CN117887134A

CN117887134A - 一种水凝胶仿生矿化支架及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117887134A
Application number: CN202410289989.6A
Authority: CN
Inventors: 陈亚芳; 胡琛; 樊渝江; 梁洁
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2024-03-14
Filing date: 2024-03-14
Publication date: 2024-04-16
Anticipated expiration: 2044-03-14
Also published as: CN117887134B

Abstract

本发明公开了一种水凝胶仿生矿化支架及其制备方法和应用，属于生物支架材料技术领域，其制备方法包括：制备改性氨基化合物；将改性氨基化合物、磷盐和钙盐溶解于水中，向混合溶液中添加光引发剂并蓝光照射，制得水凝胶前驱体；将其置于碱溶液中浸泡；然后取出置于超纯水中，调节pH值为中性，浸泡后将水凝胶取出，冻干，制得。该仿生矿化支架可有效解决现有的支架在制备过程中存在羟基磷灰石易发生团聚、沉降的问题，该方法所需的矿化时间较短，矿化效率较高，且不引入生物毒性较强的物质，在简便高效的同时所得羟基磷灰石尺寸均匀；使用时将支架研磨为粉体状后可作为骨缺损填充修复的骨粉使用，其促成骨分化、修复临界骨缺损效果显著。

Description

一种水凝胶仿生矿化支架及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物支架材料技术领域，具体涉及一种水凝胶仿生矿化支架及其制备方法和应用。

背景技术

天然骨是胶原蛋白与纳米羟基磷灰石的天然复合材料。羟基磷灰石晶体分布在胶原蛋白纤维上，约占骨重量的60%~70%。虽然天然骨组织受到外界破坏有能力重建，但在自愈合失败的情况下，如骨折不愈合，就需要借助外界生物活性材料，诸如合成羟基磷灰石和含有羟基磷灰石的聚合物复合材料。理想情况下，这些材料应具有与骨骼相似的结构性能特征，具有生物相容性、生物降解性和生物活性，并且应该易于获得、制备简单。但是目前，由羟基磷灰石颗粒与聚合物复合制备骨修复支架时，存在着增强相与基体相不相容，纳米晶体固有的高表面能有利于团聚，从而导致沉积的羟基磷灰石在基体上不均匀的问题。目前很多研究都集中在通过羟基磷灰石与其他材料共混来克服这一问题。但这种方法不能完全模拟自然界中羟基磷灰石的形成，其在使用时依然存在生物相容性、生物降解性和生物活性差的问题。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种水凝胶仿生矿化支架及其制备方法和应用，该仿生矿化支架可有效解决现有的支架在制备过程中存在羟基磷灰石易发生团聚、沉降的问题。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种水凝胶仿生矿化支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）采用甲基丙烯酸酐对氨基化合物进行改性，制得改性氨基化合物；

（2）将改性氨基化合物、磷盐和钙盐分别溶解于水中，制成溶液，然后将三种溶液混匀得混合溶液，向混合溶液中添加光引发剂，然后进行蓝光照射，制得水凝胶前驱体；

（3）将水凝胶前驱体置于碱溶液中，浸泡；

（4）将浸泡后的水凝胶取出置于超纯水，调节pH值为中性，浸泡后将水凝胶取出，冻干，制得。

上述方案中，采用甲基丙烯酸酐对氨基化合物进行改性，改性过程中，甲基丙烯酸酐酐与化合物中的氨基发生酰胺化反应，在化合物中接枝碳碳双键，制得含有碳碳双键的化合物，将该化合物溶液与磷盐和钙盐溶液混合后，对混合溶液进行蓝光照射，照射过程中，含碳碳双键的化合物之间发生交联形成水凝胶，在成胶过程中，将磷盐和钙盐包裹在凝胶内部；然后将水凝胶置于碱液中浸泡时，磷盐、钙盐和碱液发生反应形成羟基磷灰石，由于钙盐和磷盐事先被分散固定在水凝胶内，因此，形成的羟基磷灰石也是均匀分散在水凝胶内部的，使得最终制得的仿生矿化支架具有较好的性能。

进一步地，步骤（1）中具体改性过程如下：将氨基化合物溶解于Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中，制得氨基化合物溶液，然后向其中添加甲基丙烯酸酐，于35-45℃条件下搅拌反应2-4h，制得。

上述过程中，将氨基化合物与甲基丙烯酸酐在35-45℃下反应，可实现对氨基化合物的改性。

进一步地，步骤（1）中甲基丙烯酸酐与氨基化合物的体积质量比为0.05-1ml:1-10g。

进一步地，步骤（1）中氨基化合物包括重组人源化I型胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、明胶和聚胱胺酸中的至少一种。

