CN113181434A - 一种修复骨缺损的水凝胶微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种修复骨缺损的水凝胶微球的制备及其应用，属于生物医药技术领域。本发明利用微流控装置以甲基丙烯酰化明胶和纳米羟基磷灰石为原料，通过紫外光交联原理可以制备出不同直径以及不同比例的水凝胶微球，本发明所制备出的水凝胶微球具有很好的机械稳定性、生物相容性以及成骨再生能力，微球的制备方法简单，可进行批量生产，具有良好的应用前景。

Description

一种修复骨缺损的水凝胶微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种修复骨缺损的水凝胶微球及其制备方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
严重的撞击、肿瘤切除或者骨丢失都可能导致骨骼损伤。每年约进行80万例外科手术会导致骨骼损伤，并且随着人口老龄化的增长而迅速增加。由于可获得性有限，自体移植物的术后感染和出血，以及同种异体移植物和异种移植物的流行扩散风险和免疫排斥，天然骨移植物无法满足临床需求。因此，合成骨移植物的数量不断增加，可实现自体骨移植物的治疗效果，而不会引起严重的副作用。但很多有前途的合成骨移植物，特别是可注射的骨移植物，始终具有较差的有机和无机相容性。一方面，需要提高机械强度以满足应用要求。另一方面，合成材料作为“生物材料”骨移植物不仅需要满足“材料”的物理稳定性要求，而且还需要满足“生物”的要求，以使其具有生物可降解性、生物相容性和生物活性，以便它们能够促进细胞黏附、增殖、迁移和营养物质的运输并在组织再生过程中逐渐降解或吸收。
成骨细胞产生的矿化细胞外基质(ECM)是结缔组织的主要成分，占骨骼干重的大部分。在矿化ECM中，I型胶原蛋白是一种主要的有机成分。而变性胶原明胶由于其与天然ECM非常相似，因此在仿生水凝胶研究中被广泛使用。为了模仿天然骨的化学成分，一些仿生无机颗粒，例如羟基磷灰石(HAP)、硅酸盐、掺锰生物可吸收陶瓷支架和钛化合物通常用于水凝胶中。本发明在已上市的瑞士Bio-Oss骨粉的基础上做了进一步改进，将有机(明胶)和无机(HAP)复配到一起，制备出了一种直径在300-500μm的水凝胶微球。
水凝胶微球的常用制作方法可分为批量乳化法、光刻法、电喷法、机械破碎法和微流控法。批量乳化法是将不相容的液体混合在一起生成可交联的水凝胶液滴；光刻法是将光聚焦在掩模版或者模具上固化交联形成水凝胶微球；电喷法是在针头和接收液之间加上电压，使施加的电压克服针尖处的表面张力，形成了带电的液滴射流，在接收液中交联形成水凝胶微球；在机械破碎方法中，将预先形成的块状水凝胶通过机械破碎成水凝胶微球；微流控法将载有不相容液体通过微流道连接，在交汇处产生液滴，然后将液滴交联形成水凝胶微球，该方法适用于快速产生稳定的尺寸可控的微球。
此类3D支架具有较大的表面积，可改善细胞-基质相互作用。使用微流体方法能够快速生成水凝胶微球，该水凝胶微球可以封装来自骨髓的干细胞和生长因子，并创建良好的细胞生长微环境，从而增强了成骨作用。在微流体装置中产生包含光引发剂(LAP)的可光交联GelMA+HAP液滴，然后对其进行光聚合，以快速有效地产生GH微球。这种温和的胶凝条件使对掺入的细胞或者蛋白质的损害最小化。GH微球不仅具有适宜的物理稳定性，而且具有良好的生物相容性，细胞能够在微球表面黏附并增值。但是，这种方法有一些缺点，限制了其生物医学应用。首先，微流体技术需要昂贵的毛细管装置或微通道芯片，这在组装上也存在技术挑战，并极大地影响实验结果。其次，由于微流体装置没有交联，因此水凝胶微滴只能在下游交联，在那里它们会融合并变得不稳定。因此，有必要设计一种新方法，以确保简单、快速的操作使微球交联。光交联的可注射水凝胶在微流控设备中暴露于光线时可以实现稳定的交联，并表现出出色的生物相容性。例如，明胶甲基丙烯酰胺(GelMA)是一种可生物降解，无毒且无免疫原性的光交联水凝胶，可促进细胞粘附、增殖、迁移和分化。
目前临床上普遍使用的是瑞士生产的Bio-Oss骨粉用于牙周骨缺损、颌面外科骨缺损的填充，但是其存在很多缺陷，比如颗粒直径分布不均匀、棱角尖锐、生物相容性差，对其临床应用均产生不良影响。此外这款骨粉价格也比较昂贵，一盒950元/0.25g，很难普及应用。
