JPH09316104A - 抗ＡＩＤＳウイルス活性を有する新規リン酸化β−グルカン及びそれを含むレトロウイルス感染症治療用薬剤 - Google Patents
抗ＡＩＤＳウイルス活性を有する新規リン酸化β−グルカン及びそれを含むレトロウイルス感染症治療用薬剤Info
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- JPH09316104A JPH09316104A JP8135361A JP13536196A JPH09316104A JP H09316104 A JPH09316104 A JP H09316104A JP 8135361 A JP8135361 A JP 8135361A JP 13536196 A JP13536196 A JP 13536196A JP H09316104 A JPH09316104 A JP H09316104A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 抗エイズウイルス活性を有し、体内で分解さ
れにくい新規リン酸化グルカンを得る。 【解決手段】 舞茸の菌糸体から抽出したβ−１，３グ
ルカン及び／又はβ−１，６グルカンのリン酸化物。
れにくい新規リン酸化グルカンを得る。 【解決手段】 舞茸の菌糸体から抽出したβ−１，３グ
ルカン及び／又はβ−１，６グルカンのリン酸化物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はレトロウイルス等に
起因する感染症（特に後天性免疫症候群）及び人免疫不
全ウイルス（ＨＩＶ）に起因する後天性免疫不全症候群
（Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎ
ｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＩＤＳ）の新規治療薬剤に
関する。
起因する感染症（特に後天性免疫症候群）及び人免疫不
全ウイルス（ＨＩＶ）に起因する後天性免疫不全症候群
（Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎ
ｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＩＤＳ）の新規治療薬剤に
関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、我々が直面している難病の一つで
あるＡＩＤＳはレトロウイルスに属しているヒト免疫不
全ウイルス（ＨＩＶ）に起因する事が解明されている。
あるＡＩＤＳはレトロウイルスに属しているヒト免疫不
全ウイルス（ＨＩＶ）に起因する事が解明されている。
【０００３】ＷＨＯ（世界保健機構）によると、１９９
２年末の時点においてＨＩＶ感染者は１０００万人であ
り、ＡＩＤＳウイルス感染患者は６１万人である。ま
た、我が国においても、１９９２年の時点でＨＩＶ感染
者が２６０１人確認されており、その内発症にいたらな
いが、ＡＩＤＳウイルスの感染者数は５５４人となって
いる。しかし、ＡＩＤＳの治療法は全く不明であり、ま
た、本症ウイルスとして現在ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２型
の２例が発見されているが、このウイルスが極端に変異
しやすいことによりワクチン開発，治療薬の開発の実現
は非常に困難である。そこで抗ＨＩＶ剤によるＡＩＤＳ
の効果的な治療および予防が要求されている状況であ
る。
２年末の時点においてＨＩＶ感染者は１０００万人であ
り、ＡＩＤＳウイルス感染患者は６１万人である。ま
た、我が国においても、１９９２年の時点でＨＩＶ感染
者が２６０１人確認されており、その内発症にいたらな
いが、ＡＩＤＳウイルスの感染者数は５５４人となって
いる。しかし、ＡＩＤＳの治療法は全く不明であり、ま
た、本症ウイルスとして現在ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２型
の２例が発見されているが、このウイルスが極端に変異
しやすいことによりワクチン開発，治療薬の開発の実現
は非常に困難である。そこで抗ＨＩＶ剤によるＡＩＤＳ
の効果的な治療および予防が要求されている状況であ
る。
【０００４】抗ＨＩＶ剤として実用化されている薬剤に
は、ＡＺＴ（アジトチミジン）がある（Ｎａｔｕｒｅ
３２６，４３０，１９８７）。これはＨＩＶの逆転写酵
素の阻害効果に基づく抗ＨＩＶ剤であるが、この薬剤は
