物分子结构的一部分，而化合物本身的结构没有大的变化，这些物质称为前体。前体必须通过产生菌的生物合成途径，才能渗入到产物的分子结构中。

所述止血海绵的止血机理如下：

蘑菇菌类是常见的一种真菌，它们的杆径由菌丝体生长而成，菌丝体由排列整齐的菌丝组成，由排列整齐的菌丝构成管状结构，蘑菇菌类允许营养沿着菌丝体的管状结构被吸收。菌丝为白色丝状物，单一的菌丝由隔膜形成且单一的菌丝被封闭在细胞壁内，蘑菇菌类的所有营养输送都采用从菌丝吸收到菌丝的方式，当菌类杆径采用上述制备方法制成止血海绵时，菌类杆径被脱细胞，菌丝体的菌丝的细胞壁仍然存在，而细胞核、细胞质和蛋白质被去除，形成一个排列整齐的微管和多孔结构，该微管和多孔结构的止血功能具体如下：

1、该微管和多孔结构具有形状记忆功能，能够被压缩，然后在解压时迅速恢复原有形状，在其恢复过程中，并伴随着高效的吸水作用，能够在短时间内吸收大量水分或血液，将上述制备方法制得的止血海绵压缩后植入不可加压伤口，从而能促进体内止血过程；

2、该微管和多孔结构呈现为一种排列整齐的薄壁微管结构，具有快速吸收血液的能力；

3、蘑菇菌类杆茎的主要成分为几丁质，菌类杆径被脱细胞时，其构成的微管和多孔结构的主要成分仍为几丁质，而几丁质是止血材料壳聚糖的前体，具备良好的止血效果，使得微管和多孔结构同样具有良好的止血效果。

上述止血海绵在体内能够被降解，植入后无需取出材料，从而避免患者二次手术的伤害。

本发明一种菌类杆茎脱细胞止血海绵及其制备方法,其有益效果有：

1、该制备方法通过对菌类杆茎进行脱细胞处理，制成一种具有止血功能的止血海绵，该止血海绵可高效吸收血液、可压缩，且该止血海绵具备形状记忆功能，能适用于不可加压伤口的快速止血，；

2、该止血海绵在体内能够被降解，植入后无需取出材料，从而避免患者二次手术的伤害。

附图说明

图1，本发明一种菌类杆茎脱细胞止血海绵的制备方法中采用双孢蘑菇的杆茎脱细胞制得的止血海绵的扫描电镜图；

图2，为分别应用商业化明胶海绵、冻干1次脱细胞止血海绵、冻干10次脱细胞止血海绵在0s、3s、5s、10s吸附水的能力比较；

图3，为分别应用商业化明胶海绵、冻干1次脱细胞止血海绵、冻干10次脱细胞止血海绵在0s、3s、5s、10s吸附血液的能力比较；

图4，为分别应用商业化明胶海绵、冻干1次脱细胞止血海绵、冻干10次脱细胞止血海绵止血后的扫描电镜照片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：

用锋利、干净的刀片将双孢菇的菌柄沿横截面方向切成圆柱形，厚度为5毫米；然后将所有圆柱形菌柄浸泡在10％w/v的SDS溶液中，浸泡时间为5小时；然后将浸泡后的材料捞出，放置于室温下的摇床上，摇匀5天，摇匀速度为50r/min，所述室温为20℃；然后，将摇匀后的样品在蒸馏水中清洗三次，然后将样品浸泡在0.1％Triton-X-100和10％亚氯酸钠的去离子水溶液中48小时；最后将样品在乙醇溶液中消毒2小时，然后在无菌蒸馏PBS中洗涤3次，然后将样品冷冻、干燥1次制成止血海绵DS1，冷冻温度为-40℃，冷冻时间为12小时。

制成的止血海绵DS1与商业化明胶相比，DS1的屈服应变为4.22％±2.14％、应力强度227.93±13.71kPa，商业化明胶的屈服应变为2.72％±0.81％、应力强度为151.06±7.22kPa，DS1的应力屈服强度比商业化明胶大50％，DS1的压缩应力为484.52±29.59kPa，商业化明胶的压缩应力为326.35±16.21kPa，DS1比商业化明胶的压缩应力大48％，压缩恢复试验表明其具有良好的形状记忆性，能够在解压后迅速恢复原有形态；止血海绵DS1吸收血液后的单位重量为26.94±1.78g/g，而商业化明胶为3.20±0.22g/g，因此止血海绵DS1的吸收血液的性能是商业化明胶的8.4倍；血液凝集实验表明其血液凝固时间(1.1±0.1min)低于商业化明胶(1.63±0.23min)与普通医用纱布(3.63±0.33min)，具有良好的止血效果；在大鼠肝损伤模型体内植入止血海绵DS1失血量为343.4±7.1mg，显著低于商业化明胶579.6±34.2mg，止血时间从对照组商业化明胶的127±2.4s缩短为86±7.5s；植入后56天后，材料降解率为73.63％，提示其具有良好的体内降解性能。

实施例2：

用锋利、干净的刀片将双孢菇的菌柄沿横截面方向切成圆柱形，厚度为3毫米；然后将所有圆柱形菌柄浸泡在10％w/v的SDS溶液中，浸泡时间为5小时；然后将浸泡后的材料捞出，放置于室温下的摇床上，摇匀5天，摇匀速度为60r/min，所述室温为20℃；然后，将摇匀后的样品在蒸馏水中清洗三次，然后将样品浸泡在0.15％Triton-X-100和15％亚氯酸钠的去离子水溶液中48小时；最后将样品在乙醇溶液中消毒2小时，然后在无菌蒸馏PBS中洗涤3次，然后将样品冷冻、干燥10次制成止血海绵DS10，每次冷冻的温度为-40℃、时间为12小时。