发明内容
本发明是为了解决现有骨修复材料制备工艺复杂、粒径不均一、生物相容性和可降解性不优良、价格昂贵等缺点，提供一种修复骨缺损的水凝胶微球及其制备方法，本发明使用微流控技术，以甲基丙烯酰化明胶(GelMA)和纳米羟基磷灰石(nHAP)为原料制备了一种修复骨缺损的水凝胶微球，其直径分布在300～500μm之间，粒径可控，理化性质稳定，表面粗糙多孔，生物相容性较好，能促进MC3T3-E1细胞的增值、黏附以及分化。
本发明的第一个目的是提供一种制备用于修复骨缺损的水凝胶微球的方法，该方法包括如下过程：
将含双键修饰的有机成分、无机成分和光引发剂分散在水中，获得混合体系，作为分散相；将油相作为连续相，然后利用微流控装置将分散相和连续相分别注入微通道，在注射泵推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴，收集获得W/O乳液；最后将W/O乳液在紫外光下进行照射，制得水凝胶微球。
在本发明的一种实施方式中，所述含双键修饰的有机成分选自：甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、甲基丙烯酰化胶原蛋白(ColMA)；所述无机成分选自：羟基磷灰石(HAP)、β-TCP、硅酸盐、掺锰生物可吸收陶瓷和钛化合物。
在本发明的一种实施方式中，所述混合体系中双键修饰的明胶与羟基磷灰石的质量比为10：(2-10)；优选10：(3-5)；进一步优选10：3。
在本发明的一种实施方式中，所述混合体系中经双键修饰的明胶的质量浓度为5％～10％。
在本发明的一种实施方式中，所述混合体系中HAP的质量浓度为1％～10％。
在本发明的一种实施方式中，所述混合体系中还包括计入光引发剂。所述光引发剂相对混合体系的质量分数为0.125％～0.25％。
在本发明的一种实施方式中，所述油相为蓖麻油。
在本发明的一种实施方式中，所述连续相在微通道的流速控制在4～10mL/h；分散相在微通道的流速控制在1～5mL/h。本发明通过通过调节水相和油相的流速，可以获得不同尺寸分布的液滴。
在本发明的一种实施方式中，所述微流控装置选用双通道注射泵，芯片选用的是T型通道微流控芯片，连续相入口是点胶针头，0.8mm，分散相入口是毛细管，外径是1mm，内径是0.58mm。
在本发明的一种实施方式中，所述紫外光的照射功率为20-40mW cm-2；紫外光的波长为365-405nm；照射时间为30-120s。
在一种实施方式中，涉及的羟基磷灰石是纳米级羟基磷灰石(nHAP)，粒径为60-80nm。
在一种实施方式中，涉及的经双键修饰的明胶(GelMA)是通过如下方法制得：利用甲基丙烯酸酐与明胶进行酰胺反应，获得GelMA。
在一种实施方式中，所述酰胺反应是在PBS缓冲液环境中进行的，明胶和PBS缓冲液的质量体积比(w/v)为0.05～0.1g/mL。
在一种实施方式中，具体是将明胶分散在PBS缓冲液中，然后加热至50-60℃后搅拌20～60min，实现溶解。
在一种实施方式中，所述明胶和甲基丙烯酸酐的质量体积比(w/v)为0.1～1g/mL。
在一种实施方式中，酰胺反应是在避光并且剧烈搅拌条件下，缓慢加入甲基丙烯酸酐(MA)；MA滴加完成之后，使反应在充分搅拌并且避光条件下进行6～24h。
在一种实施方式中，酰胺反应的过程具体为：称量A型猪皮明胶，并量取一定量的PBS放入圆底烧瓶中，在50℃水浴中加热搅拌20-60min使其溶解，明胶溶解后，在避光并且剧烈搅拌条件下，缓慢加入MA；MA滴加完成之后，使反应在充分搅拌并且避光条件下进行6-24h。
在一种实施方式中，反应结束之后还需要进行透析、干燥；透析是指使用分子量截止值为3500Da的透析袋对反应溶液进行蒸馏水透析以除去未反应的MA；所述干燥是指使用冻干机进行冷冻干燥。
本发明的第二个目的是利用上述方法制备提供一种用于骨修复的水凝胶微球。
本发明的第三个目的是提供上述水凝胶微球在制备用于牙周骨缺损、其他外科骨缺损类药用产品、或医疗器械中的应用。
有益效果：
(1)本发明采用GelMA和nHAP作为原料，具有良好的生物相容性、机械稳定性、粒径均一及促骨再生效果，水凝胶微球可以直接填充到骨缺损位置，有利于细胞黏附、分化以及骨再生。
(2)本发明具有良好的溶胀性能，有利于细胞和药物的传递和释放。