进一步地，步骤（2）混合溶液中钙磷元素的摩尔比为1.65-1.7；混合溶液中钙盐和磷盐的总质量与改性氨基化合物的质量比为35-55:100。

进一步地，步骤（2）中磷盐为磷酸二氢钠，钙盐为氯化钙。

进一步地，步骤（2）混合溶液中光引发剂的浓度为0.2-2wt%。

进一步地，光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐。

进一步地，步骤（3）中碱液为氢氧化钠溶液，碱液的浓度为0.5-2mol/L。

进一步地，步骤（3）中浸泡温度为30-40℃，浸泡时间为0.5-2h。

一种水凝胶仿生矿化支架，采用上述的方法制得。

上述水凝胶仿生矿化支架在作为骨修复原料中的应用。

本发明所产生的有益效果为：

1、本发明中通过对氨基化合物进行改性，在氨基化合物中引入碳碳双键，便于氨基化合物进行交联，形成水凝胶，碳碳双键的接枝率为43-83%；将改性氨基化合物、磷盐和钙盐分别制成溶液，然后将三种溶液混合，使得磷酸根离子、钙离子和改性氨基化合物均匀分散，然后采用光照的方式进行处理，光照可促进溶液中的改性氨基化合物发生交联，形成水凝胶；由于溶液中的磷酸根离子和钙离子是均匀分散的，改性氨基化合物在交联过程中会将磷酸根离子和钙离子包裹在内部，实现对两种离子的固定；然后将形成的水凝胶置于碱溶液中浸泡，碱渗透进入水凝胶内部，与磷酸根离子和钙离子形成羟基磷灰石，干燥后，制得复合仿生矿化支架；本发明中通过先将磷酸根离子和钙离子进行包裹定位的方式，将用于制备羟基磷灰石的原料进行固定，可提高后续羟基磷灰石在水凝胶中的分散效果，避免羟基磷灰石在材料内发生团聚，使制备的支架与骨骼具有更好的相似性。

2、本发明中的仿生矿化支架制备方法简单，便于操作；制得的仿生矿化支架中羟基磷灰石以纳米结构存在，纳米羟基磷灰石在仿生矿化支架中的质量百分占比为20-40%。

附图说明

图1为重组人源化I型胶原蛋白MA改性前后的核磁谱图；

图2为不同仿生矿化支架的热重分析结果图；

图3为不同仿生矿化支架的微观形貌图；

图4为仿生矿化支架中钙磷元素的含量图；

图5为不同仿生矿化支架的矿物晶形检测图；

图6为不同仿生矿化支架的降解曲线图；

图7为不同仿生矿化支架的溶胀曲线图；

图8为不同仿生矿化支架的钙离子释放曲线图；

图9为不同仿生矿化支架中细胞增殖情况统计图；

图10为不同仿生矿化支架不同时间时内部细胞分布显微图；其中，A为不同仿生矿化支架不同时间时内部细胞经FDA / PI染色后的分布显微图；B为不同仿生矿化支架不同时间时内部细胞经鬼笔环肽/DAPI染色后的分布显微图；

图11为不同仿生矿化支架不同时间内细胞形态图；

图12为不同仿生矿化支架成骨后力学性能测试结果统计图；

图13为不同仿生矿化支架成骨后切片染色图；

图14为不同仿生矿化支架Micro CT结果图；

图15为不同仿生矿化支架修复骨缺损后的骨组织切片染色图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

下面结合实施例和附图对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种水凝胶仿生矿化支架，其制备方法包括以下步骤：

（1）将分子量为100kDa的重组人源化I型胶原蛋白溶解于Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中，制得浓度0.13 g/ml的重组人源化I型胶原蛋白溶液，然后向其中添加甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐与重组人源化I型胶原蛋白体积/质量比为0.1ml:1g，然后于37℃、600rpm条件下搅拌反应4h，透析，制得改性重组人源化I型胶原蛋白；

（2）将改性重组人源化I型胶原蛋白、磷酸二氢钠和氯化钙分别溶解于水中，制成溶液，然后将三种溶液混匀得混合溶液，混合溶液中改性重组人源化I型胶原蛋白与钙盐和磷盐的质量比为100:45，钙磷元素的摩尔比为1.67；向混合溶液中添加苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐，然后用405nm蓝光照射，制得水凝胶前驱体；混合溶液中苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐的浓度为1wt%；