治療に際し生体に強い副作用を示し、患者の造血機能を
阻害し、多くの患者に極度の貧血作用を発症させること
が知られている。
は、ＡＺＴ（アジトチミジン）がある（Ｎａｔｕｒｅ
３２６，４３０，１９８７）。これはＨＩＶの逆転写酵
素の阻害効果に基づく抗ＨＩＶ剤であるが、この薬剤は
治療に際し生体に強い副作用を示し、患者の造血機能を
阻害し、多くの患者に極度の貧血作用を発症させること
が知られている。
【０００５】また澱粉やデキストラン等のα−グリコシ
ド結合を有する多糖体は生理活性能が分子量に依存する
が、体内酵素によって分解される活性が低下する。
ド結合を有する多糖体は生理活性能が分子量に依存する
が、体内酵素によって分解される活性が低下する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は抗エイ
ズウイルス活性を有し、体内酵素によって分解されにく
い新規リン酸化グルカンを得ることである。
ズウイルス活性を有し、体内酵素によって分解されにく
い新規リン酸化グルカンを得ることである。
【０００７】本発明の別の目的は副作用が著しく減少し
かつ体内酵素によって分解されにくい、レトロウイルス
感染症用薬剤を得ることである。
かつ体内酵素によって分解されにくい、レトロウイルス
感染症用薬剤を得ることである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は上記目的を達
成するために鋭意検討した結果、舞茸に含まれ、体内酵
素によって分解されにくいβ−１，３グルカン及びβ−
１，６グルカンのリン酸化物は強い抗エイズウイルス活
性を有し、しかもその副作用は著しく少ないことを知見
し、本願発明を完成するに至った。
成するために鋭意検討した結果、舞茸に含まれ、体内酵
素によって分解されにくいβ−１，３グルカン及びβ−
１，６グルカンのリン酸化物は強い抗エイズウイルス活
性を有し、しかもその副作用は著しく少ないことを知見
し、本願発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち、本発明は担子菌属類の舞茸の菌
糸体及び／又は子実体から抽出したβ−１，６結合の分
岐鎖を有するβ−１，３グルカン及び／又はβ−１，３
結合の分岐鎖を有するβ−１，６グルカンのリン酸化
物、及びこれを含むレトロウイルス感染症用薬剤であ
る。
糸体及び／又は子実体から抽出したβ−１，６結合の分
岐鎖を有するβ−１，３グルカン及び／又はβ−１，３
結合の分岐鎖を有するβ−１，６グルカンのリン酸化
物、及びこれを含むレトロウイルス感染症用薬剤であ
る。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明のグルカンリン酸化物は、
舞茸から例えば熱水により抽出したグルカンをリン酸化
することによって得ることができる。リン酸化する前
に、グルカン抽出物を更に精製（例えば、遠心分離、沈
殿化、酸処理、アルカリ処理、ゲル濾過、カラム吸着処
理、透析等）することが好ましい。
舞茸から例えば熱水により抽出したグルカンをリン酸化
することによって得ることができる。リン酸化する前
に、グルカン抽出物を更に精製（例えば、遠心分離、沈
殿化、酸処理、アルカリ処理、ゲル濾過、カラム吸着処
理、透析等）することが好ましい。
【００１１】リン酸化は、リン酸塩を用いて行なうこと
ができる。本発明のグルカンリン酸化物においては、舞
茸から抽出したグルカンの水酸基のうち５％以上、好ま
しくは１０％以上、特に好ましくは１５％以上がリン酸
化されている。
ができる。本発明のグルカンリン酸化物においては、舞
茸から抽出したグルカンの水酸基のうち５％以上、好ま
しくは１０％以上、特に好ましくは１５％以上がリン酸
化されている。
【００１２】本発明のグルカンリン酸化物はβ−１，６
結合を主鎖として有し、更に高頻度のβ−１，３分枝鎖
を有するグルカン及びβ−１，３結合を主鎖として有
し、更に高頻度のβ−１，６分岐鎖を有するグルカンの
リン酸化物である。このグルカンリン酸化物の分子量は
１６〜２５万、好ましくは１８〜２３万、更に好ましく
は２０〜２２万である。
結合を主鎖として有し、更に高頻度のβ−１，３分枝鎖
を有するグルカン及びβ−１，３結合を主鎖として有
し、更に高頻度のβ−１，６分岐鎖を有するグルカンの
リン酸化物である。このグルカンリン酸化物の分子量は
１６〜２５万、好ましくは１８〜２３万、更に好ましく
は２０〜２２万である。
【００１３】本発明のグルカンリン酸化物はせいぜい１
重量％の蛋白質を含むこと又は蛋白質を全く含まないこ