(3)本发明可生物降解，使用前期可以促进新骨形成，后期降解不侵占新生组织位置。
(4)本发明具有良好的热稳定性，TGA测试结果显示热分解温度均有所升高。
(5)本发明有良好的力学性能，压缩模量达到258kPa，不会因为外力而遭到破坏，同时有利于干细胞向成骨细胞方向分化。
(6)本发明有良好的生物活性，能够促进细胞增值、黏附和分化。
(7)本发明使用的原料容易获得，成本较低，制备方法简单，适合大规模生产。
附图说明
图1为本发明的技术路线图；
图2为本发明使用微流控制备的水凝胶微球的普通光学显微镜图；其中，A为分散相流速控制为1mL/h，改变连续相的流速(2mL/h-10mL/h)条件下分别制得的水凝胶微球的普通光学显微镜图；B为连续相流速控制为5mL/h，改变分散相的流速(0.5mL/h-4mL/h)条件下分别制得的水凝胶微球的普通光学显微镜图；
图3为本发明制备的不同比例的GH水凝胶微球的扫描电镜图；
图4为本发明制备的GH水凝胶微球的溶胀结果图；
图5为本发明制备的GH水凝胶微球的热重分析(TGA)结果图；
图6为本发明制备GH水凝胶微球的机械性能测试结果图；
图7为本发明制备的GH水凝胶微球的细胞毒性评估(MTT)结果图；
图8为本发明制备的GH水凝胶微球细胞黏附结果测试的共聚焦激光扫描显微镜图；
图9为本发明制备的GH水凝胶微球与细胞共培养后ALP含量测试图；
图10为本发明制备的GH水凝胶微球的动物实验结果图。
具体实施方式
A型猪皮明胶和甲基丙烯酸酐分别购自sigma和麦克林，蓖麻油来源于国药试剂，MC3T3-E1细胞为本实验室保存。
本发明首先在50℃水浴、避光条件下进行明胶和甲基丙烯酸酐的反应，利用明胶上面的自由氨基进行接枝双键以进行后面的紫外交联成凝胶反应。明胶上的双键接枝率我们通过1HNMR来计算。
水凝胶微球的制备方法：为了制备GH微球，并且为了使微球能够促进骨再生，我们选择了GelMA复配nHAP溶液，并且加入了适量的LAP(光引发剂)作为分散相，同时使用蓖麻油作为连续相。将两相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相形成单分散液滴。通过调节水相和油相的流速，我们可以获得不同尺寸分布的液滴。收集的W/O乳液在25mWcm-2的UV光(405nm)中暴露60s后聚合成微球。使用显微镜图像和image J软件确定所得微球的大小。水凝胶微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后我们使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及其中的光引发剂，最后将微球冻干，保存至-20℃。
为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。
实施例1 GelMA的制备
精密称量10g A型猪皮明胶，并量取100mL PBS放入圆底烧瓶中，在50℃水浴中加热搅拌30min使其溶解，明胶溶解后，在避光并且剧烈搅拌条件下，缓慢加入10mL MA。MA滴加完成之后，使反应在充分搅拌并且避光条件下进行24h。之后，将产物转移至透析袋中(3500Da)，在40℃下进行透析，每4h更换一次蒸馏水，共透析6次。最后，将产物冻干得到疏松多孔的白色固体产物，即为GelMA，保存至-20℃。
实施例2
GelMA产物表征：
分别取少量的冻干产物GelMA和磨成粉的明胶，使用傅里叶变换红外光谱仪在400-4000波长范围内扫描其红外光谱。此外，甲基丙烯酰化前后的明胶使用1H NMR进行表征，分别取20mg GelMA和明胶溶解于0.5mL D2O中，然后装入核磁管中使用核磁共振波谱仪进行测试。明胶的1H NMR光谱极其复杂，因为明胶由>20种不同的氨基酸组成。这些氨基酸结构单元的结构是-NH-CHR-CO-，其中侧链(R)变化且具有不同的官能团，想要完成光谱的完整分析十分困难。对于计算DS，必须选取一个不能被修饰的基团所对应的峰，通过记录不同氨基酸的1H NMR光谱，可以将1.1ppm处的信号归因于缬氨酸(Val)，亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)侧链中的共振。缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的疏水性烷基侧链可以认为是化学惰性的，它们在合成GelMA的过程中不参与反应。我们根据已知的组成(100g明胶中含有0.0190mol Val，0.0235mol Leu，0.0102mol Ile)，可以计算出该峰(18个质子)的积分对应于0.3162mol/100g。同样，我们还需要考虑明胶中可用胺基的总量(0.0821mol/100g)，因此将DS定义为明胶中游离胺基的初始量的函数。所以GelMA的接枝率(DS)的计算公式为：