（3）将水凝胶前驱体置于1mol/L的氢氧化钠溶液中，于37℃浸泡1h；

（4）将浸泡后的水凝胶取出置于超纯水，调节pH值为中性，浸泡后将水凝胶取出，冻干，制得仿生矿化支架，标记为rC@HAp45。

实施例2

一种水凝胶仿生矿化支架，其制备方法包括以下步骤：

（1）将分子量为100kDa的透明质酸溶解于Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中，制得浓度为0.2g/ml的透明质酸溶液，然后向其中添加甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐与透明质酸的体积/质量比为0.2ml:4g，于35℃、600rpm条件下搅拌反应4h，透析，制得改性透明质酸；

（2）将改性透明质酸、磷酸二氢钠和氯化钙分别溶解于水中，制成溶液，然后将三种溶液混匀得混合溶液，混合溶液中改性透明质酸与钙盐和磷盐的质量比为100:50，钙磷元素的摩尔比为1.67；向混合溶液中添加苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐，然后用405nm蓝光照射，制得水凝胶前驱体；混合溶液中苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐的浓度为1wt%；

（3）将水凝胶前驱体置于0.5mol/L的氢氧化钠溶液中，于40℃浸泡0.5h；

（4）将浸泡后的水凝胶取出置于超纯水，调节pH值为中性，浸泡后将水凝胶取出，冻干，制得仿生矿化支架。

实施例3

一种水凝胶仿生矿化支架，其制备方法包括以下步骤：

（1）将分子量为100kDa的明胶解于Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中，制得浓度为0.5 g/ml的明胶溶液，然后向其中添加甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐与明胶积/质量比为0.5ml:5g，于45℃、600rpm条件下搅拌反应2h，透析，制得改性明胶；

（2）将改性明胶、磷酸二氢钠和氯化钙分别溶解于水中，制成溶液，然后将三种溶液混匀得混合溶液，混合溶液中改性明胶与钙盐和磷盐的质量比为120:40，钙磷元素的摩尔比为1.67；向混合溶液中添加苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐，然后用405nm蓝光照射，制得水凝胶前驱体；混合溶液中苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐的浓度为0.5wt%；

（3）将水凝胶前驱体置于0.8mol/L的氢氧化钠溶液中，于40℃浸泡0.5h；

实施例4

一种水凝胶仿生矿化支架，其制备方法包括以下步骤：

（1）将分子量为100kDa的壳聚糖溶解于Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中，制得浓度为0.3g/ml的壳聚糖溶液，然后向其中添加甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐与壳聚糖的体积/质量比为0.1ml:4g，于35℃、600rpm条件下搅拌反应4h，透析，制得改性壳聚糖；

（2）将改性壳聚糖、磷酸二氢钠和氯化钙分别溶解于水中，制成溶液，然后将三种溶液混匀得混合溶液，混合溶液中改性壳聚糖与钙盐和磷盐的质量比为110:40，钙磷元素的摩尔比为1.67；向混合溶液中添加苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐，然后用405nm蓝光照射，制得水凝胶前驱体；混合溶液中苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐的浓度为1wt%；

实验例

对实施例1中改性重组人源化I型胶原蛋白进行核磁检测，具体检测结果见图1。由图1可以看出，甲基丙烯酸酐（MA）改性的重组人源化I型胶原蛋白相较于重组人源化I型胶原蛋白核磁图谱来说，在5.3-5.5化学位移处出现新峰，表明甲基丙烯酸酐成功接枝在了重组人源化I型胶原蛋白上，接枝率在40%~83%。

以实施例1中的方法为例，将步骤（2）中混合溶液中改性重组人源化I型胶原蛋白与钙盐和磷盐的质量比从100:45依次修改为100:0、100:15和100:30，然后采用相同的方法制备得到仿生矿化支架，依次标记为 rC@HAp0、rC@HAp15、rC@HAp30；然后分别对rC@HAp0、rC@HAp15、rC@HAp30、rC@HAp45仿生矿化支架进行加热处理，然后测定仿生矿化支架的重量，具体结果见图2。由图2可以看出，随着钙盐和磷盐用量的增加，仿生矿化支架中无机矿物的含量逐渐增加，rC@HAp45仿生矿化支架中无机矿物的含量最高，约为34.25%。

以rC@HAp30、rC@HAp45仿生矿化支架为例，观察其微观形貌及元素分布，具体结果见图3-4；由图3和由图4可以看出，羟基磷灰石矿物良好的分散在基体相组成的纤维网络结构中，终产物中钙磷比为1.67，符合天然骨钙磷组成；仿生矿化支架的网络孔隙结构明显，有利于营养物质的输送以及细胞的生长。