とが好ましい。舞茸の熱水抽出物中のグルカンには例え
ば２０〜２５％の蛋白質が含まれており、この蛋白質
は、例えばゲル濾過、カラム吸着処理、透析等により除
去することができる。
重量％の蛋白質を含むこと又は蛋白質を全く含まないこ
とが好ましい。舞茸の熱水抽出物中のグルカンには例え
ば２０〜２５％の蛋白質が含まれており、この蛋白質
は、例えばゲル濾過、カラム吸着処理、透析等により除
去することができる。
【００１４】本発明のグルカンリン酸化物は、ヒトＴ細
胞由来株（ＭＴ−４）を用いた試験管内における抗ＨＩ
Ｖ活性試験により、ＨＩＶの増殖を完全に抑制すること
が分かった。最小有効濃度は１６μｇ／ｍｌであり、従
来最も有効であるといわれている硫酸デキストランの最
小有効濃度と同等であると判断できる。リン酸化前の舞
茸グルカンの最小有効濃度が１２５μｇ／ｍｌであるか
ら、リン酸化による活性の増大は格別顕著である。
胞由来株（ＭＴ−４）を用いた試験管内における抗ＨＩ
Ｖ活性試験により、ＨＩＶの増殖を完全に抑制すること
が分かった。最小有効濃度は１６μｇ／ｍｌであり、従
来最も有効であるといわれている硫酸デキストランの最
小有効濃度と同等であると判断できる。リン酸化前の舞
茸グルカンの最小有効濃度が１２５μｇ／ｍｌであるか
ら、リン酸化による活性の増大は格別顕著である。
【００１５】本発明のグルカンリン酸化物は、実施例に
示すように、ＨＩＶ−１に対して抗ウイルス活性を示す
が、ＨＩＶ−２に対しても同様の活性を有している。
示すように、ＨＩＶ−１に対して抗ウイルス活性を示す
が、ＨＩＶ−２に対しても同様の活性を有している。
【００１６】舞茸グルカンの非リン酸化物がヘルパーＴ
細胞（Ｔ４細胞）の活性を賦活化することが分っている
ことから、本発明のグルカンリン酸化物はＨＩＶによる
Ｔ４細胞の変性を著しく軽減することにより、抗ＨＩＶ
作用を示すと考えられる。
細胞（Ｔ４細胞）の活性を賦活化することが分っている
ことから、本発明のグルカンリン酸化物はＨＩＶによる
Ｔ４細胞の変性を著しく軽減することにより、抗ＨＩＶ
作用を示すと考えられる。
【００１７】本発明のレトロウイルス感染症用薬剤は、
上記のグルカンリン酸化物を活性物質として含む。本発
明の薬剤は活性物質の他に、製薬上許容可能な希釈剤、
賦形剤等の慣用的な添加剤を含み得る。添加剤としては
水、溶剤、デンプン、乳糖、油脂類等があげられる。
上記のグルカンリン酸化物を活性物質として含む。本発
明の薬剤は活性物質の他に、製薬上許容可能な希釈剤、
賦形剤等の慣用的な添加剤を含み得る。添加剤としては
水、溶剤、デンプン、乳糖、油脂類等があげられる。
【００１８】本発明の薬剤は経口、非経口、局所投与等
の任意のルートで投与が可能であるが、静脈投与が好ま
しい。
の任意のルートで投与が可能であるが、静脈投与が好ま
しい。
【００１９】本発明の薬剤は溶液、懸濁液、乳濁液、錠
剤、粉末、カプセル等の任意の形態とし得るが、液状形
態が好ましい。
剤、粉末、カプセル等の任意の形態とし得るが、液状形
態が好ましい。
【００２０】本発明の薬剤は、活性物質量として、１日
当り体積１ｋｇ当り２５〜４００ｍｇ、好ましくは５０
〜２００ｍｇ投与するが、この値は患者の年齢、性別、
症状等によって変化し得る。
当り体積１ｋｇ当り２５〜４００ｍｇ、好ましくは５０
〜２００ｍｇ投与するが、この値は患者の年齢、性別、
症状等によって変化し得る。
【００２１】本発明の薬剤はレトロウイルス（特にＨＩ
Ｖウイルス）に起因する感染症（特にＡＩＤＳ）の治療
及び発症の抑制に効果的に使用し得る。
Ｖウイルス）に起因する感染症（特にＡＩＤＳ）の治療
及び発症の抑制に効果的に使用し得る。
【００２２】本発明の薬剤は製薬上問題となるような急
性毒性は有していない。
性毒性は有していない。
【００２３】
【実施例】以下、実施例により本発明をより詳細に説明
するが、これにより本発明が限定されるものではない。
するが、これにより本発明が限定されるものではない。
【００２４】舞茸グルカンの抽出及び精製 舞茸の子実体あるいは菌糸体を粉砕し２００〜５００ｇ
の乾燥粉末を得た後、これに２Ｌ〜５Ｌの蒸留水を加
え、１００℃で５〜７時間の煮沸熱水抽出、あるいは
１．２気圧で１時間加熱処理し、冷却後遠心分離法、ま
たは濾過法によって得た澄液に等量のアルコールを加
え、４℃、１８〜２４時間インキュベーションした後、
９〜２５ｇの沈殿物を得た。これを３０％及び５０％の
酢酸で処理し、酸可溶物を除去し２〜５ｇの酸不溶物を
得た。これに５〜７％のＮａＯＨを加えアルカリ可溶物
を収集し、これに４倍の純アルコールを加えて沈殿物を
得た。