Figure BDA0003009340740000061
根据测得的核磁结果计算出甲基丙烯酰化明胶上的双键接枝率在70％～85％之间。
实施例3水凝胶微球的制备
(1)利用实施例1所得GelMA分散在水中，配制得到10wt％的GelMA溶液，并且加入相对水质量的0.25wt％的LAP(光引发剂)后获得的混合液，作为分散相；同时使用蓖麻油作为连续相；
(2)将步骤(1)中的分散相、连续相两相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴；其中，分散相控制4mL/h流速注射，连续相控制5mL/h流速注射。通过调节水相和油相的流速，可以获得不同尺寸分布的液滴。收集的W/O乳液在25mW cm-2的UV光(405nm)中暴露60s后聚合成微球。使用显微镜图像和image J软件确定所得微球的大小。
(3)步骤(2)中凝胶微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及其中的光引发剂，最后将微球冻干，保存至-20℃。
实施例4水凝胶微球的制备
(1)利用实施例所得GelMA配制10wt％的GelMA，复配加入相对水质量的3wt％的nHAP，相对水质量的0.25wt％的LAP(光引发剂)后，混匀，获得混合液，作为分散相；同时使用蓖麻油作为连续相。
(2)将步骤(1)中的两相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴；其中，分散相控制4mL/h流速注射，连续相控制5mL/h流速注射。通过调节水相和油相的流速，可以获得不同尺寸分布的液滴。收集的W/O乳液在25mW cm-2的UV光(405nm)中暴露60s后聚合成微球。使用显微镜图像和image J软件确定所得微球的大小。
(3)步骤(2)中凝胶微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及其中的光引发剂，最后将微球冻干，保存至-20℃。
实施例5水凝胶微球的制备
(1)利用实施例所得GelMA配制10wt％的GelMA，复配加入相对水质量的5wt％的nHAP，相对水质量的0.25wt％的LAP(光引发剂)后，混匀，获得混合液，作为分散相；同时使用蓖麻油作为连续相。
(2)将步骤(1)中的两相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴；其中，分散相控制4mL/h流速注射，连续相控制5mL/h流速注射。通过调节水相和油相的流速，可以获得不同尺寸分布的液滴。收集的W/O乳液在25mW cm-2的UV光(405nm)中暴露60s后聚合成微球。使用显微镜图像和image J软件确定所得微球的大小。
(3)步骤(2)中凝胶微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及其中的光引发剂，最后将微球冻干，保存至-20℃。
实施例6
(1)利用实施例所得GelMA配制10wt％的GelMA，复配加入相对水质量的2wt％的nHAP，相对水质量的0.25wt％的LAP(光引发剂)后，混匀，获得混合液，作为分散相；同时使用蓖麻油作为连续相。
(2)将步骤(1)中的两相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴；其中，分散相控制4mL/h流速注射，连续相控制5mL/h流速注射。通过调节水相和油相的流速，可以获得不同尺寸分布的液滴。收集的W/O乳液在25mW cm-2的UV光(405nm)中暴露60s后聚合成微球。使用显微镜图像和image J软件确定所得微球的大小。