以rC@HAp0、rC@HAp15、rC@HAp30、rC@HAp45仿生矿化支架为例，在液氮催冷状态下对仿生矿化支架进行研磨粉碎，将支架粉末用粉末X射线衍射仪进行矿物晶型分析，其结果如图5所示。由图5可以看出，与改性重组人源化I型胶原蛋白支架相比，经过原位矿化的纳米羟基磷灰石/重组人源化I型胶原蛋白仿生矿化支架在2θ为17°、32°附近均出现明显的HAp特征峰，据此证明支架材料在经过原位矿化后生成的矿物为HAp晶体。

以rC@HAp0、rC@HAp15、rC@HAp30、rC@HAp45仿生矿化支架为例，为了分析其降解性能，将其浸泡于浓度为50U/mL的1mL I型胶原酶的PBS溶液中，并置于恒温摇床中。在37℃下以100rpm振荡，浸泡一段时间后取出，冷冻干燥后称重，直到达到降解平衡，其降解曲线如图6所示，可见随羟基磷灰石（HAP）含量上升，仿生矿化支架的降解速率减慢，这有利于支架在成骨过程中为细胞的迁移提供稳定的场所。

以rC@HAp0、rC@HAp15、rC@HAp30、rC@HAp45仿生矿化支架为例，为了分析其溶胀特性，将其浸入PBS溶液中，置于恒温摇床中，并在37℃下以100rpm振荡。浸泡一段时间后，取出物质并称重，直到达到溶胀平衡，其溶胀曲线如图7所示，可见随HAP含量提升，仿生矿化支架溶胀率下降，有利于减轻支架植入后由溶胀带来的压迫。

以rC@HAp15、rC@HAp30、rC@HAp45仿生矿化支架为例，为了分析其钙离子释放性能，将8mg不同HAp含量的样品浸泡在4mL去离子水中，置于恒温摇床中，在37℃下以100rpm振荡，一定时间后，取去离子水，使用钙含量显色检测试剂盒（S1063S，Beyotime）定量检测钙离子浓度，其钙离子释放曲线如图8所示，可见随HAP含量上升，材料钙离子释放率逐渐增加，且材料在24小时后均大体保持线性钙离子释放。

以rC@HAp0、rC@HAp15、rC@HAp30、rC@HAp45仿生矿化支架为例，分析其生物相容性。从新生SD大鼠骨髓中提取骨髓间充质干细胞( BMSCs )，培养至P3代。α - MEM培养基(Hyclone公司,美国)中添加10 %胎牛血清(胎牛血清,美国Gibco公司)和1 %青霉素/链霉素( PS , Gibco公司)。通过二维细胞培养表征rC @ HAp的生物相容性。取不同HAp含量的rC@HAp，经γ射线辐照灭菌。将上述灭菌后的rC@HAp置于低黏附24孔板中，每孔1个。然后将15万个BMSCs加入到材料前面，放入培养箱中培养1 h。翻转材料后，再次加入15万个BMSCs，再次放置1 h。随后，每孔加入上述培养基1.5 mL，在(5% CO₂,37℃)相同条件下培养样品，每2天更换一次培养基。采用CCK - 8 (Dojindo, Japan)分别在3天、7天、14天检测不同材料中细胞增殖情况，结果如图9所示，可见14天时，HAP含量越高其细胞活性越强，说明HAP可以促进细胞增殖，且随时间推移，细胞活性逐渐增强，说明材料无明显的细胞毒性。共聚焦激光扫描显微镜观察FDA / PI和DAPI染色后的细胞增殖和形态，结果如图10所示，可见HAP含量越高，细胞的数量越多，且细胞的形态越铺展。使用场发射扫描电子显微镜( S-4800型,日立公司)观察二维培养( 2.5%戊二醛固定)后细胞的形态，结果如图11所示，与之前的结果同样证明了材料促进细胞的铺展。所述鬼笔环肽/ DAPI染色，材料用PBS洗涤，浸泡在多聚甲醛( 4%,w/v)中30分钟，然后用0.1%v/v Triton X-100 ( Sigma-Aldrich)浸润10分钟，然后用PBS洗涤3次。鬼笔环肽溶液(5μg/mL,sigma-Aldrich)处理1.5h，DAPI(10μg/mL,sigma-Aldrich)在25℃下处理30s。对于所述FDA/PI染色，材料用PBS洗涤两次，活细胞和死细胞分别用1μg/mL荧光素二乙酸酯( FDA )和1μg/mL碘化丙啶( PI )染色，然后用PBS溶液洗涤1min。