の乾燥粉末を得た後、これに２Ｌ〜５Ｌの蒸留水を加
え、１００℃で５〜７時間の煮沸熱水抽出、あるいは
１．２気圧で１時間加熱処理し、冷却後遠心分離法、ま
たは濾過法によって得た澄液に等量のアルコールを加
え、４℃、１８〜２４時間インキュベーションした後、
９〜２５ｇの沈殿物を得た。これを３０％及び５０％の
酢酸で処理し、酸可溶物を除去し２〜５ｇの酸不溶物を
得た。これに５〜７％のＮａＯＨを加えアルカリ可溶物
を収集し、これに４倍の純アルコールを加えて沈殿物を
得た。
【００２５】この沈殿物にクロロホルム−アルコール混
合液（２：１）を加え、蛋白質を除去した後アルコール
を４倍量加え混和後、４℃で１８〜２４時間インキュベ
ーションし、遠心分離法により約０．７ｇ〜１．７ｇの
沈殿物を得た。
合液（２：１）を加え、蛋白質を除去した後アルコール
を４倍量加え混和後、４℃で１８〜２４時間インキュベ
ーションし、遠心分離法により約０．７ｇ〜１．７ｇの
沈殿物を得た。
【００２６】得られた物質は、冷水に難溶な淡褐色粉末
でアンスロン反応は陽性であり、Ｌｏｗｒｙ法により２
０〜２５％の蛋白質が検出され、プロテオグルカンであ
ることが確認された。この蛋白質をまず、Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ：ＣＬ−４Ｂ，２．５×４５ｃｍカラムを用いて
ゲル濾過し、分子量２００×１０4 の高分子糖蛋白質を
得た。つぎに、この物質をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ：ＣＬ−６Ｂ，２．０×４．５ｃｍカラムに吸着さ
せ、ｐＨ７．２の１／１５Ｍリン酸緩衝液で溶出された
物質を得、この物質をＳｅｐｈａｒｏｓｅ透析チューブ
を用いて４℃蒸留水に対して透析（１８〜２４時間）
し、つぎにセファデックスＧ−２５：３×３７ｃｍカラ
ムで脱塩を実施した。これを蒸発乾固させ、淡褐色無定
形粉末状の物質を得た。この物質は、０．５〜０．７％
の蛋白質を含む多糖体であった。
でアンスロン反応は陽性であり、Ｌｏｗｒｙ法により２
０〜２５％の蛋白質が検出され、プロテオグルカンであ
ることが確認された。この蛋白質をまず、Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ：ＣＬ−４Ｂ，２．５×４５ｃｍカラムを用いて
ゲル濾過し、分子量２００×１０4 の高分子糖蛋白質を
得た。つぎに、この物質をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ：ＣＬ−６Ｂ，２．０×４．５ｃｍカラムに吸着さ
せ、ｐＨ７．２の１／１５Ｍリン酸緩衝液で溶出された
物質を得、この物質をＳｅｐｈａｒｏｓｅ透析チューブ
を用いて４℃蒸留水に対して透析（１８〜２４時間）
し、つぎにセファデックスＧ−２５：３×３７ｃｍカラ
ムで脱塩を実施した。これを蒸発乾固させ、淡褐色無定
形粉末状の物質を得た。この物質は、０．５〜０．７％
の蛋白質を含む多糖体であった。
【００２７】ついで、得られた多糖体の化学構造を明ら
かにした。
かにした。
【００２８】即ち、前記物質１ｍｇを計り、５％塩酸メ
タノール１ｍｌに溶解し、１００℃で５〜７時間封管分
解する。その後、分解物にトルエン−エタノール（１：
１）混合液を添加して減圧下で蒸発乾固する。これにト
リメチル珪素化剤を添加して６５〜７５℃で５〜１５分
間インキュベーションし、ついでＳＥ２０（シリコンゴ
ムＧＥ）を充填剤とするガスクロマトグラフィー分析で
分析したところ、グルコースのみが検出された。さら
に、この物質をエクソ−β−１，３−グルカナーゼをｐ
Ｈ５．０でマッキュルビン緩衝液の下でインキュベート
したところ、４８時間後に構成グルコース残基の４０〜
５０％が遊離した。これらの結果から、この物質はβ−
１，３結合を有するグルカンであることが確認された。
タノール１ｍｌに溶解し、１００℃で５〜７時間封管分
解する。その後、分解物にトルエン−エタノール（１：
１）混合液を添加して減圧下で蒸発乾固する。これにト
リメチル珪素化剤を添加して６５〜７５℃で５〜１５分
間インキュベーションし、ついでＳＥ２０（シリコンゴ
ムＧＥ）を充填剤とするガスクロマトグラフィー分析で
分析したところ、グルコースのみが検出された。さら
に、この物質をエクソ−β−１，３−グルカナーゼをｐ
Ｈ５．０でマッキュルビン緩衝液の下でインキュベート
したところ、４８時間後に構成グルコース残基の４０〜
５０％が遊離した。これらの結果から、この物質はβ−
１，３結合を有するグルカンであることが確認された。