(3)步骤(2)中凝胶微球表面的蓖麻油使用无水乙醇除去，之后使用超纯水反复多次洗涤微球以除去乙醇以及其中的光引发剂，最后将微球冻干，保存至-20℃。
对比例1
(1)配制10wt％的GelMA溶液，并且加入0.25wt％的LAP(光引发剂)作为分散相，同时使用矿物油(惠丰润滑油，HFV-A200)作为连续相。
(2)将步骤(1)中的两相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴；其中，分散相控制4mL/h流速注射，连续相控制5mL/h流速注射。通过调节水相和油相的流速，可以获得不同尺寸分布的液滴。收集的W/O乳液在25mW cm-2的UV光(405nm)中暴露60s后聚合成微球。使用显微镜图像和image J软件确定所得微球的大小。
(3)步骤(2)中凝胶微球表面的矿物油使用乙醚除去，之后使用超纯水反复多次洗涤微球以除去其中的光引发剂，最后将微球冻干，保存至-20℃。
但对比实施例3-6，使用矿物油以及乙醚来制备微球大大增加了其细胞毒性。
对比例2
(1)配制10wt％的GelMA溶液，并且加入0.25wt％的LAP(光引发剂)作为分散相，同时使用硅油(日本信越二甲基硅油，KF96-50CS)作为连续相。
(2)将步骤(1)中的两相分别注入微通道，在两台注射泵的推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴；其中，分散相控制4mL/h流速注射，连续相控制5mL/h流速注射。通过调节水相和油相的流速，制备不同尺寸分布的液滴。但由于我们使用的硅油流动性较好，制备的微球在微流控芯片出口处发生了融合，我们难以制备出均一稳定的水凝胶微球。
实施例7 GH水凝胶微球的表面粗糙度检测
使用扫描电镜(SEM)观察不同比例水凝胶微球的表面粗糙度。
分别制备了不同比例的水凝胶微球(GelMA:nHAP＝10:0、10:3、10:5)，通过扫描电子显微镜(SEM)对水凝胶微球形貌进行观察。将冷冻干燥得到的样品平整的用导电胶固定到SEM载物台上，喷金处理后观察不同视野范围内样品的形貌结构。
实验结果：本发明的修复骨缺损的水凝胶微球表面粗糙度的扫描结果如图3所示。结果显示单纯的GelMA微球表面表现出疏松多孔的结构，当加入少量的nHAP时，微球表面的多孔结构由于羟基磷灰石的填充导致孔隙率降低。随着nHAP的增加，微球表面的粗糙度下降，主要是由于纳米级羟基磷灰石填充到了微球表面的孔隙中。而当微球用作组织工程支架或体内植入物时，它们都需要与细胞反应，因此，微球表面上细胞的粘附和增殖对于打算在临床治疗中应用微球非常重要，所以我们需要选择一种表面相对粗糙的水凝胶微球。
实施例8 GH水凝胶微球的溶胀实验
取一定质量的冻干微球样品，记下质量为W，并将样品放置到离心管中进行实验。在0min称量样品+离心管的质量为W0。将样品浸泡在PBS中并放置到37℃，100rpm/min的环境中，在一定时间点，吸干水分并称重，记为Wt。每组至少三个平行实验，微球的溶胀率使用下列公式计算：
溶胀率(SR)＝(Wt-W0)/W×100％
实验结果：本发明的修复骨缺损的水凝胶微球溶胀测试结果如图4所示，每组微球样品均可以达到400％以上的溶胀行为。
表1 实施例3-5所得水凝胶微球在不同浸泡时间下的溶胀结果
Figure BDA0003009340740000081
实施例9GH水凝胶微球的热重分析
称取约5mg的冷冻干燥的水凝胶微球样品(G:H＝10:0、10:3、10:5)，置于洁净的坩埚中，在50～700℃范围内进行热力学分析，升温速度为15℃/min。
实验结果：本发明的修复骨缺损的水凝胶微球热重分析结果如图5所示，图5A显示，G:H＝10:0的微球在690℃质量剩余2％左右，而G:H＝10:3、10:5的微球质量分别剩余25％和35％左右。随着nHAP的加入，微球的热稳定性增加。图5B是对上图进行求导之后得出的曲线。从图中得出，10:0微球的热分解温度是322℃，10:3微球的热分解温度分别是330℃、567℃，10:5微球的热分解温度分别是324℃、543℃。320℃左右的热分解是由GelMA引起的，而550℃左右的热分解是由nHAP引起的，图5结果显示，10:3微球的两种热分解温度相对于10:0和10:5微球均有所升高，由此说明，我们制备的样品组微球(10:3)的热稳定性最高。