制成的止血海绵DS10与商业化明胶相比，DS10的屈服应变为3.77％±1.92％、应力强度为333.31±19.13kPa，商业化明胶的屈服应变2.72％±0.81％、应力强度151.06±7.22kPa，DS10的应力屈服强度比商业化明胶大60％，DS10压缩应力为641.56±38.85kPa，商业化明胶的压缩应力326.35±16.21kPa，DS10压缩应力比商业化明胶的压缩应力大100％，压缩恢复试验表明其具有良好的形状记忆性，能够在解压后迅速恢复原有形态；止血海绵DS10吸收血液后的单位重量为28.67±0.66g/g，而商业化明胶为3.20±0.22g/g，因此止血海绵DS10的吸水性能是商业化明胶的9倍；血液凝集实验表明其血液凝固时间为120±7.55s，显著低于商业化明胶的190±4.36s，具有良好的止血效果；在大鼠肝损伤模型体内植入止血海绵DS10失血量为313.4±4.6mg，显著低于商业化明胶579.6±34.2mg，止血时间从对照组商业化明胶的127±2.4s缩短为75±4.9s；植入后56天后，材料降解率为69.23％，提示其具有良好的体内降解性能。

如图1，为上述实施例制成的脱细胞止血海绵的扫描电镜照片的对比，图1中，1-4为冷冻干燥1次所制成的脱细胞止血海绵的扫描电镜照片，5-8为冷冻干燥10次所制成的脱细胞止血海绵的扫描电镜照片；通过对上述止血海绵的Zeta电位检测发现，该止血海绵携带负电荷，可以刺激血液中凝血因子FXII的激活，从而能启动内源性凝血途径加速凝血。

如图2、图3，为上述实施例制成的脱细胞止血海绵的吸附能力比较，Gel为商业化明胶海绵、DS1为冷冻干燥1次所制成的脱细胞止血海绵、DS10为冷冻干燥10次所制成的脱细胞止血海绵。

如图4，为上述实施例制成的脱细胞止血海绵的促进血小板粘附、聚集及纤维蛋白形成的扫描电镜照片，Gel为商业化明胶海绵、DS1为冷冻干燥1次所制成的脱细胞止血海绵、DS10为冷冻干燥10次所制成的脱细胞止血海绵；通过对上述止血海绵应用于内脏止血后的扫描电子显微镜照片分析可知，该止血海绵能够促进血小板的聚集、粘附及纤维蛋白形成，从而有利于形成与稳定血凝块。

以上已将本发明做一详细说明，以上所述，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能限定本发明实施范围，即凡依本申请范围所作均等变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖范围内。

Claims

1.一种菌类杆茎脱细胞止血海绵，其特征在于，它通过对菌类杆茎进行脱细胞处理制成，所述菌类杆茎脱细胞处理后，所述菌类杆茎的菌丝体的菌丝的细胞壁仍然存在，而细胞核、细胞质和蛋白质被去除，形成一个排列整齐的微管和多孔结构；

所述微管和多孔结构中几丁质成分的质量占比为5％～90％。

2.一种菌类杆茎脱细胞止血海绵的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(6)、利用无菌PBS溶液清洗材料3-10次，每次时间不少于5min；

3.根据权利要求2所述的一种菌类杆茎脱细胞止血海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述片状圆柱体根据伤口创面形状切割成方形、长方形或不规则形状，切割后的形状并进行组合。

4.根据权利要求2所述的一种菌类杆茎脱细胞止血海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)包括步骤(9)：将SDS溶液浸泡后的材料捞出，放置于蒸馏水中浸泡8-12小时。

5.根据权利要求2所述的一种菌类杆茎脱细胞止血海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)包括步骤(10)：将SDS溶液浸泡后的材料用蒸馏水清洗3-10遍，每次清洗时间大于5min。

6.根据权利要求4或5任一项所述的一种菌类杆茎脱细胞止血海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)还包括步骤(11)：将步骤(9)或步骤(10)清洗后的材料浸泡于0.01-3％的Triton-X-100与5-20％的亚氯酸钠溶液中，浸泡时间为12-96小时。

7.根据权利要求6所述的一种菌类杆茎脱细胞止血海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤(11)包括步骤(12)：将步骤(11)浸泡后的材料捞出，放置于蒸馏水中浸泡8-12小时。

8.根据权利要求6所述的一种菌类杆茎脱细胞止血海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤(11)包括步骤(13)：将步骤(11)浸泡后的材料用蒸馏水清洗3-10遍，每次清洗时间大于5min。

9.根据权利要求2所述的一种菌类杆茎脱细胞止血海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)还包括步骤(14)：将摇匀后的材料浸泡于0.1-3％的NaOH溶液中，浸泡时间为15-120min。

10.根据权利要求9所述的一种菌类杆茎脱细胞止血海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤(14)包括步骤(15)：将上述浸泡后的材料捞出，放置于蒸馏水中浸泡8-12小时。

11.根据权利要求9所述的一种菌类杆茎脱细胞止血海绵的制备方法，其特征在于，所述步骤(14)包括步骤(16)：将上述浸泡后的材料用蒸馏水清洗3-10遍，每次清洗时间大于5min。