【００２９】さらに、確認された物質を箱守法により完
全メチル化した後、この完全メチル化物を５％塩酸メタ
ノールによってメタノリシスした。これをネオペンチル
グリコールサクシネートを充填剤とするガスクロマトグ
ラフィーにて分析したところ、β−１，３結合に由来す
る２，４，６−トリ−０−メチル、β−１，６結合に由
来する２，３，６−トリ−０−メチル、１，３，４結合
に由来する２，４−ダイ−０−メチル及び非還元末端に
由来する２，３，４，６−テトラ−０−メチルグルコー
ス誘導体の存在が確認された。このことから、舞茸子実
体を煮沸熱水抽出して得られた物質は、β−１，６結合
を主鎖とし、これに高頻度のβ−１，３分枝鎖を有する
化学的構成よりなる多糖蛋白質及びβ−１，６分枝鎖を
もつβ−１，３多糖蛋白質から構成されるものと断定し
た。さらにリン酸化β−グルカンの分子量はManers法
（Ｅｔ Ａｌ. 1971）の改変法を用いて測定したところ
約２０万であった。
全メチル化した後、この完全メチル化物を５％塩酸メタ
ノールによってメタノリシスした。これをネオペンチル
グリコールサクシネートを充填剤とするガスクロマトグ
ラフィーにて分析したところ、β−１，３結合に由来す
る２，４，６−トリ−０−メチル、β−１，６結合に由
来する２，３，６−トリ−０−メチル、１，３，４結合
に由来する２，４−ダイ−０−メチル及び非還元末端に
由来する２，３，４，６−テトラ−０−メチルグルコー
ス誘導体の存在が確認された。このことから、舞茸子実
体を煮沸熱水抽出して得られた物質は、β−１，６結合
を主鎖とし、これに高頻度のβ−１，３分枝鎖を有する
化学的構成よりなる多糖蛋白質及びβ−１，６分枝鎖を
もつβ−１，３多糖蛋白質から構成されるものと断定し
た。さらにリン酸化β−グルカンの分子量はManers法
（Ｅｔ Ａｌ. 1971）の改変法を用いて測定したところ
約２０万であった。
【００３０】リン酸化 β−グルカンのリン酸化はリン酸一ナトリウム・２Ｈ2
Ｏ ０．６ｇとリン酸二ナトリウム・１２Ｈ2 Ｏ ０．
８ｇを蒸留水１ｍｌに溶解したものに凍結乾燥後のβ−
グルカンを１ｇを加え、混和後６０分間撹拌して行なっ
た。ついで濾過後２４時間減圧乾燥し粉砕し、１５５℃
で２時間インキュベートした。その後ＭｅＯＨ／Ｈ2 Ｏ
＝１／１(Wt)で洗浄した。洗浄後濾過し２４時間減圧乾
燥した。得られたリン酸化グルカンは水酸基の２０％が
リン酸化されていた。
Ｏ ０．６ｇとリン酸二ナトリウム・１２Ｈ2 Ｏ ０．
８ｇを蒸留水１ｍｌに溶解したものに凍結乾燥後のβ−
グルカンを１ｇを加え、混和後６０分間撹拌して行なっ
た。ついで濾過後２４時間減圧乾燥し粉砕し、１５５℃
で２時間インキュベートした。その後ＭｅＯＨ／Ｈ2 Ｏ
＝１／１(Wt)で洗浄した。洗浄後濾過し２４時間減圧乾
燥した。得られたリン酸化グルカンは水酸基の２０％が
リン酸化されていた。
【００３１】リン酸化β−グルカンの抗血液凝固作用 リン酸化β−グルカンの抗血液凝固作用の有無を検討す
るために、血漿中活性化部分トロンボプラスチン時間
（APTT）の測定を行った。
るために、血漿中活性化部分トロンボプラスチン時間
（APTT）の測定を行った。
【００３２】方法：使用動物は体重３．５〜３．９Kgの
日本白色在来種の雄性兎であった。兎耳静脈をメスで切
り、３．８％クエン酸ナトリウム溶液１容に対し血液９
容となるように採血し、３０００rpm で１０分間遠心分
離し、その上清の血漿を分離して測定まで氷中に保存し
た。血漿９０μｌ、被検薬物（また対照薬物）１０μ
ｌ、及びActine１００μｌを加え３７℃で２分間インキ
ュベートした。インキュベート後、０．０２５Ｍ塩化カ
ルシウム１００μｌを加え、同時に凝固時間の測定を開
始した。
日本白色在来種の雄性兎であった。兎耳静脈をメスで切
り、３．８％クエン酸ナトリウム溶液１容に対し血液９
容となるように採血し、３０００rpm で１０分間遠心分
離し、その上清の血漿を分離して測定まで氷中に保存し
た。血漿９０μｌ、被検薬物（また対照薬物）１０μ
ｌ、及びActine１００μｌを加え３７℃で２分間インキ
ュベートした。インキュベート後、０．０２５Ｍ塩化カ
ルシウム１００μｌを加え、同時に凝固時間の測定を開
始した。
【００３３】薬物：被検薬物のβ−グルカン及びβ−グ
ルカンリン酸化物は、０．３％DMSOに溶解し、硫酸デキ
ストラン（DS 500）は蒸留水に溶解した。
ルカンリン酸化物は、０．３％DMSOに溶解し、硫酸デキ
ストラン（DS 500）は蒸留水に溶解した。