实施例10 GH水凝胶微球的机械性能测试
直接将与制备微球相同的原料添加到模具中制备出15mm×6mm圆柱形水凝胶，每组样品设置三个平行，使用万能试验机进行压缩。将样品分别放置到试验机平台上，以1mm/min的固定应变率执行压缩测试，并使用250N的称重传感器测量施加的载荷，测量出应力-应变曲线，然后计算其弹性模量。
实验结果：本发明的修复骨缺损的水凝胶微球的机械性能测试结果如图6所示，结果显示，G:H＝10:0微球的压缩模量是55Kpa，10:2、10:3、10:5微球的压缩模量分别是102Kpa、258Kpa和142Kpa。nHAP的加入可以显著提高水凝胶的压缩模量，样品组微球的压缩模量比阳性对照组高出了将近5倍，但随着nHAP加入量的进一步增加，水凝胶的压缩模量反而降低，这可能是由于更多的nHAP阻止了GelMA之间的交联，水凝胶的稳定性降低。水凝胶的压缩模量合适的硬度范围可诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分化成特定的细胞类型(神经细胞20kPa，肌肉细胞40kPa，软骨细胞80kPa和成骨细胞190kPa)。我们制备的样品组微球可以促进成骨细胞的分化。
表2 实施例3-6所得水凝胶微球的压缩模量结果
水凝胶微球 压缩模量(kPa)
实施例3 55
实施例4 258
实施例5 142
实施例6 102
实施例11 GH水凝胶微球的体外细胞毒性评估
将各个样品置于EP管中，先紫外灭菌1h，然后用75％乙醇浸泡2h，再用无菌PBS置换6次，每次30min。
采用NIH 3T3细胞并用MTT法检测。将灭菌处理后的冻干微球材料浸泡于培养基中以0.2g/mL的比例在37℃，5％CO2的培养箱中浸提24h。然后将浸提液过膜。将NIH 3T3细胞以5000个/孔(每孔100μL)的密度接种于96孔细胞培养板中并贴壁培养24h。之后吸出其中的培养基，替换成100μL不同浓度的微球浸提液(0.15，0.1，0.05g/mL)，每个浓度设置6个平行，普通培养基作为空白对照，然后分别在培养箱中培养1/2/3天。在到达预设的培养时间用移液枪缓慢贴壁吸走孔板中的溶液，在避光条件下，每孔加入100μL浓度为0.5mg/ml的MTT的磷酸盐缓冲液溶液，在37℃无菌培养箱中孵育4h，弃去孔中的MTT溶液，各加入100μLDMSO并在室温下振荡15min混合均匀，之后用酶标仪记录570nm处的吸光度值(OD值)。每组样品设置6个平行实验，细胞的相对存活率计算方法如下式：
细胞相对存活率(％)＝OD570(sample)/OD570(control)×100％
实验结果：本发明的修复骨缺损的水凝胶微球的体外细胞毒性测试结果如图7所示，实验结果显示，三种比例的微球的细胞存活率都在80％以上，制备的微球具有比较好的生物相容性。同时发现阳性对照组(G:H＝10:0)的细胞存活率最高，羟基磷灰石具有一定的细胞毒性，因此随着羟基磷灰石的加入，样品组(G:H＝10:3)和阴性对照组(G:H＝10:5)的细胞存活率都有所降低，其中样品组的细胞存活率要高于阴性对照组。并且结果表明细胞存活率与浸提液浓度呈现相关性，随着浸提液浓度升高，细胞存活率下降，但按照国家标准医疗器械生物学评价中所要求的的0.1g/mL的浸提浓度，所有的水凝胶微球均表现出良好的细胞相容性。
表3 实施例3-5所得水凝胶微球在0.1g/mL的浸提浓度下细胞相对存活率结果
水凝胶微球 细胞相对存活率
实施例3 118％
实施例4 88％
实施例5 95％
实施例12 GH水凝胶微球的细胞黏附结果测试
使用MC3T3-E1细胞评估GH水凝胶微球的细胞粘附效果。将灭菌处理后的水凝胶微球铺到共聚焦皿中，铺满底部。为了细胞能够更好地黏附，用少量的培养基浸泡材料15～20min，然后吸出培养基，加含有细胞的培养基1～2mL(5万个细胞左右)。共培养一定时间后(3d、5d、7d)，吸出培养基，每次用1mLPBS洗三次。然后每个共聚焦皿加入200μL的4μM的AM染料，放置37℃培养箱中15-30min，弃去所有液体，PBS洗一次，然后加1mL的4％多聚甲醛固定15min，加1mL的PBS洗三次，使用激光共聚焦倒置荧光显微镜拍照观察细胞在微球表面的黏附情况。