以rC@HAp0、rC@HAp15、rC@HAp30、rC@HAp45仿生矿化支架为例，分析其异位成骨能力，以评价仿生矿化支架的成骨性能。对于所述裸鼠皮下异位成骨，所有手术器械均高温高压消毒，将BMSCs预接种于不同HAp含量的仿生矿化支架上，腹腔注射水合氯醛(35mg/mL)麻醉后，于每只小鼠背部皮下做切口，将接种BMSCs的rC@HAp植入裸鼠皮下( n=4 )，并让植入物在体内发育4周。术后4周将小鼠安乐死，取出标本，用4%多聚甲醛( Solarbio公司,中国)固定过夜。之后对样本进行储能模量力学测试、切片H&E染色、切片OPN免疫组化染色。其力学测试结果如图12所示，随时间推移材料力学性能明显变强，说明支架内部成骨效果显著。切片染色结果如图13所示，从结果可以看出rC@HAp15、rC@HAp30、rC@HAp45均有不同程度的新骨组织生成，且成骨相关基因表达量随HAP含量的上升而上升，材料的成骨诱导效果显著。

以rC@HAp0、rC@HAp45仿生矿化支架为例，对比研究其与现有产品Geistlich Bio-Oss的骨缺损修复性能。所有手术器械均高温高压消毒。兔腹腔注射水合氯醛(35mg/mL)麻醉后，用手术器械在兔颅骨左右两侧对称钻一直径10mm、深1mm的孔，为兔颅骨临界骨缺损模型。将粉末状rC@HAp0、rC@HAp45及Geistlich Bio-Oss分别植入不同缺损，并设置空白组（不填充）与天然组（不造模）。然后缝合皮肤伤口，使植入物在体内发育12周。术后12周将兔安乐死，钻取缺损组织，用4%多聚甲醛( Solarbio公司,中国)固定过夜。采用Micro CT 进行CT扫描及骨密度、骨微结构、骨小梁定量分析。随后，将组织脱钙，制作石蜡切片，进行H&E染色和RUNX2免疫组化染色。Micro CT结果如图14所示，可见对比空白组而言，rC@HAp45仿生矿化支架及Geistlich Bio-Oss的临界骨缺损修复能力均较为显著，切片染色结果如图15所示，同样可以看出仿生矿化支架材料在成骨诱导、骨缺损修复方面均较为接近Geistlich Bio-Oss。

Claims

1.一种水凝胶仿生矿化支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（3）将水凝胶前驱体置于碱溶液中，浸泡；

（4）将浸泡后的水凝胶取出置于超纯水中，调节溶液pH值为中性，浸泡后将水凝胶取出，冻干，制得。

2.如权利要求1所述的水凝胶仿生矿化支架的制备方法，其特征在于，步骤（1）中具体改性过程如下：将氨基化合物溶解于Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中，制得氨基化合物溶液，然后向其中添加甲基丙烯酸酐，于35-45℃条件下搅拌反应2-4h，制得。

3.如权利要求1或2所述的水凝胶仿生矿化支架的制备方法，其特征在于，步骤（1）中甲基丙烯酸酐与氨基化合物的体积质量比为0.05-1ml:1-10g。

4.如权利要求1或2所述的水凝胶仿生矿化支架的制备方法，其特征在于，步骤（1）中氨基化合物包括重组人源化I型胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、明胶和聚胱胺酸中的至少一种。

5.如权利要求1所述的水凝胶仿生矿化支架的制备方法，其特征在于，步骤（2）混合溶液中钙磷元素的摩尔比为1.65-1.7；混合溶液中钙盐和磷盐的总质量与改性氨基化合物的质量比为35-55:100。

6.如权利要求1或5所述的水凝胶仿生矿化支架的制备方法，其特征在于，步骤（2）中磷盐为磷酸二氢钠，钙盐为氯化钙；步骤（2）混合溶液中光引发剂的浓度为0.2-2wt%。

7.如权利要求1所述的水凝胶仿生矿化支架的制备方法，其特征在于，步骤（3）中碱液为氢氧化钠溶液，碱液的浓度为0.5-2mol/L。

8.如权利要求1所述的水凝胶仿生矿化支架的制备方法，其特征在于，步骤（3）中浸泡温度为30-40℃，浸泡时间为0.5-2h。

9.一种水凝胶仿生矿化支架，其特征在于，采用权利要求1-8中任一项所述的方法制得。

10.权利要求9所述的水凝胶仿生矿化支架在作为骨修复原料中的应用。