【００３４】 結 果 ：ＡＰＴＴ(sec) Cont 1 3 10 30 100（μg/ml） リン酸化β−グルカン 17.3 17.3 17.2 17.1 17.8 17.1 β−グルカン 17.5 17.3 17.5 17.0 17.7 17.3 ＤＳ 500 17.5 20.1 26.1 45.5 363.3 >600 リン酸化β−グルカンはＡＰＴＴを延長させなかった。
即ち、リン酸化β−グルカンは抗血液凝固作用は無いと
判断できる。
即ち、リン酸化β−グルカンは抗血液凝固作用は無いと
判断できる。
【００３５】硫酸デキストランは濃度依存的にＡＰＴＴ
を延長させ、ＡＰＴＴを２倍延長させる濃度は、５．４
μｇ／ｍｌであった。即ち、硫酸デキストランは抗血液
凝固作用があると判断できる。
を延長させ、ＡＰＴＴを２倍延長させる濃度は、５．４
μｇ／ｍｌであった。即ち、硫酸デキストランは抗血液
凝固作用があると判断できる。
【００３６】抗凝固作用を再度確認のため追試を実施し
た。追試には更に硫酸化β−グルカンを加えて試み、リ
ン酸化β−グルカンの濃度を高濃度にして試験を実施し
た。
た。追試には更に硫酸化β−グルカンを加えて試み、リ
ン酸化β−グルカンの濃度を高濃度にして試験を実施し
た。
【００３７】 結 果 ：ＡＰＴＴ(sec) Cont 100 200 300 400 500（μg/ml） リン酸化β−グルカン 16.7 15.9 15.9 15.5 15.7 15.6 Cont 1 3 10 30 100（μg/ml） 硫酸化β−グルカン 16.1 15.6 17.7 21.2 33.7 >600 ＤＳ 500 15.2 16.9 20.1 38.2 223.7 >600 リン酸化β−グルカンは高濃度においても抗血液凝固作
用は見られなかった。対照薬である硫酸化β−グルカン
と硫酸デキストランは濃度依存的にＡＰＴＴを延長さ
せ、ＡＰＴＴを２倍延長させる濃度は、それぞれ２８．
８μｇ／ｍｌと６．４μｇ／ｍｌであった。
用は見られなかった。対照薬である硫酸化β−グルカン
と硫酸デキストランは濃度依存的にＡＰＴＴを延長さ
せ、ＡＰＴＴを２倍延長させる濃度は、それぞれ２８．
８μｇ／ｍｌと６．４μｇ／ｍｌであった。
【００３８】以上の結果より、現在ＨＩＶ患者に有用で
あると言われている硫酸デキストランよりもリン酸化β
−グルカンの方がＨＩＶ患者には有用であることが示唆
された。
あると言われている硫酸デキストランよりもリン酸化β
−グルカンの方がＨＩＶ患者には有用であることが示唆
された。
【００３９】抗ＨＩＶ活性の測定（ウイルスによる細胞
変性抑制活性の試験） 国立予防衛生研究所エイズセンターエイズウイルス室で
実施されている方法を用いた。
変性抑制活性の試験） 国立予防衛生研究所エイズセンターエイズウイルス室で
実施されている方法を用いた。
【００４０】即ち、１次スクーリングとしてＭＴ−４細
胞のＨＩＶ感染による細胞障害性の抑制を指標にしたマ
イクロプレート法を用い、ここで活性が認められた試料
に関しては更に他の方法により抗ＨＩＶ活性の確認及び
作用メカニズムの解析を行った。
胞のＨＩＶ感染による細胞障害性の抑制を指標にしたマ
イクロプレート法を用い、ここで活性が認められた試料
に関しては更に他の方法により抗ＨＩＶ活性の確認及び
作用メカニズムの解析を行った。
【００４１】マイクロプレート法 ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−III ＢStrain）及びＨＩＶ−２
（ＨＩＶ「ＧＨ−１」）に対して高い感受性を持つＭＴ
−４細胞（ＣＤ４抗原陽性・ＨＴＬＶ−１陽性細胞）は
感染後３〜５日間でＣＰＥが出現し、ほとんどの細胞が
死滅する。
（ＨＩＶ「ＧＨ−１」）に対して高い感受性を持つＭＴ
−４細胞（ＣＤ４抗原陽性・ＨＴＬＶ−１陽性細胞）は
感染後３〜５日間でＣＰＥが出現し、ほとんどの細胞が
死滅する。
【００４２】顕微鏡下でＣＰＥを判定し、添加した試料
によってこのＣＰＥの発現を抑制するかどうかを調べ、
１次スクリーニングとした。
によってこのＣＰＥの発現を抑制するかどうかを調べ、
１次スクリーニングとした。
【００４３】即ち、丸底９６ウエルマイクロプレート
（Ｎｕｎｃ）の左端８ウェルに所定の希釈した試料溶液
２００ｍｌを加えた。試料の希釈は１０％Ｆｃｓ添加Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地で行った。残りのウエルには培地を
１００ｍｌづつ入れておき、８連ピペットで左端のウェ
ルから１００ｍｌを取り右隣のウェルに移しよく撹拌し
た。これを繰り返し試料の２倍段階希釈（１００ｍｌ／
ウェル１２段階）とした。