实验结果：本发明的修复骨缺损的水凝胶微球的细胞粘附测试结果如图8所示，结果显示GelMA:nHAP＝10:0微球细胞粘附效果最好，GelMA:nHAP＝10:3、10:5微球的细胞粘附能力均有所降低，但其仍具备一定的细胞粘附能力。
表4 实施例3-5所得水凝胶微球在经过不同粘附时间后的细胞粘附能力结果
Figure BDA0003009340740000111
实施例13 GH水凝胶微球促进细胞体外成骨分化能力测试
为了检查与GH水凝胶微球共培养的MC3T3-E1细胞成骨分化能力，在含有10％胎牛血清和1％双抗(青霉素-链霉素)的MEM-α培养基中培养了载有细胞的微球。培养7天后使用ALP活性测定法测定MC3T3-E1的成骨分化。
实验结果：本发明的修复骨缺损的水凝胶微球促进细胞体外成骨分化能力测试结果如图9所示，与MC3T3-E1细胞共培养7天后，空白组以及不同比例的微球(G:H＝10:0、10:3、10:5)组中ALP活力测定结果显示加入纳米级羟基磷灰石(nHAP)之后，ALP分泌量增加，本发明制备的微球能够促进细胞向成骨方向分化。
表5 空白组以及实施例3-5所得水凝胶微球与MC3T3-E1细胞共培养后ALP检测结果
水凝胶微球 p-nitrophenol(μmol)/蛋白(g)
空白 25.24
实施例3 37.49
实施例4 54.76
实施例5 47.90
实施例14 GH水凝胶微球修复骨缺损的动物实验
为了观察我们制备的GH水凝胶微球促进体内的骨再生能力，我们使用G:H＝10:3的微球，选用兔双侧下颌骨缺损模型进行了初步的实验探索。
实验结果：本发明的修复骨缺损的水凝胶微球促进体内骨再生能力测试结果如图10所示，其中(a)、(b)、(c)为双侧无骨缺损组，(d)、(e)为0天无植入物双侧骨缺损组，(f)、(g)、(h)为8周植入水凝胶微球双侧骨缺损组，(i)、(j)为12周无植入物双侧骨缺损组。实验结果显示与无植入物组相比，本发明制备的水凝胶微球对兔双侧骨缺损的修复有显著的效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种制备用于修复骨缺损的水凝胶微球的方法，其特征在于，所述方法包括如下过程：
将含双键修饰的有机成分、无机成分和光引发剂分散在水中，获得混合体系，作为分散相；将油相作为连续相，然后利用微流控装置将分散相和连续相分别注入微通道，在注射泵推动下分散相由于剪切力作用形成单分散液滴，收集获得W/O乳液；最后将W/O乳液在紫外光下进行照射，制得水凝胶微球；
所述含双键修饰的有机成分选自：甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化胶原蛋白；所述无机成分选自：羟基磷灰石、β-TCP、硅酸盐、掺锰生物可吸收陶瓷和钛化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合体系中双键修饰的明胶与羟基磷灰石的质量比为10：(2-10)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合体系中经双键修饰的明胶的质量浓度为5％～10％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合体系中HAP的质量浓度为1％～10％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光引发剂相对混合体系的质量分数为0.125％～0.25％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油相为蓖麻油。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连续相在微通道的流速控制在4～10mL/h。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，分散相在微通道的流速控制在1～5mL/h。
9.权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的一种用于修复骨缺损的水凝胶微球。
10.权利要求9所述的用于修复骨缺损的水凝胶微球在制备用于修复外科骨缺损类药用产品、或医疗器械中的应用。
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