（Ｎｕｎｃ）の左端８ウェルに所定の希釈した試料溶液
２００ｍｌを加えた。試料の希釈は１０％Ｆｃｓ添加Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地で行った。残りのウエルには培地を
１００ｍｌづつ入れておき、８連ピペットで左端のウェ
ルから１００ｍｌを取り右隣のウェルに移しよく撹拌し
た。これを繰り返し試料の２倍段階希釈（１００ｍｌ／
ウェル１２段階）とした。
【００４４】次に対数増殖期にあるＭＴ−４細胞をプレ
ート１枚あたり６００万個遠心分離にて集め、極く少量
の培地に懸濁した。
ート１枚あたり６００万個遠心分離にて集め、極く少量
の培地に懸濁した。
【００４５】この細胞浮遊液に遠心管内で１００ＴＣＩ
Ｄ ５０／ｍｌとなるようにＨＩＶを加え３７℃で１時
間吸着させた。
Ｄ ５０／ｍｌとなるようにＨＩＶを加え３７℃で１時
間吸着させた。
【００４６】ＨＩＶは持続感染Ｍｏｌｔ−４／ＨＩＶ細
胞の培養上清を２２μｍのミリポアフイルターで濾過し
−８０℃で保存したもので、予めＭＴ−４細胞にたいす
る感染価を決定していたものを用いた。
胞の培養上清を２２μｍのミリポアフイルターで濾過し
−８０℃で保存したもので、予めＭＴ−４細胞にたいす
る感染価を決定していたものを用いた。
【００４７】３７℃で１時間吸着後プレート１枚あたり
１０ｍｌの培地を加え１００μｌ／ウェルを試料希釈液
に添加した。この時の細胞濃度は３０万個／ｍｌに設定
した。
１０ｍｌの培地を加え１００μｌ／ウェルを試料希釈液
に添加した。この時の細胞濃度は３０万個／ｍｌに設定
した。
【００４８】非感染細胞と試料無添加感染細胞を対照と
しておき、５％ＣＯ2 存在下、３７℃で培養した。
しておき、５％ＣＯ2 存在下、３７℃で培養した。
【００４９】ＨＩＶ感染後３日目に検鏡で試料による細
胞毒性を調べると共に感染時と同じ試料の２倍段階希釈
のプレートを用意し、３日間培養したプレートから１／
３〜１／５の細胞を取り出し移し替えた。感染後６日目
に判定を行った。
胞毒性を調べると共に感染時と同じ試料の２倍段階希釈
のプレートを用意し、３日間培養したプレートから１／
３〜１／５の細胞を取り出し移し替えた。感染後６日目
に判定を行った。
【００５０】判定は検鏡によりＨＩＶ感染によるＣＰＥ
の発現の有無を観察した。試料が細胞毒性を示さない濃
度でＨＩＶ感染によるＣＰＥの発現を抑制した場合に効
果が認められるものとした。
の発現の有無を観察した。試料が細胞毒性を示さない濃
度でＨＩＶ感染によるＣＰＥの発現を抑制した場合に効
果が認められるものとした。
【００５１】抗ＨＩＶ試験結果 試料：舞茸由来リン酸化β−グルカン精製試料（分子量
約２２万）（試料Ｚ） 舞茸−β−グルカン（分子量約２０万）（試料Ｃ） 方法：ＭＴ−４細胞を用いたマイクロプレート法 使用したＨＩＶはＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２型であっ
た。
約２２万）（試料Ｚ） 舞茸−β−グルカン（分子量約２０万）（試料Ｃ） 方法：ＭＴ−４細胞を用いたマイクロプレート法 使用したＨＩＶはＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２型であっ
た。
【００５２】
【表１】
【００５３】
【発明の効果】舞茸由来リン酸化β−プロテオグルカン
（リン酸化β−ｇｌｕｃａｎともいう）は強い抗ＨＩＶ
活性を示した。培養後ウイルスによる細胞毒性の有無を
確認した結果、対照群ではウイルスによる細胞変性が認
められたが、リン酸化β−グルカン３１〜６３μｇ／ｍ
ｌという少量を添加した場合においてもウイルスによる
細胞変性が認められなかった。
（リン酸化β−ｇｌｕｃａｎともいう）は強い抗ＨＩＶ
活性を示した。培養後ウイルスによる細胞毒性の有無を
確認した結果、対照群ではウイルスによる細胞変性が認
められたが、リン酸化β−グルカン３１〜６３μｇ／ｍ
ｌという少量を添加した場合においてもウイルスによる
細胞変性が認められなかった。
【００５４】本発明のグルカンリン酸化物はウイルスに
よる細胞変性の抑制活性即ち抗ＨＩＶ活性が著しく高
い。
よる細胞変性の抑制活性即ち抗ＨＩＶ活性が著しく高
い。
Claims (4)
- 【請求項１】 担子菌属類の舞茸の菌糸体及び／又は子
実体から抽出したβ−１，６結合の分岐鎖を有するβ−
１，３グルカン及び／又はβ−１，３結合の分岐鎖を有
するβ−１，６グルカンのリン酸化物。 - 【請求項２】 グルカンの水酸基の５％以上がリン酸化
されている請求項１に記載のリン酸化物。 - 【請求項３】 グルカンが蛋白質を１％以下含有するこ
とを特徴とする請求項１又は２に記載のリン酸化物。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか一項に記載のリ
ン酸化物を含むレトロウイルス感染症用薬剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13536196A JP4540133B2 (ja) | 1996-05-29 | 1996-05-29 | 抗ＡＩＤＳウイルス活性を有する新規リン酸化β−グルカン及びそれを含むレトロウイルス感染症治療用薬剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13536196A JP4540133B2 (ja) | 1996-05-29 | 1996-05-29 | 抗ＡＩＤＳウイルス活性を有する新規リン酸化β−グルカン及びそれを含むレトロウイルス感染症治療用薬剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09316104A true JPH09316104A (ja) | 1997-12-09 |
| JP4540133B2 JP4540133B2 (ja) | 2010-09-08 |
Family
ID=15149948
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13536196A Expired - Lifetime JP4540133B2 (ja) | 1996-05-29 | 1996-05-29 | 抗ＡＩＤＳウイルス活性を有する新規リン酸化β−グルカン及びそれを含むレトロウイルス感染症治療用薬剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4540133B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001240603A (ja) * | 2000-02-29 | 2001-09-04 | Toei Shinyaku Kk | β−１，３分岐β−１，６−グルカンとアガリクス茸アルカリ抽出エキス |
| KR20030062178A (ko) * | 2002-01-16 | 2003-07-23 | 남궁 정 | 팽이버섯 자실체로부터 수용성 베타글루칸의 제조방법 |
| JP2017537215A (ja) * | 2014-12-08 | 2017-12-14 | イノ ファーム カンパニー リミテッド | 生体適合性組成物及びこの製造方法 |
| CN113975456A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-01-28 | 福建师范大学 | 杏鲍菇子实体制备甲壳素/葡聚糖复合止血海绵的方法 |
-
1996
- 1996-05-29 JP JP13536196A patent/JP4540133B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001240603A (ja) * | 2000-02-29 | 2001-09-04 | Toei Shinyaku Kk | β−１，３分岐β−１，６−グルカンとアガリクス茸アルカリ抽出エキス |
| KR20030062178A (ko) * | 2002-01-16 | 2003-07-23 | 남궁 정 | 팽이버섯 자실체로부터 수용성 베타글루칸의 제조방법 |
| JP2017537215A (ja) * | 2014-12-08 | 2017-12-14 | イノ ファーム カンパニー リミテッド | 生体適合性組成物及びこの製造方法 |
| CN113975456A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-01-28 | 福建师范大学 | 杏鲍菇子实体制备甲壳素/葡聚糖复合止血海绵的方法 |
| CN113975456B (zh) * | 2021-11-08 | 2022-06-17 | 福建师范大学 | 杏鲍菇子实体制备甲壳素/葡聚糖复合止血海绵的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4540133B2 (ja) | 2010-09-08 |
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